CN102822352A - 利用核酸色谱法的肺炎病原菌的检出方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌的10种检出对象肺炎菌的迅速且正确的检出方法、检出试剂盒。设计对于10种各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10菌种的各靶区域的引物对集，使用上述引物对集扩增基因产物。进一步设计将上述扩增产物杂交到与引物对集不同的10菌种的各靶区域内的序列的各菌株固有的探针对集。作为上述探针对集，使用结合了多个肺炎菌的第1探针的第1探针结合标记高分子载体、和固相化的第2探针负载展开支持体，进行核酸色谱法。

Description

利用核酸色谱法的肺炎病原菌的检出方法
技术领域
本发明涉及肺炎病原菌的检出方法、检出试剂盒。更具体地说，涉及以肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophilia pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)(Staphylococcus aureus(MRSA))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为检出对象的肺炎病原菌的检出方法、检出试剂盒。
背景技术
目前，肺炎在日本人的分原因死亡率中排第四位，作为癌症等基础疾病的并发症也经常发生，作为患病者数目非常多的疾病已知。以前，作为成为肺炎病因的微生物(病原菌)的探索试验而进行的培养检查至少需要几天时间，若进一步对所培养的病原菌进行药物敏感性试验则花费近一周时间，所以并没有成为充分有助于治疗选择的检查方法。对于需要入住重症监护病室(ICU)的重症肺炎来说，迅速且正确地确定病原菌对于治疗选择是极其重要的，有报道指出适当的初期治疗可以切实地提高肺炎患者的救命几率。但是实际上由于替代培养法的病原菌鉴定技术依然没有确立，所以现状是，不得不在病原菌不明的状态下进行治疗，不得不根据经验治疗使用抗生素，由此有可能会导致出现耐药菌。
对于成为肺炎病因的病原菌，发生频率高的菌株占全体的近50%，包含病毒在内的主要病原菌为20~30种左右。其中也存在不能利用通常的方法来培养的病原菌，此外也存在难以通过培养来确定病原菌的情况。特别是对于需要根据菌株·菌量适当选择抗生素来进行治疗的肺炎来说，同时检出多种肺炎病原菌以及对检出的信号进行定量性的解析是非常重要的。此外，虽然最优的治疗药根据病原菌的种类不同而不同，但是实际情况是，在医疗道德上不得不在确定病原菌之前开始治疗。为了解决这些问题，有待于开发可以从多种菌株中迅速且定量性地检出特定菌的方法。
例如，提出了使用引物集来同时检出4种的呼吸系统感染症病原菌的方法(如参照专利文献1)，所述引物集添加有分别来自编码肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的自溶素(LytA)的LytA基因、编码流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的16SrRNA的基因、编码化脓链球菌的16SrRNA的基因、编码肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的16SrRNA的基因的引物，或进一步添加有来自编码嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的16SrRNA的基因以及编码嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的病原因子MIP蛋白的mip基因的引物。
此外，提出了与呼吸系统疾病相关的10种细菌特异性的引物集以及探针寡核苷酸集(如参照专利文献2和3)，其由下述构成：作为与呼吸系统疾病相关的10种细菌特异性的引物集的，以从含有细菌的试样中分离得到的核酸作为模板，使含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的百日咳杆菌、肺炎嗜衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌中存在的靶序列特异性地扩增的引物集，和特异性地检出上述菌中存在的靶核酸的探针。
此外，提出了可以使选自含有10个以上的连续碱基片段的寡核苷酸中的5种以上的引起呼吸系统疾病的病毒的靶序列同时扩增的核酸引物集，还提出了用于检出麻疹病毒、肠病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合症相关的冠状病毒(SARS-COV)、水痘－带状疱疹病毒(VZV)、腺病毒、人类副流感病毒1型(HPIV1)、人类副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒3(HPIV3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、呼吸道合胞病毒(RSVA)和呼吸道合胞病毒B(RSVB)中一种以上病毒的探针寡核苷酸，其含有选自含有10个以上的连续碱基片段的寡核苷酸以及与其互补的寡核苷酸中的长度为10bp～100bp的一种以上的寡核苷酸，记载了含有由试样得到核酸的步骤、利用上述核酸引物集来使上述核酸扩增的步骤、和检出上述扩增产物的步骤的要点，记载了从试样得到核酸的步骤含有从试样分离RNA的步骤、从分离的RNA得到cDNA的步骤，得到cDNA的步骤例如利用逆转录酶进行，利用逆转录酶的逆转录酶反应可以使用RT-PCR，上述扩增的步骤通过PCR进行的要点(如参照专利文献4)。
另一方面，提出了诺如病毒的简易高灵敏度检出法(如参照专利文献5)，该方法为用于使试样中微量存在的大致区分的诺如病毒的基因组的基因组Ⅰ(G Ⅰ)和基因组Ⅱ(Ｇ Ⅱ)的基因特异性地扩增的方法，其特征在于，由包含下述步骤的步骤构成：由从试样中抽提的RNA，利用在规定温度下可以扩增核酸的NASBA法，得到互补的单链核酸步骤，和对于利用该NASBA法得到的扩增产物，利用在规定温度下可以扩增核酸的RT-LAMP法，进一步扩增核酸的步骤。
本发明人提出了引物集(如参照专利文献6)，其为用于多种肺炎病原菌的检出的引物集，除了使用通常的PCR，还使用多重PCR、实时PCR、RT-PCR等，可以同时检出肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体以及肺炎嗜衣原体，本发明人还提出了靶RNA的检出·定量方法(如参照专利文献7)，该方法含有由16SrRNA中的细菌特异性的RNA链，制备在相当于靶RNA的特异性序列的DNA序列和标签序列的5’末端附加了RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物，本发明人还提出了病原微生物的检出方法(如参照专利文献8)，其中，为从选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)属细菌、链球菌(Streptococcus)属细菌、克雷伯菌(Klebsiella)属细菌、埃希氏菌(Escherichia)属细菌、分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌、军团菌(Legionella)属细菌、弧菌(Vibrio)属细菌、芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、奈瑟氏菌(Neisseria)属细菌、弯曲杆菌(Campylobacter)属细菌、衣原体(Chlamydia)属菌、嗜衣体(Chlamydophila)属菌、支原体(Mycoplasma)属菌、李斯特氏菌(Listeria)属细菌、沙门氏菌(Salmonella)属细菌以及耶尔森氏菌(Yersinia)属细菌中的1种或2种以上的细菌中选择的2种以上，具有：使用具有标签序列和对上述病原微生物保持的DnaJ基因上的靶核酸选择性退火而得到的碱基序列的至少1种的第1引物集，和具有与上述标签序列实质上相同的标签序列的至少1种的第2引物集，实施聚合酶链反应的聚合酶链反应步骤，和检出含有上述靶核酸的扩增产物的步骤。
此外，已经开发了下述核酸的检出或者定量方法，该方法为用于特异性地检出或者定量试样中的靶核酸的方法，含有由试样中任意抽提的靶核酸，使用未结合半抗原或者肽的引物，作为单链核酸进行扩增的步骤，与将该扩增产物结合于膜的与扩增产物互补的第1寡核苷酸探针以及用着色高分子载体标记的互补的第2寡核苷酸探针进行杂交而检出的步骤，和通过目视判定对该检出图像进行评价的步骤，例如确立了以从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的培养菌株中抽提的全RNA作为模板进行NASBA扩增反应，通过核酸色谱条检出扩增产物的方法(如参照专利文献9)。
