CN102628088B - 一种病毒通用pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法。其包括样品处理、提取核酸、扩增处理、电泳观测、扩增产物克隆、基因组测序分析等步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于快速鉴别诊断不同病毒，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，并可用于生产中快速检测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法。
背景技术
近年来，传染病日益严重，且传染途径复杂，病原变异性大，这些毫无疑问都给临床检测带来了巨大挑战。传统的病原检测方法如通过临床症状、病理变化、病毒分离、人工致病试验等试验诊断病原，血清分离、电镜观察等，工作量大，技术复杂，耗时长，不适宜现在传染病的有效监测和防控。这就需要一种快速灵活的方法来检测病原核酸，以严格控制传染病的发生。
1990年，美国学者Welsh与Williams等分别同时建立了一种能够应用于不同的病原微生物的临床诊断技术。Welsh等将随机引物与PCR技术相结合、建立了用于杂交基因组DNA指纹分析的任一引物PCR方法(arbitrary primer，APPCR)，Williams等创造了名为随机扩增DNA的多态性PCR的方法(randomamplified poly morph DNA，RAPD)，两种方法区别在于前者的引物较长，多为20个左右碱基的单条或双条引物，而后者多选用9～10个碱基的单条引物。后国际上统称其为随机PCR技术。
随机PCR技术因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而迅速渗透到分子生物学研究领域的各个方面，在建立后的短短几年内，它已在微生物、植物、动物及人类研究等领域显示出广泛的应用前景。
随机PCR技术是指在实验室检测中不知样本病原序列的情况下，利用一系列的随机引物，在PCR反应体系中，首先在不严格条件下使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。理论上，不一定要求整个引物都与模板复性，而只要引物的一部分特别是3’端有3-4个以上碱基与模板互补复性，既可使引物延伸，一旦在两条单链上相距一定距离且有反向复性引物存在，则可在Taq DNA聚合酶的作用下进行DNA片段的扩增，经一至数轮不严格条件下的PCR循环后，再于严格条件下进行扩增。经对PCR扩增产物回收克隆后测序已检测病原的一种检测技术。
随机引物是指使用非特异序列的寡聚核苷酸(长度为5～10个碱基)作DNA合成过程中的引物，它与一般常用引物的区别在于其随机性或是与特异性相对的概念，包括两方面的含义：(1)核苷酸的排列顺序是随机的；(2)所有引物的的序列无直接相关性；(3)随机引物可用于所有物种。
而后，由于国际各类传染病以病毒性传染疾病最为严重，为更快、更好的检测病毒感染样品，国内外研究者对随机PCR技术进行了大量改进，建立了多种病毒检测PCR方法。
1991年，Reyes G R和Kim J P于建立了非依赖性基因扩大法(SISPA)，该方法在DNA模板钝末端连接一非对称引物，经过若干循环的变性、退火和延伸后，模板的数量得到扩增，后经克隆、测序、分析得到基因序列。Allander T、Zhang T等人采用SISPA技术测定了未知DNA及RNA病毒的序列，研究证实应用这一方法对于不同类型和来源的病毒均有效果，所获得的病毒全基因序列大小从3000bp-15kb不等，但该方法所得产物杂质较多，容易扩增到宿主染色体序列。随后Allander T、Breitbart M、Jones M S、v an derHoek L等人在SISPA基础上，应用DNase处理样品后再进行SISPA(DNase SISPA)，从临床样品中鉴定出牛和人的新病毒。Djikeng A等人(2008)在DNase SISPA基础上进行了新的改进，将RNase酶处理加入到SISPA技术的程序中，以清除外源RNA的污染如核糖体RNAs。2007年，Clem AL等建立了多重随机PCR，对快速监测和鉴定病毒有很强的实用性。
研究证明，目前所采用的病毒通用PCR方法可快速有效的检测临床上未知病原感染样品，对生产、传染病监测具有重大意义；但该方法存在一定的局限性，因为来自宿主的染色体DNA相对含量较高，对病毒样品的质量要求高，且由于该方法的可重复性不高，应用该技术直接发现或鉴定新病毒方面还没有得到很好的推广。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，较好的特异性和重复性。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种病毒通用的PCR检测方法，其包括以下步骤
1)样品处理
将样品用0.2-0.25um滤器过滤，滤液经30-30K超滤管5000rpm离心20-30分钟，浓缩至1-2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入2-5μl的DNase 2-5μl的RNase及5-10μl 10×Bufier，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；
2)提取核酸
消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA；
3)扩增处理
取DNA或RNA提取液5-10μl，2-52ul 5-10μM的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行扩增处理；
4)电泳观测：
取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1％w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，
5)扩增产物克隆
