CN106967847B - 一种apmv-4型病毒的检测方法 - Google Patents

一种apmv-4型病毒的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106967847B
CN106967847B CN201710321660.3A CN201710321660A CN106967847B CN 106967847 B CN106967847 B CN 106967847B CN 201710321660 A CN201710321660 A CN 201710321660A CN 106967847 B CN106967847 B CN 106967847B
Authority
CN
China
Prior art keywords
apmv
virus
pcr
type virus
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710321660.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106967847A (zh
Inventor
袁小远
王友令
杨金兴
张玉霞
于可响
宋敏训
亓丽红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201710321660.3A priority Critical patent/CN106967847B/zh
Publication of CN106967847A publication Critical patent/CN106967847A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106967847B publication Critical patent/CN106967847B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种APMV‑4型病毒的检测方法，该方法通过以下步骤实现：首先取200μL的病毒尿囊液，进行样品RNA的提取，然后用25μL DEPC水来溶解RNA，得待测产品；将上述待测产品进行一步法RT‑PCR反应；对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检验。本发明所建立的一步法的RT‑PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV‑4样品的检测，非常适合基层实验室的应用；本发明特异性的针对APMV‑4型病毒，可区分检测APMV‑1型和APMV‑4型的病毒，特异性强，灵敏度高。

Description

一种APMV-4型病毒的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种APMV-4型病毒的检测方法。
背景技术
禽副黏病毒(APMVs)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属（禽流感病毒除外），常常能从世界各地的家禽及野生鸟类中分离得到。目前，腮腺炎病毒属的APMVs分为9个血清型(APMV1~9)。新城疫病毒是禽副黏病毒1型的代表，也是各禽副黏病毒类型中特点和研究最为透彻的。而对禽副黏病毒2~9(APMV2~9)的分子特性和致病性知之甚少，对于APMV-4的研究现在已获悉APMV-4只能从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、支气管炎等呼吸道症状。APMV-4的基因组全长是15054个核苷酸，并与副黏病毒“六规则”一致。基因组包含6个非重叠的基因，囊膜蛋白为NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）和L（RNA依赖性聚合酶）；外部蛋白为M膜蛋白、F（融合蛋白）和HN（血凝素-神经氨酸酶蛋白）。目前针对APMV-4型病毒的相关研究非常少，关于本病的诊断研究则更少。文献《禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立》提供了一种荧光RT-PCR检测方法，该方法成本高，需要昂贵的仪器设备，不适合普通基层实验室进行应用。中国专利CN101892321A公开了一种检测禽副黏病毒1型的方法，该方法仅仅是针对禽副黏病毒1型的NP蛋白的高度保守区设计了引物。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种APMV-4型病毒的检测方法。
本发明所采用的具体技术方案为：
本发明提供了一种APMV-4型病毒的检测方法，该方法所采用的引物为：
APMV4-F：5'- TCACAAGGACTCGAGGCAAC -3'；
APMV4-R：5'- TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3'。
进一步的，所述检测方法具体包括以下步骤：
（1）取200 μL的病毒尿囊液，进行样品RNA的提取，然后用25 μL DEPC水来溶解RNA，得待测产品；
（2）将上述待测产品进行一步法RT-PCR反应；
（3）对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检验。
进一步的，所述RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42 min 20℃，第二步94℃3min，第三步PCR扩增94℃ 20S、52℃ 20S、72℃ 30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。
本发明的有益效果为：本发明建立了可用于检测APMV-4的一步法RT-PCR方法，该方法能克隆微量 mRNA而不需构建cDNA文库，即 cDNA合成与 PCR反应在同一Buffe及酶中进行，减少了反应时间。特异性试验表明本方法特异性强，与新城疫病毒(NDV)无交叉反应。灵敏度高，本发明的检测最小量可为102EID50。因此，本发明所建立的一步法的RT-PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV-4样品的检测，非常适合基层实验室的应用；本发明特异性的针对APMV-4型病毒，可区分检测APMV-1型和 APMV-4型的病毒。
附图说明
图1为一步法RT-PCR检测结果
M. Marker DL 2000 1-3. APMV-4的扩增结果 4. NDV的扩增结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1、参照GenBank中APMV-4的F基因序列，设计一对引物（APMV4-F、APMV4-R），用于扩增F基因部分片段。引物由华大基因公司合成，PAGE plus级纯化。
APMV4-F：5'- TCACAAGGACTCGAGGCAAC -3'
APMV4-R：5'- TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3'，预计扩增798bp。
2、RT-PCR
2.1 RNA提取
选取鸭APMV-4 分离毒株QY17进行检测。病毒RNA的提取按照博日生物Simple RNAkit操作进行，最后用25 μL DEPC水来溶解RNA。
2.2 一步法RT-PCR
RT-PCR按照TaKaRa公司的一步法RT-PCR的操作说明进行：2× PCR Buffer（含dNTP） 25μL、混合酶（RTase、HStaq、RNase inhibitor）2μL、RNA模板10μL、 RNase-free H2O补充至50μL。RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42 min 20℃，第二步94℃3 min，第三步PCR扩增94℃ 20S、52℃ 20S、72℃ 30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µL反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。
RT-PCR 扩增：APMV-4 分离毒株PCR扩增得到预期大小的扩增片段，约0.8kb。对照组NDV （即APMV-1病毒）在此处未出现扩增条带。(见图1)
敏感性试验: 将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行RT-PCR操作。扩增结果显示本方法的检测最小量可为102EID50，说明建立的检测方法灵敏性较好。
对比例1
1.1采用引物（CN101892321A提供的引物）进行检测，
1.2.RNA提取
选取鸭APMV-4 分离毒株QY17和APMV-1病毒进行检测。病毒RNA的提取按照博日生物Simple RNA kit操作进行，最后用25 μL DEPC水来溶解RNA；
1.3 一步法RT-PCR
RT-PCR按照TaKaRa公司的一步法RT-PCR的操作说明进行：2× PCR Buffer（含dNTP） 25μL、混合酶（RTase、HStaq、RNase inhibitor）2μL、RNA模板10μL、 RNase-free H2O补充至50μL。RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42 min 20℃，第二步94℃3 min，第三步PCR扩增94℃ 20S、52℃ 20S、72℃ 30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µL反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。APMV-4 分离毒株QY17和APMV-1病毒都得到了387bp的片段。
结论：无法区分APMV-4及APMV-1病毒。
临床应用
选取14份动物攻毒试验后的组织样品进行上述One-step RT-PCR方法的检测。结果检测出了11株阳性样品，经序列比对证实为APMV-4病毒。以上检测结果与鸡胚接种分离病毒的检测结果一致，由此说明本方法的特异性高，而且检测周期只需几小时，而鸡胚接种检测则需数天完成。
核苷酸序列表
<110>山东省农业科学院家禽研究所
<120>一种APMV-4型病毒的检测方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
TCACAAGGAC TCGAGGCAAC 20
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
TCAATTTCGA GGTCGGCACA 20