虽然报道了组合NASBA法和核酸色谱法，用于检出诺如病毒基因的2种基因类型的试剂(スイフトジ一ン诺如病毒Ｇ Ｉ／Ｇ II“カイノス”)，但是上述试剂大致区分并判定遗传性多样的15种以上的基因型所属Ｇ Ｉ类型和18种以上基因型所属Ｇ Ⅱ类型，不具有用于鉴定肺炎病原菌的精度。
现有技术文献
专利文献1：日本特开2005-110545号公报
专利文献2：日本特开2006-174837号公报
专利文献3：日本专利第4235645号公报
专利文献4：日本特开2006-180878号公报
专利文献5：日本特开2009-240207号公报
专利文献6：日本特开2009-39046号公报
专利文献7：国际公开2009/057330号小册子
专利文献8：国际公开2008/041354号小册子
专利文献9：日本专利4268944号公报
发明内容
本发明的目的是，提供在诊断肺炎患者时，迅速且正确地检出肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌(这些单独的细菌以下有时称为“检出对象肺炎菌”、或简称为“肺炎菌”、总称为“10种检出对象肺炎菌”)的方法、用于此的检出试剂盒。
本发明人为了实现临床上的实用化，对于进一步提高肺炎病原菌检出精度的方法进行研究，以DnaJ基因具有16SrRNA序列的约10倍的基因多态性的发现为基础，以DnaJ区域为主，以各种肺炎菌特异性的基因区域为中心，设计对于10种各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10种检出对象肺炎菌的各靶区域的引物对集，发现使用该引物对集，通过NASBA法扩增基因产物，定性·定量作为扩增产物的靶核酸，可以高精度地检出多种肺炎病原菌。进一步设计将该扩增产物杂交到与引物对集不同的10种检出对象肺炎菌的各靶区域内的序列而得到的各种肺炎菌固有的探针对集，发现通过使用上述探针对集进行核酸色谱法，用一次操作就可以高精度地检出多种甚至10种的检出对象肺炎菌，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：(1)一种检出方法，该检出方法为以选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌中的至少3种肺炎菌类作为检出对象的肺炎病原菌的检出方法，其特征在于，该检出方法具有1)由从试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸，利用引物，作为单链核酸扩增的步骤(a)，2)制备选自与扩增产物互补的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3种探针对的步骤(b)，3)使至少3种各肺炎菌的第1探针结合到标记高分子载体上，制备第1探针结合标记高分子载体的步骤(c)，4)制备使与第1探针成对的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的第2探针负载展开支持体的步骤(d)，5)将上述扩增产物杂交到负载在展开支持体上的第2探针以及结合在标记高分子载体上的第1探针而进行检出的步骤(e)，6)通过判定检出图像来进行评价的步骤(f)的各步骤；(2)根据上述(1)记载的检出方法，其特征在于，引物为选自由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种引物对；(3)根据上述(1)或者(2)记载的检出方法，其中，至少3种的各肺炎菌的第1探针由选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种DNA构成，与第1探针成对的至少3种的各肺炎菌的第2探针为选自序列号11～20表示的核苷酸序列中的至少3种DNA。
此外，本发明涉及：(4)一种试剂盒，该试剂盒为以选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌中的至少3种肺炎菌类作为检出对象的肺炎病原菌的检出试剂盒，其特征在于，该试剂盒具有选自可以扩增由试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸的、由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种引物对；(5)根据上述(4)记载的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进一步具有1)选自与扩增产物互补的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3种各肺炎菌的第1探针结合在标记高分子载体而成的第1探针结合标记高分子载体，2)与第1探针成对的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的第2探针负载展开支持体；(6)根据上述(5)记载的试剂盒，其特征在于，至少3种的各肺炎菌的第1探针由选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种DNA构成，与第1探针成对的至少3种的各肺炎菌的第2探针为选自序列号11～20表示的核苷酸序列中的至少3种DNA。
通过本发明，在诊断肺炎患者时，可以利用简便的方法迅速且正确地鉴定肺炎病原菌。
附图说明
图1为表示以8株卡他莫拉菌为对象，利用引物对的验证数据的图。
图2为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，肺炎链球菌的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图3为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物，嗜肺军团菌的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图4为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，肺炎克雷伯菌的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图5为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，卡他莫拉菌的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图6为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，金黄色葡萄球菌的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图7为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，肺炎支原体的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图8为表示利用本发明中所用的肺炎菌特异性的引物对，肺炎嗜衣原体的利用NASBA法扩增靶基因的RNA的数据的图。
图9为表示实施本发明所用的10对引物的多重化时，各引物对与靶菌以外的对象菌有无非特异性反应的验证结果的图。
图10为表示对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血杆菌，通过使用多重引物的NASBA法检出靶RNA扩增产物的图。
图11为表示对于金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，使用对应于各菌的引物对，通过使用多重引物的NASBA法进行RNA扩增时，检出靶RNA扩增产物的图。
图12为表示对于卡他莫拉菌，通过实时PCR确认利用NASBA扩增的RNA为目的的靶NASBA产物的图。
图13为表示本发明的核酸色谱法的一个具体例子的示意图。
图14为表示对各肺炎菌专用探针间的非特异结合进行研究的图。
图15为表示对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，使用对应于各菌的引物对，分别利用NASBA法进行RNA扩增时，通过核酸色谱检出靶RNA扩增产物的图。
图16为表示各探针与靶菌以外的对象菌有无非特异性反应的验证结果的图。
图17为表示对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，使用对应于各菌的引物对，通过使用多重引物的NASBA法进行RNA扩增时，通过核酸色谱检出靶RNA扩增产物的图。
图18为将肺炎病原菌5菌株用于本发明的核酸色谱测定用试验片的图。
具体实施方式