将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10-16℃过夜连接；连接产物加入到50-100μl的DH5α感受态中，0℃冰浴30min后，于40-42℃水浴热激80-90s，置冰上3～5min后，加入300-500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液于2000-3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AIX+LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；取5-10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3～6小时，试剂盒提取质粒后，于37℃对质粒进行双酶切1-2h；
6)基因组测序分析
取上述克双酶切后的样品5-10μl，与2-6μl的0.25％w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1％w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行进行测序。
本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于细胞，前处理步骤为取细胞5-10×106个，液氮中或-80℃温度下反复冻融三次于10000-12000rpm离心5-10min，取上清为样品，开始1)样品处理步骤；或者，所述前处理步骤为将细胞进行单层培养，细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，细胞从培养瓶表面脱落后，收集细胞液，液氮或-80℃中反复冻融三次，12000rpm离心10min，取上清为样品，开始1)样品处理步骤。
本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于动植物组织，前处理步骤为取组织样品100-200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或-80℃温度下反复冻融三次，10000-12000rpm离心10min，取上清为样，品开始1)样品处理步骤。
本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于全血，前处理步骤为将全血于37℃溶解，加入3-5倍全血体积于红细胞裂解液，10000-12000rpm离心10min，吸取中间白膜层为样品，开始1)样品处理步骤。
本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于血清或血浆，前处理步骤为直接将血清或血浆与37℃溶解得样品，开始1)样品处理步骤。
上述方法中，所述3)步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将5-10μlDNA提取液，2-52ul5-10μM的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH2O补足50μl，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃2min；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃，10min，得到扩增样品。
其中所述PCR反应体系成分为：PCR Master Mix(2×)25μl。
上述方法中，所述3)步骤中，取RNA提取液时，采用一次RT-PCR扩增，即将5-10μlDNA提取液，2-52ul5-10μM的随机引物，加入RT-PCR反应体系中，RNase free dH2O补足50μl，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃2min；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，再72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃保存10min，得到扩增样品。
其中所述RT-PCR反应体系成分为PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2μl，2×1step Buffer 25μl。
本发明所述的病毒通用的PCR检测方法中，所述的随机引物的DNA碱基序列为VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C中的任一种。
本发明中，1)步骤中所用的DNase(脱氧核糖核酸酶)和RNase(核糖核酸酶)购自TaKaRa公司；2)步骤中所用的总核酸试剂盒为购自TaKaRa公司的Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Ver.4.0。
本发明的有益效果在于：本发明所述的病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于快速鉴别诊断不同病毒，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，并可用于生产中快速检测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1、九份病料PCR检测结果，泳道1：分子量标准，泳道2：H9N1，泳道3：PRRSV，泳道4：PRV，泳道5：IBV，泳道6：NDV，泳道7：EDS，泳道8：PRRSV&PRV，泳道9：正常细胞，泳道10：正常鸡胚尿囊液；
图2、九份病料RT-PCR检测结果，泳道1：分子量标准，泳道2：H9N1，泳道3：PRRSV，泳道4：PRV，泳道5：IBV，泳道6：NDV，泳道7：EDS，泳道8：PRRSV&PRV，泳道9：正常细胞，泳道10：正常鸡胚尿囊液；
图3、敏感性试验电泳图，泳道1：病毒浓度为107.0，泳道2：病毒浓度为106.0，泳道3：病毒浓度为105.0，泳道4：病毒浓度为104.0，泳道5：病毒浓度为103.0，泳道6：病毒浓度为102.0，泳道7：病毒浓度为101.0；
图4、未知病毒感染CEF切片电镜观察，图A箭头处为100nm左右病毒样颗粒，颗粒表面有较明显囊膜结构。图B箭头处为20nm左右二十面体病毒颗粒。图C箭头处为丝状不明物；
