CN105296677A - 一种甲型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种甲型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、检测范围宽，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取RNA时使用吸附效果好、易于纯化的磁珠法，该法能够有效地去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的RNA，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。

Description

一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
甲型肝炎(以下简称甲肝)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的传染性疾病，甲肝的临床症状与感染者的年龄有关，6岁以下的儿童，70％的感染都是无症状的在年龄稍大的儿童和成人中，感染者多显示临床症状，其中大部分病人都会出现黄疸。甲肝病毒的平均潜伏期是28天，典型的临床症状包括发热、不舒服、厌食、呕吐、腹部不适等，这些症状通常不会超过2个月。目前尚未有证据表明感染甲肝病毒后会导致慢性肝炎或形成持续性感染,但有研究表明，15％到20％的病人会产生较长的病程或者复发，可能会持续长达6个月的时间。
HAV属于小RNA病毒科，肝病毒属，无包膜，在世界范围引起广泛的流行。甲肝病毒主要在肝脏进行复制，产生病毒血症，并通过胆汁分泌到肠道，在病人的粪便中大量存在，每克粪便中会有高达109感染性病毒颗粒，故病人排泄的类便是HAV感染的主要感染源，此外在甲肝病人的唾液中也能检测出甲肝病毒，但病毒载量比血清低1到3个数量级单位。甲肝病毒感染多为自限性，严重的可形成爆发性肝炎并导致死亡。
由于HAV主要通过粪口途径传播,包括人与人的接触和摄取被甲肝患者大便污染的食物或水。但由于HAV感染具有很长的潜伏期,很难在食物中检测病毒,除非能将食物保存下来或者有持续的污染,检测由污染食物导致的散发病例就更加困。
而目前在临床甲肝诊断的方法中，主要是采用基于实时荧光定量PCR(PolymeraseChainReaction，即聚合酶链式反应)的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊断试剂盒在HAV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测甲型肝炎病毒的方法，这些试剂盒所提供的HAV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法，然而酚-氯仿法和柱提取法存在很多不足之处：1)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差、准确度差；2)无法有效去除样本中的PCR抑制物3)无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施；5)现有方法检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，以解决背景技术所述的现有HAV检测方法准确度差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；
所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
5’FAM-CCTGAACCTGCAGGAATTAA-BHQ13’。
优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-TCACCGCCGTTTGCCTAG-3’；
下游引物：5’-GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’。
优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，且所述128碱基对的序列为：
5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’。
优选地，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱基对序列为：
5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13’。
优选地，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’。
优选地，所述DNA聚合酶为1U/μl～5U/μlTthDNA聚合酶和1U/μl～5U/μlH-TaqDNA聚合酶。
优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HAV病毒基因体外转录RNA。
优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为阴性人造血清。
优选地，所述检测试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。
优选地，所述检测试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度是100～500mmol/L的Mn(OAc)2。
优选地，所述检测试剂盒还包括：
RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍、100～400μg/ml的磁珠组成；
RNA提取溶液II：浓度为100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为100～300mmol/L的氯化钠；所述RNA提取溶液II的pH为6.5±0.2；
RNA提取溶液III：由体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通、浓度为100～300mmol/L的氯化钠；
RNA提取溶液IV：矿物油。
本发明还提供了一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用步骤包括：
S01：取体积比为1000-1200：1的RNA提取溶液I和内标，混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；
S02：取体积比为49:1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
S03：在灭菌离心管中加入200μl～1mlRNA提取溶液I-mix，加入100μl～1ml待测样本，震荡混匀，瞬时离心后备用；
S04：在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，静置；
S05：静置结束后瞬时离心，并将灭菌离心管置于磁珠分离器上，缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
S06：在备用的磁珠内加入400μl～1ml的RNA提取溶液III和100μl～500μl的RNA提取溶液IV，震荡混匀并瞬时离心，然后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上；
S07：上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置后，将管底残余液体完全吸出丢弃，上清液中的上层液保留备用；
S08：在上述保留备用的上清液的上层液中加入10μl～100ulRNA洗脱液，将灭菌离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，静置后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上，然后将洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；
S09：在八联管中加入45μl的PCR-mix，并取步骤S08的新的灭菌离心管中已处理好的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入到PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
S10：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒能够对人或动物的血清或粪便标本中的HAV进行定量分析，且仅能检测出HAV的RNA，而不能检测出其它病原体的RNA，进而说明本发明所提供的检测试剂盒具有很好的特异性。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取RNA时使用吸附效果好、易于纯化的磁珠法，该法能够有效地去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的RNA，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。同时，本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还具有操作快速、方法简便、检测范围宽的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法流程示意图；
图2是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒中定量参考品A(5.00E+06copies/ml)、B(5.00E+05copies/ml)、C(5.00E+04copies/ml)和D(5.00E+03copies/ml)的扩增曲线图；
图3是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒中定量分析的标准曲线图；
