CN102363804A

CN102363804A - 一种检测绵羊支原体肺炎的方法

Info

Publication number: CN102363804A
Application number: CN2011102417082A
Authority: CN
Inventors: 赵宗胜; 张红梅; 贾斌; 赵凤; 余鹏; 张慧; 王建梅; 刘贤侠
Original assignee: 赵宗胜
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2011-08-23
Publication date: 2012-02-29

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测绵羊支原体肺炎的方法，提供与绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态及其应用，还提供了检测绵羊支原体肺炎的方法，涉及MBL启动子区甲基化检测、人工感染验证；对绵羊MBL基因启动子区的甲基化状况检测选择重亚硫酸氢盐测序法，精确检测给定区域内每个CpG位点的甲基化状态及频率，发现3个与MBL水平相关的差异显著CpG甲基化位点，即CpG3、CpG4、CpG5，提示相对于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因启动子区甲基化可能是血清MBL水平降低更显著的一个特征，该方法更敏感和准确的检测绵羊支原体肺炎感染和易感性个体，绵羊MBL基因启动子区甲基化与绵羊MP感染研究提供了完整的信息和科学依据。

Description

一种检测绵羊支原体肺炎的方法

技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，具体说是涉及一种与绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态及其应用，还提供了检测绵羊支原体肺炎的方法。

背景技术：

目前基因启动子甲基化在表观遗传调控机制中的研究较为深入，与基因表达密切相关，在疾病研究领域较为广泛深入，哺乳动物表遗传学表达调控的主要形式是DNA甲基化修饰，是指基因组中CpG岛的胞嘧啶环上的第5位碳原子的甲基化，这种修饰是可逆和可遗传的；除了印记基因和失活的X染色体外，在正常组织中包括启动子区在内大部分基因的CpG岛是非甲基化或低甲基化的，而免疫发生发展过程中经常能检测到各种基因的异常甲基化，目前，绵羊MBL基因启动子区研究在国内外均未报道，因此，研究绵羊MBL基因启动子区甲基化状态，特别是在该基因的研究上是否存在着关键位点的甲基化导致MBL表达量减低，从而导致对许多疾病的防御能力减弱的现象也有待于进一步证实，对了解该基因的表达调控等具有重要的意义。

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引起羊支原体性肺炎主要的病原体之一，感染绵羊肺炎支原体后的主要表现为咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等临床症状。由于本病感染后常呈慢性表现，康复羊可长期带菌，因此该病的控制和消灭是比较困难的；绵羊肺炎支原体感染造成的直接损失是羔羊死亡率增加，对养羊业造成慢性营养消耗、体重减轻、上市推迟、繁殖率降低等间接损失；同时，由于绵羊肺炎支原体与其他能够引起羊支原体性肺炎的病原缺乏交叉免疫保护性，给免疫预防带来困难，因此可通过筛选一些抗感染的基因成为防控该病的主要途径；

甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)，是一种存在于血清中的C型血清凝集素，其构成补体系统的成分糖蛋白之一，在天然免疫中能防御抵抗多种病原微生物，通过补体第三激活途径激活补体系统参与构成抗感染第一道防线，已表明与一般免疫缺陷、特异性感染等多种疾病相关，这已在人类的相关研究中得到证实，而绵羊作为一种重要的家养动物，将该基因作为重要的抗病候选基因有待于进一步深入研究。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种与绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态及其应用，还提供了检测绵羊支原体肺炎的方法，具体涉及MBL启动子区甲基化检测、人工感染验证的一种检测绵羊支原体肺炎的方法，以克服上述不足。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种检测绵羊支原体肺炎的方法，包括与绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态及其应用，其特征是：一种检测绵羊支原体肺炎的方法，具体涉及MBL启动子区甲基化检测、人工感染验证。

MBL启动子区甲基化检测：

首先证实MBL水平在绵羊支原体肺炎下调的原因是MBL基因启动子CpG岛的甲基化所致，包括一下步骤：

(1)样品采集和DNA提取，采用BSP甲基化检测技术对该基因启动子区序列进行甲基化检测，成功地检测了扩增出的234bp目的片段，甲基化分析发现，感染MP绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有5个为甲基化位点，而正常绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有4个发生甲基化，说明样品中基因启动子CpG岛的甲基化状态，与正常对照组相比甲基化状态不同，表示其个体患有绵羊支原体肺炎或支原体肺炎易感性高于正常绵羊，提供了更敏感和准确的绵羊支原体肺炎检测方法；

