CN105002169A - 3型鸭肝炎病毒荧光定量rt-lamp检测试剂盒及其应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒及其应用和方法，该试剂盒包括根据3型鸭肝炎病毒VP3基因部分核苷酸序列(如SEQIDNo.1所示)设计的一对外引物、一对内引物以及一对环引物，所述外引物序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，内引物序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，环引物序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示。该方法不仅能够定性、更能够定量检测3型鸭肝炎病毒，操作简单，快捷。

Description

3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒及其应用和方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒及其应用和方法。

背景技术

近几年随着养殖业发展的不断规模化、工业化、现代化，病毒性或细菌性疾病感染现象更加普遍，并且由于微生物变异更加频繁，导致其耐药性更加严重。鸭肝炎病毒中的DHAV(Duck viral hepatitis A virus)存在于养鸭的各个国家和地区，而DHAV中的3型鸭肝炎病毒(DHAV-3)自被发现以来，其感染雏鸭的症状与1型极其相似，且针对DHAV-3无疫苗，因此建立一种准确、快速、简便、定量的DHAV-3检测方法具有重要意义。

目前，针对DHAV的检测方法有以下几种：(1)病毒的分离与鉴定，这是最可靠的传统检测方法，但由于有些病毒的变异株不能分离培养，导致该方法的使用受限；(2)形态学方法，这是一种利用胶体金免疫电镜技术对病毒颗粒进行检测的方法，但由于胶体金制备成本高，经济性差，导致此方法使用不够普遍；(3)血清学检测，但该方法同样由于DHAV抗原或抗体的纯化难度高而受限，即使用单克隆抗体对血清学检测方法进行改进，但由于单抗制备繁琐，导致该方法在基层不易被推广，另外，利用基因工程的方法制备重组蛋白，易受宿主蛋白或密码子偏爱性影响；(4)RT-PCR或定量RT-PCR检测，与其它检测方法相比，该方法具有特异性强、灵敏度高、准确性好的特点，在实验室诊断中应用广泛，但是RT-PCR技术对仪器设施要求高，实验操作过程繁琐，对检测者有一定实验技能要求，因此难以在基层推广。

反转录环介等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)是AMV反转录酶(分离自禽类成髓细胞瘤病毒中的一种反转录酶)先将RNA反转录为DNA，再依靠BstDNA聚合酶在60-65℃进行DNA扩增的一种检测方法，该方法特异性高、快速、操作简单。目前RT-LAMP定量的可能方法主要有利用浑浊度、荧光染料和荧光探针三种，其中，最常用的荧光染料定量是根据SYBR Green I与双链DNA非特异性结合，反应发出的全部荧光信号与双链DNA量呈比例，且会随扩增产物的增加而增加，可以根据荧光信号检测出LAMP或RT-LAMP体系中存在的双链DNA数量，而目前尚无关于DHAV-3的定量RT-LAMP检测方法的相关报导。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒既可以进行定性检测，也可以进行定量检测；本发明还提供了上述试剂盒的应用及方法。

本发明采取的技术方案如下：

1、3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，包括根据3型鸭肝炎病毒VP3基因部分核苷酸序列(如SEQ ID No.1所示)设计的一对外引物、一对内引物以及一对环引物，所述外引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，内引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，环引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

优选的，所述试剂盒还包括3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品、BstDNA聚合酶、20×ThermoPol Reaction Buffer、AMV反转录酶、核酸酶抑制剂、dNTPs、甜菜碱、Mg²⁺、SYBR Green I和DEPC H₂O。

优选的，所述试剂盒中以下成分在反应体系中的终浓度为：BstDNA聚合酶0.4U/μL，AMV反转录酶0.25U/μL，核酸酶抑制剂0.25U/μL，dNTPs 0.5μM，外引物各0.25μM，内引物各2μM，环引物各1μM，甜菜碱0.5M，Mg²⁺7.5mM，SYBR Green I 1×或5×。

