CN107502676A - 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物 - Google Patents

一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物，所述引物序列为上游引物：5’‑GGGACTTCGGGACTTATTGGA‑3’，下游引物：5’‑CACGAGATGCAAACTGATTTACTTG‑3’。本发明根据GenBank登录的KM435069.1的p80基因序列，设计特异性引物，首次针对绵羊肺炎支原体p80基因建立SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于绵羊肺炎支原体的诊断和流行病学调查。

Description

一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物，属于分子生物学领域。
背景技术
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)是引起羊支原体性肺炎(Mycoplasma pneumonia of goats and sheep, MPGS)的主要病原。MPGS传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源。MPGS临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，发病率为20%～30%，病死率一般为30%～50%，有的高达80%。当前国外非洲、西班牙、意大利、美国、约旦，国内四川、贵州、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道，给养羊业造成了严重的经济损失。
国内外关于Mo的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和SYBRGreen I 实时荧光定量PCR，然而Mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规PCR灵敏度较低，不能定量；而血清学方法存在特异性和敏感性较差，且容易和同属支原体发生交叉反应；国内外虽有Yang等、程振涛等、尹正军等、王华等根据p113基因、Mo 16S rRNA、tuf基因和NA基因分别建立了Mo SYBR Green I实时荧光定量PCR，然而未见有Mo黏附素基因p80的实时荧光定量PCR方法，本发明根据Mo黏附素基因p80序列设计特异性的引物，首次建立了针对Mo p80基因的实时荧光定量PCR方法，以期为MPGS在临床早期诊断和防治提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测绵羊肺炎支原体的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- GGGACTTCGGGACTTATTGGA -3’，
下游引物：5’- CACGAGATGCAAACTGATTTACTTG -3’。
利用本发明的引物可用于检测绵羊肺炎支原体的p80基因，尤其适用于基于SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的优化，建立了一套可用于检测绵羊肺炎支原体的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法。
具体操作方法如下：
1、引物设计：根据GenBank上公布的绵羊肺炎支原体KM435069.1基因序列，针对p80基因序列设计特异性的引物。
2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为： SYBR Premix Ex Taq 2×12.5μL、上、下游引物（10 μmol/L）各1μL、模板2μL、双蒸水8.5μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，60℃，30s，共40 个循环。
3、阳性标准品的制备：
利用本发明中合成的引物扩增p80基因片段。PCR产物与pMD19-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆进行扩增培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行酶切鉴定，并送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定后阳性质粒标准品利用超微量分光光度计测定浓度并换算成拷贝数，置于-70 ℃冰箱保存备用。
取1 mL绵羊肺炎支原体培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。
4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
该方法可用于绵羊肺炎支原体的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。
有益效果
本发明根据GenBank登录的KM435069.1的p80基因序列，设计特异性引物，首次针对绵羊肺炎支原体p80基因建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测到10copies，特异性好、重复性好，可用于绵羊肺炎支原体的临床诊断和流行病学调查。
附图说明
图1为绵羊肺炎支原体的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的标准曲线。
图2 为绵羊肺炎支原体的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的灵敏度检测。
具体实施方式
实施例1 绵羊肺炎支原体的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立
一、材料：
山羊支原体山羊肺炎亚种（F38）由中国农业科学院兰州兽医研究所储岳峰馈赠，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病实验室程龙飞研究员馈赠；绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、莱氏无胆甾原体、牛支原体、羊口疮病毒为本科室分离、鉴定和保存。
二、步骤
1、仪器与试剂：pMD19-T载体、SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）、DL2000 Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen（美国）公司； Mastercycler eprealplex荧光定量PCR 仪，eppendorf（德国）公司产品。
2. 引物的特异性
引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的KM435069.1的p80基因序列，利用Beacon Designer 7.9软件设计引物，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。
上游引物：5’- GGGACTTCGGGACTTATTGGA -3’，
下游引物：5’- CACGAGATGCAAACTGATTTACTTG -3’。
3、阳性标准品的制备
利用本发明中合成的引物扩增p80基因片段。PCR产物与pMD19-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆进行扩增培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行酶切鉴定，并送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定后阳性质粒标准品利用超微量分光光度计测定浓度并换算成拷贝数，置于-70 ℃冰箱保存备用。
4. 反应条件的优化
采用25μL反应体系(SYBR Premix Ex Taq 2×) 12.5μL，PCR上游引物（10μmol/L）1μL，PCR下游引物（10μmol/L）1μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最小的Ct 值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（55～68℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/L）进行优化。
5、建立标准曲线
用EASY Dilution将构建的标准品梯度稀释(107、106、105、104、103、102copies/μL)作为模板，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。
对阳性标准品的标准曲线显示，SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法Ct与拷贝数在1×102copies/μL ～1×107 copies/μL范围内有很好的线性关系，相关系数R2为0.998，扩增效率为112%。标准曲线见图1。
6 特异性检测
6.1 特异性检测
用优化的条件分别对绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、牛支原体、丝状支原体山羊亚种、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对该方法的特异性进行评价。检测结果显示，只有绵羊肺炎支原体核酸样品为阳性，其余核酸样品检测结果均为阴性。
6.2 可重复性及再现性评估
对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量PCR 进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.61%～1.72%，组间变异系数为0.63%～1.59%，可重复性好。
6.3敏感性测定
将阳性标准品稀释成1×107 copies/μL~1×101copies/μL，用实时荧光定量PCR方法进行检测。结果显示，建立的实时荧光定量PCR的检测低限为10 copies/μL。见图2。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggacttcgg gacttattgg a 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacgagatgc aaactgattt acttg 25

