JP2022185222A

JP2022185222A - マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法

Info

Publication number: JP2022185222A
Application number: JP2021092745A
Authority: JP
Inventors: 華苗山口; Kanae Yamaguchi; 隆哉俵田; Takaya Tawarada; 悟東田; Satoru Higashida
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-12-14

Abstract

【課題】試料中に存在するマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を特異的に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい検出方法を提供する。【解決手段】マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチドを用いて検出する。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法に関する。

非結核性抗酸菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｂｓｃｅｓｓｕｓｃｏｍｐｌｅｘ）はアブセッサス症の原因菌であり、人に病原性を示す。マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスは他の非結核性抗酸菌と同様に環境常在菌であり、環境水、特に水道水が感染源と考えられているおり、アブセッサス症患者数は日本における非結核性抗酸菌症患者の中ではＭＡＣ症、カンサシー症に次いで多く、特にアブセッサス症は近年増加傾向にあるといわれている。アブセッサス症における感染部位は主に肺で、肺疾患を引き起し、また、稀にリンパ節、皮膚、泌尿器などへ感染して各種病変を引き起こす。また、肺アブセッサス症の臨床症状は結核とほぼ同様であることが知られている一方で、結核とは異なりヒトからヒトへの感染はしないと考えられている。したがって、結核の否定や治療方針の決定には臨床症状による診断のみではなく原因菌を同定することが非常に重要とされている。このことから、治療方針の早期策定のためにマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスを簡便、迅速かつ正確に同定することは大変重要とされている。

一般にマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスの同定検査はＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（特許文献１）、質量分析を用いた方法などにより同定されている。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションや質量分析は、多数の菌種を一度に同定することが可能であることから有用ではあるが、検体を用いた菌の培養操作が必要となるため迅速性に乏しく、早期に診断することができない問題がある。このため、培養操作を介さず迅速に検査を行うための、高感度かつ簡便な検査が望まれている。

本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。

マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスの属する非結核性抗酸菌は現在１９０種以上報告されており非常に多様性に富む一方で、その遺伝子配列は似通っているものも多い。したがって、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスのみを鑑別することが可能なマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス遺伝子を、高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。

特開２００６－６１１５５号公開特開２０００－１４４００号公報特開２００１－３７５００号公報

本発明の目的は、試料中に存在するマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌に由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
（２）前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（４）マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
（５）一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする（４）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
（６）前記一組のプライマーセットが、配列番号９に記載の配列にハイブリダイズする第一のプライマー、あるいは／および配列番号２４に記載の配列にハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする（４）または（５）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
（７）前記第一のプライマーが、配列番号９に記載の配列又は相補配列中、連続する１９～２６塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号２４に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～２６塩基からなることを特徴とする（４）から（６）のいずれかに記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
（８）（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、及び（６）又は（７）に記載のプライマーを含んでなる、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス検出用試薬キット。
（９）配列番号１２に記載の配列である第一のプライマーと配列番号２５に記載の第二のプライマーを含んでなる、（８）に記載のキット。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明中において試料とは、喀痰、胃液、胸水、腹水、尿などの体液や気管支洗浄液、組織、培養液などがあげられる。

本発明において、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列とは、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡに配列のうち、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５７７５番目から１４６６０１２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列を含む連続した２５０塩基以下の塩基配列のことをいう。

すなわち本発明では、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が検出されることになる。

本発明のオリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの一例として、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドがある。前記オリゴヌクレオチドはマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドとして、特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸と相補的な配列をもち、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５９２６番目から１４６５９４２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも１４塩基からなる連続する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドをあげることができる。中でもより好ましくは、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補配列と相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド、配列番号７に記載の塩基配列またはその相補配列と相補的な配列でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明における条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、前述した条件下で、前記特定塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。

本発明は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５９６９番目から１４６６０１０番目までの塩基配列）またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号２３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５７７５番目から１４６５９１８番目までの塩基配列）またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。

その中でも第一のプライマー及び第二のプライマーが１６～２６塩基からなることが好ましい。

第一のプライマーの一例として、配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１９～２６塩基であるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

