CN102618635B - 鼠伤寒沙门氏菌的特异性fq-pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列；该检测方法包括以下步骤：根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组序列中的保守且特异的STM4483基因序列SEQ ID：1，设计扩增引物对序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及探针序列SEQ ID NO：4。提取样品DNA，FQ-PCR法扩增；通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取结果，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌；采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本底，检测结果特异，结果判定简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽类及其制品安全检验领域的FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列，具体是一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙门氏菌致病的常见血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热；对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，该菌形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。该菌的检测主要依靠传统培养方法(参见国标GB/T4789.4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，虽然结果可靠，但操作复杂，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情蔓延。之后，许多研究学者建立了如荧光抗体技术、免疫磁珠富集法、ELLSA、自动酶联免疫荧光法、免疫组化、显色培养基法、DNA探针技术等检测技术，但在实践中都有不同程度的局限性。FQ-PCR技术具有快速、简便、灵敏等优点，并且由于该法采用引物和探针的“双保险”，因而特异性更强。该技术逐步应用于沙门氏菌的检疫后，对沙门氏菌病诊断和防治工作起到了积极作用，曾先后有学者以沙门氏菌stn、fimY、invA等为靶基因，建立检测沙门氏菌的FQ-PCR方法。但是只针对鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法极少，并且由于检测靶位点的特异性不强，以及假阳性的出现，可对检测结果产生影响，产生判断困难。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法、核酸及引物对有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法
本发明是通过以下的技术方案具体实现的。
利用荧光定量PCR仪检测荧光素的特点，将根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的探针标记为FAM荧光报告基团，经反复试验，优化FQ-PCR反应体系和反应参数，建立了鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO：1设计引物对和探针；所述引物对和探针具体为：上游引物序列如SEQ IDNO：2所示，下游引物序列如SEQ ID NO：3所示，探针序列如SEQ ID NO：4所示。
步骤二，提取样品DNA
步骤三，FQ-PCR检测，其检测体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，5μM探针0.5μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；扩增参数具体为：95℃预变性5min后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；共45个循环(采用三步法，并在退火延伸阶段收集荧光信号)；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。
步骤四，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：通过FQ-PCR仪(BIO-RAD定量PCR仪)自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，检测成本低；并可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具有实用性；本发明检测的靶点具有单一特异性，提供的引物对和探针对不含目的基因的样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。本发明提供的引物对和探针检测DNA和菌液灵敏度分别可达2.5copies/μL和5cfu/μL，说明其具有良好的敏感性。
附图说明
图1为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法特异性评价试验扩增曲线图；
图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法DNA敏感性评价试验扩增曲线图；
图3为实施例4中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法菌液敏感性评价试验扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法的建立
步骤一，设计特异性扩增鼠伤寒沙门氏菌的引物对和探针
通过生物信息学分析，从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中筛选出保守且特异的STM4493基因，将之作为检测鼠伤寒沙门氏菌的靶基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
将STM4493基因DNA序列输入软件primer express3.0中设计引物对和探针，设置GC％范围为40％～60％，产物大小范围为100～300bp，从备选引物对和探针中选择出引物对和探针，引物对和探针序列如下(引物对和探针由上海基康生物技术有限公司合成)
上游引物：5-’CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物：5-’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
探针：5-’CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’(SEQ ID NO：4)
步骤二，DNA模板制备
将鼠伤寒沙门氏菌接菌至10ml的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1ml菌液，放入1.5ml离心管中，12,000r/min离心10min，弃上清液，加入200μL无菌双蒸水重新悬浮菌体，12,000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。用100μL无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
步骤三，FQ-PCR检测方法的建立
FQ-PCR反应体系如下：在定量PCR反应管中依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，5μM探针0.5μL，Taq酶1U，模板溶液1μL，最后用双蒸水补至25μL。将定量PCR反应管离心后，放入荧光定量PCR反应仪中，按照以下FQ-PCR循环参数进行：95℃预变性5min；之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；共45个循环(采用三步法，并在退火延伸阶段收集荧光信号)；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。
步骤四，结果鉴别和判定：
用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
结果：通过FQ-PCR仪自带软件(BIO-RAD的IQ5)分析后可获得Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，说明所建立的FQ-PCR检测方法可以成功检测出鼠伤寒沙门氏菌。
实施例2鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法特异性评价试验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例1步骤二中DNA提取方法，分别提取鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuls)、鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorosis)、鸭沙门氏菌(S.Anatis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、都柏林沙门氏菌(S.Dublin)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、海德尔堡沙门氏菌(S.Heidelberg)、山夫登堡沙门氏菌(S.Senftenberg)、大肠埃希氏菌(Escherichia)的DNA模板。