作为本发明的检出肺炎病原菌的方法，若为具有1)由从试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸，利用引物，作为单链核酸扩增的步骤(a)，2)制备选自与扩增产物互补的序列号1～20表示的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3种探针对的步骤(b)，3)使选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种各肺炎菌的第1探针结合到标记高分子载体上，制备第1探针结合标记高分子载体的步骤(c)，4)制备使选自序列号11～20表示的核苷酸序列中的、与第1探针成对的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的负载固相化第2探针的展开支持体的步骤(d)，5)将上述扩增产物杂交到负载在展开支持体上的固相化第2探针以及结合在标记高分子载体上的第1探针而检出的步骤(e)，6)通过判定检出图像来进行评价的步骤(f)的，以选自10种检出对象肺炎菌中的至少3种检出对象肺炎菌作为检出对象的方法，则不特别限定，但是作为检出对象肺炎菌，优选检出至少5种，即5～10种。
作为本发明的检出肺炎病原菌的方法，也可以使用具有：1）制备选自可以扩增由试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸的由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种引物对的步骤(a’)，2)使有可能含有检出对象的肺炎菌类的核酸的被检试样与至少3种嵌合引物对接触，利用RNA扩增法扩增基因产物的步骤(b’)，3)定性·定量作为扩展产物的靶核酸的步骤(c’)的，以选自10种检出对象肺炎病原菌中的至少3种检出对象肺炎病原菌作为检出对象的方法。该方法中，作为检出对象肺炎菌，优选检出至少5种，即5～10种。
上述检出对象肺炎菌为3种时，可以举出由下述构成的120组的3种肺炎菌类的组合：多在外来患者中检出的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌以及肺炎嗜衣原体(以下也称为“外来患者用检出对象肺炎菌”)中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及肺炎支原体，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及嗜肺军团菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及肺炎嗜衣原体等3种组合，由于医院内感染多在住院患者中检出的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、MRSA、卡他莫拉菌(以下也称为“住院患者用检出对象肺炎菌”)中，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌以及金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌以及MRSA，铜绿假单胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，金黄色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌等3种组合，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及铜绿假单胞菌等3种组合等。
上述检出对象肺炎菌为4种时，可以举出由下述构成的210组的4种肺炎菌类的组合：在外来患者用检出对象肺炎菌中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体以及嗜肺军团菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体以及肺炎嗜衣原体，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌以及肺炎嗜衣原体，肺炎链球菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌以及肺炎嗜衣原体，流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌以及肺炎嗜衣原体等4种组合，在住院患者用检出对象肺炎菌中，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌以及MRSA，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA以及卡他莫拉菌，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌等4种组合，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌以及MRSA等4种组合等。
上述检出对象肺炎菌为5种时，可以举出除了外来患者用检出对象肺炎菌5种、住院患者用检出对象肺炎菌5种之外，还有由下述构成的252组的5种肺炎菌类的组合：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、MRSA以及金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌以及肺炎嗜衣原体，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、MRSA以及卡他莫拉菌等。
上述检出对象肺炎菌为6种时，可以举出由下述构成的210组的6种肺炎菌类的组合：外来患者用检出对象肺炎菌以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、肺炎嗜衣原体以及铜绿假单胞菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、铜绿假单胞菌以及MRSA，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。
上述检出对象肺炎菌为7种时，可以举出由下述构成的120组的7种肺炎菌类的组合：外来患者用检出对象肺炎菌、MRSA以及金黄色葡萄球菌，外来患者用检出对象肺炎菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。
上述检出对象肺炎菌为8种时，可以举出由下述构成的90组的8种肺炎菌类的组合：外来患者用检出对象肺炎菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，外来患者用检出对象肺炎菌、铜绿假单胞菌、MRSA以及金黄色葡萄球菌，外来患者用检出对象肺炎菌、铜绿假单胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、铜绿假单胞菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。
上述检出对象肺炎菌为9种时，可以举出由下述构成的10组的9种肺炎菌类的组合：外来患者用检出对象肺炎菌、MRSA、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌以及肺炎克雷伯菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、MRSA、金黄色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。
作为上述步骤(a)中的制备扩增产物的方法，若为将从有可能含有检出对象肺炎菌的试样中任意抽提的上述各检出对象肺炎菌特异性靶核酸，利用可以扩增该靶核酸的引物，作为单链核酸进行扩增的方法则不特别限定。作为上述各肺炎菌特异性的靶核酸，可以举出肺炎链球菌的lytA、流感嗜血杆菌的dnaJ、肺炎支原体的dnaJ1、肺炎嗜衣原体的dnaJ、金黄色葡萄球菌的spaA、MRSA的mecA、嗜肺军团菌的dnaJ、卡他莫拉菌的dnaJ、铜绿假单胞菌的dnaJ、肺炎克雷伯菌的dnaJ中所含区域的核酸。
上述步骤(a)或者(a’)中所用引物对是可以扩增10种检出对象肺炎菌中的各肺炎菌特异性的靶核酸的引物对，是含有选自序列号21～40表示的核苷酸序列中的因各检出对象肺炎菌而不同的靶序列的引物对。更具体的说，对于肺炎链球菌来说，使用含有5’
