JP3356179B2 - クラミジア・トラコマチス検出のための組成物および方法 - Google Patents
クラミジア・トラコマチス検出のための組成物および方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本明細書に記載され、クレイムされた発明は、例え
ば、喉の綿棒かきとり物、組織試料、体液、および培養
物からの試験試料中の細菌種クラミジア・トラコマチス
（Chlamydia trachomatis）由来の核酸の増幅および検
出のための核酸プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド
および増幅オリゴヌクレオチドの設計および使用に関す
る。
ば、喉の綿棒かきとり物、組織試料、体液、および培養
物からの試験試料中の細菌種クラミジア・トラコマチス
（Chlamydia trachomatis）由来の核酸の増幅および検
出のための核酸プローブ、ヘルパーオリゴヌクレオチド
および増幅オリゴヌクレオチドの設計および使用に関す
る。
発明の背景 クラミジアは世界中で最も通常の動物病原菌に属す
る。これらのグラム陰性細胞は、絶対的な細胞内生物で
あるという点で普通でない細菌である。それらは感染細
胞中で複製し、それら自身のエネルギーを代謝反応から
作り出すことのできる酵素を欠いていて、宿主により生
産されたATPをそれら自身の必要のために使用すること
により宿主からエネルギーを奪う。
る。これらのグラム陰性細胞は、絶対的な細胞内生物で
あるという点で普通でない細菌である。それらは感染細
胞中で複製し、それら自身のエネルギーを代謝反応から
作り出すことのできる酵素を欠いていて、宿主により生
産されたATPをそれら自身の必要のために使用すること
により宿主からエネルギーを奪う。
クラミジア・トラコマチスは、クラミジア属の３つの
分類のうちの１つであり、ヒトの病原菌である。Americ
an Society for Microbiology,Manual of Clinical Mic
robiology（5th ed.1991）参照。クラミジア・トラコマ
チス株は、トラコーマ、封入体結膜炎、および性器管の
疾病の不定期な病因を包含する。病因ということについ
ては、シー・トラコマチス（C.trachomatis）は世界中
において性的交渉により伝染する疾病の主要原因であ
り、男性の尿道炎および女性の子宮頸炎を引き起こす。
感染した女性は、出産の間にその子供に伝染させる可能
性があり、他の症状に混ざった肺炎または目の疾病を引
き起こす。罹病個体におけるシー・トラコマチス感染の
初期検出は、必要な治療をを早くすることとなり、病原
菌の連鎖的伝染を防止することができる。
分類のうちの１つであり、ヒトの病原菌である。Americ
an Society for Microbiology,Manual of Clinical Mic
robiology（5th ed.1991）参照。クラミジア・トラコマ
チス株は、トラコーマ、封入体結膜炎、および性器管の
疾病の不定期な病因を包含する。病因ということについ
ては、シー・トラコマチス（C.trachomatis）は世界中
において性的交渉により伝染する疾病の主要原因であ
り、男性の尿道炎および女性の子宮頸炎を引き起こす。
感染した女性は、出産の間にその子供に伝染させる可能
性があり、他の症状に混ざった肺炎または目の疾病を引
き起こす。罹病個体におけるシー・トラコマチス感染の
初期検出は、必要な治療をを早くすることとなり、病原
菌の連鎖的伝染を防止することができる。
それゆえ、試験試料中、詳細にはヒトの臨床標本中の
シー・トラコマチスの迅速かつ特異的な検出のための核
酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することが本
発明の目的である。
シー・トラコマチスの迅速かつ特異的な検出のための核
酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することが本
発明の目的である。
本明細書の用語「試験試料」は、目的標的核酸の含有
が疑わしい試料を意味し、生物学的試料、尿、血液、
乳、脊髄液、痰、唾液、糞便、肺吸引液、喉または性器
の綿棒かきとり物のごとき体液または排泄物、上記のも
のを１種またはそれ以上含有する臨床標本、環境試料、
食品試料および研究室試料を包含するが、これらに限ら
ない。
が疑わしい試料を意味し、生物学的試料、尿、血液、
乳、脊髄液、痰、唾液、糞便、肺吸引液、喉または性器
の綿棒かきとり物のごとき体液または排泄物、上記のも
のを１種またはそれ以上含有する臨床標本、環境試料、
食品試料および研究室試料を包含するが、これらに限ら
ない。
核酸ハイブリダイゼーションは、あらかじめ決定して
おいた反応条件下で完全または部分的に相補的なヌクレ
オチド配列を有する２種の核酸鎖を、一緒にして、特異
的水素結合を伴った安定な２本鎖ハイブリッドを形成す
ることによる方法である。いずれかの核酸鎖はデオキシ
リボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）であってよい。
よって、ハイブリダイゼーションは、RNA:RNAハイブリ
ッド、DNA:DNAハイブリッド、またはRNA:DNAハイブリッ
ドを包含する。
おいた反応条件下で完全または部分的に相補的なヌクレ
オチド配列を有する２種の核酸鎖を、一緒にして、特異
的水素結合を伴った安定な２本鎖ハイブリッドを形成す
ることによる方法である。いずれかの核酸鎖はデオキシ
リボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）であってよい。
よって、ハイブリダイゼーションは、RNA:RNAハイブリ
ッド、DNA:DNAハイブリッド、またはRNA:DNAハイブリッ
ドを包含する。
よって、本願の用語「ハイブリダイゼーション」は、
完全または部分的に相補的な２種の１本鎖核酸が逆平行
で一緒になって２本鎖領域を有する安定な構造を形成す
る能力をいう。時々ハイブリッドと呼ばれるこの２本鎖
構造の２つの構成鎖は水素結合によって互いに保持され
る。最も通常には、これらの水素結合は、塩基アデニン
およびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）あ
るいはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌ
クレオチド間で形成され、これらの正しいペアーのメン
バーでない塩基の間にも塩基対が形成されうる。正しく
ない塩基対は当該分野においてよく知られている。例え
ば、The Biochemistry of the Nucleic Acids（Adams e
t al.,eds.,1992）参照。
完全または部分的に相補的な２種の１本鎖核酸が逆平行
で一緒になって２本鎖領域を有する安定な構造を形成す
