CN108950085A - 一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，该引物组的特异性强，敏感性高。本发明还公开了一种猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）合成上述的用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组；（2）提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；（3）电泳分析PCR扩增产物。该多重PCR检测方法简便、快速、经济、高效，可以大大节约检测时间，提高检测效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强。即便在pH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。常见的PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。因此现有的PCV检测主要集中在PCV1和PCV2。2016年美国首次从流产胎儿体内鉴定出PCV3（Palinski R, Pineyro P, Shang P, et al.A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses IsAssociated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and ReproductiveFailure [J]. J Virol, 2016, 91(1): 1879-16）。我国已有13个省猪场存在PCV3的感染与流行（Ku X, Chen F, Li P, et al. Identification and genetic characterizationof porcine circovirus type 3 in China [J]. Tranbound Emerg Dis, 2017, 64(3):703-708），PCV3是引起母猪流产的新型病原之一。猪伪狂犬病(Pseudorabies, PR) 是由伪狂犬病毒( Pseudorabies Virus, PRV)感染引起的一种以母猪流产为主要特征的烈性传染病。PRV属于疱疹病毒科，疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型，病毒例子直径为110-120nm，基因组为线状双链DNA，大小约150kb。PRV保存的最适PH为6-8，100℃可以存活1分钟。由于PCV3和PRV野毒感染在临床中感染猪以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。因此，建立一种能够快速区分PCV3型和PRV的多重PCR检测方法和试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测猪圆环病毒3型（PCV3）和猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）的引物组和试剂盒及其检测方法。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，其中，
所述用于检测猪圆环病毒3型的引物的核苷酸序列为：
上游引物L1：5ˊ-TAGTATTACCCGGCACCTCGGA -3ˊ（SEQ ID NO.1），
下游引物L2：5ˊ-GAACCCTCAGAGGGTACCTGT -3ˊ（SEQ ID NO.2）；
所述用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物的核苷酸序列为：
上游引物L3：5ˊ-ATGCGGCCCTTTCTGCTG -3ˊ（SEQ ID NO.3），
下游引物L4：5ˊ-GCAGGACGCTCAGGTGCG -3ˊ（SEQ ID NO.4）。
上述用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组能够用于制备检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株的试剂。
本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒的成分组成包括：DNA提取试剂、PCR扩增试剂；其中，所述PCR扩增试剂包括：PCR扩增缓冲液、dNTP、上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水；所述上游引物L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述上游引物L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物L4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的成分组成还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪圆环病毒3型的基因组DNA和猪伪狂犬病毒野毒株的基因组DNA；所述阴性对照为无菌双蒸水。
上述的试剂盒可以用于检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株。
本发明还提供了一种猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）引物合成：合成上述的用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组；
（2）PCR扩增：提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；
（3）分析PCR扩增产物：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（琼脂糖凝胶电泳的电压为100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果）。