-CAATCTAGCAGATGAAGCAGG-3’(序列号21)和5’-GGTTGTTTGGTTGGTTATTCG-3’(序列号31)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于流感嗜血杆菌来说，使用含有5’-TCAATACTCTTGCACATTGTGAT-3’(序列号22)和5’-ATACGAAGAAACCTTGCTGAC-3’(序列号32)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于肺炎支原体来说，使用含有5’-CCGGGATGGTTAGCTGTAACAG-3’(序列号23)和5’-TACCTTCTTGTACTTACTTCC-3’(序列号33)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于肺炎嗜衣原体来说，使用含有5’-CATGGTGTTGAGAAGGAACTTGTAGT-3’(序列号24)和5’-TCCACGACTCTGTACCACTTG-3’(序列号34)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于嗜肺军团菌来说，使用含有5’-CGTCAATCACGTGGACAAAGAG-3’(序列号25)和5’-AGTACCATGTCTTGGAACGGT-3’(序列号35)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于克雷伯菌来说，使用含有5’-GAAGTTCCGATCAACTTCAC-3’(序列号26)和5’-AAGCTCTCCTGAAGCTCTTT-3’(序列号36)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于铜绿假单胞菌来说，使用含有5’-ACAGGGATCGGAAATCAT-3’(序列号27)和5’-CGCGGACCTGCGCTACACCCTGGACC-3’(序列号37)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于卡他莫拉菌来说，使用含有5’-CAAAGGCTTGCCCAAAGATA-3’(序列号28)和5’-GAAGCCGAAGAAAAGCTCAA-3’(序列号38)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于MRSA来说，使用含有5’-GTATGTGGAAGTTAGATTGGG-3’(序列号29)和5’-GATACATTCTTTGGAACGAT-3’(序列号39)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于金黄色葡萄球菌来说，使用含有5’-GAGTACATGTCGTTAAACCTGGTG-3’(序列号30)和5’-TACAGTTGTACCGATGAATGG-3’(序列号40)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合。此外，取代上述序列，对于肺炎克雷伯菌来说，也可以使用含有5’-AGCGTATGAAATCCTGACTGAT-3’(序列号54)和5’-CAAAGATATCGCTGAAGTCG-3’(序列号56)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合，对于铜绿假单胞菌来说，也可以使用含有5’-GCGAGGTGTCGCTCTGCAAC-3’(序列号55)和5’-GATGTGCAAGGTGGTGGTGGA-3’(序列号57)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物构成的引物对的组合。
作为上述正向引物，使用由序列号21~30、54或55表示的核苷酸序列构成的引物。对于这些因各检出对象肺炎菌而不同的10种各靶序列的5’末端侧可以附加标签序列。作为上述标签序列，可以举出5’-TAGCAGGATCCCTCTAAG-3’(序列号41)。作为上述反向引物，使用由序列号31~40、56或57表示的核苷酸序列以及附加于这些因各检出对象肺炎菌而不同的10种各靶序列的5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的引物。作为上述RNA聚合酶启动子序列，可以举出T7RNA聚合酶的启动子序列、T3RNA聚合酶的启动子序列、SP6RNA聚合酶的启动子序列等，但是其中T7RNA聚合酶的启动子序列由于高的RNA扩增效率而优选。作为T7RNA聚合酶的启动子序列，可以举出例如5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’(序列号42)、5’-CTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’(序列号43)。上述序列号21~40或者54~57表示的核苷酸序列中，即使1个碱基或者几个(例如1~5个，优选1~3个，更优选1~2个，进一步优选1个)碱基缺失、置换或者附加，只要可以扩增各肺炎菌特异性的靶核酸，则也可以用作本发明中的引物。上述正向引物、反向引物，可以使用DNA合成装置通过常规方法合成。
作为上述步骤(a)或者(b’)中的有可能含有检出对象的肺炎菌类的核酸的被检试样，可以举出肺炎患者的唾液、咳痰、外周血、支气管肺泡洗涤液、鼻腔洗涤液、漱口液、鼻咽拭子以及它们中含有的微生物、上述微生物培养物的细胞溶解液等。作为用于从上述被检试样抽提核酸的方法，除了使用硫氰酸胍的RNA抽提法、使用EDTA-SDS-苯酚-乙醇的核酸抽提法等公知的方法之外，还可以使用Extragen Ⅱ(東ソ一社制)、Mora-Extract(Advanced Microorganism Research公司制)等市售品。可以将抽提的RNA、DNA适当进行断裂处理，制备含有1个或者多个的靶RNA、靶DNA的5’侧序列和3’侧靶特异性序列的RNA、DNA。
靶核酸为靶RNA时，为了扩增上述步骤(a)或者(b’)中所用的靶核酸，可以使用NASBA法、转录介导扩增法(TMA法)、利用转录酶和逆转录酶的协同反应的RNA扩增·检出法(Transcription Reverse TranscriptionConcerted Reaction，TRC法)等公知的RNA扩增法，但是可以有利地利用NASBA法、特别是国际公开2009/057330号小册子中记载的NASBA法。该NASBA法是通过RNA聚合酶、逆转录酶扩增试样中的靶RNA的方法，例如国际公开2009/057330号小册子中记载的NASBA法中公开了由下述步骤构成的方法：(A)将含有相当于靶RNA的5’侧靶特异性序列的DNA序列的序列号1~10表示的嵌合引物的5’末端固定于基板表面上，制备固相DNA(＋)引物的步骤；(B)制备在含有与靶RNA的3’侧序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加了T7RNA聚合酶启动子序列的、序列号11~20表示的液相cDNA(-)引物的步骤；(B’)根据需要，制备在标签序列的5’末端附加了RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物的步骤；(C)制备含有靶RNA的3’侧序列和5’侧靶特异性序列的试样RNA的步骤；(D)使步骤(B)中制备的液相cDNA(-)引物与步骤(C)中制备的试样RNA链在液相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶延伸DNA(-)链，制备cDNA链-RNA链复合体的步骤；(E)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于步骤(D)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA(-)的步骤；(F)使步骤(E)中制备的单链DNA(-)与步骤(A)中制备的固相DNA(+)引物在液相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性能的酶延伸DNA(+)链，制备双链DNA的步骤；(G)使RNA聚合酶作用于步骤(F)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链的RNA聚合酶启动子序列，扩增单链RNA(-)的步骤。
靶核酸为靶DNA时，为了扩增上述步骤(a)或者(b’)中所用靶核酸，可以使用NASBA法、PCR法、链置换扩增法(SDA法)、连接酶链反应法(LCR法)等。作为正向引物，使用选自序列号21~30、54或55表示的核苷酸序列中的引物，作为反向引物，使用含有序列号31~40、56或57表示的核苷酸序列的引物。
上述步骤(b)中使用的探针对，为选自与上述扩增产物互补的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探针对，例如为选自序列号1~20表示的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探针对，序列表中为了方便以DNA序列表示，但是可以为由DNA的核苷酸序列构成的探针对，或由RNA的核苷酸序列构成的探针。但是由于作为探针的稳定性优异，优选为由DNA的核苷酸序列构成的探针对。