Claims (2)

1.一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- GGGACTTCGGGACTTATTGGA -3’，
下游引物：5’- CACGAGATGCAAACTGATTTACTTG -3’。
2.一种用于检测绵羊肺炎支原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988340A (zh) * 2017-12-13 2018-05-04 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用
CN109536625A (zh) * 2018-12-12 2019-03-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒
CN109680080A (zh) * 2018-12-12 2019-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛支原体的nfo-RPA检测方法及检测试剂盒
CN111235289A (zh) * 2020-03-15 2020-06-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性pcr引物
CN112760392A (zh) * 2020-11-17 2021-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用
CN113430214A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 贵州大学 一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634601A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 贵州大学 山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重pcr诊断试剂盒及制备、使用方法
CN103103273A (zh) * 2013-01-25 2013-05-15 西南民族大学 一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法
CN106434919A (zh) * 2016-09-28 2017-02-22 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 三种羊致病支原体的三重pcr专用引物及检测方法
CN106636470A (zh) * 2017-01-13 2017-05-10 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重pcr专用引物
CN106676195A (zh) * 2017-03-08 2017-05-17 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于丝状支原体山羊亚种的荧光定量pcr检测引物
CN106967840A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物
CN107083441A (zh) * 2017-06-13 2017-08-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量pcr试剂盒
CN107099605A (zh) * 2017-06-08 2017-08-29 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针
CN107142331A (zh) * 2017-07-14 2017-09-08 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物和探针

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634601A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 贵州大学 山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重pcr诊断试剂盒及制备、使用方法
CN103103273A (zh) * 2013-01-25 2013-05-15 西南民族大学 一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法
CN106434919A (zh) * 2016-09-28 2017-02-22 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 三种羊致病支原体的三重pcr专用引物及检测方法
CN106636470A (zh) * 2017-01-13 2017-05-10 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重pcr专用引物
CN106676195A (zh) * 2017-03-08 2017-05-17 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于丝状支原体山羊亚种的荧光定量pcr检测引物
CN106967840A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物
CN107099605A (zh) * 2017-06-08 2017-08-29 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针
CN107083441A (zh) * 2017-06-13 2017-08-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量pcr试剂盒
CN107142331A (zh) * 2017-07-14 2017-09-08 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物和探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MA,Y.等: "Mycoplasma ovipneumoniae isolate Shawan membrane protein P80 gene, complete cds，登录号KM435069.1", 《GENBANK》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988340A (zh) * 2017-12-13 2018-05-04 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用
CN107988340B (zh) * 2017-12-13 2021-05-14 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用
CN109536625A (zh) * 2018-12-12 2019-03-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒
CN109680080A (zh) * 2018-12-12 2019-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛支原体的nfo-RPA检测方法及检测试剂盒
CN109680080B (zh) * 2018-12-12 2023-01-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛支原体的nfo-RPA检测方法及检测试剂盒
CN111235289A (zh) * 2020-03-15 2020-06-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性pcr引物
CN112760392A (zh) * 2020-11-17 2021-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用
CN112760392B (zh) * 2020-11-17 2021-08-27 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用
CN113430214A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 贵州大学 一种多病原羊支原体肺炎核酸疫苗的构建方法

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