CN110343784B - 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒 - Google Patents

基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒，所述组合物包括用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒的核酸序列，其中，针对甲型流感病毒引物、乙型流感病毒引物、丙型流感病毒引物和丁型流感病毒引物的序列如下：甲型流感病毒引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；乙型流感病毒引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；丙型流感病毒引物：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；丁型流感病毒引物：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。所述试剂盒包括上述组合物，还包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照。

Description

基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于在核酸检测的领域，具体涉及一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒。
背景技术
目前，流行性感冒病毒(Influenza virus)，是正粘病毒科的代表种，其基因组为分节段单股负链RNA，包括PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP和NS共8个基因节段。根据M节段和NP节段编码蛋白的差异，流感病毒分为甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)和丁型(D)。其中甲型和乙型流感病毒是引起人类和动物流感大流行的主要病原。在世界范围内，每年度流感流行造成约300万至500万例重症病例，其中死亡约25万至50万人。丙型流感病毒发现于1947年，主要在婴幼儿和低龄人群中引起轻症流感症状。而丁型流感病毒于2011年首次分离自猪、牛等家畜，目前在中国和美国地区都有发现。由于流感病毒基因组有相对较高的变异频率，且不同基因背景的流感病毒的各个节段有可能通过混合感染等途径发生交换，由此产生一系列的新型流感病毒。普通人群对新型流感病毒不存在免疫记忆，一旦出现新型流感病毒极其引发流感大流行，造成严重的疾病负担。流感病毒的快速鉴定是应对和防控流感大流行的关键要素。在第一时间鉴定和明确新型流感病毒，有助于快速评估病毒的传播风险和健康危害，为疫情的及时有效控制提供重要的科学依据。
流感病毒的实验室诊断方法主要有病毒分离培养，血清学诊断，抗原检测和病毒核酸检测。其中病毒核酸检测包括普通PCR法、实时荧光PCR(Real-time PCR)法、等温扩增等技术。Real-time PCR具有速度快、通量高、灵敏度高、特异性强等突出优势，从而成为最主要手段的临床诊断方法，辅助病毒分离培养和血清学检测流感病毒。
虽然real-time PCR方法检测灵敏度高于其他检测手段，但传统的单通道检测通量低，针对同一个样本需要使用多组引物/探针组合进行多次检测以确定病毒型别。目前也有部分基于不同颜色基团标记TaqMan探针或熔解曲线的流感病毒核酸检测试剂盒，但此类试剂盒都只覆盖了甲型流感病毒的不同亚型或甲、乙型流感病毒，尚没有一种试剂盒能够在一个反应体系中同时检出目前已知的全部四种流感病毒，本方法建立的新型四重流感病毒核酸检测试剂盒弥补了这一不足。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒，能够在一个反应体系中同时检出目前已知的全部四种流感病毒。
为了实现上述目的，本发明提供的一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物，所述组合物包括用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒的核酸序列，其中，针对甲型流感病毒引物、乙型流感病毒引物、丙型流感病毒引物和丁型流感病毒引物的序列如下：
甲型流感病毒引物：SEQ ID NO.1：CCCCCTCAAAGCCGAGATC
和SEQ ID NO.2：CGTCTACGCTGCAGTCCTC；
乙型流感病毒引物：SEQ ID NO.3：AGGGTTTCCATGTTCCAGCA
和SEQ ID NO.4：AGCCCAAAACTGGAGCTTGA；
丙型流感病毒引物：SEQ ID NO.5：GTCTGGAGAAGCCACCACAA
和SEQ ID NO.6：TGTCGCTTGCCTTTTTCCATG；
丁型流感病毒引物：SEQ ID NO.7：AGGTGTTGGGACTGTTGTG
和SEQ ID NO.8：GTTCTTTTTGCTTGCCAGGAT。
优选地，所述甲型流感病毒引物、乙型流感病毒引物、丙型流感病毒引物和丁型流感病毒引物的浓度均为0.1-0.4μmol/L。
本发明还提供一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒，包括上述的基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物。
进一步地，还包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照。
优选地，所述PCR反应液包括dNTPs和Mg2+。
优选地，所述酶混合液包括反转录酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。
优选地，所述阴性对照为无菌水。
优选地，所述阳性对照为人工合成浓度为1×105copies/mL的合成基因。
本发明提供的基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒，具有如下有益效果：
1、能够在一个反应体系中同时检出目前已知的甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒全部四种流感病毒，一次检测即可以同时检出四种流感病毒；
2、不需较昂贵的探针合成即可完成检测，本发明提供的试剂盒操作简便，适应性好，成本较低；
3、在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性；甲型流感病毒的检出限为1000PFU/mL，乙型流感病毒的检出限为1000PFU/mL，检出限低；本发明试剂盒检测丙型流感病毒核酸最低稀释度为10-6，检测丁型流感病毒核酸最低稀释度为10-6，灵敏度高；可广泛应用于各级医疗卫生机构的流感监测/检测实验室，对临床诊断、人群筛查、动物监测、环境调查等多种样本中的可疑流感病毒进行检测分型，具有适用于多种样本的优势。
附图说明
图1为实施例1中应用于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒核酸检测分型判定的熔解曲线示意图。
图2为实施例2中基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒的特异性试验扩增曲线图。