图5、尿囊液接种CEF细胞病变观察；A为病变细胞，梭状CEF细胞在中心部位或两端出现一个或数个空泡，随后细胞逐步萎缩、变圆，最后形成一个大的空泡。B为正常细胞对照。
具体实施方式
在本发明中中，如无特别说明，本发明的都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了文件中有详细描述：Sambrook等人编著的MolecularCloning：Alaboratory Mannual，第二版(1989)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgin编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell AndMolecular Biology(Academic Press，London)。
本发明中所出现的T载体选自18-T Vector，所述连接体系为18-TVector*1 1μl、insert DNA 0.3pmol，Solution I 5μl，ddH2O(经过两次蒸馏的蒸馏水)补足10μl。其中18-T Vector、18-Tvector*1均购自宝生物工程有限责任公司(TaKaRa BIOTECHNOLOGYCO.，LTD)。本发明中出现的One Step RT-PCR Kit Ver.2.0、DNA Fragment Purification KitVer.2.0、DnaseI、Rnase、Kpn I、HindIII均购自宝生物工程有限责任公司(TaKaRaBIOTECHNOLOGYCO.，LTD)，一步法质粒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；胎牛血清、MEM培养基购自GIBCO公司。
实施例1：病毒通用PCR方法特异性试验
5.材料
毒株、细胞：特异性试验检测病毒(如下表所示)毒株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心并保存。
菌株：DH5α菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存。
随机引物：VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C任意一种，由TaKaRa公司合成；经过测序，各病毒相应对应的随机引物分别为：H9N1：TTGGGGCGAA；
PRRSV：GCTGCCTTAA/CGTCTGCTAA；PRV：CTGCTGCTAA；
IBV：TTGGTGGCAA；EDS：TGTTTCTCAA；NDV：TTTCTCGGAA；PRRSV-PRV：GGCGTGTGAA/CTTGGGGCAA。
2、方法步骤
病毒增殖培养如下表所示：
细胞毒液样品前处理：上述1-3病毒细胞培养至CPE达90％，再用胰酶消化细胞，收集细胞毒液；4-7鸡胚培养的病毒，收集致死鸡胚的尿囊液，正常细胞90％贴壁，正常鸡胚收集鸡胚尿囊液待用；对上述9份样品的增殖液各取10ml，反复冻融三次，12000rpm，10min，取上清为样品；
样品处理：上述9种样品分别0.22um滤器过滤，滤液经30K超滤管5000rpm离心30分钟，浓缩至1ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液后合并；浓缩病毒液中分别加入5μl的Dnase I(脱氧核糖核酸酶)和5μl的Rnase(核糖核酸酶)，及5μl 10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；
病毒总核酸提取：处理好的病毒液，用总核酸提取试剂盒(Mini BEST ViralRNA/DNA Extraction Ver.4.0)，分别提取病毒DNA和RNA病毒液各300μl，用分光光度计测核酸浓度；
一次PCR扩增(病毒DNA)：PCR Master Mix(2×)25μl，病毒DNA提取液10μl，浓度为10μM的primer 2ul，ddH2O补足50μl反应体系，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃，2min；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃保存10min，得到扩增样品。
RT-PCR一步法(病毒RNA)：用TaKaRa公司的One StepRT-PCR Kit Ver.2进行，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2μl，2×1step Buffer 25μl，primer(10μM)2μl，病毒RNA提取液10μl，Rnase free dH2O补足50μl体系进行cDNA合成，合成反应条件为30℃，30min；37℃，30min；50℃，30min。随后反应条件同PCR；
电泳观测：取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1％w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，
PCR产物克隆测序：对对电泳观测结果为阳性的扩增产物PCR产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，并使用分光光度计测核酸浓度；回收产物连接于18-T Vector，连接体系为18-TVector*1 1μl，insert DNA 0.3pmol，Solution I 5μl，ddH2O补足10μl，16℃过夜连接；连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h。将培养液3000rpm离心3min，弃去200μl培养基。剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合。混合液涂布于AMP+LB固体培基。充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；
随机挑选10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3-6小时，试剂盒(一步法质粒DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司)提取质粒后，选用Kpn I酶和Hind III对质粒进行双酶切，37℃1h，电泳观测结果，酶切结果阳性的送测序公司进行测序。