(2)人工感染验证：

人工感染验证，选用3月龄绵羊43只构建试验群体攻毒组37只，对照组6只，用绵羊肺炎支原体M.ovipneumonia标准株Y-98对攻毒组进行气管内接种，运用BSP甲基化检测技术，成功检测了37只攻毒组绵羊及6只对照组绵羊中MBL基因启动子区甲基化及血清中MBL浓度水平情况，结果发现3个与MBL水平相关的差异显著CpG甲基化位点，提示相对于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因启动子区甲基化可能是血清MBL水平降低更显著的一个特征，有望通过该方法更敏感和准确的检测绵羊支原体肺炎感染和易感性个体。

一种检测绵羊支原体肺炎的方法，其特征是：包括组织基因组DNA按基因组总DNA的标准提取法提取，采用CpGenome^TM DNA Modification Kit试剂盒，按照说明书对所提取的基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰，方法如下：

(1)3M NaOH每次用前新配：溶解1g的NaOH颗粒到8.3mL的水中；20mM NaOH/90％EtOH每次用前新配：将900μL 100％EtOH、93.4μL去离子水和6.6μL 3M NaOH均匀混合；溶解Reagent I每次用前新配，开盖前使瓶子热至室温。修饰一个样本需要称0.227g的DNA Modification Reagent I和加入0.571mL水，涡旋充分混匀。处理该试剂时应适当谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤是有刺激性的。用约20μL的3M NaOH调节pH到5.0，用pH试纸检测pH值试纸变湿时立即读出，避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II：开盖前使瓶子热至室温。加1μL的β-巯基乙醇到20mL的去离子水中。修饰一个样本，需加750μL上述溶液到1.35g的DNA Modification II，混匀至完全分散，剩余的试剂可储藏在包有锡箔纸的容器里，2℃～8℃黑暗条件下保存6周；

(2)1.5-2.0mL的螺旋微量离心管：加7.0μL的3M NaOH到100μL含1.0μg DNA的水中10ng/μL，混匀。注意：若样本少于1.0μg DNA，加2μL的DNA Modification reagent IV到样本DNA中，用水加至100μL，然后加7.0μL 3M NaOH混匀；

(3)50℃孵育DNA 10min加热板或水浴；

(4)加550μL新配制的DNA Modification Reagent I，涡旋混匀；

(5)50℃中避光孵育4-16h，加热板或水浴中；

(6)初始脱盐：a.剧烈涡旋DNA Modification III至悬浮；用1mL塑料吸管端反复吸打悬浮液10次，分散剩余的凝块儿；b.加5μL混匀的DNAModification Reagent III到DNA溶液管里；c.加750μL的DNA ModificationReagent II，并简单混匀；d.室温放置5-10min；e.5,000X g离心10s白色沉淀物析出，除去上清液；f.加入1.0mL 70％的EtOH，涡旋混匀，5,000Xg离心10s，去除上清液。重复3次；g.第3次洗涤的上清液被移除后，高速离心管子2min，用塑料吸头除去剩余的上清液；

(7)2次脱盐：a.加50μL的20mM NaOH/90％EtOH溶液到适当样本中；b.简单涡旋使颗粒悬浮，室温放置5min；c.5,000X g离心10s，除去管尖的所有东西。加入1.0ml 90％的EtOH，涡旋洗涤沉淀，再次离心并去除上清液，额外重复该步骤；d.两次洗涤去除上清液后，高速离心样本3min；

(8)用塑料吸管除去所剩余的上清液，在室温下晾干管子10-20min(酒精味应变小)；

(9)加TE缓冲液；

(10)50-60℃下孵育样品15min来洗脱DNA；

(11)高速离心2-3min，用塑料吸管转移样品上清液到新管中，-15℃～-25℃储存2个月，在-80℃可储存6个月，避免反复冻融，可分装储存。

参照所获得的绵羊的MBL基因启动子区序列，设计引物，用于以重亚硫酸盐修饰的基因组DNA为模板的PCR扩增。上游引物为：

5’-TTTGATTTTTTTTATATTAAGGTGAGGA-3’；下游引物为5’-AACCCACACTATACCTAATTCTCCC-3’，欲扩增片段长度为234bp。PCR扩增、产物回收、克隆及鉴定、测序分析。

