CN102676684A

CN102676684A - 同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的方法

Info

Publication number: CN102676684A
Application number: CN2012101771996A
Authority: CN
Inventors: 魏华; 许恒毅; 万翠香; 杨友均; 徐锋; 熊勇华; 赖卫华
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明属于微生物检测领域，公开了一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌设计特异性引物，采用叠氮溴化丙锭处理处理取出死菌的干扰，最终提取DNA做多重PCR检测。本方法和经典的细菌分离、鉴定和血清学分型方法相比更快速、准确。

Description

同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。

技术背景

沙门氏菌属是革兰氏阴性、兼性厌氧的无芽孢菌。更具目前的分类，沙门氏菌属只包含两个种：邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌，其中后者包含有2500多种血清型，也是感染人和动物最多的。在众多的血清型中，鼠伤寒沙门氏菌是引起人体食源性致病菌中毒和胃肠炎的一种重要的致病菌，主要流行在发展中国家，并且对于免疫缺陷性个体而言，如果感染该致病菌而未及时治疗则有可能致命。伤寒和副伤寒沙门氏菌主要引起人体的伤寒热和副伤寒热，尽管它们已不再发达国家流行，但是在发展中国家，例如亚洲和非洲北部地区，这些致病菌仍然还在引发严重的疾病。据估计，在全世界，每年有22000万的沙门氏菌感染，其中死亡人数为20万。在南亚地区约有四分之一的肠热症是有副伤寒沙门氏菌引起。沙门氏菌主要感染居住环境拥挤，食物和饮水不卫生的人群，其中使用受污染的食物是组成沙门氏菌感染的主要途径，大约有95%的感染是有食用受污染的食物引起的。

目前现存的检测该沙门氏菌的方法主要是通过传统的培养方法。如(杨瑞军, 生肉食品中致病菌检测结果分析[J]中国卫生检验杂志.2009:19（9）2122-2125)，传统方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点。因此需要更快速检测3种致病菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的能同时检测活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。该方法可用于食品样本中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的初筛检测，其操作简便、结果客观准确，避免了现有方法操作繁琐、费时费力、成本高昂的缺点。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种叠氮溴化丙锭处理结合多重PCR同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法，包括如下步骤：

(1)取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除加大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；

(2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶（PMA）溶液，使PMA的终质量浓度为3 μg/mL，混匀后室温避光培养3-8min（优选为5min），卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）所得DNA进行mPCR，体系包含总共10μl反应液，其中，4 μl 制备的模板DNA溶液，2 μl 5×buffer，每条引物的量是15 pmol，1U Taq DNA聚合酶;反应条件是：95℃ 10 min，接着94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min 40个循环，最后 72℃ 延伸10 min；

（4）mPCR 反应结束后，进行目的菌检测分析。

步骤（1）所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。

步骤（3）所述引物分别为：从5’-3’为

fliC-F:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC

fliC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC

Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGC

Hat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTG

stgA-F:TGCCAGGTTACGCCACAAACC

stgA-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC

步骤（4）所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有636 bp条带，则说明有鼠伤寒沙门氏菌，若有551 bp条带，则说明有乙型副伤寒沙门氏菌，若有354 bp条带，则说明有伤寒沙门氏菌菌。

与现有技术相比，本发明有如下有益效果：

1、能同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌，速度快，可以在4小时内得到结果。

2、只检测具有致病性的活菌，效率更高。

3、本发明设计的特异性引物，采用特定反应条件，灵敏度高。可同时、高效地检测出该3种目的菌，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。

附图说明

图1 多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌电泳结果。M：DL1000 DNA Marker；1：多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌；2：多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌；4：多重PCR同时检测伤寒沙门氏菌菌、乙型副伤寒沙门氏菌；5：多重PCR单一检测鼠伤寒沙门氏菌；6：多重PCR单一检测乙型副伤寒沙门氏菌；7：多重PCR单一检测伤寒沙门氏菌菌。

图2 PMA去除死菌的干扰。（A）PMA处理组合方式；（B）多重PCR检测结果。各组中鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的浓度为106 CFU/mL。

图3 多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的特异性。

图4多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的最低检测线。（a）鼠伤寒沙门氏菌(泳道1-7，4.3×10⁶ 到 4.3×10¹CFU/ml), （b）乙型副伤寒沙门氏菌(泳道1-7， 3.7×10⁶到3.7×10¹CFU/ml),（c）伤寒沙门氏菌菌(泳道1-7，7.2×10⁶到7.2×10¹CFU/ml)。