根据上述的多重PCR检测方法，优选地，步骤（2）中所述PCR扩增反应的反应体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/L的dNTP 4.0μl，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4各1.0μl， DNA 模板3.0μl，5U/μl 的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl；其中，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3和下游引物L4的浓度（初始浓度）均为25pmol/L。
根据上述的多重PCR检测方法，优选地，步骤（2）中所述PCR扩增反应反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 2min，共33个循环；72℃ 10min。
本发明取得的积极有益效果：
（1）本发明根据GenBank中收录的猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的序列，通过比对PCV3和PRV野毒之间的差异，设计了检测PCV3和PRV野毒的特异性引物组，与现有技术相比，本发明的引物组具有很强的敏感性，对PCV3和PRV野毒的最低检测量分别为1.0×10- 7ng/μL和1.2ng/ml。
（2）本发明设计的用于检测PCV3和PRV野毒的引物组的特异性强，对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒均为阴性；该引物组的重复性好，对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达95%以上。
（3）本发明猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法不仅具有单个PCR的特异性、敏感性、准确性，而且检测结果准确，可以在一个反应体系里能同时检测出猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株两种病毒，简便、快速、经济、高效，省时省力，使原来需要做两次PCR和两次电泳的检测，现在一次就可以完成，大大缩短了检测时间，提高检测效率，而且还大大节约了检测成本，特别适用于临床的大量检测，在临床诊断上具有很好的应用前景。
附图说明
图1为以PCV3的DNA为模板进行引物浓度优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-4对应的引物加入量分别为0μL、0.2μL、0.5μL、1.0μL；
图2为以PRV野毒的DNA为模板进行引物浓度优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-4对应的引物加入量分别为0μL、0.2μL、0.5μL、1.0μL；
图3为以PCV3的DNA为模板进行退火温度优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-10对应的退火温度分别为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；
图4为以PRV野毒的DNA为模板进行退火温度优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-7对应的退火温度分别为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃；
图5为以PCV3的DNA为模板进行PCR扩增循环次数优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-5对应的PCR循环次数分别为28、29、30、31、32；
图6为以PRV野毒的DNA为模板进行PCR扩增循环次数优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-5对应的PCR循环次数分别为29、30、31、32、33；
图7为PCV3扩增引物的优化；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-9对应的退火温度分别为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃；
图8为PCV3扩增引物的优化；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-10对应的退火温度分别为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；
图9为PRV野毒扩增引物的优化；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-9对应的退火温度分别为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃；
图10为PRV野毒扩增引物的优化；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-8对应的退火温度分别为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃；
图11为本发明多重PCR检测方法对PCV3、PRV野毒、PCV3+ PRV野毒混合的电泳检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1为PCV3，泳道2为PRV野毒；泳道3为PCV3+ PRV野毒混合；
图12为本发明多重PCR检测方法的特异性检验结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-10分别为PCV3、PRV野毒、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒；
图13为本发明多重PCR检测方法对PCV3的敏感性检验结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-6对应PCV3的DNA模板浓度分别为1×10-4ng/μl、1×10-5ng/μl、1×10-6ng/μl、1×10-7ng/μl、1×10-8ng/μl；