本发明的优点是：

本发明甘露聚糖结合凝集素(MBL)广泛存在于动物和人的肝脏及血液中，它由肝脏细胞合成后分泌进入血液循环中，通过识别与甘露聚糖结合，发挥其免疫调节作用，或者激活补体系统，发挥调理素的作用，MBL是人类天然免疫系统中重要的一线抗感染分子。绵羊MBL基因的表达调控、MBL基因启动子区甲基化与去甲基化与疾病的关系等方面还有待进一步研究。本实验首次采用BSP法成功建立了绵羊MBL基因启动子区甲基化检测平台，可在本实验得到的绵羊MBL基因启动子区序列和3个显著CpG甲基化位点基础上，参考基因转录表达调控机制深入研究绵羊MBL基因调控机理；发展分子生物学水平的绵羊支原体肺炎易感性科学检测技术；结合MBL去甲基化分析MBL表达的表观遗传机制；分析MBL基因型、血清表达水平与各种疾病的相关性，为绵羊的抗病育种提供理论基础；结合现有研究利用绵羊MBL在人类进行临床治疗，观察结果。这不仅对绵羊MBL的研究有着重要的意义，更对表观遗传学的作用机制有着更为深刻的意义和广阔的前景；

本发明拟以绵羊支原体肺炎这个严重影响了新疆绵羊产业的传染病作为疾病模型，首先克隆绵羊MBL基因的启动子区序列，并对MBL基因启动子区的结构特征和CpG岛甲基化分析，结合MBL血浆蛋白浓度的分析，筛选出可引起绵羊MBL表达量改变的甲基化位点，证实这些关键位点甲基化与绵羊MP感染率间的关系，并进一步通过绵羊进行活体感染实验，验证绵羊MBL基因启动子区甲基化与MP之间的相关性，并在此基础上筛选更为敏感和有效的抗病基因型，为绵羊支原体肺炎抗性基因品种的遗传改良提供基因资源。

附图说明：

图1是本发明用于PCR扩增的绵羊基因组DNA的示意图；

图2是本发明绵羊MBL基因PCR扩增产物电泳结果示意图；

图3是本发明重组克隆载体pGM-T的鉴定结果示意图；

图4是本发明DNAssist比对结果示意图；

图5是本发明BIQ-Analyzer分析结果示意图；

图6是本发明甲基化检测及分析示意图。

下面结合实施例对本发明作进一步描述，

具体实施方式：

实施例：如图1-图6所示，一种检测绵羊支原体肺炎的方法，本发明提供与绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态信息及其应用，还提供了检测绵羊支原体肺炎的方法，具体涉及MBL启动子区甲基化检测、人工感染验证。

(1)、绵羊MBL基因启动子区甲基化检测方法的建立。

对绵羊MBL基因启动子区的甲基化状况检测选择目前DNA甲基化检测的金标准--重亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing PCR，BSP)，可以精确检测给定区域内每个CpG位点的甲基化状态及频率，为我们提供其启动子区具体每一个CpG位点的特定甲基化状态准确信息。本实验应用重亚硫酸氢盐测序法如下：绵羊基因组DNA中非甲基化胞嘧啶在重亚硫酸氢盐修饰作用下，可脱去氨基转化为尿嘧啶，经PCR反应扩增后，该尿嘧啶变成胸腺嘧啶而产生T∶A配对，但重亚硫酸氢盐对已甲基化的胞嘧啶则没有作用，DNA甲基化状态不同的片段就可转化为有碱基序列差异的2个片段，再通过克隆测序，可以在测序过程中把目的序列全部CpG给完整测出，还可以明确目的序列每个CpG的甲基化状态，这就为绵羊MBL基因启动子区甲基化与绵羊MP感染的相关性研究提供了完整的信息和科学依据。