Claims (1)

1.一种检测APMV-4型病毒的引物对，其特征在于，所述引物为：
APMV4-F：如SEQ ID NO：1所示；
APMV4-R：如SEQ ID NO：2所示。
CN201710321660.3A 2017-05-09 2017-05-09 一种apmv-4型病毒的检测方法 Active CN106967847B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710321660.3A CN106967847B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种apmv-4型病毒的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710321660.3A CN106967847B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种apmv-4型病毒的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106967847A CN106967847A (zh) 2017-07-21
CN106967847B true CN106967847B (zh) 2020-10-27

Family

ID=59330786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710321660.3A Active CN106967847B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种apmv-4型病毒的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106967847B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531650A (zh) * 2018-04-12 2018-09-14 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） Apmv-1和apmv-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892321A (zh) * 2010-01-29 2010-11-24 中国农业大学 一种检测禽副粘病毒的方法
CN106435021A (zh) * 2016-09-20 2017-02-22 中国农业大学 一种用于检测不同基因型鸡新城疫病毒的试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892321A (zh) * 2010-01-29 2010-11-24 中国农业大学 一种检测禽副粘病毒的方法
CN106435021A (zh) * 2016-09-20 2017-02-22 中国农业大学 一种用于检测不同基因型鸡新城疫病毒的试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Circulation of avian paramyxoviruses in wild birds of Kazakhstan in 2002-2013;Kobey Karamendin等;《Virology Journal》;20161231;第13卷(第23期);第1-9页 *
Limited evidence of intercontinental dispersal of avian paramyxovirus serotype 4 by migratory birds;Andrew B.Reeves;《Infect Genet Evol》;20160630;第40卷;第1-9页 *
王静静等.禽副黏病毒4型荧光PT-PCR检测方法的建立.《中国动物检疫》.2014,第31卷(第3期),第68-70页. *
禽副黏病毒4型荧光PT-PCR检测方法的建立;王静静等;《中国动物检疫》;20141231;第31卷(第3期);第68页摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106967847A (zh) 2017-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106435024B (zh) 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN108064315B (zh) 检测流感的方法
De Battisti et al. Rapid pathotyping of Newcastle Disease Virus by pyrosequencing
US9803251B2 (en) Methods of detecting influenza virus
CN102676701B (zh) 禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
Wei et al. Rapid detection of avian influenza virus a and subtype H5N1 by single step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction
Mihindukulasuriya et al. Nyamanini and midway viruses define a novel taxon of RNA viruses in the order Mononegavirales
CN110343784B (zh) 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
Nidzworski et al. Detection and differentiation of Newcastle disease virus and influenza virus by using duplex real-time PCR
CN106967847B (zh) 一种apmv-4型病毒的检测方法
CN109593892A (zh) 一种扩增h5n6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组、试剂盒及方法
Istimewa Molecular pathotyping of Newcastle disease virus from naturally infected chickens by RT-PCR and RFLP methods
CN108611438A (zh) 同时鉴别h9和h10亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用
CN110669872A (zh) H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法
JP5561708B2 (ja) 鳥インフルエンザウイルスのｎａ亜型判定用プライマーセット
Ghalyanchi Langroudi et al. Phylogenetic study based on the phosphoprotein gene of Iranian Newcastle disease viruses (NDV) isolates, 2010-2012
CN107058630B (zh) 一种牛副流感3型病毒3种基因型多重rt-pcr检测方法
KR101310873B1 (ko) Ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 ａ형 인플루엔자 바이러스 검출 방법
CN103866047B (zh) 用于检测h7n9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒
Boostani et al. Molecular characterization and phylogenetic study of Newcastle disease virus isolates from the 2010 to 2011 outbreaks in Shiraz, Iran
CN108866245B (zh) 鸡细小病毒、禽流感病毒和鸡新城疫病毒三重pcr检测方法的建立
Orozovic et al. Degenerate primers for PCR amplification and sequencing of the avian influenza A neuraminidase gene
TW202108775A (zh) 用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組及方法
Mase et al. Simple differentiation of avirulent and virulent strains of avian paramyxovirus serotype-1 (Newcastle disease virus) by PCR and restriction endonuclease analysis in Japan
Haryanto et al. Single step multiplex RT-PCR for detection and differential diagnosis of avian influenza, newcastle disease and infectious bursal disease viruses in chicken

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant