CN104531885B - 维氏气单胞菌快速检测引物、试剂盒及应用 - Google Patents

维氏气单胞菌快速检测引物、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了维氏气单胞菌快速检测引物、试剂盒及应用，维氏气单胞菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。本发明的方法检测维氏气单胞菌周期短、检测成本低、实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错。特异性好。采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，不经过细菌培养，仅需取少量鱼类血液等样品即可进行检测。

Description

维氏气单胞菌快速检测引物、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种维氏气单胞菌快速检测引物、试剂盒及应用，属于水产病原菌快速检测领域。
背景技术
维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)也称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌，是一类革兰氏阴性杆菌。是近年来发现和鉴定的一种气单胞菌。维氏气单胞菌是一种人畜共患的条件致病菌，近年来在淡水养殖鱼类中，如鲶、鲤、锦鲤、中华鳖、河蟹等有受维氏气单胞菌感染的报道，给养殖户带来了巨大的经济损失。目前对于鱼类维氏气单胞菌的检测，主要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技术，细菌分离鉴定耗时长，成本高，多以杀死水产动物为前提，操作复杂，需要专业的仪器设备和技术人员，养殖生产中急需一种能够应用于养殖现场的、快速准确、操作简便的维氏气单胞菌检测技术及其产品。
LAMP技术是由Notomi等于2000年首次建立的体外链置换核酸扩增的方法，近年来被广泛研究、应用。它利用靶序列上6个关联区域设计的4条特异引物和1种高活性链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)，在等温条件(60～65℃)放置30～60min即可完成核酸扩增反应，反应液中加入核酸染料SYBR Green I或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。该技术具有快速高效、灵敏度高、特异性强、产物易检测、操作简单等优点。目前尚未有关于维氏气单胞菌LAMP检测技术的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种维氏气单胞菌快速检测引物。
本发明的第二个目的是提供能应用于现场检测的一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒。
本发明的第三个目的是提供检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，对鱼体损伤小的、操作简便不易出错的一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒的应用。
本发明的技术方案概述如下：
维氏气单胞菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。
一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒，包括：
(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0；
(2)Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；
(3)LAMP反应液，24μl LAMP反应液的组成为：2.5μl 10×反应缓冲液；3μl浓度为2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物，1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物；1μl钙黄绿素与锰离子形成的配合物、13.5μl DEPC水；
(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取维氏气单胞菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次3～5min，充分干燥；
(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤2次，每次3～5min，充分干燥；
(6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。
上述一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)取待检鱼脾、鱼肾或鱼肝加入盛有200μlTE缓冲液的采集管中，研磨棒研磨至浆状；
(2)用吸管吸取步骤(1)获得的浆状物或鱼血液或维氏气单胞菌液，将FTA膜片充分润湿后室温干燥；放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次3～5min，充分干燥；
(3)将步骤(2)获得的膜片和一个阳性对照膜片、一个阴性对照膜片分别放入盛有24μl LAMP反应液的检测管中，每个检测管中分别加入1μl BstDNA聚合酶，混匀，置于60-65℃条件下保温40～60min，得到检测液、阳性对照和阴性对照；
(4)阴性对照呈橙色，阳性对照呈绿色，根据检测液颜色判断是否含有维氏气单胞菌。
本发明的优点：
(1)本发明解决了现有技术检测维氏气单胞菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错。
(2)本发明依据维氏气单胞菌基因所设计的扩增引物能有效检测维氏气单胞菌，具有很好的特异性和准确性。