1、1材料和方法：

组织基因组DNA按基因组总DNA的标准提取法提取，采用CpGenome^TM DNAModification Kit试剂盒，按照说明书对所提取的基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰，(1)3M NaOH(每次用前新配)：溶解1g的NaOH颗粒到8.3mL的水中；20mM NaOH/90％EtOH(每次用前新配)：将900μL 100％EtOH、93.4μL去离子水和6.6μL 3M NaOH均匀混合；溶解Reagent I(每次用前新配)：开盖前使瓶子热至室温。修饰一个样本需要称0.227g的DNA Modification Reagent I和加入0.571mL水，涡旋充分混匀。处理该试剂时应适当谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤是有刺激性的。用约20μL的3M NaOH调节pH到5.0，用pH试纸检测pH值(试纸变湿时立即读出)。避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II：开盖前使瓶子热至室温。加1μL的β-巯基乙醇到20mL的去离子水中。修饰一个样本，需加750μL上述溶液到1.35g的DNA Modification II。适当混匀至完全分散，剩余的试剂可储藏在包有锡箔纸的容器里，2℃～8℃黑暗条件下保存6周；(2)1.5-2.0mL的螺旋微量离心管：加7.0μL的3M NaOH到100μL含1.0μg DNA的水中(10ng/μL)，混匀。注意：若样本少于1.0μg DNA，加2μL的DNA Modification reagent IV到样本DNA中，用水加至100μL，然后加7.0μL 3M NaOH混匀；(3)50℃孵育DNA 10min(加热板或水浴)；(4)加550μL新配制的DNA Modification Reagent I，涡旋混匀；(5)50℃中避光孵育4-16h，加热板或水浴中；(6)初始脱盐：a.剧烈涡旋DNAModification III至悬浮。用1mL塑料吸管端反复吸打悬浮液10次，分散剩余的凝块儿；b.加5μL混匀的DNA Modification Reagent III到DNA溶液管里；c.加750μL的DNA Modification Reagent II，并简单混匀；d.室温放置5-10min；e.5,000X g离心10s(白色沉淀物析出)，除去上清液；f.加入1.0mL 70％的EtOH，涡旋混匀，5,000X g离心10s，去除上清液。重复3次；g.第3次洗涤的上清液被移除后，高速离心管子2min，用塑料吸头除去剩余的上清液。(7)2次脱盐：a.加50μL的20mM NaOH/90％EtOH溶液到适当样本中；b.简单涡旋使颗粒悬浮，室温放置5min；c.5,000X g离心10s，除去管尖的所有东西。加入1.0ml 90％的EtOH，涡旋洗涤沉淀，再次离心并去除上清液，额外重复该步骤；d.两次洗涤去除上清液后，高速离心样本3min。(8)用塑料吸管除去所剩余的上清液，在室温下晾干管子10-20min(酒精味应变小)；(9)加TE缓冲液；(10)50-60℃下孵育样品15min来洗脱DNA；(11)高速离心2-3min，用塑料吸管转移样品(上清液)到新管中，-15℃～-25℃储存2个月，在-80℃可储存6个月，避免反复冻融，可分装储存；

2、结果：

1、用于PCR扩增的绵羊基因组DNA

从图1可以看出：采用酚∶氯仿提取法所得的绵羊基因组DNA，纯度和浓度都很高，可进行下一步PCR扩增实验。

2、PCR扩增结果

以重亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA为模板进行扩增，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，扩增片段长度约为234bp，与目的片段长度相符(图2)。

3、PCR克隆鉴定结果

对回收的DNA片段分别进行TA克隆和菌液PCR检测，菌液PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，与以绵羊肝脏基因组DNA为模板的PCR产物纯化回收电泳结果相一致(图3)，表明重组克隆载体pGM-T构建成功。

4、测序结果及分析

绵羊MBL基因目的片段测序图谱清晰、波峰大小适中、无明显的杂带。测序所得序列经DNAssist软件分析比对发现：重亚硫酸修饰后序列与GenBank中的比较发现，非CpG位点中的非甲基化的“C”均转化为“T”，而其余碱基完全一致(图4)。图4DNAssist比对结果，上排为测序序列，下排为原序列--经重亚硫酸修饰后：所有非甲基化的胞嘧啶“C”均转化为胸腺嘧啶“T”；所有6个CpG位点中的甲基化的胞嘧啶“C”仍保持不变

运用生物软件BIQ-Analyzer对序列进行分析后发现，目的片段中的6个CpG位点中有4个为甲基化位点，有2个位非甲基化位点(图5)。分析发现，感染MP绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有5个为甲基化位点，而正常绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有4个发生甲基化，差异较大，证明本实验建立的BSP技术平台准确可靠，可以帮助我们获取绵羊MBL基因启动子区CpG位点的甲基化状态，推测该甲基化状态与绵羊MP的感染有一定相关性，为我们下一步大样本量的人工感染实验奠定了稳定的检测基础，也为绵羊MBL基因启动子区甲基化与绵羊MP感染的相关性研究提供了可靠地科学依据，更有利于进一步研究绵羊MP表观遗传学异常机制。

图6BIQ-Analyzer分析结果，深点上排为正常绵羊分析结果，浅点下排为患病绵羊分析结果；浅点代表非甲基化位点，代表甲基化位点上排为正常绵羊分析结果，下排为患病绵羊分析结果；浅点代表非甲基化位点，深点代表甲基化位点。