图4是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对HAV不同基因型的HAV核酸进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图；
图5是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对正常人血清样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图。
具体实施方式
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，解决了现有HAV检测方法准确度差的问题。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括一种PCR反应液，且该PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。
其中，PCR缓冲液为5×PCR缓冲液；脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.2mmol/l；DNA聚合酶包括浓度为1U/μl～5U/μl的TthDNA聚合酶(TthDNApolymerase，即耐热DNA聚合酶)和1U/μl～5U/μl的H-TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus，即H-耐热DNA聚合酶)。
本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索到的HAV病毒各型别基因组序列进行同源性比较，找出保守的区段，设计了多对通用引物，经优化，筛选出了扩增效果相对较好的一对用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物。
其中，该探针的碱基对序列为：5’FAM-CCTGAACCTGCAGGAATTAA-BHQ13’；
用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-TCACCGCCGTTTGCCTAG-3’；
下游引物：5’-GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’。
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒由于采用了上述探针和上下游引物，仅能检测出HAV的RNA，而不能检测出他病原体的RNA，从而说明本发明试剂盒具有很好的特异性。应用本发明提供的检测试剂盒不仅能够对人或动物血清或是粪便标本中的HAV进行定量分析，而且操作快速、方法简便、特异性好。
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的PCR反应液进一步包括内标，即包括阳性内对照，该内标为插入pUC18T载体的一段长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒。在PCR反应体系中，该内标可以监控PCR反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性。其中，该内标的浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/mlcopies/ml，且该内标的128碱基对的序列为：
5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’。
本发明实施例提供的PCR反应液还包括针对128碱基对序列而设计的用于检测内标的非竞争性探针，该非竞争性探针的的碱基对序列为：5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13’。
同时，本发明实施例还提供了用于扩增内标的上下游引物，该上下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’。
优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阳性对照，该阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HAV病毒基因体外转录RNA。
优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阴性对照，该阴性对照为阴性人造血清。
优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括RNA洗脱液，该RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，即三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)和0.1～1.0mol/L的EDTA(EthyleneDiamineTetraaceticAcid，即乙二胺四乙酸)。
优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括RT-PCR增强剂，该RT-PCR增强剂为浓度是100～500mmol/L的Mn(OAc)2(Manganousacetate，即乙酸锰)。
优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进一步还包括：
RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍、100～400μg/ml的磁珠组成；
RNA提取溶液II：浓度为100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为100～300mmol/L的氯化钠；该RNA提取溶液II的pH为6.5±0.2；
RNA提取溶液III：由体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通、浓度为100～300mmol/L的氯化钠；
RNA提取溶液IV：矿物油。
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒所采用的RNA提取溶液能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适用于人或动物血清、血浆、粪便标本中的HAV的RNA提取和PCR检测。
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进一步还包括HAV定量参考品，该HAV定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为5.00E+06copies/m(A)、5.00E+05copies/ml(B)、5.00E+04copies/ml(C)和5.00E+03copies/ml(D)。
请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法流程示意图。将本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒用于检测血浆、血清等样本中HAV-RNA的操作步骤为：
S01：按照人份取体积比为1000-1200：1的RNA提取溶液I和内标，充分混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；
S02：根据待测样本(血浆、血清等待测样本)、阴性对照、阳性对照的数量，取体积比为49：1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
S03：在灭菌离心管中加入200μl～1mlRNA提取溶液I-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心后备用；
S04：在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；
S05：静置结束后瞬时离心，瞬时离心结束后将灭菌离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
S06：在备用的磁珠内加入400μl～1ml的RNA提取溶液III和100μl～500μl的RNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟后瞬时离心，将瞬时离心后的灭菌离心管再次置于磁珠分离器上进行分离；
S07：2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，上清液中的上层液保留备用；
S08：在上述保留备用的上清液中的上层液加入10μl～100ulRNA洗脱液，将灭菌离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；
S09：根据根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向八联管中加入45μl的PCR-mix，并取步骤S08的新的灭菌离心管中处理好的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
S10：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在对HAV的RNA进行提取时所选用的方法为吸附效果好、易于纯化的磁珠法，使用磁珠法提纯HAV的RNA能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的核酸，大大提高检测的灵敏度、准确度和稳定性，其中，检测的灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml。
进一步，将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试包括以下步骤：