(3)采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。
(4)基于对取样方法的改进，不经过细菌培养，仅需取少量鱼类血液等样品即可进行检测，实现了微创取样，尤其适用于经济价值较高的鱼类。
附图说明
图1为维氏气单胞菌快速检测试剂盒检测结果示意图。
图2为维氏气单胞菌快速检测试剂盒实际应用检测结果图。
图3为维氏气单胞菌快速检测试剂盒灵敏性检测结果图。
图4为维氏气单胞菌快速检测试剂盒特异性检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，下面的实施例并不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内。
本发明所用仪器及试剂：
电热恒温水浴锅购自北京三二八科学仪器有限公司；BstDNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTP购自NEB公司；引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4均由上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris购自上海生工生物工程有限公司；钙黄绿素购自SIGMA公司；FTA膜片购自通用电气医疗公司(GE healthcare)；EDTA、硫酸锰为国产分析纯。
钙黄绿素与锰离子形成的配合物配比为0.05mmol/L钙黄绿素和0.6mmol/L锰离子。
维氏气单胞菌基因组DNA采用商业化的DNA抽提试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)从纯培养的维氏气单胞菌菌液中提取。(维氏气单胞菌是从患病剑尾鱼脾脏、肾脏中提取，经形态学、生化特性分析及以16S rDNA为遗传标记的系统发育分析鉴定为维氏气单胞菌)
本发明可用于检测鱼血液、鱼肝脏、鱼肾脏组织是否感染维氏气单胞菌，也可用于检测水体中是否含有维氏气单胞菌或某菌液是否为维氏气单胞菌。
实施例1
维氏气单胞菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。
实施例2
维氏气单胞菌快速检测试剂盒，包括：
(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0；
(2)Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；
(3)LAMP反应液，24μl LAMP反应液的组成为：2.5μl 10×反应缓冲液；3μl浓度为2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物，1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物；1μl钙黄绿素与锰离子形成的配合物；13.5μl DEPC水；
(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取维氏气单胞菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次4min，充分干燥；
(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤2次，每次4min，充分干燥；
(6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。
实施例3
维氏气单胞菌快速检测试剂盒，包括：
(1)-(3)同实施例2的(1)-(3)；
(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取维氏气单胞菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次3min，充分干燥；
(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤2次，每次3min，充分干燥；
(6)同实施例2的(6)。
实施例4
维氏气单胞菌快速检测试剂盒，包括：
(1)-(3)同实施例2的(1)-(3)；
(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取维氏气单胞菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次5min，充分干燥；
(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤2次，每次5min，充分干燥；
(6)同实施例2的(6)。
实施例5
维氏气单胞菌快速检测试剂盒检测方法的建立
(1)模板制备：采用DNA提取试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)提取的纯培养的维氏气单胞菌基因组DNA，作为阳性对照液，以纯培养的维氏气单胞菌菌液，作为检测样品，测试所建立检测方法的可行性。
(2)引物设计合成
采用BLAST软件分析维氏气单胞菌基因(AB290200.1)序列，筛选出维氏气单胞菌Aeromonasveronii基因的核酸序列，根据LAMP技术引物设计原则，针对该片段设计出LAMP引物并合成，所用引物如下：
(3)检测过程
①检测膜片，用下述方法制成：吸取维氏气单胞菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次4min，充分干燥；
阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤2次，每次4min，充分干燥；
②将阴性对照膜片、检测膜片分别放入盛有24μl LAMP反应液的反应管中，另取1μl步骤(1)所述阳性对照液放入盛有23μl LAMP反应液的反应管中，再分别加入1μl BstDNA聚合酶，置于65℃条件下保温50min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
