CN112760392A - 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测绵羊肺炎支原体的特异性PCR引物，本发明首先通过对绵羊肺炎支原体基因测序和对比，筛选到用于检测绵羊肺炎支原体的靶序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，然后设计了检测其特异性PCR引物，可将Mo与Mccp、Mmc、精氨酸支原体以及常见反刍动物支原体、细菌区分开，显示出良好的特异性，可作为新诊断靶标，以此为基础建立更具临床实用性的Mo诊断技术。

Description

用于检测绵羊肺炎支原体的特异性PCR引物及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测绵羊肺炎支原体的特异性PCR引物。
背景技术
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)简称为MO,是一种原核微生物，是羊支原体肺炎的一种病原体，也是引起绵羊和山羊支原体肺炎的主要病原之一，感染后临床症状主要表现为咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等，主要危害三月龄以下的羔羊，是一种世界性的传染病。
羊感染本病后常呈亚急性表现，并且康复的羊还可成为长期带菌者，故本病的控制和消灭比较困难，给许多国家的养羊业造成重大经济损失。本病的直接损失是羔羊死亡率增加，疾病监测治疗的费用增加；间接损失主要是疾病的慢性营养消耗、体重减轻、上市推迟、繁殖力降低等。
目前，分子生物学检测方法是实验室检测支原体常用的方法之一。该技术比常规病原分离培养法快得多，比血清学方法更可靠，且可对早期病原菌感染的病料进行检测。对于检测类似支原体这种特别难培养的微生物来说，应用此方法更为有效。
目前已报道的核酸分子诊断技术主要是基于特异性基因建立的PCR体系，或利用已经普及的测序技术进行病原鉴定。现有的核酸诊断方法包括普通PCR、q-PCR、聚合酶链式-限制酶切分析(PCR-REA)、环介导恒温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)系统，主要是基于Mo特异性基因16S rRNA，HSP70，P113,hly设计引物/探针。随着技术的不断改进，这些核酸诊断方法具有良好的特异性以及敏感性，但一方面大部分的扩增系统都是基于DNA样本，需要专业的实验室设备；而其中无需提取DNA和专业实验设备的RPA技术检测成本高，这很大程度的降低了核酸诊断方法检测Mo的临床实用性。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种用于检测绵羊肺炎支原体的特异性PCR引物，可将Mo与Mccp、Mmc、精氨酸支原体以及常见反刍动物支原体、细菌区分开，可作为新诊断靶标，以此为基础建立更具临床实用性的Mo诊断技术。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
通过比较基因组学获得一些Mo特异性序列，通过NCBI Primer-blast软件针对这些序列设计引物，根据得分情况，最终在上述Mo特异性序列中选择SEQ ID NO.1所示的序列作为PCR检测靶序列。
本发明设计的用于检测绵羊肺炎支原体(Mo)的特异性PCR引物的基因序列如下：
7282R：5'-CAAGCAAATCCCGAACCCTG-3'；
7282F：5'-AGCGTCTCACATTTTCGCAC-3'。
本发明提供了上述特异性引物在制备检测绵羊肺炎支原体的PCR试剂盒中的应用。
本发明进一步提供了含有上述引物的PCR试剂盒，
优选地，采用所述PCR试剂盒检测时，PCR扩增体系为：25μl：酶12.5μl，上/下游引物各0.5μl，模板2μl，水9.5μl；PCR扩增程序为98℃2min，94℃10s，64℃15s，72℃15s，72℃1min，30个循环。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明以新发现的一段Mo特有序列作为靶基因，设计一对Mo特异性引物，初步建立了普通PCR体系，扩增产物大小为288bp，该引物可以将Mo与Mccp、Mmc、精氨酸支原体以及常见反刍动物支原体、细菌区分开，可作为新诊断靶标，成本低，以此为基础能够建立更具临床实用性的绵羊肺炎支原体诊断技术。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Mo特异性引物7282R/2F扩增出53株Mo DNA样品的结果图；图中，第一排：M：DNA Marker2000，1-24分别为d2、MOGH、6、T116-1、LS2、d6、YC5、YC4、MO116、B85、WH08、YC1、S1A、GS12、K17、LNMO、WH、K23、116-2、IK3-3、K22、S2B、CQ5、阴性对照；第二排：M：DNA Marker2000，1-24分别为2、YC08、YC8、FF5、LX-F、YC20、SB005、TX、MO3-4、GS17、NXMO、MOZZ、d1、3、5、B2、K24、S1B、89单、IK3-4、IB4-3、YCL02、IK4-3、阴性对照；第三排：M：DNA Marker2000，1-8分别为FL4、274、150、A3、Y98、FL3、3-3、阴性对照。
