JP2021058143A - プライマー及びGAPDH mRNAの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料中に存在するGAPDH mRNAを高感度、迅速かつ特異的に増幅検出する方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれるGAPDH mRNAの特定塩基配列の3’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の5’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号1、5および9のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号14または20に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記プライマーセットを用いてGAPDH mRNAを検出する。【選択図】なし
Description
本発明は、試料中に含まれるGAPDH mRNAを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたGAPDH mRNAの検出方法に関する。
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)は解糖系に含まれる酵素であり、GAPDH mRNAは多くの組織や細胞中に共通して一定量発現しているハウスキーピング遺伝子だとみなされている。臨床的に用いられているGAPDH mRNA検出法として、RTPCR法(特許文献1、特許文献2)用いたものがある。しかし、RTPCR法による検出法は、感度、特異性とも極めて高いが、検査に時間がかかり、操作が煩雑である。
TRC法(特許文献3、特許文献4)では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、1時間程度で結果を得ることができるうえ、操作が簡便である。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
TRC法は比較的低温の一定温度(例えば、40℃から50℃)条件下でRNAの増幅を行う方法であり、このような方法では、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなる。また、GAPDHのゲノムを検出せず、mRNAだけを検出するためには複数のエクソンをまたぐように増幅領域を設計する必要があり、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計は困難であった。
本発明の目的は、試料中に存在するGAPDH mRNAに由来する核酸を高感度、迅速かつ特異的に増幅し得るプライマー、および、当該プライマーを用いたGAPDH mRNAの検出方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
(1) 試料中に含まれるGAPDH mRNAの特定塩基配列の3’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の5’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号1、5、10および15のいずれかに
記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。
第一のプライマーが、配列番号1、5、10および15のいずれかに
記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。
(2) 第一のプライマーが少なくとも15塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも18塩基からなるオリゴヌクレオチドである、(1)に記載のプライマーセット。
(3) 第一のプライマーが、配列番号2、6、11および16のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する15塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号23、29もしくは33に記載の塩基配列中、少なくとも連続する18塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、(1)または(2)に記載のプライマーセット。
第二のプライマーが、配列番号23、29もしくは33に記載の塩基配列中、少なくとも連続する18塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、(1)または(2)に記載のプライマーセット。
(4) 第一のプライマーが配列番号3、4、7〜9、12〜14および17〜21のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号24〜27および30、31および34〜39のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、(1)〜(3)のいずれかに記載のプライマーセット。
第二のプライマーが、配列番号24〜27および30、31および34〜39のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、(1)〜(3)のいずれかに記載のプライマーセット。
(5) 第一のプライマーが配列番号3、4、7〜9、14および21のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号24〜27、30、31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
(1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセット。
第二のプライマーが、配列番号24〜27、30、31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
(1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセット。
(6) 第一のプライマーが配列番号4または9に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号26、27、30および31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
(1)〜(5)のいずれかに記載のプライマーセット。
第二のプライマーが、配列番号26、27、30および31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
(1)〜(5)のいずれかに記載のプライマーセット。
(7) (1)〜(6)のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、GAPDH mRNAの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、GAPDH mRNAを検出する工程を含む、GAPDH mRNAの検出方法。
(8) (1)〜(6)のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号40または41に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブとを含む、GAPDH mRNA検出試薬。
本発明のプライマーセットはGAPDH mRNAに特異的な塩基配列を含む配列(特定塩基配列)およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、GAPDH mRNAの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。
本発明のプライマーセットを用いたGAPDH mRNA検出法は、試料中に含まれるGAPDH mRNAを迅速、高感度に検出できる。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のプライマーセットは、試料中に含まれるGAPDH mRNAの特定塩基配列の3’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の5’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、プライマーセットである。
なお、本発明において、「相補的な配列を有する」とは対象核酸に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、「相同的な配列を有する」とは対象核酸の相補鎖に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。
(試料)
本発明において「試料」とは、検出対象であるGAPDH mRNAを含む可能性のある限り限定されないが、例えばヒト由来の細胞、組織、血液(全血等)、尿またはそれらの処理物等の生体試料が挙げられる。GAPDH mRNAを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られるRNA、あるいはmRNAを富化した試料等も使用できる。試料中のRNA量としては、限定されないが、例えば、反応液100μl当り0.01ng〜10μg程度である。
本発明において「試料」とは、検出対象であるGAPDH mRNAを含む可能性のある限り限定されないが、例えばヒト由来の細胞、組織、血液(全血等)、尿またはそれらの処理物等の生体試料が挙げられる。GAPDH mRNAを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られるRNA、あるいはmRNAを富化した試料等も使用できる。試料中のRNA量としては、限定されないが、例えば、反応液100μl当り0.01ng〜10μg程度である。
(対象遺伝子)
本発明のプライマーセットおよび方法は、GAPDH遺伝子、特にヒトGAPDH遺伝子を検出対象とする。より具体的には、本発明のプライマーセットおよび方法は、GAPDH mRNAを検出対象とする。
本発明のプライマーセットおよび方法は、GAPDH遺伝子、特にヒトGAPDH遺伝子を検出対象とする。より具体的には、本発明のプライマーセットおよび方法は、GAPDH mRNAを検出対象とする。
本発明のプライマーセットおよび方法が検出対象とするGAPDH mRNAとしては、本発明のプライマーセットおよび方法により検出される限り限定されない。
本発明において「特定塩基配列」とは、GAPDH mRNAに特異的な塩基配列を含む配列であって、GAPDH mRNAのうち、本発明の第二のプライマーとの相同領域の5’末端から本発明の第一のプライマーとの相補領域の3’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち、本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。