(2)人工感染验证启动子区CpG岛甲基化与MBL水平的相关性

1、材料和方法：

将实验羊群随机分组，攻毒组37只，其中中国美利奴羊新疆军垦型羔羊33只，湖羊4只，均由气管内接种绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)标准株Y-98，每只羊接种5ml；对照组为6只中国美利奴羊新疆军垦型，气管内接种相同量灭菌生理盐水，接种时要将针头贴在气管内壁上缓慢推注。之后对攻毒组、对照组两组羔羊给予正常的饲养管理，饲喂过程均不添加抗生素，注意进行临床观察。分不同时间段采集血样，具体时间段为攻毒前一周、攻毒后一天、攻毒后一周、攻毒后二周、攻毒后三周。血液基因组DNA按基因组总DNA的标准提取法提取。参照上述BSP甲基化检测方法检测该羊群患病和未患病羊只的甲基化状态。

2、结果：

2.1 MBL浓度检测结果

采用ELISA对供试羊群血清中MBL浓度检测，使用SPSS 13.0进行数据分析，结果显示，所有供试羊群MBL水平在攻毒后都有降低，其中对照组的MBL水平在攻毒前后差异不显著，而攻毒组的MBL水平却在攻毒前后的差异极显著(表1)。

2.2甲基化检测及分析

运用生物软件BIQ-Analyzer对序列进行分析后发现，6个CpG位点中有2～6个为甲基化位点，有1～4个位非甲基化位点，并按照CpG位点分别编号为CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6(图5)

深点代表非甲基化位点，浅点代表甲基化位点

1、2号为对照组绵羊，3～9号为攻毒组绵羊；○代表非甲基化位点，●代表甲基化位点，图6分析结果，

2.3甲基化与MBL水平相关分析；

MBL水平统计分析显示，对照组的MBL水平在攻毒前后差异不显著，而攻毒组中的MBL水平在攻毒后都极显著降低；供试群体甲基化检测对比分析显示，所选目的片段中共6个CpG位点，对照组有2～4个甲基化位点，其中CpG3、CpG6的甲基化率为3/6，而CpG4、CpG5均未发生甲基化；而攻毒组中有4～6个甲基化位点，其中CpG4甲基化率为20/37，CpG5的甲基化率为29/37，CpG6的甲基化率为30/37，死亡6只，见表(1)

表1MBL水平与甲基化位点分析

Table3 Analysis between methylation and MBL levels

针对CpG3～CpG6位点甲基化与MBL水平进行相关性分析，发现CpG3、CpG4位点甲基化与MBL水平差异显著(p＜0.05)，CpG5位点的甲基化与MBL水平差异极显著(p＜0.01)，而CpG位点6甲基化与MBL水平差异不显著(表2)。研究发现，MBL基因启动子区甲基化CpG数量和甲基化发生的位点都与血清MBL水平有关，而且MBL基因启动子区每个CpG的甲基化对于MBL血清水平的影响是有所不同的，实验分析显示，在检测到甲基化并且血清水平MBL极显著降低的6只攻毒试验中死亡的绵羊标本中，CpG1和CpG2位点甲基化发生率在攻毒组和对照组间则没有统计学意义差异，而CpG5甲基化发生率是最高的，极显著高于其它5个CpG检测位点，CpG3和CpG4甲基化发生率显著高剩余3个CpG位点，这提示MBL基因中启动子区靠近编码序列的CpG位点(CpG3、CpG4、CpG5)甲基化可能对于调控MBL蛋白表达具有更为重要的意义。

表2甲基化位点与MBL水平相关性分析

Table 4 Analysis of the correlation between methylation and MBL levels

本实验首次采用BSP法成功建立了绵羊MBL基因启动子区甲基化检测平台，可在本实验得到的绵羊MBL基因启动子区序列和3个显著CpG甲基化位点基础上，参考基因转录表达调控机制深入研究绵羊MBL基因调控机理；发展分子生物学水平的绵羊支原体肺炎易感性科学检测技术；结合MBL去甲基化分析MBL表达的表观遗传机制；分析MBL基因型、血清表达水平与各种疾病的相关性，为绵羊的抗病育种提供理论基础；结合现有研究利用绵羊MBL在人类进行临床治疗，观察结果。这不仅对绵羊MBL的研究有着重要的意义，更对表观遗传学的作用机制有着更为深刻的意义和广阔的前景。

Claims

1.一种检测绵羊支原体肺炎的方法，包括绵羊支原体肺炎(MP)相关的MBL基因启动子区CpG岛甲基化状态及其应用，其特征是：具体涉及MBL启动子区甲基化检测、人工感染验证MBL启动子区CpG岛甲基化与绵羊支原体肺炎及MBL水平的相关性，