步骤二，FQ-PCR检测方法特异性评价
按照实施例1步骤三中FQ-PCR反应体系，取步骤一中制备各菌株的DNA模板1μL作为FQ-PCR反应模板分别添加到FQ-PCR反应体系中，空白对照则以1μL的无菌双蒸水为模板；然后按照实施例1步骤三中FQ-PCR循环参数进行扩增反应。
步骤三，结果鉴别和判定：
用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含有鼠伤寒沙门氏菌。
结果：
图1所示为该方法特异性评价试验的检测结果，其血清型及菌株编号请参见表1说明。
| 菌株 | 编号 | 菌数 | 结果 |
| Salmonella Typhimurium | 50115-13 | 1 | + |
| Salmonella choleraesuls | AS1.1190 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi A | ATCC 9150 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi B | CMCC 50004 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi C | CMCC50118 | 1 | - |
| Salmonella Pullorosis | CVCC 1878 | 1 | - |
| Salmonella Anatis | CMCC50774 | 1 | - |
| Salmonella Gallinarum | CMCC 50770 | 1 | - |
| Salmonella Dublin | CMCC 50042 | 1 | - |
| Salmonella Senftenberg | CMCC 50050 | 1 | - |
| Salmonella Heidelberg | CICC 21487 | 1 | - |
| Salmonella Enteritidis | CMCC 50335 | 1 | - |
| Escherichia coil | CMCC 44102 | 1 | - |
表1中：-：FQ-PCR结果为阴性；+：FQ-PCR结果为阳性
从图1及表1中可以看出以鼠伤寒沙门氏菌DNA为模板，可得到Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，而扩增猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鸡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌的DNA及空白对照均未得到Ct＜35且呈对数增长的特异性的扩增曲线。以上结果说明引物对和探针的特异性良好，建立的FQ-PCR方法可特异性的检测出鼠伤寒沙门氏菌。
实施例3鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法DNA敏感性评价试验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例1步骤二中DNA提取方法，提取鼠伤寒沙门氏菌DNA模板。经测定，鼠伤寒沙门氏菌总DNA溶液的浓度为2.5×1010copies/μL，用无菌水做10倍梯度稀释，稀释至2.5×10-1copies/μL，共稀释12个梯度备用。
步骤二，DNA敏感性评价试验
取DNA溶液浓度分别为2.5×103copies/μL、2.5×102copies/μL、2.5×101copies/μL、2.5×100copies/μL、2.5×10-1copies/μL的模板溶液各1μL作为反应模板加入同实施例1步骤三中FQ-PCR的反应体系，并按照实施例1步骤三中FQ-PCR循环参数进行扩增反应。
步骤三，结果鉴别和判定：
用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明该方法可检测出样品中含有的鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明该方法不能检测出样品中含有的鼠伤寒沙门氏菌。
结果：图2中扩增曲线1～5对应的DNA浓度分别为：1.2.5×103copies/μL；2.2.5×102copies/μL；3.2.5×101copies/μL；4.2.5×100copies/μL；5.2.5×10-1copies/μL，如图2中所示，扩增模板浓度为2.5×103copies/μL、2.5×102copies/μL、2.5×101copies/μL、2.5copies/μL的DNA均可得到Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线。而扩增模板浓度为2.5×10-1copies/μL的DNA未得到Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线。因此，判定建立的FQ-PCR检测方法检测DNA灵敏度为2.5copies/μL，具有较高的敏感性。
实施例4鼠伤寒沙门氏菌特异性FQ-PCR检测方法菌液敏感性评价试验
步骤一，DNA模板的制备
经测定，鼠伤寒沙门氏菌菌液浓度为5.0×1010cfu/μL。按照实施例1步骤二中DNA提取方法，提取鼠伤寒沙门氏菌DNA模板。用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释12个梯度备用。
步骤二，菌液敏感性评价试验
取菌液浓度分别为：5.0×103cfu/μL、5.0×102cfu/μL、5.0×101cfu/μL、5.0×100cfu/μ、5.0×10-1cfu/μL的模板溶液各1μL作为反应模板加入同实施例1步骤三中FQ-PCR的反应体系，后按照实施例1步骤三中FQ-PCR循环参数进行扩增反应，用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，获得扩增曲线。
步骤三，结果鉴别和判定：
FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明该方法可检测出样品中含有的鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明该方法不能检测出样品中含有的鼠伤寒沙门氏菌。
结果：图3中扩增曲线1～5对应的菌液浓度分别为：1.5.0×103cfu/μL；2.5.0×102cfu/μL；3.5.0×101cfu/μL；4.5.0×100cfu/μL；5.5.0×10-1cfu/μL。如图3中所示，扩增模板浓度为5.0×103cfu/μL、5.0×102cfu/μL、5.0×101cfu/μL、5.0cfu/μL的菌液均可得到Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，而扩增模板浓度为5.0×10-1cfu/μL的菌液未得到Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线。因此，判定建立的FQ-PCR检测方法检测菌液灵敏度为5cfu/μL，具有较高的灵敏度。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种非诊断和治疗目的的鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，筛选出鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA中的保守且特异性的STM4493基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO：1定义，并根据其序列设计扩增引物对和探针；引物对和探针序列如下：
上游引物：5-’CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物：5-’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
探针：5-’CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’(SEQ ID NO：4)
步骤二，提取样品DNA；
步骤三，对样品DNA进行FQ-PCR检测；FQ-PCR反应体系如下：依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，5μM探针0.5μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；扩增参数具体为：95℃预变性5min；之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；共45个循环；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束；
步骤四，通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
2.用于权利要求1所述的特异性FQ-PCR检测方法中的扩增引物对和探针；引物对和探针序列如下：
上游引物：5-’CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物：5-’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
探针：5-’CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’(SEQ ID NO：4)。
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Granted publication date: 20140702 |