优选的，所述试剂盒按反应体系体积为20μL计，包括：8U/μL的BstDNA聚合酶1μL，20×Thermo Pol Reaction Buffer 2μL，5U/μL的AMV反转录酶1μL，5U/μL的核酸酶抑制剂1μL，2.5μM的dNTPs 4μL，外引物的混合物0.5μL，内引物的混合物4μL，环引物的混合物2μL，4M的甜菜碱2.5μL，300mM的Mg²⁺0.5μL，20×SYBR Green I或100×SYBR Green I 1μL，80ng/μL阳性标准品RNA 0.5μL；所述外引物、内引物及环引物中每个引物的浓度均为10μM，相应引物混合的体积比为1:1。

优选的，所述试剂盒以Ct值为纵坐标，以3型鸭肝炎病毒阳性标准品RNA模板拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线进行定量检测。

优选的，所述3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品的制备包括如下步骤：首先以含3型鸭肝炎病毒的尿囊液抽提RNA，反转录合成cDNA，然后以外引物进行PCR扩增得到217bp的目的片段，将目的片段进行回收，构建重组质粒pGEM-T/VP3，测序鉴定后通过体外转录将DNA转录为RNA，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小为291bp，核酸蛋白质检测仪测定RNA浓度，将RNA模板依次10倍稀释得到阳性标准品。

优选的，所述PCR扩增条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

2、上述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中用于3型鸭肝炎病毒的定性或定量检测。

3、上述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中定量检测3型鸭肝炎病毒的方法，先制备3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品，然后以阳性标准品RNA为模板，加入引物和试剂，瞬时离心混匀，置于荧光定量PCR仪中61～65℃条件下反应50min，每隔1min收集一次荧光，设置50个循环，在80℃条件下反应2min后停止反应，通过构建标准曲线对结果进行定量分析。

优选的，荧光定量PCR仪中的反应温度为64.2℃。

本发明的有益效果在于：本发明通过构建荧光定量RT-LAMP引物，获得了DHAV-3荧光定量RT-LAMP检测试剂盒。该试剂盒既能够用于DHAV-3的定性检测，也可以用于定量检测。若用于定性检测，则根据反应体系是否变浑浊或瞬时离心观察白色沉淀即可判断结果为阴性还是阳性，另外还可以在反应后加入高浓度SYBR Green I(100×)，根据自然光或紫外灯下其颜色的变化对结果进行判断；若用于定量检测，则在反应体系中加入低浓度SYBRGreen I(20×)，通过荧光定量PCR仪收集荧光即可获得定量检测数据。该方法准确、快速、简便，最低检测限达24拷贝数，更适用于基层推广应用。另外，从定量的结果来分析，相对而言，本发明所建方法更适合于高浓度样本的定量检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-3泳道为PCR产物(条带大小为217bp)，M泳道为DNA Marker(DL2000)；

图2重组质粒的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为菌落PCR产物(条带大小为217bp)，M泳道为DNA Marker(DL2000)；

图3抽提质粒的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为质粒(质粒大小为3217bp，但因质粒为环状，实际位置小于线性DNA Marker的对应位置)，M泳道为DNA Marker(DL15000)；

图4线性化质粒的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为质粒(质粒大小为3217bp，但因质粒为环状，实际位置小于线性DNA Marker的对应位置)，2泳道为线性化质粒，3泳道为纯化后的线性化质粒(2、3泳道线性化质粒的大小为3217bp)，M泳道为DNA Marker(DL15000)；

图5体外转录RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为体外转录RNA，RNA大小为291bp(从T7启动子→217bp目的片段→SalI酶切位点共有291bp)，M泳道为RNA Marker(DL1000)；