图3为为实施例2中基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本甲型流感病毒的熔解曲线图。
图4为为实施例2中基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本乙型流感病毒的熔解曲线图。
图5为为实施例2中基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本丙型流感病毒的熔解曲线图。
图6为为实施例2中基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验阳性样本丁型流感病毒的熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测试剂盒，是一种能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒核酸RNA的试剂盒。不仅可应用于人类、动物样本检测，同时也可对环境水样本、空气样本、土壤样本、微生物/病毒培养物样本等多种样本类型进行检测。
利用生物信息学分析技术手段筛选甲型、乙型、丙型和丁型流感病毒的基因保守区，根据保守区序列设计特异性引物对，并确定扩增产物的熔解温度和最佳反应体系的检测程序，并对该检测方法进行灵敏度、特异性、稳定性性能验证，及临床样本检测。
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物，包括用于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒检测的引物序列，各引物序列的浓度为0.1-0.4μmol/L。
用于甲型流感病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
用于乙型流感病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
用于丙型流感病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
用于丁型流感病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，见表1。
表1基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物
SEQ ID NO.1 CCCCCTCAAAGCCGAGATC
SEQ ID NO.2 CGTCTACGCTGCAGTCCTC
SEQ ID NO.3 AGGGTTTCCATGTTCCAGCA
SEQ ID NO.4 AGCCCAAAACTGGAGCTTGA
SEQ ID NO.5 GTCTGGAGAAGCCACCACAA
SEQ ID NO.6 TGTCGCTTGCCTTTTTCCATG
SEQ ID NO.7 AGGTGTTGGGACTGTTGTG
SEQ ID NO.8 GTTCTTTTTGCTTGCCAGGAT
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒，包括基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物、PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照，其中PCR反应液包括dNTPs和Mg2+，酶混合液包括反转录酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂，其中阴性对照为无菌水，阳性对照为人工合成浓度为1×105copies/mL的合成基因。
与现有的TaqMan探针法实时荧光反转录多重检测相比，在具有同样检测性能的基础上不需较昂贵的探针合成即可完成检测，本发明提供的试剂盒操作简便，适应性好，成本较低。
在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性；甲型流感病毒的检出限为1000PFU/mL，乙型流感病毒的检出限为1000PFU/mL，检出限低；本发明试剂盒检测丙型流感病毒核酸最低稀释度为10-6，检测丁型流感病毒核酸最低稀释度为10-6，灵敏度高；可广泛应用于各级医疗卫生机构的流感监测/检测实验室，对临床诊断、人群筛查、动物监测、环境调查等多种样本中的可疑流感病毒进行检测分型，具有适用于多种样本的优势。
实施例1
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒的建立
1、样本核酸提取采用Qiagen公司的
Figure BDA0002122364130000051
Viral RNA Mini Kit试剂盒，制备样本核酸RNA 60μL。
2、配制试剂反应体系为25μL，反应体系组成如表2所示：
表2试剂盒的试剂反应体系
Figure BDA0002122364130000061
3、设置反应条件，如表3所示：
表3试剂盒的反应条件
Figure BDA0002122364130000062
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
4、结果判定
(1)流感病毒核酸的阴阳性判定
扩增曲线呈S形且Ct值≤34，判定为阳性；Ct值≥36，判定为阴性；Ct值＜36且＞34，判定为可疑，需重复检测。
当样本检测阳性，阴性对照检测阴性，阳性对照检测阳性时，结果判定为流感病毒核酸阳性；当样本检测阴性，阴性对照检测阴性，阳性对照检测阳性时，结果判定为流感病毒核酸阴性；除此之外的其他所有情况判定为可疑或检测失败，需重复检测。
(2)流感病毒分型判定
针对流感病毒核酸检测阳性样本，当熔解曲线峰值在81.46±0.25时，判定为甲型流感病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在79.60±0.15时，判定为乙型流感病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在76.43±0.15时，判定为丙型流感病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在75.25±0.15时，判定为丁型流感病毒核酸阳性；当熔解曲线峰值在上述所有范围之外时为检测失败，需重复检测。如图1所示，图1为应用于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒核酸检测分型判定的熔解曲线示意图，显示不同溶解曲线峰型和区分，以甲型流感A/Puerto Rico/8/1934为例，A为甲型流感病毒熔解曲线峰；以乙型流感B/Brisbane/60/2008为例，B为乙型流感病毒熔解曲线峰；以丙型流感C/Victoria/2/2012为例，C为丙型流感病毒熔解曲线峰；以丁型流感D/swine/Oklahoma/1334/2011为例，D为丁型流感病毒熔解曲线峰。
实施例2
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒的特异性分析
