CN109536625A - 一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒。本发明通过以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b‑specific‑Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。相应的，本发明的检测试剂盒，其成分除了商品化的Premix Ex Taq外，主要包括特别设计的牛支原体特异性的引物、探针及配套试剂：M.b‑specific‑Forward，M.b‑specific‑Reverse，M.b‑specific‑Probe，Nuclease‑free water，阳性对照模板。本发明除了用于实验室常规检测牛支原体核酸外，特别适用于无实验室条件下(如基层兽医部门、养殖场等)的现场检测，具有高特异性和灵敏性，是一种快速、准确的牛支原体核酸检测试剂盒，具有良好的应用前景。

Description

一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒。
背景技术
牛支原体(mycoplasma bovis，M.bovis)是感染牛的一种重要的致病性病原体，能够引起犊牛肺炎、乳房炎、耳炎、生殖道炎、关节炎、角膜结膜炎、流产与不孕等多种疾病，这些疾病统称为牛支原体相关疾病(MbAD)。近年来，MbAD已经在世界范围内广泛传播，且牛支原体还可以与其他病原造成继发感染或混合感染，给养牛业造成了巨大的经济损失。
目前，对牛支原体的检测方法主要有病原分离培养、血清学检测方法、分子生物学诊断方法。牛支原体的分离培养在试验操作方面要求严格，分离鉴定难度大，分离周期长，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够的可靠依据，影响实验的准确性；血清学检测既费时又费力，而且灵敏度不高；分子生物学方法方便快捷、灵敏度高，主要有常规PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)，这些检测方法虽然避免了上述两类方法的缺陷，但是需要在有精密仪器的实验室中操作，限制了在现场快速检测诊断上的推广应用。iiPCR(恒温隔绝式PCR)方法凭借特异性引物和探针，有效地增加了检测的特异性和敏感性，同时大大提高了检测速度和检测结果的准确率，且该方法实现反应体系的全封闭自动操作，避免了DNA的污染，具有广泛的现场实用性，可确保快速、准确地检测病原体，在病原体的快速定性检测方面具有广阔的应用前景和发展趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒，旨在解决现有技术敏感性不高，检测条件要求过高，准确率低，或反应体系不稳定、不易保藏等问题。
本发明是这样实现的，一种牛支原体的iiPCR检测方法，通过iiPCR法检测牛支原体核酸，该方法以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b-specific-Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述R1序列为：TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC。
优选地，所述探针M.b-specific-Probe为：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
优选地，所述M.b序列的克隆引物为：
M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’；
M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’。
优选地，所述iiPCR法包括以下步骤：
(1)以牛支原体的P80基因为模板并设计引物，PCR扩增得到M.b序列产物；
(2)切胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，然后将连接产物导入到DH-5α感受态细胞，筛选出阳性克隆子；
(3)建立iiPCR反应体系，该体系中包括探针M.b-specific-Probe，往该iiPCR反应体系分别加入牛支原体和其它基因组DNA为模板，检测阳性结果。
优选地，在步骤(3)中，所述iiPCR反应体系具体为：反应体系为50μL，其中PremixEx Taq 25ul，上、下游引物(10uM)各0.8ul，探针(10uM)0.4ul，ddH2O 18uL，DNA模板5uL。
本发明进一步公开了一种牛支原体的iiPCR检测试剂盒，试剂盒包括Premix ExTaq，引物，探针，阴性对照和阳性对照；其中，所述引物为：
M.b-specific-Forward：5′-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3′；
M.b-specific-Reverse：5′-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3′；
所述探针为：
M.b-specific-Probe：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
优选地，所述引物的浓度为10uM，探针的浓度为10uM，上游引物、下游引物与探针的体积比为2：2：1。
优选地，所述阳性对照为构建的pMD18-T/P80阳性标准质粒，所述阴性对照为Nuclease-free water。
优选地，所述试剂盒各成分的浓度和用量为：Premix Ex Taq 25uL，M.b-specific-Forward(10uM)0.8uL，M.b-specific-Reverse(10uM)0.8uL，M.b-specific-Probe(10uM)0.4uL，Nuclease-free water 18uL。
本发明克服现有技术的不足，提供一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒，本发明选取牛支原体P80基因的一段序列，基于该基因序列，设计特异性引物和探针，建立了牛支原体检测试剂盒，为了检测该试剂盒的特异性，本发明以构建的重组质粒(pMD18-T/P80)为阳性对照，以牛支原体08M和其它基因组DNA作为阴性对照，进行iiPCR反应，结果发现：除阳性对照(pMD18-T/P80)以外，牛支原体08M基因组DNA检测结果为阳性(+)，其余的检测结果均为阴性(-)。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将检测结果同之前建立的牛支原体实时荧光定量PCR检测结果进行比较，发现两种方法的符合率为100％；同时，本发明也对试剂盒的稳定性进行了检测，发现在-20℃条件下，所建立的试剂盒至少可以保存一个月，这为牛支原体的现场检测提供了极大的便利。因此，本发明所建立的试剂盒是一种具有特异性高、方便快捷的牛支原体检测技术手段，能够满足一般临床样品的检测要求；