る能力をいう。時々ハイブリッドと呼ばれるこの２本鎖
構造の２つの構成鎖は水素結合によって互いに保持され
る。最も通常には、これらの水素結合は、塩基アデニン
およびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）あ
るいはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌ
クレオチド間で形成され、これらの正しいペアーのメン
バーでない塩基の間にも塩基対が形成されうる。正しく
ない塩基対は当該分野においてよく知られている。例え
ば、The Biochemistry of the Nucleic Acids（Adams e
t al.,eds.,1992）参照。
核酸ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチド
配列を有する標的核酸の検出および定量のための通常の
方法である。かかる方法は、生物の同定および分類、感
染症および遺伝学的異常の診断、食品および薬剤の試
験、および犯罪容疑の決定、ならびに他の事柄において
有用である。典型的には、核酸ハイブリダイゼーション
アッセイには、標的配列に相補的な核酸配列を有する標
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
プローブを用いる。かかる標識は当該分野においてよく
知られており、放射性同位元素、酵素、または蛍光、発
光もしくは化学発光基を包含しうる。出願人は、標識と
して化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。本
願と共有のArnoldらの米国特許第5,185,439号参照（参
照により本明細書に記載されているものとみなす）。相
補的領域における水素結合による２つの鎖のアニーリン
グを可能にするのに適したハイブリダイゼーション条件
下にて、標的配列を有する核酸を含有している疑いのあ
る試料にプローブを接触させる。次いで、プローブは、
試料中に存在する標的核酸にハイブリダイゼーションす
る。ハイドロキシアパタイド吸着のごとき当該分野にお
いてよく知られた種々の方法により、得られたハイブリ
ッド２本鎖を検出することができる。ハイブリダイゼー
ションしていないプローブ上に存在する標識を選択的に
分解し、次いで、残存しているハイブリダイゼーション
したプローブに結合している標識量を測定することを含
む方法もこれらの方法に包含され、この方法は本願と共
有のArnoldらの米国特許第5,283,174号に記載されてお
り、該特許を参照により本明細書に記載されているもの
と見なす。ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HP
A）と呼ばれる後者の方法は、出願が目下好んでいる方
法である。
配列を有する標的核酸の検出および定量のための通常の
方法である。かかる方法は、生物の同定および分類、感
染症および遺伝学的異常の診断、食品および薬剤の試
験、および犯罪容疑の決定、ならびに他の事柄において
有用である。典型的には、核酸ハイブリダイゼーション
アッセイには、標的配列に相補的な核酸配列を有する標
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
プローブを用いる。かかる標識は当該分野においてよく
知られており、放射性同位元素、酵素、または蛍光、発
光もしくは化学発光基を包含しうる。出願人は、標識と
して化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。本
願と共有のArnoldらの米国特許第5,185,439号参照（参
照により本明細書に記載されているものとみなす）。相
補的領域における水素結合による２つの鎖のアニーリン
グを可能にするのに適したハイブリダイゼーション条件
下にて、標的配列を有する核酸を含有している疑いのあ
る試料にプローブを接触させる。次いで、プローブは、
試料中に存在する標的核酸にハイブリダイゼーションす
る。ハイドロキシアパタイド吸着のごとき当該分野にお
いてよく知られた種々の方法により、得られたハイブリ
ッド２本鎖を検出することができる。ハイブリダイゼー
ションしていないプローブ上に存在する標識を選択的に
分解し、次いで、残存しているハイブリダイゼーション
したプローブに結合している標識量を測定することを含
む方法もこれらの方法に包含され、この方法は本願と共
有のArnoldらの米国特許第5,283,174号に記載されてお
り、該特許を参照により本明細書に記載されているもの
と見なす。ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HP
A）と呼ばれる後者の方法は、出願が目下好んでいる方
法である。
用いる個々の標識の検出限界によっては、試験試料
は、しばしば、核酸ハイブリダイゼーションによる直接
検出または定量を可能にする多量の核酸分子を含んでい
ない。かかる場合、核酸ハイブリダイゼーションを用い
て試験試料中の存在または量を調べる前に、検出可能標
的ヌクレオチド配列量を増加させる。この方法は核酸増
幅といわれ、標的核酸量の増加方法は標的核酸または標
的ヌクレオチド配列の増幅といわれる。
は、しばしば、核酸ハイブリダイゼーションによる直接
検出または定量を可能にする多量の核酸分子を含んでい
ない。かかる場合、核酸ハイブリダイゼーションを用い
て試験試料中の存在または量を調べる前に、検出可能標
的ヌクレオチド配列量を増加させる。この方法は核酸増
幅といわれ、標的核酸量の増加方法は標的核酸または標
的ヌクレオチド配列の増幅といわれる。
増幅方法は、核酸ポリマー化反応において、標的ヌク
レオチド配列を含む少なくとも１種の核酸鎖を鋳型とし
て使用して標的ヌクレオチド配列を含む相補的な第２の
鎖を得る。生成した核酸を鋳型として用いてこの方法を
連続サイクルでくり返すことにより、標的ヌクレオチド
配列を有する多数の核酸分子が迅速に増加する。
レオチド配列を含む少なくとも１種の核酸鎖を鋳型とし
て使用して標的ヌクレオチド配列を含む相補的な第２の
鎖を得る。生成した核酸を鋳型として用いてこの方法を
連続サイクルでくり返すことにより、標的ヌクレオチド
配列を有する多数の核酸分子が迅速に増加する。
多くの増幅方法が記載されており、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）（例えば、Mullisらの米国特許第4,683,195
号参照）、および１工程またはそれ以上の工程のインビ
トロ転写（RNA合成）を用いる方法（例えば、Murakawa
et al.,DNA 7:287−295、BurgらのPCT出願WO89/1050、G
ingerasらのPCT出願WO88/10315、KacianおよびFultzの