(プライマーセット)
本発明のプライマーセットは、GAPDH mRNAにおける特定塩基配列または特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し得るプライマーセットである。
本発明のプライマーセットは、GAPDH mRNAにおける特定塩基配列または特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し得るプライマーセットである。
より具体的には、本発明のプライマーセットにおける第一のプライマーは、配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーは、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性(例えば、同一性や類似性)が高いポリヌクレオチド同士、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、42℃において、50%(v/v)ホルムアミド、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%フィコール、0.1%のポリビニルピロリドン、50mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、150mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、洗浄条件として、60℃、1xSSC、0.1% SDS、好ましくは0.1xSSC、0.1% SDS、さらに好ましくは65℃、0.1xSSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1xSSC、0.1% SDS等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、Molecular Cloning(Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY (2001))等を参照し、本発明の第一のプライマー(配列番号1、5または9に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド)、および、本発明の第二のプライマー(配列番号14または20に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド)を容易に取得することができる。
また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列またはその相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、前記特定塩基配列またはその相補配列を増幅可能であれば、第一および第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列またはその相補配列と比較して、1または数個程度(例えば、プライマー配列の塩基数の10%以下程度)の置換、欠失、挿入、付加および/または修飾があってもよい。なお、プライマーの3’末端に相当する塩基配列には、置換、欠失、挿入および付加はないことが好ましい。
すなわち、第一および第二のプライマーは、特定塩基配列の3’末端部の配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、前記特定塩基配列の5’末端部の配列番号22、28または32に記載の塩基配列の一部もしくは全長と、70%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドであってよい。第一および第二のプライマーは、好ましくは、配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、配列番号22、28または32に記載の塩基配列の一部もしくは全長と80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の配列同一性を有する。
本明細書における塩基配列の相同性(同一性または類似性ともいう)は、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いて計算することができる。
第一および第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは10塩基から50塩基、さらに好ましくは16塩基〜30塩基、より好ましくは17塩基〜25塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
プライマーは1種または2種以上を組み合わせて使用することができる。プライマーの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定することができる。プライマーは、本明細書の記載および公知技術に基づいて、製造することができる。
本発明は、GAPDH mRNAの特定塩基配列の3’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号1に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の169番目から192番目までの塩基配列)または配列番号5に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の217番目から252番目までの塩基配列)または配列番号10に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の367番目から392番目までの塩基配列)または配列番号15に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の423番目から484番目までの塩基配列の相補配列)またはとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、またGAPDH mRNAの特定塩基配列の5’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号22に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の15番目から48番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号28に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の69番目から96番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号32に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の248番目から302番目までの塩基配列の相補配列)とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
その中でも第一のプライマーが少なくとも15塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも18塩基からなることが好ましい。
第一のプライマーの一例として、配列番号1に記載の塩基配列の相補配列である配列番号2に記載の塩基配列中、少なくとも連続する21塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号3(GenBank No.NM_002046.7の172番目から192番目までの塩基配列の相補配列)、配列番号4(GenBank No.NM_002046.7の169番目から190番目までの塩基配列の相補配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号5に記載の塩基配列の相補配列である配列番号6に記載の塩基配列中、少なくとも連続する23塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号7(GenBank No.NM_002046.7の231番目から252番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号8(GenBank No.NM_002046.7の224番目から247番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号9(GenBank No.NM_002046.7の217番目から240番目までの塩基配列の相補配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号10に記載の塩基配列の相補配列である配列番号11に記載の塩基配列中、少なくとも連続する16塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号12(GenBank No.NM_002046.7の376番目から392番目までの塩基配列の相補配列)、配列番号13(GenBank No.NM_002046.7の371番目から387番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号14(GenBank No.NM_002046.7の367番目から382番目までの塩基配列の相補配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号15に記載の塩基配列の相補配列である配列番号16に記載の塩基配列中、少なくとも連続する15塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号17(GenBank No.NM_002046.7の466番目から484番目までの塩基配列の相補配列)、配列番号18(GenBank No.NM_002046.7の459番目から474番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号19(GenBank No.NM_002046.7の452番目から466番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号20(GenBank No.NM_002046.7の436番目から450番目までの塩基配列の相補配列)または配列番号21(GenBank No.NM_002046.7の423番目から445番目までの塩基配列の相補配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