图6不同温度与相对荧光信号强度关系，其中，曲线1-5依次代表64.2℃、63.3℃、61.1℃、62.0℃和65.0℃下的荧光信号强度曲线；

图7不同外引物F 3和B3浓度与相对荧光信号强度关系；以F3/B3浓度为10μM计，1-5曲线依次为其加入量0.5μl、0.1μl、0.9μl、0.7μl和0.3μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图8不同内引物FIP和BIP浓度与相对荧光信号强度关系；以FIP/BIP浓度为10μM计，1-5曲线依次为其加入量4.0μl、3.0μl、3.5μl、2.0μl和2.5μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图9不同环引物LF和LB浓度与相对荧光信号强度关系；以LF/LB浓度为10μM计，1-5曲线依次为其加入量2.0μl、1.0μl、1.5μl、2.5μl和0.5μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图10不同甜菜碱与相对荧光信号强度关系；以甜菜碱浓度为4M计，1-5曲线依次为其加入量3.0μl、2.5μl、2.0μl、1.5μl和3.5μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图11不同BstDNA聚合酶浓度与相对荧光信号强度关系；以BstDNA聚合酶浓度为8U/μl计，1-5曲线依次为其加入量1.0μl、0.8μl、0.4μl、0.6μl和1.2μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图12不同镁离子浓度与相对荧光信号强度关系；以MgSO₄浓度为300mM计，1-5曲线依次为其加入量1.5μl、0.5μl、1.0μl、2.0μl和2.5μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图13不同dNTPs浓度与相对荧光信号强度关系；以dNTPs浓度为2.5mM计，1-5曲线依次为其加入量4.0μl、5.0μl、3.0μl、4.5μl和3.5μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图14不同核酸酶抑制剂浓度与相对荧光信号强度关系；1-5曲线依次为核酸酶抑制剂加入量1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.8μl和1.6μl的荧光信号强度曲线；

图15不同AMV反转录酶浓度与相对荧光信号强度关系；以AMV反转录酶浓度为5U/μl计，1-5曲线依次为其加入量1.0μl、1.2μl、1.8μl、1.4μl和1.6μl的对应浓度的荧光信号强度曲线；

图16阳性标准品的扩增曲线；

图17阳性标准品的标准曲线；

图18RT-LAMP产物的PstI酶切图，其中1泳道为酶切主产物分别为187bp、317bp，M泳道为DNA Marker(DL2000)；

图19RT-LAMP产物的电泳图，其中1-8泳道分别对应的RNA模板模板拷贝数依次为2.4×10⁸、2.4×10⁷、2.4×10⁶、2.4×10⁵、2.4×10⁴、2.4×10³、2.4×10²和24copies反应后的电泳图；M泳道为DNA Marker(DL2000)；

图20RT-LAMP产物离心后有白色沉淀图，由于反应中有焦磷酸镁白色沉淀产生，反应后观察到浑浊，瞬时离心后管底有白色沉淀；

图21RT-LAMP产物中加入SYBR Green I后颜色变化图，反应产物中加入100×SYBR Green I后，A图为在紫外灯下观察，阳性为绿色，阴性为无色；B、C图为自然光下直接观察，阳性样品变为黄绿色，阴性对照为棕色，其中1-11分别对应的RNA模板拷贝数依次为2.4×10¹⁰、2.4×10⁹、2.4×10⁸、2.4×10⁷、2.4×10⁶、2.4×10⁵、2.4×10⁴、2.4×10³、2.4×10²、24和2.4copies，1-10为阳性黄绿色，11颜色为棕色，与阴性对照组一致，12为阴性对照，颜色为棕色；

图22RT-LAMP特异性结果，DHAV-3进行了扩增收集到荧光，DHAV-1、鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里氏杆菌不扩增，无荧光收集。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中外引物、内引物及环引物的序列如下：

表1 RT-LAMP相关引物

实施例1DHAV-3阳性标准品制备

一、DHAV-3的VP3基因克隆

1、PCR引物设计与合成

根据DHAV-3的VP3核苷酸序列(如SEQ ID No.1所示)，设计引物如表1F3和B3，合成引物用DEPC水溶解制成浓度为10pmol/μl的溶液，-20℃保存备用。