欧州特許出願第89313154号、McDonoughらのPCT出願WO94
/03472、KacianらのPCT出願WO93/22461、およびDattagu
ptaらの米国特許出願第08/215,081号（米国に1994年３
月16日出願）参照）といった種々の具体例がこれらの方
法に含まれる。これらの文献の開示を参照により本明細
書に記載されているものとみなす。最後の２つの文献は
本願と共有である。
反応（PCR）（例えば、Mullisらの米国特許第4,683,195
号参照）、および１工程またはそれ以上の工程のインビ
トロ転写（RNA合成）を用いる方法（例えば、Murakawa
et al.,DNA 7:287−295、BurgらのPCT出願WO89/1050、G
ingerasらのPCT出願WO88/10315、KacianおよびFultzの
欧州特許出願第89313154号、McDonoughらのPCT出願WO94
/03472、KacianらのPCT出願WO93/22461、およびDattagu
ptaらの米国特許出願第08/215,081号（米国に1994年３
月16日出願）参照）といった種々の具体例がこれらの方
法に含まれる。これらの文献の開示を参照により本明細
書に記載されているものとみなす。最後の２つの文献は
本願と共有である。
大部分の核酸増幅方法は、オリゴヌクレオチドプライ
マーおよび／またはプロモーター−プライマーを使用す
る。これらのプライマーまたはプロモーター−プライマ
ーは比較的短い（好ましくは10ないし100ヌクレオチド
の間、最も好ましくは約12ないし50ヌクレオチドの間の
長さ）１本鎖核酸分子であり、それらは、目的標的核酸
のヌクレオチド配列領域の少なくとも一部に相補的なヌ
クレオチド配列を有するように、人の手によって化学
的、生物学的または酵素的に合成され、設計され、そし
て／または選択される。核酸鎖のハイブリダイゼーショ
ンを可能にする条件下でプライマーまたはプロモーター
−プライマーを標的核酸と一緒にした場合、プライマー
またはプロモーター−プライマーの少なくとも一部が２
本鎖の水素結合したハイブリッドを標的核酸とともに形
成する。常にではないがしばしば、かかるハイブリッド
のはっきりとした特徴は、プライマーまたはプロモータ
ー−プライマーがハイブリダイゼーションされつつも核
酸ポリメラーゼによるプライマー伸長反応においてヌク
レオチドと反応しうる遊離の3'ヒドロキシ基を有してい
るということである。しかしながら、遊離の3'ヒドロキ
シル基は、プロモーターとして機能するプロモーター−
プライマーには必要とされなくてもよい。
マーおよび／またはプロモーター−プライマーを使用す
る。これらのプライマーまたはプロモーター−プライマ
ーは比較的短い（好ましくは10ないし100ヌクレオチド
の間、最も好ましくは約12ないし50ヌクレオチドの間の
長さ）１本鎖核酸分子であり、それらは、目的標的核酸
のヌクレオチド配列領域の少なくとも一部に相補的なヌ
クレオチド配列を有するように、人の手によって化学
的、生物学的または酵素的に合成され、設計され、そし
て／または選択される。核酸鎖のハイブリダイゼーショ
ンを可能にする条件下でプライマーまたはプロモーター
−プライマーを標的核酸と一緒にした場合、プライマー
またはプロモーター−プライマーの少なくとも一部が２
本鎖の水素結合したハイブリッドを標的核酸とともに形
成する。常にではないがしばしば、かかるハイブリッド
のはっきりとした特徴は、プライマーまたはプロモータ
ー−プライマーがハイブリダイゼーションされつつも核
酸ポリメラーゼによるプライマー伸長反応においてヌク
レオチドと反応しうる遊離の3'ヒドロキシ基を有してい
るということである。しかしながら、遊離の3'ヒドロキ
シル基は、プロモーターとして機能するプロモーター−
プライマーには必要とされなくてもよい。
２本鎖のプライマー：標的核酸ハイブリッドが核酸ポ
リメラーゼおよび必要なヌクレオチド三リン酸と接触す
る場合、プライマー伸長反応が起こる。プライマーの利
用可能な3'ヒドロキシル基は、核酸ポリメラーゼがプラ
イマーの3'末端へのヌクレオチド残基付加を特異的に開
始することを可能にする。伸長中のプライマー生成物の
配列は、標的核酸鋳型のヌクレオチド配列によって決定
される。かくして、最初のアニーリングまたはハイブリ
ダイゼーションの領域において、プライマーは相補的核
酸鎖の合成を開始する。
リメラーゼおよび必要なヌクレオチド三リン酸と接触す
る場合、プライマー伸長反応が起こる。プライマーの利
用可能な3'ヒドロキシル基は、核酸ポリメラーゼがプラ
イマーの3'末端へのヌクレオチド残基付加を特異的に開
始することを可能にする。伸長中のプライマー生成物の
配列は、標的核酸鋳型のヌクレオチド配列によって決定
される。かくして、最初のアニーリングまたはハイブリ
ダイゼーションの領域において、プライマーは相補的核
酸鎖の合成を開始する。
「プロモーター−プライマー」は、遊離の3'ヒドロキ
シル基を有する場合にはその目的核酸標的に対する3'領
域の相補性を有しているという点で、プライマーとして
機能しうる。さらに、プロモーター−プライマーは、標
的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域をその5'末
端に有する。核酸ポリメラーゼの作用によりこの領域が
２本鎖となった場合（このとき、鋳型核酸の3'末端が伸
長）、２本鎖の非相補的領域は、RNAポリメラーゼ活性
を有する酵素を用いるRNA合成のための開始部位として
機能しうる。
シル基を有する場合にはその目的核酸標的に対する3'領
域の相補性を有しているという点で、プライマーとして
機能しうる。さらに、プロモーター−プライマーは、標
的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域をその5'末
端に有する。核酸ポリメラーゼの作用によりこの領域が
２本鎖となった場合（このとき、鋳型核酸の3'末端が伸
長）、２本鎖の非相補的領域は、RNAポリメラーゼ活性
を有する酵素を用いるRNA合成のための開始部位として
機能しうる。
標的ヌクレオチド配列のユニークさおよびハイブリダ
イゼーションアッセイに必要な選択性の程度に応じて、
プライマーまたはプロモーター−プライマーは、ハイブ
リダイゼーションアッセイプローブとしても機能しう
る。別法として、ハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブまたは増幅オリゴヌクレオチドを、その主要機能の
みについて設計し使用してもよい。
イゼーションアッセイに必要な選択性の程度に応じて、
プライマーまたはプロモーター−プライマーは、ハイブ
リダイゼーションアッセイプローブとしても機能しう
る。別法として、ハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブまたは増幅オリゴヌクレオチドを、その主要機能の