第二のプライマーの一例として、配列番号22に記載の塩基配列の相補配列である配列番号23に記載の塩基配列中、少なくとも連続する18塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号24(GenBank No.NM_002046.7の28番目から48番目までの塩基配列)および配列番号25(GenBank No.NM_002046.7の22番目から43番目までの塩基配列)、配列番号26(GenBank No.NM_002046.7の15番目から35番目までの塩基配列)または配列番号27(GenBank No.NM_002046.7の16番目から33番目までの塩基配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号28に記載の塩基配列の相補配列である配列番号29に記載の塩基配列中、少なくとも連続する19塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号30(GenBank No.NM_002046.7の78番目から96番目までの塩基配列)、配列番号31(GenBank No.NM_002046.7の69番目から91番目までの塩基配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号32に記載の塩基配列の相補配列である配列番号33に記載の塩基配列中、少なくとも連続する18塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号34(GenBank No.NM_002046.7の278番目から302番目までの塩基配列)、配列番号35(GenBank No.NM_002046.7の275番目から298番目までの塩基配列)、配列番号36(GenBank No.NM_002046.7の266番目から289番目までの塩基配列)、配列番号37(GenBank No.NM_002046.7の260番目から281番目までの塩基配列)、配列番号38(GenBank No.NM_002046.7の253番目から274番目までの塩基配列)、配列番号39(GenBank No.NM_002046.7の248番目から265番目までの塩基配列)に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
中でもGAPDH mRNAを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号3、4、7〜9、14,21のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号24〜27、30、31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーが配列番号4、9のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号26、27、30、31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットがより好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号4と26、4と27、4と30、4と31、9と27のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットがさらに好ましい。
本発明のプライマーセットは、RT−PCR法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、GAPDH mRNAの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したRNAポリメラーゼを用いて、RNAポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からNASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、TMA(Transcription−Mediated Amplification)法、TRC(Transcription−Reverse transcription Concerted reaction)法といった一定温度でRNAを増幅する方法を用いて、RNAを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの5’末端側に付加するプロモーターは、RNA増幅に用いるRNAポリメラーゼ(例えば、分子生物学の分野で汎用される、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼやSP6 RNAポリメラーゼ)に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。RNA増幅に用いるRNAポリメラーゼとしてT7 RNAポリメラーゼを用いたときの、プライマーの5’末端側に付加するプロモーター(T7プロモーター)の具体例として、配列番号42または43に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
本発明のプライマーセットを用いて増幅したGAPDH mRNAの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。
具体的には、
(A)電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
(B)検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
(C)当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
等があげられる。
(A)電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
(B)検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
(C)当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
等があげられる。
前記(C)の蛍光色素標識プローブの一例として、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。
(検出試薬)
本発明の検出試薬は、GAPDH mRNAの検出に用いられる試薬であって、本発明のプライマーセット、および、増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを含む、GAPDH mRNA検出試薬である。オリゴヌクレオチドプローブの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
本発明の検出試薬は、GAPDH mRNAの検出に用いられる試薬であって、本発明のプライマーセット、および、増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを含む、GAPDH mRNA検出試薬である。オリゴヌクレオチドプローブの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
本発明の検出試薬は、試料中に含まれるGAPDH mRNAの発現量を迅速、高感度に検出できる。そのため、種々の検査、特に臨床診断用試薬として有用である。
本発明の検出試薬には、本発明の効果を妨げない限り、上記成分以外に、さらに任意の反応、検出等に用いられる成分、例えば、pH緩衝剤、2価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド等から選択される少なくとも1種を含んでもよい。
(プローブ)
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、GAPDH mRNAの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの3’末端側、5’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはGAPDH mRNAの特定塩基配列(または当該特定塩基配列の相補配列)と相補的2本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的2本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお3’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドプローブの3’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸等の適当な修飾がされているとよい。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、GAPDH mRNAの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの3’末端側、5’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはGAPDH mRNAの特定塩基配列(または当該特定塩基配列の相補配列)と相補的2本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的2本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお3’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドプローブの3’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸等の適当な修飾がされているとよい。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号40に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の136番目から153番目までの塩基配列)またはその相補配列、または配列番号41に記載の塩基配列(GenBank No.NM_002046.7の352番目から366番目までの塩基配列)またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
(検出方法)
本発明のプライマーセットを用いてGAPDH mRNAを検出するには、例えば以下の(1)から(6)に示す工程により実施すればよい。
本発明のプライマーセットを用いてGAPDH mRNAを検出するには、例えば以下の(1)から(6)に示す工程により実施すればよい。
(1)配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがGAPDH mRNAにハイブリダイズし、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なcDNAを合成し、前記RNAとのRNA−DNA2本鎖を生成する工程、