23μl LAMP反应液与24μl LAMP反应液的组成比，少1μl DEPC水；
③观察反应管中液体的颜色，阴性对照呈橙色，阳性对照呈绿色，根据检测液颜色判断是否含有维氏气单胞菌。结果见图1(图1中1为维氏气单胞菌菌液检测结果，反应液呈明显的绿色；2为阳性对照，反应液呈明显的绿色；3为阴性对照，反应液呈橙色)。
(4)LAMP反应条件及优化
设定反应管中引物混合液外引物与内引物浓度比分别为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，反应时间从20min、25min、30min、40min、50min、60min，反应温度为54℃、57℃、60℃、63℃、65℃、68℃，选择最佳反应参数建立完善的LAMP检测技术。最终确定的反应参数如下：
外引物与内引物的浓度比为1:8，即外引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2浓度为5μmol/L，内引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物浓度为40μmol/L，将反应管置于60-65℃保温40-60min，得到检测液，直接观察检测液颜色，判定反应结果为阳性或者阴性。
实施例6.一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)在无菌条件下抽取待检鱼血液100μl，将FTA膜片充分润湿后室温干燥；放入盛有200μl TE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次4min，充分干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜片和一个阳性对照膜片、一个阴性对照膜片分别放入盛有24μl LAMP反应液的检测管中，每个检测管中分别加入1μl Bst DNA聚合酶，混匀，置于65℃条件下保温60min，得到检测液、阳性对照和阴性对照；
(3)取出检测管，直接观察检测管内液体颜色呈绿色，判断是含有维氏气单胞菌。
实施例7.一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)在无菌条件下，分别取待检样品组织：健康鱼肝脏100mg，人工感染维氏气单胞菌后发病的鱼肝脏100mg，健康鱼肾脏100mg，人工感染维氏气单胞菌后发病的鱼肾脏100mg，健康鱼脾脏100mg，人工感染维氏气单胞菌后发病的鱼脾脏100mg，分别加入盛有200μlTE缓冲液的采集管中，研磨棒研磨至浆状；
(2)用吸管吸取步骤(1)获得的浆状物，将FTA膜片分别充分润湿后室温干燥；放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤2次，每次5min，充分干燥；
(3)将步骤(2)获得的膜片和一个阳性对照膜片、一个阴性对照膜片分别放入盛有24μl LAMP反应液的检测管中，每个检测管中分别加入1μl Bst DNA聚合酶，混匀，置于60℃条件下保温40min，得到检测液、阳性对照和阴性对照；
(4)取出检测管，直接观察检测管内液体颜色，健康鱼的肝脏、肾脏和脾脏的检测管内液体呈橙色，人工感染维氏气单胞菌后发病的鱼的肝脏、肾脏和脾脏的检测管内液体呈绿色，判断后三者是含有维氏气单胞菌。阴性对照，呈橙色；阳性对照，呈绿色。
实施例8.一种维氏气单胞菌快速检测试剂盒检测方法的建立，包括如下步骤：
(1)将1μl维氏气单胞菌菌液，1μl,维氏气单胞菌DNA(阳性对照)和1μl DEPC水分别加入盛有23μl LAMP反应液的检测管中，每个检测管中分别加入1μl BstDNA聚合酶，混匀，置于65℃条件下保温60min，得到检测液、阳性对照和阴性对照；
23μl LAMP反应液与24μl LAMP反应液的组成比，少1μl DEPC水；
(2)取出检测管，直接观察检测管内液体颜色呈绿色，判断是含有维氏气单胞菌。
结果见图2。1为阳性对照，呈绿色；2为纯培养的菌液，呈绿色；3为阴性对照，呈橙色。
实施例9 维氏气单胞菌快速检测试剂盒的检测灵敏度测定
将纯培养的维氏气单胞菌接入普通营养肉汤液体培养基中培养24h后，以无菌生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度为3×108cfu/ml，10倍比梯度稀释，取稀释好的菌液按照实施例8所述方法，检测梯度稀释的维氏气单胞菌菌液。结果如图3所示，样品1为阴性对照(呈橙色)，2-9作为模板的维氏气单胞菌菌液浓度分别为3×101cfu/ml(呈橙色)、3×102cfu/ml(呈绿色)、3×103cfu/ml(呈绿色)、3×104cfu/ml(呈绿色)、3×105cfu/ml(呈绿色)、3×106cfu/ml(呈绿色)、3×107cfu/ml(呈绿色)、3×108cfu/ml(呈绿色)。结果显示3×102cfu/ml以上浓度的菌液，均呈现绿色，表明该试剂盒对维氏气单胞菌的最低检测浓度为3×102cfu/ml。
实施例10.维氏气单胞菌快速检测试剂盒的检测特异性测试
分别取纯培养并鉴定后的维氏气单胞菌、海豚链球菌、柱状黄杆菌、哈维氏弧菌、诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌菌液，按照实施例8所述方法检测以上样品。检测结果见图4，样品1-8分别为阴性对照(呈橙色)、海豚链球菌(呈橙色)、柱状黄杆菌(呈橙色)、哈维氏弧菌(呈橙色)、诺卡氏菌(呈橙色)、美人鱼发光杆菌(呈橙色)、维氏气单胞菌(呈绿色)、阳性对照(呈绿色)。样品7维氏气单胞菌及样品8阳性对照为阳性，阴性对照及其它菌检测结果均为阴性，证实该试剂盒具有较好的检测特异性。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (1)

1.维氏气单胞菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。
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