みについて設計し使用してもよい。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて目
的の標的核酸の存在を検出および／または定量する。通
常には、放射活性または発光原子または光学発光部分の
ごとき検出可能な化学基でかかるプローブを標識する。
出願人は、標識試薬としてアクリジニウムエステル誘導
体の使用を好む。ときどき、目的の標的核酸は、通常に
は生物学的ソース由来のヌクレオチド配列とともに異な
る核酸分子の集団を含むであろう。例示目的のみであ
り、しかも限定するものではないが、標的ヌクレオチド
配列は、生物属の核酸に共有されている可能性があり
（当該属以外の生物によっては共有されていない）、そ
のいずれかの検出が望ましい。あるいはまた、標的ヌク
レオチド配列は特定の生物種またはその種の属する株に
独特のものである可能性もある。
的の標的核酸の存在を検出および／または定量する。通
常には、放射活性または発光原子または光学発光部分の
ごとき検出可能な化学基でかかるプローブを標識する。
出願人は、標識試薬としてアクリジニウムエステル誘導
体の使用を好む。ときどき、目的の標的核酸は、通常に
は生物学的ソース由来のヌクレオチド配列とともに異な
る核酸分子の集団を含むであろう。例示目的のみであ
り、しかも限定するものではないが、標的ヌクレオチド
配列は、生物属の核酸に共有されている可能性があり
（当該属以外の生物によっては共有されていない）、そ
のいずれかの検出が望ましい。あるいはまた、標的ヌク
レオチド配列は特定の生物種またはその種の属する株に
独特のものである可能性もある。
すべてのプローブを標識する必要があるというわけで
はない。「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘル
パープローブ」と呼ばれるいくつかのハイブリダイゼー
ションプローブは、個々の標識プローブがその標的ヌク
レオチド配列に結合するのを可能にするように設計され
ている。理論に拘束されるのを望まないが、ヘルパープ
ローブは、標的核酸中の分子間水素結合量を局部的に減
少させることにより標識プローブの結合を容易にし、か
くして、標的ヌクレオチド配列の標識プローブとの特異
的ハイブリダイゼーションをより容易にすると考えられ
る。標的プローブの結合部位および標的核酸の２次構造
によっては、ヘルパープローブは標識プローブの結合部
位近傍のヌクレオチド配列領域を指向するものであって
もよく、それにもかかわらずプローブ結合に影響する結
合部位から離れた領域を指向するものであってもよい。
ヘルパープローブは、本願と共有のHoganらの米国特許
第5,030,557号に記載されており、これを参照により本
明細書に記載されているものとみなす。
はない。「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘル
パープローブ」と呼ばれるいくつかのハイブリダイゼー
ションプローブは、個々の標識プローブがその標的ヌク
レオチド配列に結合するのを可能にするように設計され
ている。理論に拘束されるのを望まないが、ヘルパープ
ローブは、標的核酸中の分子間水素結合量を局部的に減
少させることにより標識プローブの結合を容易にし、か
くして、標的ヌクレオチド配列の標識プローブとの特異
的ハイブリダイゼーションをより容易にすると考えられ
る。標的プローブの結合部位および標的核酸の２次構造
によっては、ヘルパープローブは標識プローブの結合部
位近傍のヌクレオチド配列領域を指向するものであって
もよく、それにもかかわらずプローブ結合に影響する結
合部位から離れた領域を指向するものであってもよい。
ヘルパープローブは、本願と共有のHoganらの米国特許
第5,030,557号に記載されており、これを参照により本
明細書に記載されているものとみなす。
特定の核酸配列の存在を検出するための核酸ハイブリ
ダイゼーションの使用についての記載は、Kohneらの米
国特許第4,851,330号およびHoganらの国際特許出願PCT/
US87/03009にあり、これら両方の文献は本願と共有であ
り、参照により本明細書に記載されているものとみな
す。Hoganは、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて
試料中の非ウイルス生物または非ウイルス生物群の存在
を決定する方法を記載している。
ダイゼーションの使用についての記載は、Kohneらの米
国特許第4,851,330号およびHoganらの国際特許出願PCT/
US87/03009にあり、これら両方の文献は本願と共有であ
り、参照により本明細書に記載されているものとみな
す。Hoganは、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて
試料中の非ウイルス生物または非ウイルス生物群の存在
を決定する方法を記載している。
上記Hoganの文献は、特定の生物または生物群に属す
る標的リボゾームRNA（rRNA）ヌクレオチド配列のみを
特異的に検出する多くのハイブリダイゼーションプロー
ブも記載している。
る標的リボゾームRNA（rRNA）ヌクレオチド配列のみを
特異的に検出する多くのハイブリダイゼーションプロー
ブも記載している。
シー・トラコマチス検出用DNAハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブが記載されている。Hyppia et al.,
J.Gen.Microbiol.130:3159−3164（1984）には、シー・
トラコマチスからの6.7kbのプラスミドの単離およびそ
のハイブリダイゼーションプローブとしての使用が記載
されている。Griffairs et al.,Res.Microbiol.140:139
−141（1989）、Ostergaard et al.,J.Clin.Microbiol.
28:1254−1260（1990）、McGarty et al.,Gut 32:1011
−1015（1991）、Class et al.,J.Clin.Microbiol.29:4
2−45（1991）、Longiaruの欧州特許第420 260号（出
願番号第90118620.5）、およびLongiaruらの米国特許第
5,232,829号においては、増幅オリゴヌクレオチドと組
み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いるシー
・トラコマチスのプラスミドヌクレオチド配列の増幅が
記載されている。シー・トラコマチスの主要外膜蛋白
（MOMP）をコードする配列の増幅は、Dutilh et al.,Re
s.Microbiol.140:7−16（1989）、Holland et al.,J.In
fect.Dis.162:984−987（1990）、Bobo et al.,J.Clin.