图14为本发明多重PCR检测方法对PRV野毒的敏感性检验结果；其中，M为DL2000marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-6对应PRV野毒的DNA模板浓度分别为1.2×104ng/ml、1.2×103ng/ml、1.2×102ng/ml、1.2×101ng/ml、1.2ng/ml、1.2×10-1ng/ml；
图15为本发明多重PCR检测方法对临床样本的检测结果；其中，M为DL2000 marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-7为部分临床样品。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明。若未特别指明，实施例中所用的材料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。
材料来源：
猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株阳性病料均为河南省农业科学院畜牧兽医研究所保存；公众可以从河南省农业科学院畜牧兽医研究所获得。
实施例1：猪圆环病毒3型（PCV3）和猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）的多重PCR检测方法的构建
1、用于检测猪圆环病毒3型（PCV3）和猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）引物组的设计与合成
（1）用于检测猪圆环病毒3型（PCV3）的引物设计与合成：
根据NCBI公布的PCV3基因序列的差异，根据PCV3（GenBank登录号为HM143844.1）采用primer premier5.0软件进行引物设计（引物设计条件为：引物长度控制在30个碱基以内，GC含量为37%-46%，Tm值为58-63；在引物设计时，将引物之间的GC含量差距控制在10%以内，以方便进行有效的扩增；另外，本引物设计避免了连续5个以上的类似的碱基出现，避免了由于引物自身的原因而出现PCR扩增失败的情况），设计了用于检测PCV3的上游引物L1和下游引物L2，使用上游引物L1、下游引物L2进行PCR扩增，PCR产物大小预计为916bp。其中，上游引物L1的核苷酸序列为：5ˊ- TAGTATTACCCGGCACCTCGGA-3ˊ（SEQ ID NO.1），下游引物L2的核苷酸序列为：5ˊ- GAACCCTCAGAGGGTACCTGT-3ˊ（SEQ ID NO.2）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
（2）用于检测猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）的引物设计与合成：
根据NCBI公布的猪伪狂犬病毒野毒株基因序列的差异，根据猪伪狂犬病毒野毒株（GenBank登录号为BH001744）采用primer premier5.0软件进行引物设计（引物设计条件为：引物长度控制在30个碱基以内，GC含量为55%-58%，Tm值为56-59；在引物设计时，将引物之间的GC含量差距控制在10%以内，以方便进行有效的扩增；另外，本引物设计避免了连续5个以上的类似的碱基出现，避免了由于引物自身的原因而出现PCR扩增失败的情况），设计了用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的上游引物L3和下游引物L4，使用上游引物L3、下游引物L4进行PCR扩增，PCR产物大小估计为544bp。其中，上游引物L3的核苷酸序列为：5ˊ-ATGCGGCCCTTTCTGCTG-3ˊ（SEQ ID NO.3），下游引物L4的核苷酸序列为：5ˊ-GCAGGACGCTCAGGTGCG-3ˊ（SEQ ID NO.4）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2、病毒DNA的提取
分别提取PCV3、PRV野毒的DNA。
以PCV3为例，其DNA提取的具体操作方法为：
（1）取猪圆环病毒细胞培养裂解液，反复冻融3次后，13000rpm离心15min；
（2）取上清500μL加入到1.5mL细心管中，加入50μg/ml的蛋白酶K 5μL，加入质量分数10%的SDS溶液25μL，55℃水浴2-3h；
（3）加入200μL Tris饱和酚，充分混匀，13000rpm离心15min；
（4）取上清加入到一个新离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200μL，充分混匀后，13000rpm离心15min；
（5）取上清到一个新的离心管中，加入200μL氯仿，充分混匀，13000rpm离心15min；
（6）取上清到一个新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，13000rpm离心15min，弃上清；
（7）加入体积分数70%的乙醇冲洗沉淀表面和管壁，弃乙醇，晾干；
（8）加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，即得DNA，-20℃保存备用。
PRV野毒的DNA提取方法与PCV3相同，在此不再赘述。
3、多重PCR扩增反应条件的优化
（1）引物浓度优化：
1）、以PCV3的DNA为模板，对上游引物L1、下游引物L2浓度的优化：
以PCV3的DNA为模板，以上游引物L1、下游引物L2为引物进行PCR扩增反应，对PCR反应体系中的引物的浓度进行优化（将浓度为25pmol/μl的上游引物L1和下游引物L2的添加量分别设定为0、0.2、0.5、1.0μL）；具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L1、下游引物L2，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，共35个循环；72℃ 10min。对不同引物浓度的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图1。由图1可知，引物添加量为0.5μL和1.0μL时均可扩增出目的条带（916bp），而且引物添加量为1.0μL时条带更亮，因此，为了避免条带含量低而造成的假阴性，上游引物L1、下游引物L2添加量选择1.0μL。
2）、以PRV野毒的DNA为模板，对上游引物L3、下游引物L4浓度的优化：
