CN104726614A - 牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法，本发明检测引物包括一对外引物和一对内引物，外引物为F3：5′-GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3′、B3：5′-GCTGTACACGGTCTCGGAG-3′，内引物为FIP：5′-TGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3′、BIP：5′-ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3′，本发明还针对该检测引物设计了试剂盒及环介导等温扩增检测方法。本发明快速检测引物特异性好，检测方法快速、简便、准确、廉价，尤其适合基层临床兽医使用。
Description
技术领域
本发明属于动物检验检疫领域，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法，尤其适合基层临床兽医使用。
背景技术
近年来，随着奶牛养殖数量的增加和养殖密度的增大，牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）的发病日益增多。IBR是牛的一种急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织列为B类动物传染病，该病由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRv）引起，病牛临床表现为上呼吸道及气管粘膜发炎、呼吸困难、流鼻液、生殖道感染、流产、乳房炎和脑膜炎等。报道显示我国多数地区均有IBR阳性病例检出的报道，给我国奶牛业造成严重危害和损失。
同时，我国还规定，进出口牛及其肉制品必须检测IBRv，也促使其检测方法迅速发展，目前，已经研究开发了多种诊断方法，主要有病原学方法和血清学方法。血清学方法主要包括血清中和试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，可用于IBRv抗体检测，但往往操作繁琐，且无法检测病原，对体内潜伏感染检测困难。病原学检测技术主要包括病毒分离鉴定、核酸检测（PCR、qPCR和核酸探针技术），尽管该方法可以对病毒直接进行检测，但是往往需要的一定的实验设备和技术要求，在兽医临床基层实验室推广有一定限制。
发明内容
针对上述问题，本发明采用环介导等温扩增技术（LAMP），提供了一种特异性好的牛传染性鼻气管炎病毒检测引物、试剂盒及一种快速、简便、准确、廉价的检测方法，尤其适合基层临床兽医使用。
本发明通过以下技术方案实现：
设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测引物，包括一对外引物和一对内引物：
外引物为
F3：5′-GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3′
B3：5′-GCTGTACACGGTCTCGGAG-3′，
内引物为
FIP：5′-TGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3′
BIP：5′-ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3′。
本发明还设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，包括扩增反应体系，由以下含量的原料组成：
2×LAMP Mix 10μL，
FIP终浓度 0.8μmol/L，
BIP终浓度 0.8μmol/L，
F3终浓度 0.2μmol/L，
B3终浓度 0.2μmol/L，
25mmol/L的MgCl2 3μL，
8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，
LAMP 可见光染料1μL，余量为蒸馏水，补充至19μL。
对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，所述LAMP 可见光染料为3mmol/L的羟基萘酚蓝。
本发明还设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待检测组织中的病毒基因组DNA；
（2）将所得基因组DNA定量加入上述扩增反应体系；
（3）LAMP扩增反应：将体系中各反应物混合均匀，置于60℃条件下扩增反应2小时，再在80℃灭活10分钟；
（4）检测结果：直接观察，如果颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊，则表明发生了LAMP扩增，即待检测组织中携带牛传染性鼻气管炎病毒；否则待检测组织中不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，所述待检测组织为牛机体组织、鼻腔分泌物、阴道分泌物、气管分泌物、肺脏分泌物或子宫分泌物。。
对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，所述步骤（1）采用市售病毒DNA抽提试剂盒提取。
对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，步骤（2）所述基因组DNA定量为1.5μL，净含量为1～100ng。
本发明的积极有益效果：
本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出特异性强的LAMP引物，建立了牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP快速检测体系及方法，为基层临床兽医提供了快速、简便、准确、廉价的IBRv病原检测保障，填补了IBRV恒温扩增检测技术的空白。
具体实施方式
以下以具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。
实施例一
本发明根据IBRV毒力基因gE序列，综合考量了其保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，设计出了LAMP引物并合成，该牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测引物包括一对外引物和一对内引物，外引物为F3：5′-GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3′、B3：5′-GCTGTACACGGTCTCGGAG-3′，内引物为FIP：5′-ATGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3′、BIP：5′-ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3′。
实施例二
一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，包括扩增反应体系，由以下原料组成：
2×LAMP Mix 10μL，
FIP终浓度 0.8μmol/L，
BIP终浓度 0.8μmol/L，
F3终浓度 0.2μmol/L，
B3终浓度 0.2μmol/L，
25mmol/L的MgCl2 3μL，
8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，
LAMP 可见光染料1μL（3mmol/L的羟基萘酚蓝），余量为蒸馏水，补充至19μL。
实施例三
一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，包括以下步骤：
（1）选用商品化的病毒DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），提取待检测组织中的病毒基因组DNA；
（2）将所得基因组DNA1μL（净含1ng）加入扩增反应体系：2×LAMP Mix 10μL，FIP终浓度0.8μmol/L，BIP终浓度0.8μmol/L，F3终浓度0.2μmol/L，B3终浓度0.2μmol/L，25mmol/L的MgCl2 3μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，LAMP 可见光染料（羟基萘酚蓝，3mmol/L）1μL，补足蒸馏水到20μL；
（3）LAMP扩增反应：混匀体系中各反应物，置于60℃反应2小时，再在80℃灭活10分钟；
（4）检测结果：直接观察，如果待检测组织携带牛传染性鼻气管炎病毒，则会发生LAMP扩增，颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊；否则就不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
实施例四