第ニのプライマーの一例として、配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１６～２６塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

中でもマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号１４と６５、１４と７１、１６と６５、１６と６７、１６と７１、２２と６５、２２と６７、２２と７１、２０と６５、２０と６７、２０と６９、２０と７３、１８と６３、１８と６５、１８と６９、１２と２５、１２と２７、１２と２９、１２と３１、１２と３３、１２と３５、１２と３７、１２と３９、１２と４１、１２と４３、１２と４５、１２と４７、１２と４９、１２と５１、１２と５３、１２と５５、１２と５７、１２と５９、１２と６１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。

本発明のプライマーセットは、ＲＴ－ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣｏｎｃｅｒｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号７３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のオリゴヌクレオチドを用いてマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１０記載の塩基配列またはその相補配列とで特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号２３記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号３またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列に対し、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。

前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（ＡｖｉａｎＭｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓＶｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（ＭｏｌｏｎｙＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（ＲｏｕｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。

前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１４から２６塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。

前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。

前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含むマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号３～８記載の塩基配列からなるものが好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にハイブリダイズすることより、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に検出させることができる。

本発明のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を迅速、高感度に検出でき、かつ偽陽性の発生も極めて少なく特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１標準ＲＮＡ調製もしくは菌培養液の希釈物
後述の実施例で使用する、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の亜種のひとつであるマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）標準ＲＮＡ、およびマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）を以下に示す方法で調製した。なお調製した標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡ
２３ＳｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。
（２）マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ
２３ＳｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。

実施例２インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号７に記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号３おいては５’末端から５番目のチミンと６番目のアデニンとの間に、配列番号５及び７においては、５’末端から３番目のチミンと４番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。

実施例３マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス２３ＳｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡおよびマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ（実施例１（１）、実施例１（２））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。

反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭトレハロース
各０．３９ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭＧＴＰ
３．２ｍＭＩＴＰ
０．２μＭ第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号５３）を付加したもの）
０．２μＭ第二のプライマー
７５ｎＭＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０３８ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン
１４２ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
６．４ＵＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１１．５０％ジメチルスルホキシド
２０．５ｍＭ塩化マグネシウム
１０４ｍＭ塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。

開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．６０を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１、２及び３に示す。実験は、各々の組合せごとに２回数測定し、その平均値を使用した。「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．６０以下（陰性判定）であったことを意味する。

マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス２３ＳｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０１からＡ１９、Ａ３８、Ａ３９のうち、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス２３ＳｒＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ３８、Ａ３９は１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス２３ＳｒＲＮＡを平均で５分以内に検出しており、マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・アブセッサス２３ＳｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ２３ＳｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ２０からＡ３９のうち、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ２３ＳｒＲＮＡを平均で５分以内に検出しており、マイコバクテリウム・アブセッサスサブスピーシーズ・マシリエンセ２３ＳｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスには、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・アブセッサス、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・ボレッティ、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・マシリエンセの三種類の亜種が存在する。

本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、検出時間が５分以内であった組合せのうちからＡ３９を用いて、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の亜種全種類の検出（表２）及び交差反応性（表３）を実施した。

マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出については、２ＣＦＵ／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・アブセッサス、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・ボレッティ、あるいはマイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・マシリエンセを検出した。交差反応性については、２×１０^５ＣＦＵ／ｔｅｓｔの非結核性抗酸菌２０菌種を検出せず、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

Claims

マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の２３ＳｒＲＮＡもしくは２３ＳｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
前記一組のプライマーセットが、配列番号９に記載の配列にハイブリダイズする第一のプライマー、あるいは／および配列番号２４に記載の配列にハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする請求項４または５に記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
前記第一のプライマーが、配列番号９に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～２６塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号２４に記載の配列又は相補配列中、連続する１９～２６塩基からなることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載のマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス菌の検出方法。
請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、及び請求項６又は７に記載のプライマーを含んでなる、マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックス検出用試薬キット。
配列番号１２に記載の配列である第一のプライマーと配列番号２５に記載の第二のプライマーを含んでなる、請求項８に記載のキット。