(2)本发明除了用于实验室常规检测牛支原体核酸外，特别适用于无实验室条件下(如基层兽医部门、养殖场等)的现场检测，具有高特异性和灵敏性，是一种快速、准确的牛支原体核酸检测试剂盒，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是结果判定图；如果结果显示“+”，则判定为阳性；如果结果显示“－”，则判定为阴性；如果结果显示“？”，则需要用新鲜样品重新进行检测；
图2是特异性检测结果；结果显示：除阳性对照(pMD18-T/P80)以外，牛支原体08M基因组DNA检测结果为阳性(+)，其余的检测结果均为阴性(－)；
图3是敏感性检测结果；结果显示：该方法可以检测到38.9拷贝/uL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料和方法
1、菌株和部分支原体、细菌基因组DNA
牛支原体08M、绵羊肺炎支原体、无乳支原体P2、牛生殖道支原体PG11、丝状支原体山羊亚种(Mmc)PG3、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)M1601、山羊支原体山羊亚种(Mcc)D27-1、巴氏杆菌、牛沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等支原体和细菌的基因组DNA均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
2、主要仪器设备与试剂
POCKITTM核酸分析仪(POCKITTM Nucleic Acid Analyzer)、高速离心机Eppendorfcentrifuge5804R、核酸浓度测定仪NanoDrop-2000，细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampBacteria DNA Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司，质粒DNA提取试剂盒、pMD18-TCloning Kit、Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司。
3、引物、探针的设计与合成
从NCBI数据库中获取牛支原体的P80基因序列(GenBank登录号：NZ_LQDV01000064.1)，应用DNAMAN软件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)分析基因序列，根据引物和探针设计原则，在多态位点较丰富区域设计扩增片段长度为197bp的一对引物，并在该引物的扩增区域内设计一条荧光探针。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物和探针序列分别为：
M.b-specific-Forward：5′-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3′
M.b-specific-Reverse：5′-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3′
M.b-specific-Probe：5′-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3′
其中，5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
4、阳性标准质粒的构建
以M.b-specific-Forward和M.b-specific-Reverse为引物，牛支原体08M基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小为197bp的目的片段。PCR产物切胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，然后将连接产物导入到DH-5α感受态细胞，筛选出阳性克隆子，琼脂糖凝胶电泳验证后提取质粒并测定浓度。
5、反应体系
iiPCR反应体系为50μL，其中Premix Ex Taq 25ul，上、下游引物(10uM)各0.8ul，探针(10uM)0.4ul，ddH2O 18ul，DNA模板5ul。
6、特异性检测
以标准质粒pMD18-T/P80为阳性对照，按上述反应体系分别加入牛支原体(08M株)和其它基因组DNA为模板，检测试剂盒的特异性。
7、敏感性检测
以10×倍比稀释的标准质粒pMD18-T/P80(3.89×107拷贝/μL～5.96拷贝/μL)为模板，按上述反应体系加入模板，检测方法的敏感性。
8、稳定性检测
在200μL PCR管内于-20℃保存若干管反应预混液(Premix Ex Taq 25ul，上、下游引物(10uM)各0.8ul，探针(10uM)0.4ul，ddH2O 18ul，共计45ul)，并以阳性对照(pMD18-T/P80)为模板，分别在第7天、第14天、第21天、第28天检测预混液的保存效果，即试剂盒的稳定性。
二、结果
1、特异性检测
图1为结果判定图示意图；如果结果显示“+”，则判定为阳性；如果结果显示“－”，则判定为阴性；如果结果显示“？”，则需要用新鲜样品重新进行检测。
检测结果如图2所示，图2中，1～12(黑色方框上方所标准的数字1～12)分别是pMD18-T/p80、牛支原体08M、绵羊支原体、无乳支原体、牛生殖道支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、巴氏杆菌、牛沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、ddH2O。如图2所示，根据iiPCR检测结果显示，阳性对照(pMD18-T/P80)和牛支原体(08M株)呈阳性(+)，其余的检测结果呈阴性(－)。
2、敏感性检测
iiPCR检测结果如图3所示，图3中，1～8(黑色方框上方所标准的数字1～8)分别是10×倍比稀释的标准质粒pMD18-T/p80(3.89×107拷贝/uL～3.89拷贝/uL)。从图3中可以看出，本发明方法敏感性可达到38.9拷贝/uL。
