CN103571943A - 一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌核酸检测方法。所述方法为：根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鼠伤寒沙门氏菌。本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。

Description

一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，涉及一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，具体地说是一种基于环介导等温扩增技术的鼠伤寒沙门氏菌的检测方法。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是常见的沙门氏菌致病的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。
传统鉴定鼠伤寒沙门氏菌方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法有操作繁琐、耗时长、检出率低等缺陷，对该病的准确检测和及时治疗十分不利。针对鼠伤寒沙门氏菌的酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、免疫组化及免疫荧光等检测技术也有报道，但也不同程度地存在某些缺点。至上世纪80年代末聚合酶链反应技术诞生，极大的推动了分子生物学技术的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的发展，成为最重要的检测手段之一。但PCR技术需要复杂的温度变化、长时间的温度循环、繁琐的电泳检测，而荧光定量PCR技术需要昂贵的仪器以及繁琐的操作过程，使得该技术在基层实验室以及检疫机构推广使用受到了局限。
21世纪初，Notomi T等几位日本学者开发了一种新型的恒温扩增技术，即环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。其原理为采用能够特异生识别靶序列上8个区域设计的6个特异引物，利用一种具有链置换性Bst-DNA聚合酶在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。其扩增效率可达到109-1010个拷贝数的数量级，并且可以通过扩增副产物焦凝酸镁沉淀产生的浊度或者显色反应进行判断反应发生与否。
LAMP技术与PCR技术相比具有相同甚至更高的灵敏度，且具有操作简便、花费低等优点。该技术使得整个检测过程在恒温水浴锅中即可完成，大幅降低了仪器成本，并且适用于大量样本同时检测。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法、核酸及引物有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，该方法是一种鼠伤寒沙门氏菌的快速检测试剂盒的制备和检测方法，为食品及公共卫生安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：选取鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因序列如SEQ ID NO：1所示，特异性强保守性高的区域，利用PrimerExplorer V软件进行分析，设计可以特异性识别靶基因6个不同序列的引物：两个内引物(上游内引物和下游内引物)、两个外引物(上游外引物和下游外引物)和两个环游引物(上游环引物和下游环引物)，而且内引物包含靶DNA的正义链和反义链。通过LAMP反应，在等温条件下，在45分钟内，在内外引物的作用下，可使靶DNA累积到1011拷贝，可通过荧光染料等方法来观察扩增结果。
1鼠伤寒沙门氏菌基因的环介导等温扩增引物情况
表1：针对编码鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因的LAMP反应引物序列组成
引物 类别 序列组成
F3    外引物          5'-GCATTTATCCAGCCCGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)
B3    外引物          5'-AACAAGACATCGGGATCCAG-3’(SEQ ID NO：3)
FIP   内引物          5'-AGCCGTTCCCAAAGAGGATGG-TGTTTTACCTCAATGGCGGA-3’(SEQ ID NO：4)
BIP   内引物          5'-GCGCTGCCGGTTTTAATACTGC-CACTGCCGTAAGCATTGTTC-3’(SEQ ID NO：5)
LF    上游环游引物    5'-TTCCAAAGTGCGGCATGGT-3’(SEQ ID NO：6)
LB    下游环游引物    5'-CAGCACAGAATGATGCTGAAGT-3’(SEQ ID NO：7)
2.提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA(或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA)。
3.鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下：
2xU-LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％TritonX-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM，；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl；
其中，阳性对照扩增体系中的模板为鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA；阴性对照扩增体系中的模板为灭菌超纯水；待检测样品扩增体系中的模板为待检测样品DNA。
4.特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→-20℃保存。
5.LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括：
(1)肉眼直接观察反应浊度
(2)琼脂糖凝胶电泳分析
(3)肉眼观察反应液颜色的变化.
上述3种方法中可选一种或多种作为判断标准。其中：
(1)肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大。在反应结束后，可直接通过肉眼判读。反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性。
(2)琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性。
(3)加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的方法具有设备要求简单，相对于其他核酸检测技术而言，本发明不需要特定的反应和检测仪器，普通的恒温水浴锅即可进行，便于应用和推广。本发明的核酸检测技术灵敏度高，可在1小时内实现对样本106-109倍的扩增，灵敏度优于PCR检测。由于发明中对BstDNA链置换聚合酶的采用，实现在相应反应体系下对待测靶基因的指数级增加。使得不仅仅提高了反应的效率，而且减少了反应中非特异性扩增产物的污染。以及相对于PCR或者FQ-PCR而言，大大的节省了时间，并且促环引物的加入进一步提高了反应的速度等优点，适合基层卫生机构、检验检疫机构查验的大规模使用。
附图说明
图1为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法特异生评价实验凝胶电泳结果图；
图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法的建立
步骤一，设计特异性扩增鼠伤寒沙门氏菌的引物对
通过生物信息学分析，从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中筛选出保守且特异的STM4493基因，将之作为检测鼠伤寒沙门氏菌的靶基因；
将STM4493基因DNA序列输入PrimerExplorer V软件进行分析，设计可以特异性识别靶基因6个不同序列的引物：两个内引物(上游内引物和下游内引物)、两个外引物(上游外引物和下游外引物)和两个环游引物(上游环引物和下游环引物)，而且内引物包含靶DNA的正义链和反义链。(引物由上海基康生物技术有限公司合成)
步骤二，DNA模板制备
将鼠伤寒沙门氏菌接菌至10ml的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1ml菌液，放入1.5ml离心管中；12,000r/min离心10min，弃上清液，加入200μl无菌双蒸水重新悬浮菌体，12,000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。用100μl无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
步骤三，鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测体系及程序
2xU-LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mMMgSO4、0.2％TritonX-100、2.4mMdNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl；
特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→-20℃保存。
步骤四，结果判定
(1)肉眼直接观察反应浊度
(2)琼脂糖凝胶电泳分析
(3)肉眼观察反应液颜色的变化.
上述3种方法中可选一种或多种作为判断标准。其中：