3.实验结果
电泳结果：本研究以H9N1、PRRSV、PRV、IBV、NDV、EDS、PRRSV&PRV1∶1混合样品为材料建立了病毒通用PCR方法的特异性试验，电泳观察结果显示(图2，图3)PCR检测PRV、EDS和PRRSV&PRV结果为阳性，其他六份样品的检测结果为阴性；而RT-PCR检测H9N1、PRRSV、IBV、NDV、PRRSV&PRV结果阳性，均可得到单一的目的条带，检测PRV、EDS、正常细胞液、正常鸡胚尿囊液结果为阴性。
测序结果：测序结果与已知各病毒序列一致。
4.结论
该实施例中，以H9N1、PRRSV、PRV、IBV、NDV、EDS、PRRSV&PRV1∶1混合样品为材料建立了病毒通用PCR方法的特异性试验。用该方法对这7份病毒液进行检测，均可得到各自的目的条带，而对正常细胞液和鸡胚尿囊液的检测结果均为阴性，对PCR产物克隆后测序，测序结果显示，各PCR检测到的序列与已知各病毒序列一致，未见宿主基因组、细菌或外源病毒感染，表明该方法具有较好的特异性。
实施例2：病毒通用PCR方法敏感性试验
5.材料
毒株、细胞：PRV-Ra株的TK基因缺失的PRV重组病毒PRV/TK-：由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心构建并保存；BHK21细胞购自中国兽药监察所。
菌株：DH5α菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存。
随机引物：VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C任意一种，由TaKaRa公司合成。
2.方法步骤
病毒增殖：BHK21细胞按常规方法培养，以5-10PFU/细胞感染病毒，当细胞病变(CPE)达90％左右收获病毒，计算病毒的TCID50；
细胞毒液样品前处理：取107.0TCID50的细胞病毒液，反复冻融三次，12000rpm，10min，取上清为样品；
样品处理：上述样品0.22um滤器过滤，滤液经30K超滤管5000rpm离心30分钟，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，取1ml的浓缩病毒液中分别加入5μl的DnaseI和5μl的Rnase，及10μl 10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；
病毒总核酸提取：处理好的病毒液，用总核酸提取试剂盒(TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Ver.4.0)，分别提取病毒核酸DNA和RNA各300μl，用分光光度计测核酸浓度；
RT-PCR一步法(病毒RNA)：上述RNA提取液10倍系列稀释后，取各浓度的10μl核酸液分别进行RT-PCR；用TaKaRa公司的One StepRT-PCR Kit Ver.2进行，Prime Script 1 step Enzyme Mix 2μl，2×1step Buffer 25μl，primer(10μM)2μl，RNA模板10μl，Rnase free dH2O补足50μl体系，进行cDNA合成，合成条件为30℃，30min；37℃，30min；50℃，30min；通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火30℃2min；经过33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s的复性，72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品；
电泳观测：取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1％w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，
PCR产物克隆测序：对电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，并使用分光光度计测核酸浓度；回收产物连接于18-T Vector，连接体系为18-T Vector*1 1μl，insert DNA 0.3pmol，Solution I 5μl，ddH2O补足10μl，16℃过夜连接；连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h。将培养液3000rpm离心3min，弃去200μl培养基。剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合；混合液涂布于AMP+LB固体培基。充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；
随机挑选10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3-6小时，试剂盒(一步法质粒DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司)提取质粒后，选用Kpn I酶和Hind III对质粒进行双酶切，37℃1h，电泳观测结果，酶切结果阳性的送测序公司进行测序。
3 实验结果
电泳结果：用病毒通用PCR方法检测PRV重组病毒PRV/TK-，原始浓度为107.0个TCID50的细胞病毒液10倍系列后分别进行RT-PCR，敏感性试验表明，病毒通用PCR方法检测PRV重组病毒PRV/TK-最低量为104.0个TCID50。
测序结果：测序结果为PRV基因序列。
4.结论
本研究以PRV-Ra株的重组病毒PRV/TK-为材料，用随机引物V8A2建立了病毒通用PCR方法的敏感性试验；PRV/TK-的最低检出量为个104.0TCID50，表明该方法具有较高的敏感性。
实施例3：未知微生物鉴定
某鸡场用病死鸡肝脏悬液接种鸡胚，鸡胚全身出血严重，尿囊膜上出现水泡样物质，PCR、血清学等多种方法无法鉴别尿囊液中未知微生物；特进行本试验鉴定该未知微生物。
2.材料
鸡胚：购自广东大华农