作为成为上述检出对象的因各肺炎菌而不同的探针对，可以具体地表示为肺炎链球菌的5’-ACGCACGAGTATTGCACGAATAACC-3’(序列号1)和5’-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGT-3’(序列号11)，流感嗜血杆菌的5’-AAACTTGTCCGCATTGCCACGGTTC-3’(序列号2)和5’-CTCTGGGGCTGAAAAAGGTTCTAAAG-3’(序列号12)，肺炎支原体的5’-AGGCCAAACACAAGTGTAAGACTTG-3’(序列号3)和5’-AGAATCAACGCTCCATCTTTGGTAC-3’(序列号13)，肺炎嗜衣原体的5’-ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’(序列号4)和5’-TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’(序列号14)，嗜肺军团菌的5’-GAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC-3’(序列号5)和5’-CAATTGACCCTTGAAGAAGCAGCTA-3’(序列号15)，肺炎克雷伯菌的5’-GTGGTGGAGACGCCGGTGGGGCTGA-3’(序列号6)和5’-TGAAACCCAGACCGGCAAGCTGTTC-3’(序列号16)，铜绿假单胞菌的5’-GGTGACCGGTGTGGTGCCGG-3’(序列号7)和5’-GTCTTGCAACCGACCAGGGTCGGCA-3’(序列号17)，卡他莫拉菌的5’-GGTTGCGCGTTTTTCAGGATCACTG-3’(序列号8)和5’-CCACCAGAGCCCATGCCTTGTTCAT-3’(序列号18)，MRSA的5’-AGACCGAAACAATGTGGAATTGGC-3’(序列号9)和5’-ATGCAGAAAGACCAAAGCATACATAT-3’(序列号19)，以及金黄色葡萄球菌的5’-CATGATCAAACCTGGTCAAGAACTTG-3’(序列号10)和5’-CGGCACTACTGCTGACAAAATTGCT-3’(序列号20)的组合。此外，作为探针对，也可以使用流感嗜血杆菌的5’-AACTTGTCCGCATTGCCACGGTTCT-3’(序列号44)和5’-TGTGATAGCTGTGGTGGCTCTGGGG-3’(序列号49)，肺炎嗜衣原体的5’-TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’(序列号45)和5’-ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’(序列号50)，嗜肺军团菌的5’-AAGAAGCAGCTATAGGAAAAGAAGT-3’(序列号46)和5’-GGGGCGCTGATTTGCAATTTAATGT-3’(序列号51)，肺炎克雷伯菌的5’-TCGAACAGGGCGGCATGGGCGGCGG-3’(序列号47)和5’-CAGAAGCGTGCGGCCTACGATCAGT-3’(序列号52)，铜绿假单胞菌的5’-TCCAGGTTCACCGGGGTTTCCACC-3’(序列号48)和5’-GCTCTGCAACGACTTGCGGAACTC-3’(序列号53)的组合。
可以将上述10种探针对中的任意一种作成步骤(c)中的第1探针或者步骤(d)中的第2探针，或根据预想其存在的检出对象肺炎菌等适当选择·确定。此外，上述序列号1~20或者44~53表示的核苷酸序列中，即使1个碱基或者几个(例如1~5个，优选为1~3个，更优选为1~2个，进一步优选为1个)碱基缺失、置换或者附加，只要可以检出各肺炎菌特异性的靶核酸，则可以用作本发明中的探针。
作为上述步骤(c)中的第1探针，可以举出与上述第2探针成对的至少3种探针，例如选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的与第2探针成对的至少3种、优选至少5种的各肺炎菌的第1探针，例如，可以同时使用2组的5种各肺炎菌的第1探针结合在标记高分子载体上而成的第1探针结合标记高分子载体。作为将上述多种第1探针结合到标记高分子载体上的方法，可以举出将具有在5’或者3’末端引入了附加基团的序列号1～10表示的核苷酸序列的DNA，结合到引入了附加基团的标记高分子载体上的方法。作为上述附加基团，可以举出氨基、羧基、羟基、巯基等。例如，标记高分子载体被羧基修饰时优选为氨基。此外，由于将多个第1探针结合在一个标记高分子载体上，这种情况，在检出时，由于没有必要像以往那样将一个第1探针结合在一个标记高分子载体而成的第1探针结合标记高分子载体多种混合，所以不仅检出操作简便，而且可以将标记胶乳等下述的标记高分子载体浓度设定到最优浓度，所以优选。本发明的一个具体例以示意图方式如图13所示。
作为上述标记高分子载体中的高分子载体，可以举出羧基甲基纤维素(CMC)、具有羧基的聚丙烯酸盐等亲水性树脂，丙烯酸类胶乳、聚酯类胶乳、聚苯乙烯类胶乳、聚氨酯类胶乳、聚乙酸乙烯酯类胶乳、SBR树脂、NBR树脂、聚酰胺类胶乳、羧基改性聚苯乙烯类胶乳等胶乳等，而向上述序列号1～10表示的核苷酸序列中引入氨基时，利用通过氨基和羧基产生共价键的反应，容易将选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种、优选至少5种各肺炎菌的第1探针结合到标记高分子载体上，所以优选为在聚苯乙烯类胶乳中引入羧基而成的羧基改性聚苯乙烯类胶乳，具体地说，可以使用含羧基的聚苯乙烯胶乳(固体成分4%(w/w))(Duke Scientific公司制)、含羧基的聚苯乙烯胶乳(固体成分10%(w/w))(Bangs公司制)。
作为具体的结合了多个第1探针的标记高分子载体的第1探针结合标记高分子载体的制备方法，可以举出例如将在选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种各肺炎菌的5’末端引入了氨基的第1探针、和含羧基的聚苯乙烯胶乳（Bangs公司制）、和水溶性碳化二亚胺在50mM的MES(2-吗啉乙磺酸一水合物，2-Morpholinoethanesulfonic acid，monohydrate)(同仁化学研究所社制)缓冲液中混合，使胶乳中的羧基与第1探针的氨基结合后，添加单乙醇胺（和光纯药工业社制），进一步进行反应，将上述反应液离心分离后除去上清液，对得到的沉淀用含有非离子性表面活性剂的HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid)(埼京化成社制)缓冲液洗涤以及再悬浮来制备的方法。此外，高分子载体的粒径尺寸可以适当选择，但是，优选从比膜孔径小的粒径中选择，例如可以选择直径500nm以下的粒子尺寸。
此外，作为上述标记高分子载体，可以使用呈现出可以与展开支持体的颜色区别的颜色的高分子载体，也可以使用用颜料等着色的高分子载体，除此之外还可以使用荧光标记高分子载体。
作为上述步骤（d）中的第2探针，可以举出与上述第1探针成对的至少3种探针，例如选自序列号11~20表示的核苷酸序列中的与第1探针成对的至少3种，优选至少5种的各肺炎菌的第2探针。上述第2探针固相化在支持体上，可以使一个第2探针在支持体的规定位置固相化（专用），也可以使多个第2探针在支持体的规定位置固相化（共用）。作为制备负载展开第2探针的支持体的方法，可以举出在各肺炎菌展开支持体上可以识别的规定位置固相化第2探针的方法。可以举出例如将在5’或者3’末端引入了附加基团的具有序列号11~20表示的核苷酸序列的探针在展开支持体上固相化的方法。作为上述附加基团，可以举出氨基、羧基、羟基、巯基等，但是例如展开支持体被羧基修饰时优选为氨基，无论有无附加上述附加基团，都可以利用化学合成法等公知的方法制备第2探针。
作为上述展开支持体，可以举出尼龙膜或羧基修饰尼龙膜等尼龙膜衍生物、纤维素膜或硝酸纤维素膜等纤维素膜衍生物等。但是，在上述序列号11~20表示的核苷酸序列中引入氨基时，利用通过氨基和羧基产生共价键的反应，容易将选自序列号11~20表示的核苷酸序列中的至少3种、优选至少5种的各肺炎菌的第2探针在展开支持体上的可以识别的规定位置上固相化，所以优选为羧基修饰尼龙膜。
作为负载第2探针的展开支持体的具体的制备方法，可以举出例如将羧基修饰尼龙膜用水溶性碳化二亚胺处理，用去离子水洗涤使其活化，在上述活化的羧基修饰尼龙膜上，将具有第2探针序列的核苷酸适当在所分配的规定位置固相化以对于各肺炎菌可以识别，风干15分钟，之后对固相化了具有第2探针序列的核苷酸的羧基修饰尼龙膜用Tris基础缓冲液处理，由此除去活性基团，将固相化了核苷酸的膜用去离子水洗涤来制备的方法。作为具有第2探针序列的核苷酸的固相化的方式不特别限定，可以为线状或圆形点状。