(2)リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし(ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーターが付加される)、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーターを含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)配列番号40または41またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記RNA転写産物量を経時的に測定する工程。
(2)リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし(ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーターが付加される)、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーターを含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)配列番号40または41またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記RNA転写産物量を経時的に測定する工程。
前記(1)の工程で用いるRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、前記(2)の工程で用いるRNase H活性を有する酵素、および前記(3)の工程で用いるDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、AMV(Avian Myeloblastosis Virus)逆転写酵素、MMLV(Molony Murine Leukemia Virus)逆転写酵素、RAV(Rous Associated Virus)逆転写酵素、HIV(Human Immunodeficiency Virus)逆転写酵素等が使用できる。各酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
前述した態様によるGAPDH mRNA検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー/プローブのTm等に依存するが、使用する酵素がAMV逆転写酵素およびT7 RNAポリメラーゼであり、プライマー/プローブの長さが16から30塩基の範囲である場合は、35から65℃の範囲で反応温度を設定すればよく、40から50℃の範囲で設定するとより好ましい。反応時間は、必要な目的物量等に応じて、適宜設定可能である。
前述した態様によるGAPDH mRNA検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例20分以内で終了することが可能である。
前述した態様によるGAPDH mRNA検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むGAPDH mRNA試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にGAPDH mRNAを増幅し検出することができる。本発明のGAPDH mRNA検出試薬において、オリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号40または41に記載の塩基配列からなるものが好ましい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
<実施例1> 標準RNA調製
後述の実施例で使用する、GAPDH mRNA標準RNAを以下に示す方法で調製した。なお調製した各標準RNAの定量は、260nmにおける吸光度を基に実施した。
後述の実施例で使用する、GAPDH mRNA標準RNAを以下に示す方法で調製した。なお調製した各標準RNAの定量は、260nmにおける吸光度を基に実施した。
(1)GAPDH mRNA
GAPDH mRNA配列(GenBank No.NM_002046.7)に基づき、人工的に23S rRNA遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、GAPDH mRNA標準RNAを調製した。
GAPDH mRNA配列(GenBank No.NM_002046.7)に基づき、人工的に23S rRNA遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、GAPDH mRNA標準RNAを調製した。
<実施例2> インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記(A)に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ(以下、INAFプローブと記載する)を特開2000−316587号公報で開示の方法に基づき作製した。
下記(A)に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ(以下、INAFプローブと記載する)を特開2000−316587号公報で開示の方法に基づき作製した。
(A)配列番号40からなるオリゴヌクレオチドの5’末端から5番目のグアニンと6番目のシトシンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。または配列番号41からなるオリゴヌクレオチドの5’末端から7番目のシトシンと8番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
<実施例3> GAPDH mRNA検出用オリゴヌクレオチドの検討
表1に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびINAFプローブの組み合わせ(以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する)を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表1に記載のINAFプローブは実施例2で作製したプローブである。
表1に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびINAFプローブの組み合わせ(以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する)を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表1に記載のINAFプローブは実施例2で作製したプローブである。
(1)実施例1で調製した標準RNAのうち、GAPDH mRNA(実施例1(1))は、RNA希釈液(10mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA、0.02% コール酸ナトリウム)を用いて10000コピー/15μLになるように希釈し、これらをRNA試料として用いた。
(2)以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
反応液の組成:濃度はRNA試料、開始液、添加後(30μL中)の最終濃度
60mM Tris−HCl緩衝液(pH8.35)
300mM トレハロース
各0.48mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各1.8mM ATP、CTP、UTP
1.3mM GTP
2.9mM ITP
0.2μM 第一のプライマー(各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの5’末端側にT7プロモーター(配列番号42または43)を付加したもの)
0.2μM 第二のプライマー
50nM INAFプローブ(実施例2で調製したもの)
0.025mg/mL 牛血清アルブミン
142U T7 RNAポリメラーゼ
6.4U AMV逆転写酵素
60mM Tris−HCl緩衝液(pH8.35)
300mM トレハロース
各0.48mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各1.8mM ATP、CTP、UTP
1.3mM GTP
2.9mM ITP
0.2μM 第一のプライマー(各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの5’末端側にT7プロモーター(配列番号42または43)を付加したもの)
0.2μM 第二のプライマー
50nM INAFプローブ(実施例2で調製したもの)
0.025mg/mL 牛血清アルブミン
142U T7 RNAポリメラーゼ
6.4U AMV逆転写酵素
(3)上記の蒸発乾燥後にRNA試料を15μL添加後、46℃で5分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液15μLを添加し撹拌した。
開始液の組成:反応時(30μL中)の最終濃度
10.07% ジメチルスルホキシド
21mM 塩化マグネシウム
105mM 塩化カリウム
10.07% ジメチルスルホキシド
21mM 塩化マグネシウム
105mM 塩化カリウム
(4)引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、46℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に20分間測定した。
開始液を加え撹拌を終えた時点を0分として、反応液の蛍光強度比(所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値)が20分以内に1.3を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。1.3を超えなかった場合はNDと表記した。結果を表1に示す。実験は2回実施した。
GAPDH mRNAの検出性能(表1)については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ78パターン(A01からA78)のうち、60の組み合わせで500000コピー/testのGAPDH mRNAを20分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせA09,A10,A11,A12,A28は500000コピー/testのGAPDH mRNAを3分以内に検出しており、GAPDH mRNAを高感度、迅速かつ特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