图2是本发明实施例提供的Mo特异性引物7282R/2F建立的PCR反应体系对常见反刍动物支原体、细菌区分开样品检测的结果图；图中，第一排：M：DNA Marker2000，1-21分别为08M、M1801、F38、Y-Goat、FJ-GT、KS-1、CKid、牛莫拉氏菌、蜡状芽孢杆菌、海藻糖比伯斯坦菌、肺炎链球菌、肠球菌、溶血曼氏杆菌A、衣原体、无乳链球菌、肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、羊链球菌、阴性对照、阳性对照；第二排：M：DNA Marker2000，1-20分别为、动物奈瑟菌、粪肠球菌、沙门氏菌、屎肠球菌、PG45、M1601、PG50、PG3、PG2、结膜支原体、殊异支原体、牛鼻支原体、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、3-3、FL3、Y98、274、阴性对照，阳性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、试剂：
酶(2×Flash PCR MasterMix(Dye)，康为世纪)，DNA提取试剂盒(细菌基因组DNA提取试剂盒，天根)，DNA样本保存于实验室。菌株：实验中所使用的菌株均为中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
2、Mo特异性序列
通过比较基因组学，根据最新NCBI数据信息，将目前已知的全部14株Mo全基因组序列与Mycoplasma arginini、Mmc、Mccp全基因组序列进行blast比对，得到部分Mo种间特异性序列。再将得到的序列与实验室本地已测序50株Mo进行blast比对，获得Mo种内特异性序列。
3、引物设计
通过NCBI Primer-blast软件针对这些序列在50株MO中共有的保守片段设计引物，根据得分情况，选取了11对序列，送擎科生物公司合成。经过筛选，最终在上述Mo特异性序列中选择SEQ ID NO.1所示的序列作为PCR检测靶序列。
4、特异性验证
准备DNA样品对所设计的两对引物进行特异性验证，其中包括包括正向评估核酸盘：53株MO。反向评估核酸盘：MMC(PG3、FJ-GT)、MMM LC(Y-Goat)、Mccp(M1601、M1801、F38)、Mcc(CKid)、M.conjuctionate(HRC581)、M.putrefaciens(KS-1)、M.agalactiae(PG2)、M.Leachii(PG50)、牛支原体(08M、PG45)、殊异支原体、牛鼻支原体，牛莫拉氏菌、蜡状芽孢杆菌、海藻糖比伯斯坦菌、肺炎链球菌、肠球菌、溶血曼氏杆菌A、衣原体、无乳链球菌、肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、羊链球菌、动物奈瑟菌、粪肠球菌、沙门氏菌、屎肠球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌。
PCR扩增体系25μl：酶12.5μl，上/下游引物各0.5μl，模板2μl，水9.5μl。
扩增程序为98℃2min，94℃10s，64℃15s，72℃15s，72℃1min，30个循环。
通过特异性验证，证明其中一对引物7282R/2F(表1)具有特异性且能够扩增出MoDNA样品(如图1所示)。
表1Mo特异性引物7282R/2F
Figure BDA0002781853740000061
本发明首先通过对绵羊肺炎支原体基因测序和对比，筛选到用于检测绵羊肺炎支原体的靶序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，然后设计了检测其的特异性PCR引物，可将Mo与Mccp、Mmc、精氨酸支原体以及常见反刍动物支原体、细菌区分开，显示出良好的特异性，可作为新诊断靶标，以此为基础建立更具临床实用性的Mo诊断技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002781853740000071
Figure BDA0002781853740000081
Figure BDA0002781853740000091

Claims (4)

1.一种用于检测绵羊肺炎支原体的特异性PCR引物，其特征在于，上述引物的基因序列如下：
7282R：5'-CAAGCAAATCCCGAACCCTG-3'；
7282F：5'-AGCGTCTCACATTTTCGCAC-3'。
2.一种如权利要求1所述的特异性PCR引物在制备检测绵羊肺炎支原体的PCR试剂盒中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的特异性PCR引物的PCR试剂盒。
4.如权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，采用所述PCR试剂盒检测时，PCR扩增体系为：25μl：酶12.5μl，上、下游引物各0.5μl，模板2μl，水9.5μl；PCR扩增程序为：98℃2min，94℃10s，64℃15s，72℃15s，72℃1min，30个循环。
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