CN102676701B - 禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法，属于禽类病毒检测技术领域。该通用型RT-PCR检测引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，检测方法是用禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物和待检样品RNA进行RT-PCR，如果PCR产物片段大小为319bp或320bp，则待检样品中有禽肺病毒。本发明的引物特异性高、且片段小、敏感性高，整个PCR过程可以在2h内完成，能够特异地检测出各亚型APV的存在，可以大大减小对APV感染错漏诊断。

Description

禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法

技术领域

本发明涉及禽类病毒检测技术领域，具体涉及一对禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法。

背景技术

禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV) 又名火鸡鼻气管炎病毒( Turkey Rhinot racheitis Virus，TRTV)，属于副粘病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为单链负股RNA病毒，可引起火鸡和一些其他禽类上呼吸道疾病。APV基因组包含了8个主要的结构蛋白基因，基因组全长约为13.4 kb，8个基因从3'端到5'端排列顺序为N-P-M-F-M2-SH-G-L。最初人们认为APV只有一个血清型，两个基因亚型（A和B），通过核苷酸序列分析和单克隆抗体分析可以有效将两个基因型区分开。上世纪90年代末，分别在美国和法国出现了两种不同的新型的APV毒株（C型和D型），改变了之前的看法，人们由此认为APV至少存在四个以上基因型或者多个血清型的毒株。RT-PCR已经被广泛地应用于APV的病原检测中，设计区别不同亚型APV的RT-PCR比设计通用型RT-PCR简单得多。但将亚型特异性RT-PCR作为首选的检测技术会导致当有新型APV存在的时候常常被忽略掉，不利于对APV感染进行有效地检测，D型APV就是在法国存在超过15年后才被认识到的。现有的用于APV检测引物只能检测出其中的某一种亚型，为了便于全面检测该病毒，急需一种通用型的RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物。

本发明的另一目的是提供一种禽肺病毒RT-PCR检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。

基于上述设计的引物，本发明还保护一种禽肺病毒检测方法，是用上述SEQ ID NO:1~2所示引物和待检样品RNA进行RT-PCR，如果PCR产物片段大小为319bp或320bp，则待检样品中有禽肺病毒。可以使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如果电泳结果在319bp或320bp处出现扩增条带，即表明待检样品中有禽肺病毒。

上述禽肺病毒检测方法中， RT-PCR的反应体系含有一步法PCR混合酶（PrimeScipt 1 Step Enzyme Mix）、缓冲液（2×1 Step Buffer）、SEQ ID NO:1~2所示引物、样品RNA和无RNA酶的水（RNase Free H₂O）。

上述禽肺病毒检测方法中，RT-PCR的反应程序为：

（1）50℃ 30min；

（2）预变性：95℃ 4min；

（3）变性：94℃ 30sec；退火：55~58℃ 20sec；延伸：72℃ 1 min；共进行30个循环；

（4）延伸：72℃10min。

上述RT-PCR反应程序的步骤（3）中退火温度最佳为57℃。

上述禽肺病毒检测方法，RT-PCR扩增产物序列为SEQ ID NO:3~6中的任意一条时，说明待检样品中有禽肺病毒。该检测方法可以同时检测APV病毒的多种亚型，至少包括A、B、C、D四个目前已知的亚型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的引物特异性高、且片段小、敏感性高，整个PCR过程可以在2h内完成，能够特异地检测出各亚型APV的存在，可以大大减小对APV感染错漏诊断。

附图说明

图1. APV各亚型病毒检测电泳结果，其中M：DNA Marker DL2000 ；1、空白对照；2、A型APV；3、B型APV；4、C型APV。

图2. APV各亚型病毒RT-PCR产物测序结果，其中TN-A为A亚型，TN-B为B亚型，TN-C为C亚型，TN-D为D亚型。

具体实施方式

实施例1

1、试验材料

1.1 主要试剂与仪器

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒（Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250），TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa Code:DRR055A)，Thermo高速低温离心机，Thermo PCR仪。

1.2 毒株

A、B型APV弱毒株购自海博莱生物有限公司，C型APV弱毒株购自梅里亚生物有限公司，作为待检样品。

1.3 引物设计

首先对比APV A、B、C、D基因组N基因序列上共同的保守区域，然后设计一对扩增目的带为319bp或者320 bp的引物TN01。

表1

2、试验方法 

2.1 RNA模板制备

使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒（Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250）提取模板RNA（A、B、C型APV弱毒株的RNA），-70℃保存。

2.2 PCR反应

反应体系：使用TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa Code:DRR055A) PCR试剂盒，反应体系为25μL体系，具体如下：

序号	组分	体积
			1	PrimeScipt 1 Step Enzyme Mix	1μL
2	2×1 Step Buffer	12.5μL
			3	TN01-F(10μM)	0.5μL
4	TN01-R(10μM)	0.5μL
			5	模板RNA	5μL(约500ng)
6	RNase Free H2O	补足至25μL

反应条件：逆转录：50℃ 30min；预变性：95℃ 4min；扩增30个循环（包括：变性：94℃ 30sec；退火：57℃ 20sec；延伸：72℃ 1 min）；最后延伸：72℃10min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

3、实验结果

经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR反应获得的目的条带符合预期大小（图1），各亚型APV毒株都能扩增出大小为319bp或者320 bp的目的带。经测序结果显示（见SEQ ID NO:3~5），A、B、C亚型扩增的片段正确，通过序列对比（见图2），TN01理论上还可以检测到D型APV（见SEQ ID NO:6）。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东温氏食品集团有限公司

 

<120>  禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gcaagcttat ggtgcaggtc                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgcatagctt tctgctgca                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  319

<212>  DNA

<213>  APV-A

 

<400>  3

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<210>  4

<211>  319

<212>  DNA

<213>  APV-B

 

<400>  4

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<210>  5

<211>  320

<212>  DNA

<213>  APV-C

 

<400>  5

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<210>  6

<211>  319

<212>  DNA

<213>  APV-D

 

<400>  6

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tgctgctgaa agctatgca                                                 319

 

 

Claims (1)

1.禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。

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