以PRV野毒的DNA为模板，以上游引物L3、下游引物L4为引物进行PCR扩增反应，对PCR反应体系中的引物的浓度进行优化（将浓度为25pmol/μl的上游引物L3和下游引物L4的添加量分别设定为0、0.2、0.5、1.0μL）；具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L3、下游引物L4，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 2min，共35个循环；72℃ 10min。对不同引物浓度的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图2。由图2可知，引物添加量为0.2μL、0.5μL和1.0μL时均可扩增出目的条带（544bp），而且引物添加量为1.0μL时条带更亮，因此，为了避免条带含量低而造成的假阴性，上游引物L3、下游引物L4添加量选择1.0μL。
由于上游引物L1、下游引物L2的添加量均为1.0μL时，以PCV3的DNA为模板能够扩增出目的条带（916bp），上游引物L3、下游引物L4添加量均为1.0μL时，以PRV野毒的DNA为模板也能够扩增出目的条带（544bp），所以，多重PCR扩增反应体系中浓度为25pmol/μl的上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4的加入量均选取1.0μL。
（2）退火温度的优化：
1）、以PCV3的DNA为模板，进行退火温度的优化：
以PCV3的DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR扩增反应的退火温度进行优化，具体优化的退火温度分别为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L1、下游引物L2各1.0μL，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，退火30s，72℃ 2min，共35个循环；72℃ 10min。对不同引物浓度的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图3。由图3可知，退火温度为56℃时，能够扩增出目的条带（916bp）。
2）、以PRV野毒的DNA为模板，进行退火温度的优化：
以PRV野毒的DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR扩增反应的退火温度进行优化，具体优化的退火温度分别为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L3、下游引物L4各1.0μL，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，退火30s，72℃ 2min，共35个循环；72℃10min。对不同引物浓度的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图4。由图4可知，退火温度为55℃和56℃时，能够扩增出目的条带（544bp）。
退火温度为56℃时，以PCV3的DNA为模板能够扩增出目的条带（916bp）、以PRV野毒的DNA为模板也能够扩增出目的条带（544bp），所以，多重PCR扩增反应选取退火温度为56℃。
（3）PCR循环次数的优化：
1）、以PCV3的DNA为模板，进行PCR循环次数的优化：
以PCV3的DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR循环次数进行优化，具体优化的PCR循环次数为29、30、31、32、33。具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L1、下游引物L2各1.0μL，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共29-33个循环；最后72℃延伸10min。对不同循环次数的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图5。由图5可知，在第31个循环可以发现目的条带（916bp），但是目的条带的含量较低。因此，对于临床中检测来说，为了避免目的条带含量低而造成的假阴性，循环次数至少选取32次。
2）、以PRV野毒的DNA为模板，进行PCR循环次数的优化：
以PRV野毒的DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR循环次数进行优化，具体优化的PCR循环次数为29、30、31、32、33。具体采用的PCR反应体系（50μl）为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L3、下游引物L4各1.0μL，DNA 模板3.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共29-33个循环；最后72℃延伸10min。对不同循环次数的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（电压100V），电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果，其结果见图6。由图6可知，在第31个循环可以发现目的条带（544bp），但是目的条带的含量较低。因此，对于临床中检测来说，为了避免目的条带含量低而造成的假阴性，循环次数至少选取33次。
由于PCR循环次数为33次时，以PCV3的DNA为模板能够扩增出目的条带（916bp）、以PRV野毒的DNA为模板也能够扩增出目的条带（544bp），所以，多重PCR扩增反应的循环次数选取33次。
（4）引物优化：
1）、PCV3的引物优化：
根据NCBI公布的PCV3基因序列的差异，本发明还设计了用于扩增PCV3的特异性引物L5、L6，该引物预期扩增产物为905bp，引物L5、L6的具体序列如下：
L5：5ˊ- CCCGGATCCACGGAGGTCTG -3ˊ（SEQ ID NO.5），
L6：5ˊ- AGCCACAAAATTAACAAACCCA -3ˊ（SEQ ID NO.6）。
采用引物L5、L6，分别在51-59℃的退火温度下对PCV3进行PCR扩增，扩增结果见图7。由图7可以看出，采用引物L5、L6在51-59℃的退火温度下对PCV3进行PCR扩增均无目的条带，表明引物L5和L6无法实现对PCV3的PCR检测。