利用实施例1中建立的四重流感病毒核酸检测的试剂盒分别对甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型Yamagata流感病毒、乙型Victoria流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、博卡病毒、肠病毒、冠状病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体进行检测。如图2所示，图2为四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验扩增曲线图，其中曲线1为甲型H1N1流感病毒扩增曲线，曲线2为甲型H3N2流感病毒扩增曲线；曲线3为乙型Victoria流感病毒扩增曲线；曲线4为乙型Yamagata流感病毒扩增曲线；曲线5为丙型流感病毒扩增曲线；曲线6为丁型流感病毒扩增曲线；曲线7-17为副流感病毒1型、副流感病毒4型、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、博卡病毒、肠病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、肺炎支原体和肺炎衣原体的扩增曲线。如图3所示，图3为特异性试验阳性样本甲型流感病毒的熔解曲线图，图3中可见阳性样本甲型流感病毒的熔解曲线峰值为81.45；如图4所示，图4为特异性试验阳性样本乙型流感病毒的熔解曲线图，图4中可见阳性样本乙型流感病毒的熔解曲线峰值为79.66；如图5所示，图5为特异性试验阳性样本丙型流感病毒的熔解曲线图，图5中可见阳性样本丙型流感病毒的熔解曲线峰值为76.35；如图6所示，图6为特异性试验阳性样本丁型流感病毒的熔解曲线图，图6中可见阳性样本丁型流感病毒的熔解曲线峰值为75.30。四重流感病毒核酸检测的试剂盒特异性试验的检测结果见表4，可见本发明所述试剂盒在检测其他病原时没有交叉反应，具有很强的特异性。
表4四重流感病毒核酸检测试剂盒特异性确认
样本 检测结果 样本 检测结果
甲型H1N1流感病毒 阳性 副流感病毒1型 阴性
甲型H3N2流感病毒 阳性 副流感病毒4型 阴性
乙型Yamagata流感病毒 阳性 呼吸道合胞病毒 阴性
乙型Victoria流感病毒 阳性 鼻病毒 阴性
丙型流感病毒 阳性 腺病毒 阴性
丁型流感病毒 阳性 博卡病毒 阴性
肠病毒 阴性
冠状病毒HKU1 阴性
冠状病毒OC43 阴性
肺炎支原体 阴性
肺炎衣原体 阴性
实施例3
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测试剂盒的对甲型、乙型流感病毒检出限的确认
利用实施例1中建立的四重流感病毒核酸检测试剂盒分别对甲型流感病毒和乙型流感病毒的不同浓度样本进行检测，结果见表5和表6，表5为重流感病毒核酸检测试剂盒检测甲型流感病毒检出限确认，表6为四重流感病毒核酸检测试剂盒检测乙型流感病毒检出限确认。通过表5和表6，结果显示本检测方法的检出限(LOD)为甲型流感病毒1000PFU/mL，乙型流感病毒1000PFU/mL。
表5四重流感病毒核酸检测试剂盒检测甲型流感病毒检出限确认
样本浓度(PFU/ml) 检测重复数 检测阳性数 阳性检出率
0 20 0 0
10 20 1 5.00％
100 20 3 15.00％
500 20 16 80.00％
1000 20 20 100.00％
5000 20 20 100.00％
10000 20 20 100.00％
表6四重流感病毒核酸检测试剂盒检测乙型流感病毒检出限确认
样本浓度(PFU/ml) 检测重复数 检测阳性数 阳性检出率
0 20 0 0
10 20 0 0
100 20 10 50.00％
500 20 18 90.00％
1000 20 20 100.00％
5000 20 20 100.00％
10000 20 20 100.00％
实施例4
基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测试剂盒的对丙型、丁型流感病毒检测灵敏度的确认
丙型、丁型流感病毒核酸使用无RNA酶去离子水进行10倍梯度系列稀释，利用实施例1建立的四重流感病毒核酸检测试剂盒和实验室其他自建方法(TaqMan real-time RT-PCR)在不同检测仪器上，采用不同的反应程序进行检测。结果显示本发明试剂盒与其他实验室自建方法灵敏度相近，使用本发明试剂盒检测丙型流感病毒核酸最低稀释度为10-6，检测丁型流感病毒核酸最低稀释度为10-6。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市疾病预防控制中心
<120> 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
<130> P20190075
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccccctcaaa gccgagatc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtctacgct gcagtcctc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggtttcca tgttccagca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcccaaaac tggagcttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtctggagaa gccaccacaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtcgcttgc ctttttccat g 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggtgttggg actgttgtg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gttctttttg cttgccagga t 21

Claims (8)

1.一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒的核酸序列，其中，针对甲型流感病毒引物、乙型流感病毒引物、丙型流感病毒引物和丁型流感病毒引物的序列如下：
甲型流感病毒引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
乙型流感病毒引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
丙型流感病毒引物：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
丁型流感病毒引物：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述甲型流感病毒引物、乙型流感病毒引物、丙型流感病毒引物和丁型流感病毒引物的浓度均为0.1-0.4μmol/L。
3.一种基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dNTPs和Mg2+。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括反转录酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无菌水。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为人工合成浓度为1×105copies/mL的合成基因。
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