2、DHAV-3的RNA提取

DHAV-3增殖：用9-11日龄非免疫且无DHAV-3母源抗体的鸭胚，画气室，碘消毒，酒精脱碘，在垂直胚体的气室边缘上方0.1cm处锥一小孔，用2mL注射器吸取DHAV-3病毒液，沿小孔平行刺入0.5-1cm，0.2mL/胚，熔蜡封孔，37℃继续孵育，每12h照胚检查，观察胚体的成活和死亡胚体肝脏、肺脏、脾脏等组织有无特异性的病理变化，弃24h内死亡的胚体，无菌采集24h-96h内死亡胚体的尿囊液，-70℃保存备用。

核酸提取(RNAiso Plus法)：取DHAV-3病毒样品液200μL，加1mL的RNAiso Plus溶液(裂解液)充分振荡，室温作用l0min，使RNA充分暴露；加200μL氯仿，混匀静置5min，12000g、4℃离心15min；取上清液(使用剪去枪头的移液枪：防止下层的蛋白质等的污染)加等体积异丙醇于室温作用，12000g、4℃离心10min，使其彻底沉淀；将上清液去掉，沉淀用1mL的75％乙醇洗涤，7500g、4℃离心10min；上清液去掉，根据沉淀量加适量的无RNase水溶解沉淀，-20℃保存备用。

3.RT-PCR目的片段扩增

(1)cDNA合成

将提纯好的RNA反转录合成cDNA，反应体系及过程如下：取Random 6mers 1μl，加入4μl的dNTPs(2.5μm)，65℃加热5min，置冰上2min，然后加入RNA 2μl，5×Primerscript^TMBuffer 4μl，核酸酶抑制剂1μl，37℃孵育2min，再加入反转录酶1μl，25℃孵育10min，补无RNase水至20μl，37℃孵育50min，70℃孵育15min，冰上冷却，-20℃保存。

(2)PCR反应

PCR反应体系如表2所示，

表2 PCR反应体系

反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察电泳结果如图1所示，1-3泳道为PCR产物，PCR特异性条带大小为217bp；M泳道为DNA Marker(DL2000)。

(3)PCR产物凝胶回收

PCR产物20μl/管，共4管，经1％琼脂糖凝胶电泳后进行回收，根据AxyPrep DNA GelExtraction Kit说明书进行操作，然后取2μl纯化产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。将回收的DNA片段于-20℃保存备用。

二、pGEM-T/VP3重组质粒构建

1、目的片段加A和估浓度

目的片段加A体系如下：目的片段7.5μl，普通酶2.5μl，总体积10μl，72℃反应30min后，取2ul加A的产物电泳，根据DNA Marker对其估浓度，然后进行连接。

2、pGEM-T/VP3连接

pGEM-T/VP3连接体系见表3，16℃连接过夜。

表3 pGEM-T/VP3连接体系

3、转化

取感受态细胞DH5α100μl，冰浴化开，加入连接好的pGEM-T/VP3重组质粒10μl轻轻混匀，冰浴30min，然后42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，冰浴2-3min，加入LB液体培养基900μl，于37℃缓摇孵育1.5-2h后，将培养物适量涂于1.5％琼脂Amp LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16h。挑取白色菌落为模板，接种于含Amp液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以重组菌液为模板进行菌液PCR鉴定，如图2所示：1泳道为菌落PCR产物，条带大小为217bp；M泳道为DNA Marker(DL2000)。