Microbiol.28:1968−197（1990）、Holland et al.,Inf
ec.Immun.60:2040−2047（1992）、およびPalmer et a
l.,J.Clin.Pathol.44:321−325（1991）により記載され
ている。Ossewaarde et al.,J.Clin.Microbiol.30:2122
−2128（1992）およびRoosendaal et al.,J.Med.Microb
iol.38:426−433（1993）には、プラスミドおよびMOMP
配列の増幅が記載されている。
ンアッセイプローブが記載されている。Hyppia et al.,
J.Gen.Microbiol.130:3159−3164（1984）には、シー・
トラコマチスからの6.7kbのプラスミドの単離およびそ
のハイブリダイゼーションプローブとしての使用が記載
されている。Griffairs et al.,Res.Microbiol.140:139
−141（1989）、Ostergaard et al.,J.Clin.Microbiol.
28:1254−1260（1990）、McGarty et al.,Gut 32:1011
−1015（1991）、Class et al.,J.Clin.Microbiol.29:4
2−45（1991）、Longiaruの欧州特許第420 260号（出
願番号第90118620.5）、およびLongiaruらの米国特許第
5,232,829号においては、増幅オリゴヌクレオチドと組
み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いるシー
・トラコマチスのプラスミドヌクレオチド配列の増幅が
記載されている。シー・トラコマチスの主要外膜蛋白
（MOMP）をコードする配列の増幅は、Dutilh et al.,Re
s.Microbiol.140:7−16（1989）、Holland et al.,J.In
fect.Dis.162:984−987（1990）、Bobo et al.,J.Clin.
Microbiol.28:1968−197（1990）、Holland et al.,Inf
ec.Immun.60:2040−2047（1992）、およびPalmer et a
l.,J.Clin.Pathol.44:321−325（1991）により記載され
ている。Ossewaarde et al.,J.Clin.Microbiol.30:2122
−2128（1992）およびRoosendaal et al.,J.Med.Microb
iol.38:426−433（1993）には、プラスミドおよびMOMP
配列の増幅が記載されている。
本願と共有のHoganらのPCT出願番号PCT/US87/03009、
およびShahらのPCT公開番号WO90/15159には、シー・ト
ラコマチスの16Sおよび23S rRNA配列の検出用プローブ
が記載されている。Naher et al.,Genitourin.Med.65:3
19−322（1989）、Kluyimans et al.,J.Clin.Microbio
l.29:2685−2689（1991）、Scieux et al.,Res Microbi
ol.143:755−765（1992）、およびHolland et al.,Infe
ct.Immun.（上記）には、シー・トラコマチスのrRNAに
指向されたプローブの使用が記載されている。Cheema e
t al.,Amer.J.Med.Sci.302:261−268（1991）には、ク
ラミジアのリボゾームDNAに指向されたプローブが記載
されている。Pollard et al.,Mol.Cell.Probes 3:383−
389（1989）、Roosendaal,（上記）、およびClaas et a
l.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infec.Dis.9:864−868（199
0）には、クラミジア種の16Sリボゾームサブユニット由
来のヌクレオチド配列の増幅が記載されている。
およびShahらのPCT公開番号WO90/15159には、シー・ト
ラコマチスの16Sおよび23S rRNA配列の検出用プローブ
が記載されている。Naher et al.,Genitourin.Med.65:3
19−322（1989）、Kluyimans et al.,J.Clin.Microbio
l.29:2685−2689（1991）、Scieux et al.,Res Microbi
ol.143:755−765（1992）、およびHolland et al.,Infe
ct.Immun.（上記）には、シー・トラコマチスのrRNAに
指向されたプローブの使用が記載されている。Cheema e
t al.,Amer.J.Med.Sci.302:261−268（1991）には、ク
ラミジアのリボゾームDNAに指向されたプローブが記載
されている。Pollard et al.,Mol.Cell.Probes 3:383−
389（1989）、Roosendaal,（上記）、およびClaas et a
l.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infec.Dis.9:864−868（199
0）には、クラミジア種の16Sリボゾームサブユニット由
来のヌクレオチド配列の増幅が記載されている。
発明の概要 本発明は、シー・トラコマチスのrRNAまたはそれをコ
ードしているDNAの特定領域に相補的であるように、あ
るいはシー・トラコマチスのrRNAまたはrDNAヌクレオチ
ド配列を有する、必須としてなる、またはそれよりなる
オリゴヌクレオチドまたは核酸に相補的であるように設
計された増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌク
レオチド、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブを開示し、クレイムする。
ードしているDNAの特定領域に相補的であるように、あ
るいはシー・トラコマチスのrRNAまたはrDNAヌクレオチ
ド配列を有する、必須としてなる、またはそれよりなる
オリゴヌクレオチドまたは核酸に相補的であるように設
計された増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌク
レオチド、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブを開示し、クレイムする。
本発明ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸
の選択的検出を可能にする条件下で特定の標的ヌクレオ
チド配列を有する分子の領域中の標的核酸にハイブリダ
イゼーションするように設計されている。
の選択的検出を可能にする条件下で特定の標的ヌクレオ
チド配列を有する分子の領域中の標的核酸にハイブリダ
イゼーションするように設計されている。
本発明増幅オリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド
配列の3'側（標的核酸について）に存在する標的核酸の
領域にハイブリダイゼーションするように設計および／
または選択されている。それゆえ、ハイブリダイゼーシ
ョンした増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸の少なく
とも一部に相補的な核酸鎖の合成を可能にする。形成期
の鎖も標的ヌクレオチド配列を含んでいる。増幅オリゴ
ヌクレオチドは、本明細書記載のハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブと同等の高度な特異性を標的核酸に
対して有していてもよく、また有していなくてもよい。