本発明は、試薬等に適用できる。
<配列の説明>
配列番号1 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の169番目から192番目までの塩基配列)
配列番号2 : 配列番号1の相補配列
配列番号3 : 配列番号2の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の172番目から192番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号4 : 配列番号2の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の169番目から190番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号5 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7NM_002046.7の217番目から252番目までの塩基配列)
配列番号6 : 配列番号5の相補配列
配列番号7 : 配列番号6の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の217番目から252番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号8 : 配列番号6の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の224番目から247番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号9 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の217番目から240番目までの塩基配列)
配列番号10: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の367番目から392番目までの塩基配列)
配列番号11: 配列番号10の相補配列
配列番号12: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の376番目から392番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号13: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の371番目から387番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号14: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の367番目から382番目までの塩基配列の相補配列)
配列番号15: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の423番目から484番目までの塩基配列)
配列番号16: 配列番号15の相補配列
配列番号17: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の466番目から484番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号18: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の459番目から474番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号19: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の452番目から466番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号20: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の436番目から450番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号21: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の423番目から445番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号22:ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の15番目から48番目までの塩基配列の相補配列)
配列番号23: 配列番号22の相補配列
配列番号24: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の28番目から48番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号25: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の22番目から43番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号26: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の15番目から35番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号27: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の16番目から33番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号28: ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の69番目から96番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号29: 配列番号28の相補配列
配列番号30: 配列番号29の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の78番目から96番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号31: 配列番号29の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の69番目から91番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号32: ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の248番目から302番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号33: 配列番号32の相補配列
配列番号34: 配列番号33の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の278番目から302番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号35: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の275番目から298番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号36: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の266番目から289番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号37: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の260番目から281番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号38: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の253番目から274番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号39: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の248番目から265番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号40: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の136番目から153番目までの塩基配列)(オリゴヌクレオチドプローブの一例)
配列番号41: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の352番目から366番目までの塩基配列)(オリゴヌクレオチドプローブの一例)
配列番号42: T7プロモーター
配列番号43: T7プロモーター
配列番号1 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の169番目から192番目までの塩基配列)
配列番号2 : 配列番号1の相補配列
配列番号3 : 配列番号2の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の172番目から192番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号4 : 配列番号2の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の169番目から190番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号5 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7NM_002046.7の217番目から252番目までの塩基配列)
配列番号6 : 配列番号5の相補配列
配列番号7 : 配列番号6の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の217番目から252番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号8 : 配列番号6の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の224番目から247番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号9 : ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の217番目から240番目までの塩基配列)