4、阳性菌测序

由于质粒为双链DNA，根据体外转录的原理，应该挑选pGEM-T/VP3上的T7启动子连接的序列为NCBI里RNA序列的方向互补链。

三、体外转录

1.质粒抽提

反向序列的阳性菌抽质粒，步骤如下：①将3-5ml菌液10000rpm离心60s收集沉淀(菌体)；②倒掉上清，并尽可能除干净，将沉淀(菌体)用混旋器完全悬浮于250μl悬浮液(溶液I)中；③加入250μl裂解液(溶液II)，轻柔地颠倒混匀10次左右，不要剧烈振荡，至溶液逐渐变得粘稠、清亮；④加入350μl中和液(溶液III)，轻柔地颠倒混匀10次左右；⑤10000rpm离心10分钟后，将上清液小心转移入一个离心纯化柱中，13000rpm离心1min，重复2遍，倒掉收集管中的废液；⑥加500μl的Buffer HB到离心纯化柱中，10000rpm离心60s，重复两遍倒掉收集管中的废液；⑦将纯化柱重新套入废液收集管中，加入700μl Wash Buffer，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；⑧重复步骤⑦一次，尽可能将杂质及残留的乙醇去除；⑨取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置10分钟，使乙醇充分挥发干加入40μl DEPC水于硅胶膜上，不能粘在管壁上13000rpm离心2分钟；⑩洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次；离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1-2ul电泳(10g/L琼脂糖，120V，15-20分钟)，检测其条带大小为3217bp，如图3所示：1泳道为质粒，因质粒为环状，实际位置略低于线性DNA Maker的3217bp位置；M泳道为DNA Maker(DL15000)。

2.质粒单酶切线性化

将测序后的阳性重组质粒用Sal I酶切2h，使其线性化，酶切体系如表4所示，将溶液混匀后，37℃水浴作用2-3h。

表4 质粒SalI酶切体系

取2μl线性化质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察电泳结果如图4所示：1泳道为质粒(因质粒为环状，实际位置略低于线性DNA Maker的3217bp位置)；2泳道为线性化质粒，大小为3217bp；M泳道为DNA Marker(DL15000)。

3.线性化质粒纯化

用试剂盒回收质粒DNA线性产物步骤如下：①50μl的酶切产物中加入150ul的Buffer DC(如果需加入的Buffer DC量不足100μl时应加入100μl)，然后均匀混合；②将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；③将上述操作①的溶液转移至Spin Column中，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液(如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率)；④将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30s，弃滤液；⑤重复操作步骤④；⑥将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心2分钟；⑦将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25-30μl的DEPC水，室温静置1分钟(将DEPC水加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率)；⑧室温12,000rpm离心2分钟洗脱线性化质粒。其电泳结果如图4所示：1泳道为质粒(因质粒为环状，实际位置略低于线性DNA Maker的3217bp位置)；2泳道为线性化质粒，大小为3217bp；3泳道为纯化后的线性化质粒，大小为3217bp；M泳道为DNA Marker(DL15000)。

4.体外转录

体外转录体系如表5所示，在37℃水浴中反应2-3h后，加入DNase I，37℃水浴中反应15min。转录完毕后，对转录产物进行纯化，纯化方法同实施例1中核酸提取步骤。转录、纯化后的RNA电泳结果如图5所示：其中1泳道为体外转录RNA，大小为291bp(由从T7启动子→217bp目的片段→SalI酶切位点共有291bp)；M泳道为RNA Marker(DL1000)。

表5 体外转录体系

注：体系中模板量为1μg，RNA产物为150ng；若是模板浓度低，产物就减少；若是模板浓度高，会影响产物纯度；根据核酸蛋白仪浓度进行体积换算。

5.阳性标准品浓度测定

提纯的RNA经核酸蛋白质检测仪检测并定量后，采用如下公式计算其拷贝数：

待测样本浓度(ng/uL)＝OD260×340×稀释倍数

样本分子量＝碱基数×324

待测样本拷贝数(copies/μl)＝待测样本浓度/样本分子量×6×10¹⁴

实施例2实时荧光定量RT-LAMP方法的建立与优化

实时荧光定量RT-LAMP反应体系成分如下：阳性标准品体外转录的RNA、BstDNA聚合酶(8U/μl)、20×Thermo Pol Reaction Buffer、AMV反转录酶(5U/μl)、RNase抑制剂(5U/μl)、dNTPs(2.5μM)、F3和B3(10μM)、BIP和FIP(10μM)、LF和LB(10μM)、Betaine(4M)、MgSO₄(300mM)、SYBR Green I(20×)、DEPC H₂O。上述反应体系配好后，按下述方法操作：瞬时离心混匀，放入荧光定量的PCR仪，在一定温度下反应50min，之后在80℃的条件下反应2min(BstDNA聚合酶变性，反应终止)，反应1min后收集荧光，共设置50个循环。