例えば、増幅オリゴヌクレオチドは種特異的でなくても
よいが、属または科特異的であってよい。しかしなが
ら、増幅生成物（アンプリコン）を種特異的ハイブリダ
イゼーションアッセイプローブを用いて検出するかぎ
り、絶対的な特異性の欠如は、シー・トラコマチスの検
出における増幅オリゴヌクレオチドの有用性を無に帰す
ることはないであろう。
配列の3'側（標的核酸について）に存在する標的核酸の
領域にハイブリダイゼーションするように設計および／
または選択されている。それゆえ、ハイブリダイゼーシ
ョンした増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸の少なく
とも一部に相補的な核酸鎖の合成を可能にする。形成期
の鎖も標的ヌクレオチド配列を含んでいる。増幅オリゴ
ヌクレオチドは、本明細書記載のハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブと同等の高度な特異性を標的核酸に
対して有していてもよく、また有していなくてもよい。
例えば、増幅オリゴヌクレオチドは種特異的でなくても
よいが、属または科特異的であってよい。しかしなが
ら、増幅生成物（アンプリコン）を種特異的ハイブリダ
イゼーションアッセイプローブを用いて検出するかぎ
り、絶対的な特異性の欠如は、シー・トラコマチスの検
出における増幅オリゴヌクレオチドの有用性を無に帰す
ることはないであろう。
よって、本発明増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオ
リゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションプロー
ブの基本的かつ新規な特性は、適当なハイブリダイゼー
ション条件下で、非標的核酸または核酸領域よりも標的
シー・トラコマチス核酸のあらかじめ決められた領域に
優先的にハイブリダイゼーションする能力である。この
特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列と、水素
結合したハイブリダイゼーション複合体に含まれる増幅
ヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブと
の間の相補性の程度ならびにハイブリダイゼーション反
応条件の関数である。また本発明は、ハイブリダイゼー
ションプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドと、それ
らに特異的な標的核酸との間に形成された２本鎖核酸ハ
イブリッド分子を開示しクレイムする。標識プローブと
標的核酸分子との間に形成されたハイブリッドはシー・
トラコマチスの検出および／または定量に有用である。
なぜなら、これらの構造は、ハイブリダイゼーション反
応後にハイブリダイゼーションしていない標識プローブ
から物理的または化学的に識別されうるからであり、か
くして、プローブ上の標識は元の試料中の標的核酸の存
在を示す唯一のものであるからである。
リゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションプロー
ブの基本的かつ新規な特性は、適当なハイブリダイゼー
ション条件下で、非標的核酸または核酸領域よりも標的
シー・トラコマチス核酸のあらかじめ決められた領域に
優先的にハイブリダイゼーションする能力である。この
特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列と、水素
結合したハイブリダイゼーション複合体に含まれる増幅
ヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブと
の間の相補性の程度ならびにハイブリダイゼーション反
応条件の関数である。また本発明は、ハイブリダイゼー
ションプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドと、それ
らに特異的な標的核酸との間に形成された２本鎖核酸ハ
イブリッド分子を開示しクレイムする。標識プローブと
標的核酸分子との間に形成されたハイブリッドはシー・
トラコマチスの検出および／または定量に有用である。
なぜなら、これらの構造は、ハイブリダイゼーション反
応後にハイブリダイゼーションしていない標識プローブ
から物理的または化学的に識別されうるからであり、か
くして、プローブ上の標識は元の試料中の標的核酸の存
在を示す唯一のものであるからである。
同様に、増幅オリゴヌクレオチドとそれらに特異的な
標的核酸配列領域との間に形成された本発明ハイブリッ
ドは、少なくとも１ラウンドのDNA合成、RNA転写、また
はそれらの両方のための開始部位を提供する。次いで、
以下に詳述するように、検出可能なハイブリッド分子を
形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブを用
いて、生じた増幅核酸配列領域を検出する。よって、両
方のタイプのハイブリッド分子は本発明対象を得ること
に有用である。
標的核酸配列領域との間に形成された本発明ハイブリッ
ドは、少なくとも１ラウンドのDNA合成、RNA転写、また
はそれらの両方のための開始部位を提供する。次いで、
以下に詳述するように、検出可能なハイブリッド分子を
形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブを用
いて、生じた増幅核酸配列領域を検出する。よって、両
方のタイプのハイブリッド分子は本発明対象を得ること
に有用である。
それゆえ、シー・トラコマチスの標的ヌクレオチド配
列を増幅しうる増幅オリゴヌクレオチドを提供すること
が本発明の１の目的である。シー・トラコマチスの標的
ヌクレオチド配列は、シー・トラコマチス、好ましくは
シー・トラコマチス核酸、およびそれに完全に相補的な
ヌクレオチド配列中に含まれるDNAまたはRNA中に存在す
るヌクレオチド配列である。好ましくは、増幅オリゴヌ
クレオチドが結合する核酸配列領域は密接に関連した細
菌種には存在しない。しかしながら、シー・トラコマチ
スの核酸の増幅を可能にし、あるいはシー・トラコマチ
スの検出のために特異的なハイブリダイゼーションアッ
セイプローブの結合を促進するためには、増幅オリゴヌ
クレオチドも、ヘルパーオリゴヌクレオチドも、種特異
的であることを必要としない。
列を増幅しうる増幅オリゴヌクレオチドを提供すること
が本発明の１の目的である。シー・トラコマチスの標的
ヌクレオチド配列は、シー・トラコマチス、好ましくは
シー・トラコマチス核酸、およびそれに完全に相補的な
ヌクレオチド配列中に含まれるDNAまたはRNA中に存在す
るヌクレオチド配列である。好ましくは、増幅オリゴヌ
クレオチドが結合する核酸配列領域は密接に関連した細
菌種には存在しない。しかしながら、シー・トラコマチ
スの核酸の増幅を可能にし、あるいはシー・トラコマチ
スの検出のために特異的なハイブリダイゼーションアッ
セイプローブの結合を促進するためには、増幅オリゴヌ
クレオチドも、ヘルパーオリゴヌクレオチドも、種特異
的であることを必要としない。
よって、試験試料中の他の微生物からシー・トラコマ
チスを識別しうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブを開示することが本発明のもう
１つの目的である。これらのプローブはシー・トラコマ
チスの核酸に対して高度の特異性を有し、シー・ニュー
モニエ（C.pneumoniae）またはシー・シッタシ（C.psit
taci）のごとき密接に関連した生物由来の核酸への同じ
プローブのハイブリダイゼーションには不利なハイブリ
ダイゼーション条件下でシー・トラコマチスの核酸にハ
イブリダイゼーションするであろう。よって、標識プロ
ーブの使用により、これらの生物を含む試験試料中のシ
ー・トラコマチスの特異的検出または定量が可能にな