作为步骤(e)中的检出上述扩增产物的方法，若为将所扩增的单链核酸杂交到负载在展开支持体上的第2探针以及结合在标记高分子载体上的第1探针而检出的方法则不特别限定，但是优选预先将多个第1探针结合在标记高分子载体上而成的第1探针结合标记高分子载体保持在保持部，作为上述保持部，可以合适地举出ADVANTEC制的吸收垫。通过将由保持了上述第1探针结合标记高分子载体的吸收垫等构成的保持部与上述负载第2探针的展开支持体的另一端依次连接，可以形成可以有利地用于本发明的检出方法的核酸色谱用试验片。作为保持部的制造方法，可以举出将结合多个具有第1探针序列的核苷酸的标记高分子载体涂布在保持部，并进行干燥的方法。
步骤(e)中，作为将上述步骤(a)中的扩增产物杂交到负载在展开支持体的第2探针以及结合在标记高分子载体上的第1探针而检出的方法，例如可以将上述核酸色谱用试验片浸渍在含扩增产物的溶液中，由此将上述第1探针结合标记高分子载体从上述保持部浸出到展开支持体，到达展开支持体上的与第1探针成对的各检出对象肺炎菌的第2探针固相化的规定位置时，在上述规定位置上，使上述扩增产物三明治杂交，由此捕捉。即使扩增产物中存在多种靶单链核酸时，也会依次在规定位置被各第2探针捕捉。
然后，在步骤(f)中，通过结合了具有第1探针序列的核苷酸的标记高分子载体在到达具有第2探针序列的核苷酸在展开支持体上固相化的位置的规定位置蓄积，将出现在规定位置的着色线或者着色点等的有无作为检出图像，直接或者用荧光可视化装置进行判定，由此可以进行评价，通过上述评价可以检出检出对象肺炎菌(肺炎病原菌)。而且，从简便性的观点考虑，上述判定优选为目视判定。
此外，对于由序列号1~10表示的序列构成的第1探针可以替代或者追加使用由序列号44~48表示的序列构成的核苷酸，对于由序列号11~20表示的序列构成的第2探针可以替代或者追加使用由序列号49~53表示的序列构成的核苷酸。
作为步骤(c’)中的定性·定量靶核酸的方法，可以举出电泳、杂交法、测序法。作为电泳法，可以举出通过利用琼脂糖凝胶的分子筛效果进行扩增产物的分子量解析的方法，利用毛细管电泳的アジレントテクノロジ一株式会社的解析系统。作为杂交法，可以举出像实时PCR那样，利用实时监控用试剂实时监控扩增产物的生成过程并进行解析的方法。作为实时监控试剂，可以举出例如TaqMan(注册商标：Applied Biosystems公司制)探针等。杂交法中也可以含有Northern印迹法。作为测序法，可以举出利用双脱氧核苷酸碱基特异性终止DNA聚合酶的合成的双脱氧法等。
作为本发明的肺炎病原菌的检出试剂盒，可以用于上述本发明的肺炎病原菌的检出方法，可以举出具有选自可以扩增由试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸的由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物，由序列号54表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号56表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物，由序列号55表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号57表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种，优选至少5种，即5～10种引物对的试剂盒，上述试剂盒，除了上述引物对之外，还可以具有上述步骤(b’)中的RNA扩增法中使用的各种试剂类、上述步骤(c’)中的为了定性·定量靶核酸而使用的各种试剂类。此外，也可以为具有：由从试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸、使用引物作为单链核酸扩增的扩增集，选自与扩增产物互补的核苷酸序列、例如序列号1～10或者44~48表示的核苷酸序列中的至少3种各肺炎菌的第1探针结合在标记高分子载体上而成的第1探针结合标记高分子载体，和与第1探针成对的第2探针、例如选自序列号11～20或者49~53表示的核苷酸序列中的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的各肺炎菌专用的或者多个肺炎菌共用的第2探针负载展开支持体的试剂盒，可以合适地举出具有上述扩增集和上述核酸色谱用试验片的试剂盒。上述试剂盒可以合适地用于上述本发明的肺炎病原菌的检出方法中。
以下举出实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明的范围不被这些例子所限定。
实施例
[卡他莫拉菌dnaJ引物的设计]
迄今，卡他莫拉菌的基因组信息未得到解读，虽然基于近缘属种的dnaJ基因序列进行了设计，但是难以设计本菌特异性的引物。另一方面，近年仅清楚本菌的基因组序列信息，因此基于该序列，通过ORF抽提，利用アライメントソフトDNASISpro(Hitachi Software公司制)实施dnaJ基因的注释，由该序列尝试新的引物的设计。利用8株卡他莫拉菌菌株实施新的引物的验证，作为试剂盒，根据记载的协议，利用TaKaRaPCRThermal CyclerGP，作为仪器，利用EX Taq Hot start(TaKaRa bio公司制)，在95℃、3min，(95℃、10sec，65℃、10sec，72℃、10sec)×40个循环的条件下实施PCR。所得的PCR产物，用MultiNA通过电泳解析。电泳结果如图1所示。任意一种菌株中，所得到的PCR产物都扩增，因此可知新设计的引物对对于卡他莫拉菌的检出是有用的。
[多重化的研究]
(成为模板的RNA的制备)
由于难以培养肺炎支原体以及肺炎嗜衣原体，通过利用质粒载体的DNA克隆，制备成为模板的RNA。克隆靶基因区域制备重组体。首先，将肺炎支原体或者肺炎嗜衣原体的靶基因dnaJ的各DNA片段插入到质粒载体中后，分别将成为宿主的大肠杆菌转化。由大肠杆菌抽提质粒后，通过PCR进行靶基因的DNA扩增，由所得到的PCR产物，利用RiboMAX(注册商标)T7Express系统(Promega公司制)，根据协议扩增RNA，所得到的RNA作为NASBA法的模板。肺炎支原体及肺炎嗜衣原体以外的检出对象肺炎菌的RNA通过常规方法制备。
(通过NASBA法进行的RNA靶基因的扩增)
作为正向引物，使用在选自序列号21~40表示的核苷酸序列中的各检出对象肺炎菌10种各靶序列的5’末端侧附加TAGCAGGATCCCTCTAAG(序列号41)而成的引物。作为反向引物，使用在各检出对象肺炎菌不同的10种各靶序列的5’末端侧附加作为T7RNA聚合酶的启动子序列的CTAATACGACTCACTATAGGGAG(序列号43)的启动子而成启动子。从上述肺炎链球菌、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体7种标准菌株抽提得到的RNA作为模板，对每1种菌株实施NASBA法，表示扩增靶基因的RNA的数据。RNA抽提利用MORA-EXTRACT(Advanced Microorganism Research公司制)、根据随附协议实施，NASBA法利用NASBA Amplification试剂盒(カイノス制)、根据随附协议实施。作为肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌的各模板的RNA试样分别使用稀释到1、1/10、1/100、1/1000倍的稀释物，利用BioAnalyzer、Agilent RNA Pico 6000进行。作为对照，制备未添加酶的反应液，实施同样的步骤。结果如图2~8所示。确认对于全部靶检出对象肺炎菌，通过NASBA法RNA都扩增。
(各引物间的特异性的验证)
实施本案引物10对的多重化时，验证各引物是否与靶菌以外的对象菌产生非特异反应。结果如图9所示。本案引物10对的全部引物中都未发现非特异反应。
(通过利用多重引物的NASBA法扩增靶RNA)
对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎嗜衣原体、MRSA、流感嗜血杆菌，利用本案引物对进行多重化的研究结果如图10所示。此外同样地，对于金黄色葡萄杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，利用本案引物对进行多重化的研究结果如图11所示。确认全部靶检出对象肺炎病原菌菌株的RNA都通过NASBA法扩增。
(NASBA产物的确认)
需要判断通过NASBA法扩增的RNA是否具有靶序列。以作为NASBA反应的副产物合成的DNA作为靶，实施实时PCR，测定NASBA产物和NASBA未反应样品的对照的Ct值，通过比较其差间接地确认靶NASBA产物。利用SYBR premixEX Taq Hot start(TaKaRa bio公司制)，根据协议，PCR在95℃、3min，(95℃、10sec，65℃、10sec，72℃、10sec)×40个循环的条件下进行。在全部菌株中，间接地确认通过NASBA法扩增的RNA为目的的靶NASBA产物。卡他莫拉菌的例子如图12所示。