一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测方法，包括以下步骤：
（1）选用商品化的病毒DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），提取待检测组织中的病毒基因组DNA；
（2）将所得基因组DNA1μL（净含100ng）加入扩增反应体系：2×LAMP Mix 10μL，FIP终浓度0.8μmol/L，BIP终浓度0.8μmol/L，F3终浓度0.2μmol/L，B3终浓度0.2μmol/L，25mmol/L的MgCl2 3μL， 8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，LAMP 可见光染料（羟基萘酚蓝，3mmol/L）1μL，补足蒸馏水到20μL；
（3）LAMP扩增反应：混匀体系中各反应物，置于60℃反应2小时，再在80℃灭活10分钟；
（4）检测结果：直接观察，如果待检测组织携带牛传染性鼻气管炎病毒，则会发生LAMP扩增，颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊；否则就不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
实施例五
提取待检测组织中的病毒基因组DNA可采用以下步骤：
1）对于机体组织样品：将离体组织在灭菌研磨器内剪碎，研磨，用1640细胞生长液制成5倍稀释悬浮液，-40℃反复冻融3次。经8000r/min离心30min。剩余操作按步骤（2）进行；或按下述方法进行：取445μL上清液，加入10%SDS 50μL，蛋白酶K（20mg/mL）12.5μL，混匀后于56℃保温1h，间隔10min摇晃一次。加入等体积的酚，振荡混匀，12000rpm 离心 5min ，将上层水相移入另一离心管中。加入等体积酚：氯仿，振荡混匀，12000rpm 离心 5min，将上层水相移入另一新离心管中。加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min，将上层水相移入另一新离心管中。加入1/10 体积的 3mol/L NaAC，2倍体积的预冷无水乙醇，冰水浴中放置，2h以上，4℃，12000rpm离心30min，弃去上清。 用70% 冷乙醇洗沉淀 2 次，自然干燥，以 30μL含 RNA 酶（ 20 μg/mL）的 TE 溶解核酸；
对于液体病毒样品：在1.5mL离心管中加入0.1～0.2mL液体病毒样品。如果病毒需要富集，可将1.5mL液体在4℃ 24000rpm冷冻离心60min，移弃1.3mL后剩下的0.2mL用于步骤2）处理；
对于分泌物样品：用1个棉拭子蘸取，再将棉拭子放入离心管中，加入1mL生理盐水，振荡器上充分震荡30s，然后转移0.2mL到1.5mL离心管中，用于步骤（2）处理；
2）加入0.6mL溶液A到第一步得到的0.2mL样品中，震荡30 s混匀后室温放置10min；
3）短暂离心后将500μL溶液转移到吸附柱中，室温放置2min；
4)12000rpm室温离心1min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管中；
5）将剩余溶液短暂离心后全部转移到步骤3）的吸附柱中，室温放置2min；
6）12000rpm 室温离心1min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管中；
7）加入0.7mL通用洗柱液到吸附柱中，12000 rpm 室温离心1min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管中；
8）12000 rpm室温离心1min，弃含穿透液的离心管；
9）将吸附柱套入到一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱的滤膜的中部加入30～100μL洗脱液，然后室温放置2 min；
10）12000rpm室温离心1min，管底溶液即DNA溶液，可立即使用或放-20℃冰箱长期保存。
本发明引物的相关鉴定试验：
（1）敏感性试验：将传染性鼻气管炎病毒gE 基因部分片段（225bp）插入质粒pUC57中，通过10倍比稀释，制成浓度分别为1.68×109～1.68×100拷贝/μL的质粒模板，利用本发明实施例3检测方法对上述质粒模板进行检测。结果显示，该方法检测下限可达1.68×104拷贝/μL，敏感性较高。
（2）特异性试验：利用本发明实施例3分别对牛传染性鼻气管炎病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、猪流感病毒、链球菌、魏氏梭菌等进行检测，结果显示只有牛传染性鼻气管炎病毒呈现阳性反应，其余均为阴性。
本发明并不局限于上述具体实施方式，本领域技术人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或者类似的变化都应涵盖在本发明权利要求的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南牧业经济学院
<120> 牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgcgtctgc agtctgag 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgtacacg gtctcggag 19
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcggatgag cgcgcagtct ttttcgacga ggctccct 38
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgagacgtg catcttccac cgtacggcga cgcgaag 37
Claims (7)
1.一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物，其特征在于，包括一对外引物和一对内引物：
外引物为：
F3：5′-GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3′
B3：5′-GCTGTACACGGTCTCGGAG-3′，
内引物为：
FIP：5′-TGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3′
BIP：5′-ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3′。
2.一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括扩增反应体系，由以下含量的原料组成：
2×LAMP Mix 10μL，
FIP终浓度 0.8μmol/L，
BIP终浓度 0.8μmol/L，
F3终浓度 0.2μmol/L，
B3终浓度 0.2μmol/L，
25mmol/L的MgCl2 3μL，
8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，
LAMP 可见光染料1μL，余量为蒸馏水，补充至19μL。
3.根据权利要求2所述牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP 可见光染料为3mmol/L的羟基萘酚蓝。
4.一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待检测组织中的病毒基因组DNA；
（2）将所得基因组DNA定量加入权利要求2所述扩增反应体系；
（3）LAMP扩增反应：将体系中各反应物混合均匀，置于60℃条件下扩增反应2小时，再在80℃灭活10分钟；
（4）检测结果：直接观察，如果颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊，则表明发生了LAMP扩增，即待检测组织中携带牛传染性鼻气管炎病毒；否则待检测组织中不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
5.对于权利要求4所述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其特征在于：所述待检测组织为牛的机体组织、鼻腔分泌物、阴道分泌物、气管分泌物、肺脏分泌物或子宫分泌物。
6.根据权利要求4所述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）采用市售病毒DNA抽提试剂盒提取。
7.根据权利要求4所述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述基因组DNA定量为1.0μL，净含量为1～100ng。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150624 |