る。これらのプローブを単独でハイブリダイゼーション
アッセイに使用してもよく、また、ヘルパーオリゴヌク
レオチドと組み合わせて使用してもよい。未増幅標的核
酸の検出にハイブリダイゼーションアッセイプローブを
直接使用してもよく、また、核酸増幅により得られたシ
ー・トラコマチスのヌクレオチド配列を有する核酸を検
出するためにこれを使用してもよい。
チスを識別しうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブを開示することが本発明のもう
１つの目的である。これらのプローブはシー・トラコマ
チスの核酸に対して高度の特異性を有し、シー・ニュー
モニエ（C.pneumoniae）またはシー・シッタシ（C.psit
taci）のごとき密接に関連した生物由来の核酸への同じ
プローブのハイブリダイゼーションには不利なハイブリ
ダイゼーション条件下でシー・トラコマチスの核酸にハ
イブリダイゼーションするであろう。よって、標識プロ
ーブの使用により、これらの生物を含む試験試料中のシ
ー・トラコマチスの特異的検出または定量が可能にな
る。これらのプローブを単独でハイブリダイゼーション
アッセイに使用してもよく、また、ヘルパーオリゴヌク
レオチドと組み合わせて使用してもよい。未増幅標的核
酸の検出にハイブリダイゼーションアッセイプローブを
直接使用してもよく、また、核酸増幅により得られたシ
ー・トラコマチスのヌクレオチド配列を有する核酸を検
出するためにこれを使用してもよい。
シー・トラコマチスの核酸に指向されたハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌク
レオチドの使用により、子宮頸管または尿道の綿棒かき
とり物あるいは他の試料由来の試験試料中のシー・トラ
コマチスの迅速、特異的かつ再現性のある同定を可能に
することが本発明のもう１つの目的である。
ゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌク
レオチドの使用により、子宮頸管または尿道の綿棒かき
とり物あるいは他の試料由来の試験試料中のシー・トラ
コマチスの迅速、特異的かつ再現性のある同定を可能に
することが本発明のもう１つの目的である。
試験試料中のシー・トラコマチスの標的ヌクレオチド
配列を有する核酸分子数を増加させることにより、核酸
ハイブリダイゼーションアッセイ感度を上昇させること
が本発明のもう１つの目的である。
配列を有する核酸分子数を増加させることにより、核酸
ハイブリダイゼーションアッセイ感度を上昇させること
が本発明のもう１つの目的である。
シー・トラコマチスの核酸にハイブリダイゼーション
しうるヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、シー・トラコマチス特異的ハイブリダイゼーション
アッセイプローブのその標的核酸へのハイブリダイゼー
ション率を向上させ、また、得られたハイブリッドの安
定性を向上させ、そのことにより標識プローブのその標
的への結合を容易にする組成物を提供することが本発明
のもう１つの目的である。
しうるヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、シー・トラコマチス特異的ハイブリダイゼーション
アッセイプローブのその標的核酸へのハイブリダイゼー
ション率を向上させ、また、得られたハイブリッドの安
定性を向上させ、そのことにより標識プローブのその標
的への結合を容易にする組成物を提供することが本発明
のもう１つの目的である。
好ましい具体例の説明および最良のモードの定義 下記用語は、明細書中で特に示さないかぎり、以下に
示す意味を有する。
示す意味を有する。
「標的核酸」は、標的ヌクレオチド配列を有する１本
鎖または２本鎖核酸を意味する。
鎖または２本鎖核酸を意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、長さ２ヌクレオチドより
も長い、好ましくは長さ10ないし100ヌクレオチド、最
も好ましくは長さ12ないし50ヌクレオチドの１本鎖ヌク
レオチドポリマーを意味する。かかるオリゴヌクレオチ
ドはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、
あるいは他の稀なまたは天然に存在しない結合により結
合されていてもよい。さらにそのうえ、オリゴヌクレオ
チドは普通でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部
分を有していてもよい。本明細書定義のオリゴヌクレオ
チドは核酸、好ましくはDNAであるが、RNAであってもよ
く、あるいは共有結合したリボヌクレオチドおよびデオ
キシリボヌクレオチドの組み合わせを有していてもよ
い。当業者に知られた方法、例えば、化学合成または生
化学的合成により、および例えば細菌またはレトロウイ
ルスベクターのような組み換え核酸分子からのインビト
ロまたはインビボ発現により、一定配列のオリゴヌクレ
オチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを製造す
ることができる。本開示により強調されるように、オリ
ゴヌクレオチドは染色体DNAまたはそのインビボ転写物
からなるものではない。
も長い、好ましくは長さ10ないし100ヌクレオチド、最
も好ましくは長さ12ないし50ヌクレオチドの１本鎖ヌク
レオチドポリマーを意味する。かかるオリゴヌクレオチ
ドはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、
あるいは他の稀なまたは天然に存在しない結合により結
合されていてもよい。さらにそのうえ、オリゴヌクレオ
チドは普通でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部
分を有していてもよい。本明細書定義のオリゴヌクレオ
チドは核酸、好ましくはDNAであるが、RNAであってもよ
く、あるいは共有結合したリボヌクレオチドおよびデオ
キシリボヌクレオチドの組み合わせを有していてもよ
い。当業者に知られた方法、例えば、化学合成または生
化学的合成により、および例えば細菌またはレトロウイ
ルスベクターのような組み換え核酸分子からのインビト
ロまたはインビボ発現により、一定配列のオリゴヌクレ
オチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを製造す
ることができる。本開示により強調されるように、オリ
ゴヌクレオチドは染色体DNAまたはそのインビボ転写物
からなるものではない。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または
「標的配列」は、１本鎖標的核酸分子のヌクレオチド配
列およびそれに完全に相補的なデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチド配列の全部または一部を含む
特に望ましいデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌク
レオチド配列を意味する。
「標的配列」は、１本鎖標的核酸分子のヌクレオチド配
列およびそれに完全に相補的なデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチド配列の全部または一部を含む
特に望ましいデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌク
レオチド配列を意味する。
「実質的に類似」のヌクレオチド配列とは、特定の核
酸配列と比較した場合に、同一のヌクレオチド配列、あ
るいは20％未満のミスマッチ、欠失および／または付加
を有するヌクレオチド配列（RNAまたはDNA同等ヌクレオ
チドを除く）である。実質的に類似のヌクレオチド配列