(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；
(2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测HAV；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标。
(3)荧光定量PCR反应条件为：
结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对于测定Ct值≤38的样本，报告为HAV-RNA阳性；对于测定无Ct值的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为HAV-RNA阴性。若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。对于测定Ct值>38的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为低于检测下限。
(1)线性范围
荧光PCR扩增结束后，输入HAV定量参考品A-D的浓度，通过软件自助分析可以得知各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果(浓度值)。阳性对照和阴性对照的结果能够验证实验的有效性，HAV定量参考品A-D的扩增曲线和标准曲线请参考附图2和3。
从附图2和3可以看出，PCR反应体系的扩增曲线一致性较好，且线性相关系数为-0.999，说明具有良好的线性关系，同时也能够说明本试剂盒的线性范围为5.00E+09～5.00E+01copies/ml，检测下限可达50copies/ml。
(2)准确性、灵敏性
本发明实施例提供的检测试剂盒对HAV不同基因型(I、11、III、IV、V和VI型)的HAV核酸进行荧光PCR反应测试，反应的测试结果请参考附图4。从附图4中能够看出Ct值从21-41均具有很好的扩增曲线，且线性范围良好，由此可以说明本检测试剂盒具有很高的灵敏度。
从附图4中还可以看出，本发明实施例提供的检测试剂盒对HAV不同基因型的检测结果均为阳性，且阳性符合率为100％，由此可以说明本检测试剂盒具有很高的准确性。
(3)特异性
请参考附图5，附图5示出了本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对正常人血清样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图。
从附图5中可以看出，本发明实施例提供的检测试剂盒通过对正常人血清样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试，反应的结果显示均为阴性，未见扩增产物，且阴性符合率为100％。通过与对HAV不同基因型的HAV核酸进行荧光PCR反应测试结合进行比较可以得出，本发明实施例提供的检测试剂盒仅能检测出HAV的RNA，而不能检测出其它病原体的RNA，由此可以说明本发明所提供的检测试剂盒具有很好的特异性。
(4)磁珠法提纯RNA的独特性
本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提纯RNA方法上还与常用的提纯法(酚-氯仿法和柱提取法)进行比较。通过比较可以得知，本发明的磁珠法提取纯化HAVRNA，血浆、血清样本的HAV检测和内标检测的结果均有Ct值(即都为阳性)，体系中没有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在低浓度血浆、血清样本的HAV检测无Ct值(Undet)的情况(即为阴性)，而此时内标也检测为阴性(Undet)，由于3种提取方法使用的是同一种PCR扩增体系，由此说明，酚-氯仿法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，可能导致HAV阳性样本检测为阴性，即为假阴性，提示应该进行重新检测或者改进方法进行检测。因此，本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆、血清样本的RNA提取和PCR检测。同时也说明，体系中加入内标，可以有效预防假阴性结果。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；
所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
5’FAM-CCTGAACCTGCAGGAATTAA-BHQ13’。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-TCACCGCCGTTTGCCTAG-3’；
下游引物：5’-GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’。
3.根据权利要求2所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，且所述128碱基对的序列为：
5’-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3’。
4.根据权利要求3所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱基对序列为：
5’HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13’。
5.根据权利要求4所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
上游引物：5’-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3’；
下游引物：5’-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3’。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为1U/μl～5U/μlTthDNA聚合酶和1U/μl～5U/μlH-TaqDNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05copies/ml的HAV病毒基因体外转录RNA。
8.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为阴性人造血清。
9.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。
10.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度是100～500mmol/L的Mn(OAc)2。
11.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：
RNA提取溶液I：由质量/体积比为0.2％～1.0％的十二烷基硫酸钠、体积/体积比为1.0％～4.0％的曲拉通，0.2mol/L～1.0mol/L的异硫氰酸胍、100～400μg/ml的磁珠组成；
RNA提取溶液II：浓度为100～300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为100～300mmol/L的氯化钠；所述RNA提取溶液II的pH为6.5±0.2；
RNA提取溶液III：由体积/体积比为0.1％～1.0％的曲拉通、浓度为100～300mmol/L的氯化钠；
RNA提取溶液IV：矿物油。
12.一种权利要求7-11中任意一项所述甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用步骤包括：
S01：取体积比为1000-1200：1的RNA提取溶液I和内标，混和均匀并形成RNA提取试剂I-mix，瞬时离心后备用；
S02：取体积比为49：1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
S03：在灭菌离心管中加入200μl～1mlRNA提取溶液I-mix，加入100μl～1ml待测样本，震荡混匀，瞬时离心后备用；
S04：在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，静置；
S05：静置结束后瞬时离心，并将灭菌离心管置于磁珠分离器上，缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
S06：在备用的磁珠内加入400μl～1ml的RNA提取溶液III和100μl～500μl的RNA提取溶液IV，震荡混匀并瞬时离心，然后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上；
S07：上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置后，将管底残余液体完全吸出丢弃，上清液中的上层液保留备用；
S08：在上述保留备用的上清液的上层液中加入10μl～100ulRNA洗脱液，将灭菌离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，静置后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上，然后将洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；
S09：在八联管中加入45μl的PCR-mix，并取步骤S08的新的灭菌离心管中已处理好的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入到PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
S10：将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
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