(1)肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大。在反应结束后，直接通过肉眼判读。反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性。
(2)琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性。
(3)加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。
实施例2鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法的特异性实验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例1步骤二分别提取鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸭沙门氏菌(S.Anatis)、山夫登堡沙门氏菌(S.Senftenberg)、海德尔堡沙门氏菌(S.Heidelberg)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuls)、大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA模板。
步骤二，鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法特异生评价试验
按照实施例1步骤三中LAMP反应体系，取步骤一中制备各菌株的DNA模板1μL作为LAMP反应模板分别添加到LAMP反应体系中；然后按照实施例1步骤三中LAMP循环参数进行扩增反应。
步骤三，结果判定
琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性。
结果：图1及表2为鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果。
表2：鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的特异性实验检测结果
菌株 编号 菌数 结果
Salmonella Typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌) 50115-13 1 +
Salmonella choleraesuls(猪霍乱沙门氏菌) AS1.1190 1 -
Salmonella ParatyphiA(甲型副伤寒沙门氏菌) ATCC9150 1 -
Salmonella Paratyphi B(乙型副伤寒沙门氏菌) CMCC50004 1 -
Salmonella Paratyphi C(丙型副伤寒沙门氏菌) CMCC50118 1 -
Salmonella Anatis(鸭沙门氏菌) CMCC50774 1 -
Salmonella Senftenberg(山夫登堡沙门氏菌) CMCC50050 1 -
Salmonella Heidelberg(海德尔堡沙门氏菌) CICC21487 1 -
Escherichia coli(大肠杆菌) CMCC44103 1 -
-：LAMP结果为阴性；+：LAMP结果为阳性
图1中：泳道1-10：鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸭沙门氏菌(S.Anatis)、山夫登堡沙门氏菌(S.Senftenberg)、海德尔堡沙门氏菌(S.Heidelberg)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuls)、大肠杆菌(Escherichia coli)；泳道M：2000bp分子量标准。
从图1及表2中可以看出，取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析：在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性，反之，则为阴性。扩增鼠伤寒沙门氏菌DNA可得到典型的梯状条带，而扩增其他DNA均未得到梯状条带。以上结果说明引物对具有良好的特异性，建立的LAMP检测方法可以特异性的检测鼠伤寒沙门氏菌。
实施例3鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法敏感性评价实验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例一步骤二提取鼠伤寒沙门氏菌DNA基因组模板，经OD260/280检测，鼠伤寒沙门氏菌DNA溶液的浓度为24.85μg／ml，用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释7个梯度。
步骤二，鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法敏感生评价试验
每个梯度分别取2μl加入LAMP应体系，按照实施例1步骤三中方法对DNA模板进行LAMP扩增检测。
步骤三，结果判定
琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性。
若电泳结果出现典型的梯状条带，则说明可以检测出样品中含的鼠伤寒沙门氏菌；若没有出现典型的梯状条带，，则说明未能检出样品中含的鼠伤寒沙门氏菌。
结果：图2：泳道1-7：DNA模板浓度分别为：49.7ng、4.97ng、497pg、49.7pg、4.97pg、497fg、49.7fg；泳道M：2000bp分子量标准。
由图2可知，在第1-6泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度分别为49.7ng、4.97ng、497pg、49.7pg、4.97pg、497fg，在第7条泳道看不到扩增条带。因此，判定LAMP检测灵敏度为497fg，具有较高的灵敏度。
实施例4鼠伤寒沙门氏菌疑似菌株的检测
利用实施例1建立的鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测方法对30株疑似鼠伤寒沙门氏菌的沙门氏菌菌株进行检测，。
结果：经LAMP检测发现15株疑似菌株呈阳性结果。将这15株疑似菌株进行血清学分型实验，其血清型分别为4，5：i：-，4，1：i：-，与鼠伤寒沙门氏菌抗原式(1，4，5，12：i：1，2)相符合，之后经
Figure BSA0000094365120000061
Microbial Characterization System鉴定，结果表明这15株疑似菌株为鼠伤寒沙门氏菌。而对LAMP检测方法为阴性的其它疑似菌株，进行血清学分型实验，其血清型结果与鼠伤寒沙门氏菌抗原式不符，经
Figure BSA0000094365120000062
Microbial Characterization System鉴定证实其不是鼠伤寒沙门氏菌。本实施例证明，所建立的鼠伤寒沙门氏菌的特异性LAMP法具有非常高的可靠性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Figure ISA0000094365140000011
Figure ISA0000094365140000021
Figure ISA0000094365140000031
Figure ISA0000094365140000041

Claims (4)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，其具体步骤为：
(1).根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的环介导等温扩增引物；
(2).提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA；
(3).鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下：
2xU-LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM，；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl，同时设置阴阳性对照扩增体系，阴阳性对照扩增体系除模板外，其余成分同上述检测反应体系；
(4).特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→-20℃保存；
(5).LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括：
①肉眼直接观察反应浊度
②琼脂糖凝胶电泳分析
③肉眼观察反应液颜色的变化.
所述述3种方法中可选一种或多种作为判断标准，其中：
①肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大，在反应结束后，可直接通过肉眼判读，反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；
②琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；
③加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增鼠伤寒沙门氏菌的特定靶核酸序列区域。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的阴阳性对照扩增体系中，阳性对照模板为含有鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA或含检测靶序列的重组质粒DNA，阴性对照的模板为灭菌超纯水，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对鼠伤寒沙门氏菌中的Genbank登录号为NC_003197.1的STM4493基因设计环介导等温扩增特异性引物。
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