[探针对的确定]
尝试制备对于成为检出对象的各检出对象肺炎菌的下表1表示的基因区域的核酸的靶序列具有互补的序列的含有1对氨基的的寡核苷酸探针。
[表1]
 菌株名   基因区域
 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)   LytA
 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)   DnaJ
 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)   DnaJ1
 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)   DnaJ
 肺炎嗜衣原体(Chlamydophilia pneumoniae)   DnaJ1
 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)   DnaJ
 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)   DnaJ
 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)   spaA
 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(MRSA))   mecA
 卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)   DnaJ
对于各种肺炎菌，为了选择20~30个碱基长的序列作为对于表1记载的各基因区域的扩增的单链核酸的候补探针，使用序列信息解析软件DNASIS pro(注册商标)(日立ソフトウェア社制)进行解析，确定具有序列号1~20表示的序列的寡核苷酸探针。
[第1探针结合标记高分子载体的制备]
为了使寡核苷酸探针与含羧基的聚苯乙烯胶乳结合，合成在5’末端引入了氨基的5’末端引入氨基的寡核苷酸。将由上述选择的序列构成的20种的各寡核苷酸的5’末端引入氨基的寡核苷酸作为各肺炎菌的第一探针序列来制备。将具有成为检出对象的至少3种、优选至少5种的各肺炎菌的第1探针序列的核苷酸，和含羧基的聚苯乙烯胶乳(Bangs公司制)，以及水溶性碳化二亚胺在50mM的MES(2-吗啉乙磺酸一水合物，2-Morpholinoethanesulfonic acid、monohydrate)(同仁化学研究所社制)缓冲液中混合，使胶乳中的羧基与多个第1探针的氨基结合后，添加单乙醇胺(和光纯药工业社制)，进一步进行反应。将上述反应液离心分离后除去上清液，对所得到的沉淀用含有非离子性表面活性剂的HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid)(埼京化成社制)缓冲液洗涤以及再悬浮，制备结合具有第1探针序列的核苷酸多个的标记高分子载体，4℃保存直至使用。
[具有第2探针序列的寡核苷酸在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的展开支持体的制备]
为了使由上述选择的第2探针序列构成的寡核苷酸与羧基修饰的尼龙膜(ポ一ル社制)结合，通过DNA合成机制备在所选择的第2探针序列的3’末端引入了氨基的3’末端引入氨基的寡核苷酸(第2探针)。将上述膜用水溶性碳化二亚胺处理，用去离子水洗涤使其活化。在上述活化的羧基修饰尼龙膜上结合上述3’末端引入氨基的寡核苷酸(第2探针)的1种，风干15分钟。将风干的膜用Tris基础缓冲液处理，除去残留的活性基团，将膜用去离子水洗涤，再次风干，由此制备具有第2探针序列的寡核苷酸在各肺炎菌可以识别的规定位置以线状固相化而成的展开支持体。由于检出对象的肺炎菌为3种以上，所以上述处理各肺炎菌进行至少3次。
5’或者3’末端侧引入了氨基的序列如下表2所示。对于各种肺炎菌，利用以下的组合进行本发明的核酸色谱法。而且，表中肺炎菌名最后的尾缀“L”表示结合在标记高分子载体上的探针，“M”表示固相化的探针。
[表2]
  肺炎菌   探针序列(5’~3’)
  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)L   NH2-AGACCGAAACAATGTGGAATTGGC
  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)M   ATGCAGAAAGACCAAAGCATACATAT-NH2
  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)L   NH2-GGTGACCGGTGTGGTGCCGG
  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)M   GTCTTGCAACCGACCAGGGTCGGCA-NH2
  流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)L   NH2-AAACTTGTCCGCATTGCCACGGTTC
  流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)M   CTCTGGGGCTGAAAAAGGTTCTAAAG-NH2
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)L   NH2-CATGATCAAACCTGGTCAAGAACTTG
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)M   CGGCACTACTGCTGACAAAATTGCT-NH2
  肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)L   NH2-ACGCACGAGTATTGCACGAATAACC
  肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)M   TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGT-NH2
  肺炎嗜衣原体(Chlamydophilia pneumoniae)L   NH2-ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA
  肺炎嗜衣原体(Chlamydophilia pneumoniae)M   TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-NH2
  肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)L   NH2-GTGGTGGAGACGCCGGTGGGGCTGA
  肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)M   TGAAACCCAGACCGGCAAGCTGTTC-NH2
  嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)L   NH2-GAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC
  嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)M   CAATTGACCCTTGAAGAAGCAGCTA-NH2
  卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)L   NH2-GGTTGCGCGTTTTTCAGGATCACTG
  卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)M   CCACCAGAGCCCATGCCTTGTTCAT-NH2
  肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)L   NH2-AGGCCAAACACAAGTGTAAGACTTG
  肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)M   AGAATCAACGCTCCATCTTTGGTAC-NH2
[参考线]
为了表明在肺炎病原菌的检出位置未检出线时，其原因是无被检出的核酸，以证明标记高分子载体可以在色谱条上流动为目的而检出的线是参考线。而且，由于该线是为了确认标记高分子载体的流动而检出的，所以存在检出的肺炎病原菌的核酸时，也优选参考线被检出。