3、稳定性检测
分别对-20℃保存第7天、第14天、第21天和第28天预混液的稳定性进行了iiPCR检测，发现阳性对照(pMD18-T/P80)检测结果均呈阳性(+)。说明上述预混液或试剂盒在-20℃保存条件下可进行长期保存，至少可保存1个月。
本发明选取牛支原体P80基因的一段序列，基于该基因序列，设计特异性引物和探针，建立了牛支原体的iiPCR检测试剂盒。本发明以构建的重组质粒(pMD18-T/P80)为阳性对照，以牛支原体(08M)和其它基因组DNA为阴性对照，检测本试剂盒的特异性。结果发现：除阳性对照(pMD18-T/P80)以外，牛支原体(08M)的基因组DNA检测结果为阳性(+)，其余基因组DNA的检测结果均为阴性(－)。
本发明将检测结果同之前建立的牛支原体实时荧光定量PCR检测结果进行比较，发现两种方法的符合率为100％，iiPCR方法的敏感性可达到38.9拷贝/ul，表明本发明所建立的试剂盒该具有较好的特异性和敏感性，能够满足一般临床样品的检测要求。
同时，本发明也对试剂盒的稳定性进行了检测，发现在-20℃条件下，所建立的试剂盒至少可以保存一个月，这为牛支原体的现场检测提供了极大的便利，省去了现场操作带来的交叉污染以及费时费力等问题。因此，本发明建立的牛支原体iiPCR检测试剂盒是一种特异、便捷的牛支原体检测试剂盒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> DNA
<213> Mycoplasma bovis
<400> 1
caaagatagt agagataaac cttacaaaca agttactcct gcacaattta ttagtgatgc 60
tgcttcatat gtattccctg taaaaggttt tgaaaaaact gatacatcta agatcaaaaa 120
taagtacatt gttcatacat ataacgaatt aaaagaagct gtaacaaata aaaatgttgt 180
tatatatgaa gaaccag 197
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caaagatagt agagataaac ct 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctggttcttc atatataaca ac 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgatgctgct tcatatgtat tccc 24

Claims (9)

1.一种牛支原体的iiPCR检测方法，通过iiPCR法检测牛支原体，其特征在于，该方法以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b-specific-Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的牛支原体的iiPCR检测方法，其特征在于，所述探针M.b-specific-Probe为：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
3.如权利要求1所述的牛支原体的iiPCR检测方法，其特征在于，所述M.b序列的克隆引物为：
M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’；
M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’。
4.如权利要求1所述的牛支原体的iiPCR检测方法，其特征在于，所述iiPCR法包括以下步骤：
(1)以牛支原体的P80基因为模板并设计引物，PCR扩增得到M.b序列产物；
(2)切胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，然后将连接产物导入到DH-5a感受态细胞，筛选出阳性克隆子；
(3)建立iiPCR反应体系，该体系中包括探针M.b-specific-Probe，往该iiPCR反应体系分别加入牛支原体和其它基因组DNA为模板，检测阳性结果。
5.如权利要求4所述的牛支原体的iiPCR检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述iiPCR反应体系具体为：反应体系为50μL，其中Premix Ex Taq 25ul，上、下游引物(10uM)各0.8ul，探针(10uM)0.4ul，ddH2O 18uL，DNA模板5uL。
6.一种牛支原体的iiPCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括Premix Ex Taq，引物，探针，阴性对照和阳性对照；其中，所述引物为：
M.b-specific-Forward：5′-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3′；
M.b-specific-Reverse：5′-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3′；
所述探针为：
M.b-specific-Probe：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
7.如权利要求6所述的牛支原体的iiPCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10uM，探针的浓度为10uM，上游引物、下游引物与探针的体积比为2：2：1。
8.如权利要求7所述的牛支原体的iiPCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为构建的pMD18-T/P80阳性标准质粒，所述阴性对照为Nuclease-free water。
9.如权利要求8所述的牛支原体的iiPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒各成分的浓度和用量为：Premix Ex Taq 25uL，M.b-specific-Forward(10uM)0.8uL，M.b-specific-Reverse(10uM)0.8uL，M.b-specific-Probe(10uM)0.4uL，Nuclease-free water18uL。
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