各因素优化过程如下：

(1)反应温度确定

根据BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl、20×Thermo Pol Reaction Buffer 2μl、AMV反转录酶(5U/μl)1μl、RNase抑制剂(5U/μl)1μl、dNTPs(2.5μM)3μl、F3和B3(10μM)混合物0.5μl、BIP和FIP(10μM)混合物2μl、LF和LB(10μM)混合物1μl、Betaine(4M)2μl、MgSO₄(300mM)1μl、SYBR Green I(20×)1μl、DEPC dH₂O 2.5μl、RNA模板2μl共20μl，反应体系配好后，瞬时离心混匀，分别在61.1℃、62.0℃、63.3℃、64.2℃和65.0℃恒温条件下反应50min，反应结束后根据Ct值如表7和荧光曲线如图6，确定最佳的反应温度，该反应的最优温度为64.2℃。

表7 不同温度对应的Ct值

(2)F3/B3浓度(10μM)

优化F3/B3浓度时，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，在反应体系中分别加入0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.7μl、0.9μl的F3/B3(10μM)，对应的DEPC dH₂O体积依次为2.9μl、2.7μl、2.5μl、2.3μl、2.1μl。反应结束后根据Ct值如表8和荧光曲线如图7所示：

表8 不同F3/B3浓度对应的Ct值

根据Ct值说明该反应的最优F3/B3体积为0.5μl，浓度为0.25μM。

(3)BIP/FIP浓度(10μM)

优化BIP/FIP浓度时，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，反应体系中分别加入2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl、4.0μl的BIP/FIP(10μM)，对应的DEPC dH₂O体积依次为2.5μl、2.0μl、1.5μl、1.0μl、0.5μl。反应结束后根据Ct值如表9和荧光曲线如图8所示：

表9 不同BIP/FIP浓度对应的Ct值

根据Ct值说明该反应的最优BIP/FIP体积为4.0μl，浓度为2.0μM。

(4)LF/LB浓度(10μM)

优化LF/LB浓度时，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，反应体系中分别加入0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.50μl的LF/LB(10μM)对应的DEPC dH₂O体积依次为3.0μl、2.5μl、2.0μl、1.5μl、1.0μl。反应结束后根据Ct值如表10和荧光曲线如图9所示：

表10 不同LF/LB浓度对应的Ct

根据Ct值说明该反应的最优LF/LB体积为2μl，浓度为1.0μM。

(5)Betaine甜菜碱(4M)浓度

优化Betaine甜菜碱，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，反应体系中分别加入1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl的Betaine甜菜碱，对应的DEPC dH₂O体积依次为3.0μl、2.5μl、2.0μl、1.5μl、1.0μl。浓度反应结束后根据Ct值如表11和荧光曲线如图10所示：

表11 不同甜菜碱浓度对应的Ct

根据图中各个浓度的Ct值:甜菜碱的最优体积为2.5μl，浓度为0.5M。

(6)BstDNA聚合酶(8U/μl)浓度

优化BstDNA聚合酶，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，反应体系中分别加入0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.2μl的BstDNA聚合酶，对应的DEPC dH₂O体积依次为3.1μl、2.9μl、2.7μl、2.5μl、2.3μl。反应结束后根据Ct值如表12和荧光曲线如图11所示：

表12 不同BstDNA聚合酶浓度对应的Ct

根据图中各个浓度的Ct值：BstDNA(8U/μl)聚合酶最优体积为1.0μl，浓度为0.4U/μl。

(7)镁离子(300mM)浓度

优化镁离子，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，反应体系中分别加入0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl的镁离子(300mM)，对应的DEPC dH₂O体积依次为3.0μl、2.5μl、2.0μl、1.5μl、1.0μl。反应结束后根据Ct值如表13和荧光曲线如图12所示：

表13 不同镁离子浓度对应的Ct值

根据图中各个浓度的Ct值得出镁离子(300mM)最优体积0.5μl，浓度为7.5mM。从扩增曲线和各个浓度对应Ct值看，与其他影响因素相比，镁离子对荧光定量影响最大，明显高于普通RT-LAMP，因此镁离子浓度优化具有重要意义。