具体实施方案

下面结合具体实施例，进一步阐释本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，活按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。

实施例

步骤1，食物样本预处理

称取1 g的食物样本，加入9ml的PBS，碾磨制成匀浆液，900 g 离心5 min，去除加大的食物残渣，取上清（该过程必须无菌操作）。

步骤2，PMA处理

PMA溶解于二甲亚砜( DMSO) 中，配制成0.5 mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。取500 μL制备好的菌悬液置于1.5 mL微量离心管中，加入3 μL 0.5 mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为3 μg/mL；PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5 min，利用500 W的卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20 cm处，交联后的悬浮液于10000 g离心5 min，所得沉淀用于DNA的提取。

步骤3，基因组DNA的提取

经步骤2获得的样品在10000 g，4^oC条件下离心5 min，弃上清，并小心吸走残余液体，加入30 μl无菌的去离子水100^oC煮沸10 min，待冷却后12000 g，4^oC条件下离心5 min，取上清作为mPCR反应模板，制备的模板应立即用于检测。

步骤4，选取靶点及设计引物

多重PCR之所以难做，问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每个靶点都需要两边的引物同时配合。因此，本发明分别选取鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌特异性基因，采用Oligo7软件设计多重PCR引物，调整各对引物之间的退火温度，并调节引物对之间的扩增配合程度，使各对引物的退火温度尽量一致，扩增速度尽量相等。并通过实验来验证多重PCR的扩增效果，选取条件最优的引物对来作为下面检测用引物（表1）。并采用表2提供的菌株进行引物特异性验证，菌株的编号和来源见表2。

表2 供试菌株及检测结果

^a JX-CDC, 江西省疾病预防与控制中心，中国；^bNCTC, 国家典型菌种保藏中心，英国

^cATCC,美国典型菌种保藏中心，美国；^dCMCC, 中国药物菌种保藏中心，中国

步骤5，mPCR反应体系及反应参数

本多重PCR体系包含总共10μl反应液，其中，4 μl 制备的模板DNA溶液，2 μl 5×buffer，每条引物的量是15 pmol，1U Taq DNA聚合酶。反应条件是：95^oC 10 min，接着40个循环（94^oC 30 s， 50^oC 30 s，72^oC 1 min），最后 72^oC 延伸10 min。

步骤6，mPCR扩增结果检测

mPCR 反应结束后，用枪头吸取5μl反应液，加到2%琼脂糖凝胶的上样孔里，85 V电泳30 min，取出凝胶块，在紫外成像系统中观察电泳条带，并拍照记录。确定样品中是否有目的菌的具体标准为：用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有636 bp条带，则说明有鼠伤寒沙门氏菌，若有551 bp条带，则说明有乙型副伤寒沙门氏菌，若有354 bp条带，则说明有伤寒沙门氏菌菌。

具体的实验结果如下图所示：

图2 PMA去除死菌的干扰。（A）PMA处理组合方式；（B）多重PCR检测结果。各组中鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的浓度为106 CFU/mL

通过表2的供试菌株的测试证明，实施本发明的检测方法进行检测具有很好的特异性，有良好的检测效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大学

<120> 同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门

氏菌的方法

<130> 2012

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcgctgaat gaaatcaaca ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagaaaccgt accattaccg tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actcaggctt cccgtaacgc 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttcataca gaccatcttt agttg 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgccaggtta cgccacaaac c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgctgtggta tcaatcgtgc 20

Claims

1.一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于包含下列步骤：

(2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶溶液，使叠氮溴化丙啶PMA的终质量浓度为3 μg/mL，混匀后室温避光培养3-8min，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）所得DNA进行mPCR，体系包含总共10μl反应液，其中，4 μl 制备的模板DNA溶液，2 μl 5×buffer，每条引物的量是15 pmol，1U Taq DNA聚合酶;反应条件是：95℃ 10 min，接着40个循环（94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min），最后 72℃ 延伸10 min；

（4）mPCR 反应结束后，进行目的菌检测分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）混匀后室温避光培养5min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述引物分别为：从5’-3’为

fliC-F:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC

fliC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC

Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGC

Hat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTG

stgA-F:TGCCAGGTTACGCCACAAACC

stgA-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有636 bp条带，则说明有鼠伤寒沙门氏菌，若有551 bp条带，则说明有乙型副伤寒沙门氏菌，若有354 bp条带，则说明有伤寒沙门氏菌菌。