[核酸色谱测定用试验片的制备]
本发明所用核酸色谱用试验片如下制备。将上述结合了多个具有各肺炎菌的第1探针序列的核苷酸的标记高分子载体溶解于缓冲液中，涂布到展开垫(ADVANTEC公司制)后，进行干燥作为保持部。在上述展开支持体的一端以与上述展开支持体不重合的部分与保持部连接。进一步地，在该展开支持体的另一端连接吸收衬垫(ADVANTEC公司制)，作为核酸色谱测定用试验片。
[标记高分子载体结合第1探针间的非特异结合的确认]
关于对于特别有效地用于外来患者的肺炎菌鉴定的5种肺炎病原菌的外来用探针集，和对于特别有效地用于住院患者的肺炎菌鉴定的5种肺炎病原菌的住院用探针集，在不存在扩增产物下，检查各肺炎菌用的标记高分子载体结合第1探针与第2探针(专用)之间是否直接性地杂交而未产生特异性的结合。作为第1探针结合标记高分子载体，使用结合了外来患者用检出对象肺炎菌的5种的第1探针的结合第1探针的标记高分子载体，和结合了住院患者用检出对象肺炎菌的5种的第1探针的第1探针结合标记高分子载体。作为负载第2探针的展开支持体，使用分别负载5种的外来患者用检出对象肺炎菌的第2探针的5片负载第2探针的展开支持体(专用)，和分别负载5种的住院患者用检出对象肺炎菌的第2探针的5片负载第2探针的展开支持体(专用)。结果如图14所示。用于实验中的任意一种菌株中，在参考的位置都观察到红色的着色线，确认在不存在扩增产物下，标记高分子载体结合第1探针与第2探针之间未产生非特异结合。
[通过核酸色谱法检出靶NASBA产物]
对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，用核酸色谱检出研究用对于各菌的引物扩增的NASBA产物。测定用试验片，使用表2所示的探针，根据上述方法，对各检出对象肺炎菌分别制造。其结果如图15所示。任意一种NASBA产物都被结合各肺炎菌专用探针的核酸色谱条检出。
[各探针中的特异性的验证]
验证各探针与靶菌以外的对象菌的NASBA产物是否产生非特异反应。结果如图16所示。所有本案探针中都未发现非特异反应。
(通过用多重引物扩增的NASBA产物的核酸色谱检出)
对于嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体，通过核酸色谱检出使用本案引物对的用多重引物扩增的NASBA产物。其结果如图17所示。用多重引物扩增的NASBA产物都被核酸色谱检出。
[多种肺炎菌的检出]
嗜肺军团菌使用BCYEα培养基在35℃进行培养，肺炎嗜衣原体使用HEp-2细胞进行培养，肺炎支原体使用PPLO培养基在37℃进行培养，流感嗜血杆菌使用巧克力培养基在37℃进行培养，肺炎链球菌使用羊血液培养基在37℃进行培养。由培养后的各菌悬浮液100μL，使用EXTRAGENII试剂(東ソ一社制)，从各试样抽提核酸，用50μL的RNase free water将上述5种菌的核酸溶解。对于2.5μL的核酸溶液，使用NASBA Amplification试剂盒(カイノス社制)，以totalRNA为模板，使用NASBA Amplification试剂盒(カイノス社制)，使用杂交到与本发明的探针对的集不同的10菌株的各靶区域内的序列的各菌株固有的引物对，进行NASBA扩增反应。此时的各菌专用引物浓度制备成最终浓度为0.2μM。扩增反应后的各菌的溶液，不对扩增结束后的NASBA的扩增产物进行前处理而汇集到1根，立即使用核酸色谱条，通过核酸色谱法，尝试检出肺炎菌。NASBA产物不流动时，仅检出表现出进行了流动的参考线(参照图18A)。上述肺炎病原菌5菌株的NASBA产物流动时，在与参考线不同的各检出位置检出线。(参照图18B)。
Figure IDA00002194655400011
Figure IDA00002194655400021
Figure IDA00002194655400031
Figure IDA00002194655400041
Figure IDA00002194655400051
Figure IDA00002194655400071

Claims (6)

1.一种检出方法，该检出方法为以选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌中的至少3种肺炎菌类作为检出对象的肺炎病原菌的检出方法，其特征在于，该检出方法具有以下的步骤(a)～步骤(f)：
1)由从试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸，利用引物，作为单链核酸扩增的步骤(a)，
2)制备选自与扩增产物互补的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3种探针对的步骤(b)，
3)使至少3种各肺炎菌的第1探针结合到标记高分子载体上，制备第1探针结合标记高分子载体的步骤(c)，
4)制备使与第1探针成对的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的第2探针负载展开支持体的步骤(d)，
5)将所述扩增产物杂交到负载在展开支持体上的第2探针以及结合在标记高分子载体上的第1探针而进行检出的步骤(e)，
6)通过判定检出图像来进行评价的步骤(f)。
2.根据权利要求1所述的检出方法，其特征在于，引物为选自由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种引物对。
3.根据权利要求1或2所述的检出方法，其特征在于，至少3种的各肺炎菌的第1探针由选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种DNA构成，与第1探针成对的至少3种的各肺炎菌的第2探针为选自序列号11～20表示的核苷酸序列中的至少3种DNA。
4.一种试剂盒，该试剂盒为以选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎嗜衣原体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌中的至少3种肺炎菌类作为检出对象的肺炎病原菌的检出试剂盒，其特征在于，该试剂盒具有选自可以扩增由试样中任意抽提的各肺炎菌特异性的靶核酸的、由序列号21表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号22表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号23表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号24表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号25表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号35表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号26表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号36表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号27表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号28表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号29表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物、由序列号30表示的核苷酸序列构成的正向引物和由序列号40表示的核苷酸序列及附加于其5’末端侧的RNA聚合酶启动子序列构成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3种引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进一步具有：
1)选自与扩增产物互补的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3种各肺炎菌的第1探针结合在标记高分子载体而成的第1探针结合标记高分子载体，
2)与第1探针成对的至少3种各肺炎菌的第2探针在各肺炎菌可以识别的规定位置固相化而成的第2探针负载展开支持体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，至少3种的各肺炎菌的第1探针由选自序列号1～10表示的核苷酸序列中的至少3种DNA构成，与第1探针成对的至少3种的各肺炎菌的第2探针为选自序列号11～20表示的核苷酸序列中的至少3种DNA。
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