(8)dNTPs(2.5μM)浓度

优化dNTPs，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，在反应体系中分别加入3.0μl、3.5μl、4.0μl、4.5μl、5.0μldNTPs，对应的DEPC dH₂O体积依次为2.5μl、2.0μl、1.5μl、1.0μl、0.5μl。反应结束后根据Ct值如表14和荧光曲线如图13所示：

表14 不同dNTPs(2.5μM)浓度对应的Ct

根据图中各个浓度的Ct值确定dNTPs(2.5μM)最优体积为4.0μl，浓度为0.5μM。

(9)核酸酶抑制剂(5U/μl)浓度

优化核酸酶抑制剂(5U/μl)，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，在反应体系中分别加入1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl的核酸酶抑制剂，对应的DEPC dH₂O体积依次为2.5μl、2.3μl、2.1μl、1.9μl、1.7μl。反应结束后根据Ct值如表15和荧光曲线如图14所示：

表15 不同核酸酶抑制剂浓度

根据图中各个浓度的Ct值得出核酸酶抑制剂最优体积为1.0μl，浓度为0.25U/μl。

(10)AMV反转录酶(5U/μl)浓度

优化AMV反转录酶(5U/μl)，除去DEPC dH₂O和本试剂，其余试剂体积不变和优化温度时一样的反应体积，在反应体系中分别加入1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl的AMV反转录酶，对应的DEPC dH₂O体积依次为2.5μl、2.3μl、2.1μl、1.9μl、1.7μl。反应结束后根据Ct值如表16和荧光曲线如图15所示：

表16 不同AMV反转录酶浓度

根据图中各个浓度的Ct值得出AMV反转录酶最优体积为1.0μl，浓度为0.25U/μl。

根据以上优化的反应体系中各个成分，得到最优的反应体系如表17。

表17 最优反应体系(20μl体系)

最佳操作条件为：瞬时离心混匀，放入荧光定量的PCR仪，在64.2℃温度下反应50min，每隔1min收集一次荧光，设置50个循环，在80℃的条件下反应2min(BstDNA聚合酶变性，反应终止)。

若进行定性检测，只需将上述反应体系中1μl的SYBR Green I(20×)换成1μl的DEPC水，放入64.2℃的水浴锅中反应50min，反应结束后加入1μl的SYBR Green I(100×)，观察颜色的变化，即可判断阴阳性。

3.标准曲线构建和灵敏度确定

3.1标准曲线构建

用核酸蛋白质检测仪测定体外转录的RNA浓度，初始浓度为10⁸copies/μl，将模板依次10倍稀释，进行RNA扩增，扩增曲线如图16所示和不同模板浓度对应不同Ct值如表18所示，构建标准曲线如图17所示。

表18 不同模板浓度对应不同Ct值

3.2灵敏度确定

根据标准曲线确定该定量RT-LAMP方法的灵敏度为2.4×10⁴拷贝数；根据反应后加入100×SYBR Green I颜色判断，定性RT-LAMP最低检测限度为24拷贝数，如图21C所示。

4.PstI酶切RT-LAMP产物

根据LAMP反应的原理，用PstI酶切产物后，有两种主产物，分别为187bp、317bp，如图18所示：1泳道为酶切主产物分别为187bp、317bp，M泳道为DNA Marker(DL2000)。

5.反应结果的可视化

5.1RT-LAMP的产物电泳检测

取5μl产物电泳检测，结果如图19所示：1-8泳道分别对应的RNA模板拷贝数依次为2.4×10⁸、2.4×10⁷、2.4×10⁶、2.4×10⁵、2.4×10⁴、2.4×10³、2.4×10²、24copies反应后的电泳图；M泳道为DNA Marker(DL2000)。由于RT-LAMP有多种产物，而且有荧光染料存在，因此电泳条带具有阶梯式其有明显亮带。