本发明还设计了用于扩增PCV3的特异性引物L7、L8，该引物预期扩增产物为939bp，引物L7、L8的具体序列如下：
L7：5ˊ- TAGGGAGAAAAAGTGGTATCC -3ˊ（SEQ ID NO.7），
L8：5ˊ- CCGGTACAACATTACTAGT -3ˊ（SEQ ID NO.8）。
采用引物L7、L8，分别在51-60℃的退火温度下对PCV3进行PCR扩增，扩增结果见图8。由图8可以看出，退火温度为52℃时扩增出了目的条带（939bp），但与猪伪狂犬病毒野毒株的退火温度不一致，无法与猪伪狂犬病毒野毒株实现一个PCR反应扩增两条目的条带，检测两种病毒的方法。
2）、PRV野毒的引物优化：
根据NCBI公布的PRV野毒基因序列的差异，本发明还设计了用于扩增PRV野毒的特异性引物L9、L10，该引物预期扩增产物为413bp，引物L9、L10的具体序列如下：
L9：5ˊ- ACGACGATGACCTCAACG -3ˊ（SEQ ID NO.9），
L10：5ˊ- GTAGAGGCCCGTGTCGTT -3ˊ（SEQ ID NO.10）。
采用引物L9、L10，分别在51-59℃的退火温度下对PRV野毒进行PCR扩增，扩增结果见图9。由图9可以看出，采用引物L9、L10在51-59℃的退火温度下对PRV野毒进行PCR扩增均无目的条带，表明引物L9和L10无法实现对PRV野毒的PCR检测。
本发明还设计了用于扩增PRV野毒的特异性引物L11、L12，该引物预期扩增产物为502bp，引物L11、L12的具体序列如下：
L11：5ˊ- TTCGGCTCGGCCCTCGCAT -3ˊ（SEQ ID NO.11），
L12：5ˊ- AGAAGAGCTGCGAGTGGAA -3ˊ（SEQ ID NO.12）。
采用引物L11、L12，分别在51-59℃的退火温度下对PRV野毒进行PCR扩增，扩增结果见图10。由图10可以看出，退火温度为52℃时扩增出了目的条带（502bp），但与PCV3的退火温度不一致，无法与PCV3实现一个PCR反应扩增两条目的条带，检测两种病毒的方法。
经过上述对PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、PCR循环次数和引物的优化，得到用于检测PCV3和PRV野毒的多重PCR扩增的反应体系为（50μl）：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μl的dNTP 4.0μl，25pmol/μl的上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4各1.0μl，DNA 模板3.0μl，5U/μl 的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl。优化后的多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，共33个循环；72℃ 10min。
分别以PCV3的DNA、PRV野毒的DNA、PCV3+PRV野毒的混合DNA为模板，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图11所示，其中，泳道1为PCV3的DNA，泳道2为PRV野毒的DNA，泳道3为PCV3+PRV野毒的混合DNA。经过测序发现，泳道1、2、3中的目的条带的序列与预期扩增的序列相符。由此也说明，本发明的多重PCR方法能够对PCV3和PRV野毒进行有效检测。
本发明用于检测PCV3和PRV野毒的试剂盒包括上述检测方法中所用的病毒DNA提取试剂、PCR扩增试剂。
实施例2：特异性检验
利用本发明实施例1构建的猪圆环病毒3型（PCV3）和猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）的多重PCR检测方法验证本发明引物组的特异性，具体方法如下：
分别提取猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的RNA，分别以各个病毒的RNA为模板进行反转录，得到各个病毒相应的cDNA。按照实施例1中步骤2所述的方法分别提取PCV3、PRV野毒、猪细小病毒的DNA。分别以猪蓝耳病病毒的cDNA、猪瘟病毒的cDNA、猪流行性腹泻病毒的cDNA、猪传染性胃肠炎病毒的cDNA、猪轮状病毒的cDNA、猪德尔塔冠状病毒的cDNA、猪细小病毒的DNA、PCV3的DNA、PRV野毒的DNA为模板，按照实施例1中步骤3所述的优化后的PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增，其扩增结果如图12所示。由图12可知，只有以PCV3的DNA、PRV野毒的DNA为模板扩增得到了目的条带（目的条带的大小为916bp和544bp），其他均未扩增出条带。由此说明，本发明设计的用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组具有较好的特异性，能够对猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株进行特异性扩增。
实施例3：敏感性检验
（1）对PCV3的DNA（浓度为1×10-3ng/μl）进行10倍梯度稀释，分别得到浓度为1×10- 4ng/μl、1×10-5ng/μl、1×10-6ng/μl、1×10-7ng/μl、1×10-8ng/μl的PCV3的DNA，然后分别以稀释后的各浓度梯度的DNA为模板，按照实施例1中步骤3所述的优化后的PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增，扩增结果如图13所示。由图13可知，PCV3的DNA浓度为1×10-7ng/μl时仍能够扩增出目的条带。
（2）对PRV野毒的DNA（浓度为1.2×105ng/ml）进行10倍梯度稀释，分别得到浓度为1.2×104ng/ml、1.2×103ng/ml、1.2×102ng/ml、1.2×101ng/ml、1.2ng/ml、1.2×10-1ng/ml的PRV野毒的DNA，然后分别以稀释后的各浓度梯度的DNA为模板，按照实施例1中步骤3所述的优化后的PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增，扩增结果如图14所示。由图14可知，PRV野毒的DNA浓度为1.2ng/ml时仍旧能够扩增出目的条带。