随机引物：VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C任意一种，由TaKaRa公司合成。
3.方法步骤
1)微生物扩繁：鸡胚尿囊腔接种：含未知微生物的鸡胚尿囊液0.1um滤器过滤，10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种，观察3-5天，收集鸡胚尿囊液；
2)鸡胚成纤维细胞(CEF)接种：含未知微生物的鸡胚尿囊液0.1um滤器过滤，接种CEF，观察2-4天，完全病变后收毒，得到细胞液；
3)上述细胞液反复冻融后10000rpm离心10min，取上清为样1，样1与氯仿1∶1混合，充分振荡静置10min，12000rpm离心10min，吸取上清为样2，样1和样2分别用0.22μm的滤器过滤后接种两组CEF，观察2-4天。
鸡胚尿囊液病毒纯化及电镜观察：取上述1)中鸡胚尿囊液15ml于10000rpm离心30分钟，上清0.1um滤器过滤后30KDa超滤管5000rpm超滤30分钟，取尿囊余液蔗糖密度梯度离心(15％、30％、50％三个梯度，30000rpm离心2h)，对可见条带、不同梯度离心液及尿囊液负染观察。再取15ml上述1)中的鸡胚尿囊液30000rpm离心2h，取沉淀及上清负染观察。
鸡胚切片观察：对上述1)中的病变鸡胚做超薄切片电镜观察。
CEF切片观察：对上述2)中病变CEF收毒后的细胞液进行电镜观察。
样品前处理：将10ml上述1)中的鸡胚尿囊液、2)中细胞液的反复冻融3次，10000rpm离心30分钟，取上清为样品；
样品处理：上述样品0.22um滤器过滤，滤液经30KD超滤管5000rpm离心30分钟，浓缩得到1ml病毒液；
病毒总核酸的提取：浓缩的1ml病毒液依次加入Rnase、Dnase I消化1.5小时，用总核酸提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionVer.4.0)，分别提取病毒核酸DNA和RNA各300μl；
一次PCR(病毒DNA)：PCR Master Mix(2×)25μl，病毒DNA提取液10μl，浓度为10μM的primer 2ul，ddH2O补足50μl反应体系，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃2min；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃保存10min，得到扩增样品。
RT-PCR一步法(病毒RNA)：上述RNA提取液10倍系列稀释后，取各浓度的10μl核酸液分别进行RT-PCR；用TaKaRa公司的One StepRT-PCR Kit Ver.2进行，Prime Script 1 step Enzyme Mix 2μl，2×1 step Buffer 25μl，primer(10μM)2μl，RNA模板10μl，Rnase free dH2O补足50μl体系，进行cDNA合成，合成条件为30℃，30min；37℃，30min；50℃，30min；通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃2min；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃，10min，得到扩增样品；
电泳观测：取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1％w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，
PCR产物克隆测序：对对电泳观测结果为阳性的扩增产物CR产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，并使用分光光度计测核酸浓度；回收产物连接于18-T Vector，连接体系为18-TVector*1 1μl，insert DNA 0.3pmol，Solution I 5μl，ddH2O补足10μl，16℃过夜连接；连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h。将培养液3000rpm离心3min，弃去200μl培养基。剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合。混合液涂布于AMP+LB固体培基。充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；
随机挑选10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3-6小时，试剂盒(一步法质粒DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司)提取质粒后，选用Kpn I酶和Hind III对质粒进行双酶切，37℃1h，电泳观测结果，酶切结果阳性的送测序公司进行测序。
4.实验结果
电镜观察结果：鸡胚尿囊液直接观察或梯度离心后样品观察未见明显病毒样颗粒，鸡胚切片也未见明显病毒样颗粒，CEF切片电镜观察见图4；
CEF接毒观察：鸡胚液接种CEF可见明显细胞病变，见图5。
氯仿处理后CEF接毒观察：病毒接种48小时后，氯仿处理组未见细胞病变，未处理组出现明显的空泡样细胞病变。
随机引物PCR结果：(1)PCR：随机引物PCR扩增得到一个1.7kb左右条带，无可见拖带；测序鉴定结果为圆环病毒2型。(2)RT-PCR：随机引物RT-PCR扩增细胞毒得到600bp和1000bp左右的两条条带，无明显拖带。测序结果为鸭瘟病毒。
5.结论
尿囊液经0.2um滤器过滤后接种鸡胚，鸡胚全身出血明显，尿囊膜上可见水泡样病变，与未过滤尿囊液接种所致症状一致，由此可判定致病未微生物属病毒类。