5.2浑浊度

由于焦磷酸镁沉淀产生，用肉眼就能观察到反应产物浑浊，瞬时离心有白色沉淀生成，结果如图20所示。

5.3RT-LAMP产物中加入100×SYBR Green I后颜色变化

由于双链DNA存在，在RT-LAMP产物中加入SYBR Green I(100×)，直接观察阳性变为黄绿色，阴性为棕色，用来判断常规RT-LAMP的检测限度，结果如图21C所示，其中1-11分别对应的RNA模板拷贝数依次为2.4×10¹⁰、2.4×10⁹、2.4×10⁸、2.4×10⁷、2.4×10⁶、2.4×10⁵、2.4×10⁴、2.4×10³、2.4×10²、24、2.4copies，1-10颜色为黄绿色，11为棕色，12为阴性对照，颜色为棕色，因此常规RT-LAMP的检测限度为24拷贝数。在紫外灯照射下阳性为绿色，阴性为无色，结果如图21A所示。

6.特异性检测

以DHAV-3为阳性标准品，DHAV-1、DPV、大肠杆菌、沙门氏杆菌、鸭疫里默氏菌、健康鸭胚尿囊液为阴性对照，进行RT-LAMP定量，对应的Ct值如表19和扩增曲线如图22所示。

表19 特异性检测

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括根据3型鸭肝炎病毒VP3基因部分核苷酸序列(如SEQ ID No.1所示)设计的一对外引物、一对内引物以及一对环引物，所述外引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，内引物序列如SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示，环引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

2.如权利要求1所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品、BstDNA聚合酶、20×Thermo Pol Reaction Buffer、AMV反转录酶、核酸酶抑制剂、dNTPs、甜菜碱、Mg²⁺、SYBR Green I和DEPC H₂O。

3.如权利要求2所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中以下成分在反应体系中的终浓度为：BstDNA聚合酶0.4U/μL，AMV反转录酶0.25U/μL，核酸酶抑制剂0.25U/μL，dNTPs 0.5μM，外引物各0.25μM，内引物各2μM，环引物各1μM，甜菜碱0.5M，Mg²⁺7.5mM，SYBR Green I1×或5×。

4.如权利要求2所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按反应体系体积为20μL计，包括：8U/μL的BstDNA聚合酶1μL，20×Thermo Pol ReactionBuffer 2μL，5U/μL的AMV反转录酶1μL，5U/μL的核酸酶抑制剂1μL，2.5μM的dNTPs 4μL，外引物的混合物0.5μL，内引物的混合物4μL，环引物的混合物2μL，4M的甜菜碱2.5μL，300mM的Mg²⁺0.5μL，20×SYBR Green I或100×SYBR Green I 1μL，80ng/μL阳性标准品RNA0.5μL；所述外引物、内引物及环引物中每个引物的浓度均为10μM，相应引物混合的体积比为1:1。

5.如权利要求1～4任一项所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以Ct值为纵坐标，以3型鸭肝炎病毒阳性标准品RNA模板拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线进行定量检测。

6.如权利要求5所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品的制备包括如下步骤：首先以含3型鸭肝炎病毒的尿囊液抽提RNA，反转录合成cDNA，然后以外引物进行PCR扩增得到217bp的目的片段，将目的片段进行回收，构建重组质粒pGEM-T/VP3，测序鉴定后通过体外转录将DNA转录为RNA，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小为291bp，核酸蛋白质检测仪测定RNA浓度，将RNA模板依次10倍稀释得到阳性标准品。

7.如权利要求6所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

8.权利要求1～7任一项所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中用于3型鸭肝炎病毒的定性或定量检测。

9.权利要求1～7任一项所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中定量检测3型鸭肝炎病毒的方法，其特征在于，先制备3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品，然后以阳性标准品RNA为模板，加入引物和试剂，瞬时离心混匀，置于荧光定量PCR仪中61～65℃条件下反应50min，每隔1min收集一次荧光，设置50个循环，在80℃条件下反应2min后停止反应，通过构建标准曲线对结果进行定量分析。

10.如权利要求9所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中定量检测3型鸭肝炎病毒的方法，其特征在于，荧光定量PCR仪中的反应温度为64.2℃。