包括以下步骤：

(2)人工感染验证：

人工感染验证，选用3月龄绵羊43只构建试验群体攻毒组37只，对照组6只，用绵羊肺炎支原体M.ovipneumonia标准株Y-98对攻毒组进行气管内接种，运用BSP甲基化检测技术，成功检测了37只攻毒组绵羊及6只对照组绵羊中MBL基因启动子区甲基化及血清中MBL浓度水平情况，结果发现3个与MBL水平相关的差异显著CpG甲基化位点，即CpG3、CpG4、CpG5，提示相对于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因启动子区甲基化可能是血清MBL水平降低更显著的一个特征，有望通过该方法更敏感和准确的检测绵羊支原体肺炎感染和易感性个体。

2.一种检测绵羊支原体肺炎的方法，其特征是：包括组织基因组DNA按基因组总DNA的标准提取法提取，采用CpGenome^TM DNA Modification Kit试剂盒，按照说明书对所提取的基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰(1)3M NaOH 每次用前新配：溶解1g的NaOH颗粒到8.3mL的水中；20mM NaOH/90％EtOH每次用前新配：将900μL 100％EtOH、93.4μL去离子水和6.6μL 3M NaOH均匀混合；溶解Reagent I每次用前新配，开盖前使瓶子热至室温，修饰克隆测序，分析正常组和患病组的CpG岛甲基化状态，方法如下：一个样本需要称0.227g的DNA Modification Reagent I和加入0.571mL水，涡旋充分混匀。处理该试剂时应适当谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤是有刺激性的。用约20μL的3M NaOH调节pH到5.0，用pH试纸检测pH值试纸变湿时立即读出，避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II：开盖前使瓶子热至室温。加1μL的β-巯基乙醇到20mL的去离子水中。修饰一个样本，需加750μL上述溶液到1.35g的DNAModification II，混匀至完全分散，剩余的试剂可储藏在包有锡箔纸的容器里，2℃～8℃黑暗条件下保存6周；

(2)1.5-2.0mL的螺旋微量离心管：加7.0μL的3M NaOH到100μL含1.0μg DNA的水中10ng/μL，混匀。注意：若样本少于1.0μg DNA，加2μL的DNA Modification reagent IV到样本DNA中，用水加至100μL，然后加7.0μL3M NaOH混匀；

(3)50℃孵育DNA 10min加热板或水浴；

(4)加550μL新配制的DNA Modification Reagent I，涡旋混匀；

(5)50℃中避光孵育4-16h，加热板或水浴中；

(6)初始脱盐：a.剧烈涡旋DNA Modification III至悬浮；用1mL塑料吸管端反复吸打悬浮液10次，分散剩余的凝块儿；b.加5μL混匀的DNAModification Reagent III到DNA溶液管里；c.加750μL的DNA Modification Reagent II，并简单混匀；d.室温放置5-10min；e.5,000X g离心10s白色沉淀物析出，除去上清液；f.加入1.0mL 70％的EtOH，涡旋混匀，5,000X g离心10s，去除上清液。重复3次；g.第3次洗涤的上清液被移除后，高速离心管子2min，用塑料吸头除去剩余的上清液；

(9)加TE缓冲液；

(10)50-60℃下孵育样品15min来洗脱DNA；

(11)高速离心2-3min，用塑料吸管转移样品上清液到新管中，-15℃～-25℃储存2个月，在-80℃可储存6个月，避免反复冻融，可分装储存，

参照所获得的绵羊的MBL基因启动子区序列，设计引物，用于以重亚硫酸盐修饰的基因组DNA为模板的PCR扩增。上游引物为：5’-TTTGATTTTTTTTATATTAAGGTGAGGA-3’；下游引物为5’-AACCCACACTATACCTAATTCTCCC-3’，欲扩增片段长度为234bp。PCR扩增、产物回收、克隆及鉴定、测序分析。

采用BSP甲基化检测技术对该基因启动子区序列进行甲基化检测，成功地检测了扩增出的234bp目的片段，甲基化分析发现，感染MP绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有5个为甲基化位点，而正常绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有4个发生甲基化，说明样品中基因启动子CpG岛的甲基化状态，与正常对照组相比甲基化状态不同，表示其个体患有绵羊支原体肺炎或支原体肺炎易感性高于正常绵羊，提供了更敏感和准确的绵羊支原体肺炎检测方法。