尿囊液直接电镜负染观察或梯度离心后负染观察，未见明显病毒样颗粒。原因可能有两种：a，病毒虽然能感染鸡胚，但在鸡胚上的增殖滴度不高；b，鸡胚尿囊液成分复杂，试验中未能有效分离纯化相关病毒。但感染鸡胚的超薄切片观察仍然未见明显病毒颗粒，因此病毒在鸡胚上的增殖滴度不高可能是主要原因；未知病毒能感染鸡胚成纤维细胞，细胞出现特异性病变。病变细胞超薄切片观察，发现三种疑似病毒结构：a，100nm左右圆形病毒颗粒，存在明显囊膜结构；b，20nm左右二十面体病毒结晶；c，一种丝状结晶物。其中100nm左右病毒颗粒比例相对较多，其次为20nm左右病毒颗粒，偶见丝状结晶物。本发明提取病毒核酸通过病毒通用PCR，提取病毒核酸时，通过Dnase I和Rnase A处理裸露核酸，避免组织核酸污染。从尿囊液中提取病毒总核酸进行PCR鉴定，能扩增出1.7kb左右条带；提取病毒总RNA进行RT-PCR鉴定，扩增出600和1000bp左右条带。PCR测序结果为猪圆环病毒2型，其大小与电镜观察中所见20nm左右二十面体病毒颗粒一致。RT-PCR测序结果显示为鸭瘟病毒，其大小与电镜观察中所见100nm左右具有明显囊膜结构圆形病毒颗粒符合。综上所述，本发明建立的病毒通用PCR检测方法确定了该未知病毒混合物中存在猪圆环病毒2型和鸭瘟病毒，表明该检测方法对临床生产具有重要意义。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：取植物组织样品100-200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或-80℃温度下反复冻融三次，10000-12000rpm离心10min，取上清为样品；还包括以下步骤；
1） 样品处理
将样品用0.2-0.25um滤器过滤，滤液经30-30K超滤管5000rpm离心20-30分钟，浓缩至1-2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入2-5μl的DNase 2-5μl的RNase及5-10μl10× Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；
2）提取核酸
消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA；
3）扩增处理
取病毒DNA或RNA提取液10μl，2ul 10μM的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行PCR或RT-PCR扩增处理；
4）电泳观测：
取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1%w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，
5）扩增产物克隆
将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10-16℃过夜连接；连接产物加入至50-100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于40-42℃水浴热激80-90s，置冰上3～5min后，加入300-500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液于2000-3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AMP+ LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；取5-10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3～6小时，试剂盒提取质粒后，于37℃对质粒进行双酶切1-2h；
6）基因组测序分析
取上述双酶切后的样品5-10μl，与2-6μl 的0.25%w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1%w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行测序。
2. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述3）步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将10μl DNA提取液，2ul 10μM的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH2O补足50μl，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃ 2min ，33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s， 再72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品。
3. 根据权利要求2所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系成分为 2×PCR Master Mix 25μl。
4. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述3）步骤中，取RNA提取液时，采用一次RT-PCR扩增，即将10μl RNA提取液，2ul 10μM的随机引物，加入RT-PCR反应体系中，RNase free dH2O补足50μl，离心混匀后进行通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃ 2min ；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，再 72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品。
5. 根据权利要求4所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应体系成分为 Prime Script1 step Enzyme Mix 2μl，2×1 step Buffer 25μl。
6. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述随机引物的DNA碱基序列为VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C中的任一种。
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