配列番号10: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の367番目から392番目までの塩基配列)
配列番号11: 配列番号10の相補配列
配列番号12: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の376番目から392番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号13: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の371番目から387番目までの塩基配列の相補配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号14: 配列番号10の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の367番目から382番目までの塩基配列の相補配列)
配列番号15: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の423番目から484番目までの塩基配列)
配列番号16: 配列番号15の相補配列
配列番号17: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の466番目から484番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号18: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の459番目から474番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号19: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の452番目から466番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号20: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の436番目から450番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号21: 配列番号16の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の423番目から445番目までの塩基配列)(第一のプライマーの一例)
配列番号22:ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の15番目から48番目までの塩基配列の相補配列)
配列番号23: 配列番号22の相補配列
配列番号24: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の28番目から48番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号25: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の22番目から43番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号26: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の15番目から35番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号27: 配列番号23の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の16番目から33番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号28: ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の69番目から96番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号29: 配列番号28の相補配列
配列番号30: 配列番号29の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の78番目から96番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号31: 配列番号29の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の69番目から91番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号32: ヒトGAPDH mRNAの部分配列の相補配列(GenBank No.NM_002046.7の248番目から302番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号33: 配列番号32の相補配列
配列番号34: 配列番号33の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の278番目から302番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号35: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の275番目から298番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号36: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の266番目から289番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号37: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の260番目から281番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号38: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の253番目から274番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号39: 配列番号34の部分配列(GenBank No.NM_002046.7の248番目から265番目までの塩基配列)(第二のプライマーの一例)
配列番号40: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の136番目から153番目までの塩基配列)(オリゴヌクレオチドプローブの一例)
配列番号41: ヒトGAPDH mRNAの部分配列(GenBank No.NM_002046.7の352番目から366番目までの塩基配列)(オリゴヌクレオチドプローブの一例)
配列番号42: T7プロモーター
配列番号43: T7プロモーター
Claims (8)
- 試料中に含まれるGAPDH mRNAの特定塩基配列の3’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の5’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号1、5、10および15のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号22、28または32に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。 - 第一のプライマーが少なくとも15塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも18塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1に記載のプライマーセット。 - 第一のプライマーが、配列番号2、6、11および16のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する15塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号23、29もしくは33に記載の塩基配列中、少なくとも連続する18塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1または2に記載のプライマーセット。 - 第一のプライマーが配列番号3、4、7〜9、12〜14および17〜21のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号24〜27および30、31および34〜39いずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセット。 - 第一のプライマーが配列番号3、4、7〜9、14および21のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号24〜27、30、31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセット。 - 第一のプライマーが配列番号4および9のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号26、27、30および31のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1〜5のいずれか一項に記載のプライマーセット。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、GAPDH mRNAの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、GAPDH mRNAを検出する工程を含む、GAPDH mRNAの検出方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のプライマーセットと、
配列番号40または41に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブ、とを含む、GAPDH mRNA検出試薬。
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JP2019184994A JP2021058143A (ja) | 2019-10-08 | 2019-10-08 | プライマー及びGAPDH mRNAの検出方法 |
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