实施例4：重复性检验
利用本发明实施例1构建的PCV3和PRV野毒的多重PCR检测方法对同一样品进行3次检测，每次检测间隔一个月，3次检测都能获得相同的检测结果，由此说明本发明建立的多重PCR检测方法重复性好，检测结果稳定。
实施例5：临床样本检测
收集58份来自临床的病死猪的肺脏以及脑组织样品，向肺脏以及脑组织样品（用剪刀适当剪碎）加入适量生理盐水，冻融3次，取上清提取DNA （DNA提取方法同实施例1），-20℃保存备用。
以临床样品的DNA为模板进行，以实施例1中步骤3所述的优化后的PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，其电泳结果如图15所示。经检测发现，58份临床样品中20份样品为PCV3阳性，38份样品为PRV阳性。该检测结果与采用现有技术检测的结果的符合率为100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagtattacc cggcacctcg ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaccctcag agggtacctg t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcggccct ttctgctg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaggacgct caggtgcg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccggatcca cggaggtctg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agccacaaaa ttaacaaacc ca 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagggagaaa aagtggtatc c 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggtacaac attactagt 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgacgatga cctcaacg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtagaggccc gtgtcgtt 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcggctcgg ccctcgcat 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaagagctg cgagtggaa 19
Claims (8)
1.一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，其特征在于，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，其中，
所述用于检测猪圆环病毒3型的引物的核苷酸序列为：
上游引物L1：5ˊ- TAGTATTACCCGGCACCTCGGA -3ˊ（SEQ ID NO.1），
下游引物L2：5ˊ- GAACCCTCAGAGGGTACCTGT -3ˊ（SEQ ID NO.2）；
所述用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物的核苷酸序列为：
上游引物L3：5ˊ- ATGCGGCCCTTTCTGCTG -3ˊ（SEQ ID NO.3），
下游引物L4：5ˊ- GCAGGACGCTCAGGTGCG -3ˊ（SEQ ID NO.4）。
2.权利要求1所述引物组在制备检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株试剂中的应用。
3. 一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分组成包括：DNA提取试剂、PCR扩增试剂；其中，所述PCR扩增试剂包括：PCR扩增缓冲液、dNTP、上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分组成还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪圆环病毒3型的基因组DNA和猪伪狂犬病毒野毒株的基因组DNA；所述阴性对照为无菌双蒸水。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株中的应用。
6.一种猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）引物合成：合成权利要求1所述的引物组；
（2）PCR扩增：提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；
（3）分析PCR扩增产物。
7. 根据权利要求6所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增反应的反应体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/μL的dNTP 4.0μl，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4各1.0μl， DNA 模板3.0μl，5U/μl 的Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl；其中，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3和下游引物L4的初始浓度均为25pmol/μL。
8. 根据权利要求6所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增反应反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，共33个循环；72℃ 10min。
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