は、標的核酸に相補的な８個未満の付加ヌクレオチドを
有するであろうし、リファレンスヌクレオチド配列より
も４ヌクレオチド未満短いであろう。さらに、実質的に
類似のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド
は、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて特定の核
酸配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸
との安定なハイブリッドを形成しうる。
酸配列と比較した場合に、同一のヌクレオチド配列、あ
るいは20％未満のミスマッチ、欠失および／または付加
を有するヌクレオチド配列（RNAまたはDNA同等ヌクレオ
チドを除く）である。実質的に類似のヌクレオチド配列
は、標的核酸に相補的な８個未満の付加ヌクレオチドを
有するであろうし、リファレンスヌクレオチド配列より
も４ヌクレオチド未満短いであろう。さらに、実質的に
類似のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド
は、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて特定の核
酸配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸
との安定なハイブリッドを形成しうる。
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件と
は、特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブ
が標的核酸（好ましくは、シー・トラコマチスのrRNAま
たはrDNA）にハイブリダイゼーションすることができ、
他の微生物（例えば、クラミジア・ニューモニエおよび
クラミジア・シッタシ）またはヒトのいずれか由来の試
験試料中に存在する他の核酸とは有意にハイブリダイゼ
ーションしない条件をいう。GC含量およびプローブ長、
ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション
試薬または溶液の組成、ならびに要求されるハイブリダ
イゼーション特異性の程度を包含するファクターに応じ
てこれらの条件を変更できることが理解されるであろ
う。特に厳密なハイブリダイゼーション条件の例は後の
開示にある。
は、特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブ
が標的核酸（好ましくは、シー・トラコマチスのrRNAま
たはrDNA）にハイブリダイゼーションすることができ、
他の微生物（例えば、クラミジア・ニューモニエおよび
クラミジア・シッタシ）またはヒトのいずれか由来の試
験試料中に存在する他の核酸とは有意にハイブリダイゼ
ーションしない条件をいう。GC含量およびプローブ長、
ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション
試薬または溶液の組成、ならびに要求されるハイブリダ
イゼーション特異性の程度を包含するファクターに応じ
てこれらの条件を変更できることが理解されるであろ
う。特に厳密なハイブリダイゼーション条件の例は後の
開示にある。
「プローブ」は、検出が必要な核酸配列に部分的また
は完全に相補的な配列を有していて、厳密なハイブリダ
イゼーション条件下でそれに安定にハイブリダイゼーシ
ョンする１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。群また
は種特異的プローブの場合、プローブは、厳密なハイブ
リダイゼーション条件下で標的核酸に安定にハイブリダ
イゼーションする能力を有し、系統発生論的な群または
種の外側にある生物由来の核酸のごとき非標的核酸には
安定にハイブリダイゼーションしない。厳密なハイブリ
ダイゼーション条件下でプローブに必要な特異性を変化
させない限り、プローブは標的核酸に相補的でない領域
を有していてもよいが、これを必要とはしない。かかる
相補的でない領域が存在する場合、それらはRNA転写の
ための5'プロモーター配列および／または結合部位を有
していてもよく、また、プローブ上に触媒活性部位また
はヘアピン構造のごとき所望２次構造または３次構造、
あるいはそれら両方を付与する配列を含んでいてもよ
い。プローブが標的配列にハイブリダイゼーションした
ことの検出または確認に使用できる放射性同位元素、蛍
光または化学発光部分のごときレポーター基部分で、酵
素または他のリガンドで、プローブを標識してもよい。
プローブの１の用法はハイブリダイゼーションアッセイ
プローブとしての使用である。インビボまたはインビト
ロ治療用オリゴヌクレオチドとして、あるいは病的な細
胞、感染細胞または病原性細胞において遺伝子転写、mR
NAスプライシングまたは翻訳をブロックまたは阻害する
アンチセンス剤としてプローブを使用してもよい。
は完全に相補的な配列を有していて、厳密なハイブリダ
イゼーション条件下でそれに安定にハイブリダイゼーシ
ョンする１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。群また
は種特異的プローブの場合、プローブは、厳密なハイブ
リダイゼーション条件下で標的核酸に安定にハイブリダ
イゼーションする能力を有し、系統発生論的な群または
種の外側にある生物由来の核酸のごとき非標的核酸には
安定にハイブリダイゼーションしない。厳密なハイブリ
ダイゼーション条件下でプローブに必要な特異性を変化
させない限り、プローブは標的核酸に相補的でない領域
を有していてもよいが、これを必要とはしない。かかる
相補的でない領域が存在する場合、それらはRNA転写の
ための5'プロモーター配列および／または結合部位を有
していてもよく、また、プローブ上に触媒活性部位また
はヘアピン構造のごとき所望２次構造または３次構造、
あるいはそれら両方を付与する配列を含んでいてもよ
い。プローブが標的配列にハイブリダイゼーションした
ことの検出または確認に使用できる放射性同位元素、蛍
光または化学発光部分のごときレポーター基部分で、酵
素または他のリガンドで、プローブを標識してもよい。
プローブの１の用法はハイブリダイゼーションアッセイ
プローブとしての使用である。インビボまたはインビト
ロ治療用オリゴヌクレオチドとして、あるいは病的な細
胞、感染細胞または病原性細胞において遺伝子転写、mR
NAスプライシングまたは翻訳をブロックまたは阻害する
アンチセンス剤としてプローブを使用してもよい。
本開示に用いる語句、特定配列の群「から選択される
配列を必須としてなる核酸配列を有するプローブ（また
はオリゴヌクレオチド）」は、厳密なハイブリダイゼー
ション条件下において、基本的かつ新規な特性として、
プローブが当該群に含まれる核酸配列の１つに正確に相
補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列領域
において核酸と安定なハイブリッドを形成することを意
味する。この定義における正確な相補性は対応DNAまた
はRNA配列を包含する。
配列を必須としてなる核酸配列を有するプローブ（また
はオリゴヌクレオチド）」は、厳密なハイブリダイゼー
ション条件下において、基本的かつ新規な特性として、
プローブが当該群に含まれる核酸配列の１つに正確に相
補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列領域
において核酸と安定なハイブリッドを形成することを意
味する。この定義における正確な相補性は対応DNAまた
はRNA配列を包含する。
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」は、好
ましくは長さ10ないし100ヌクレオチド、最も好ましく
は長さ12ないし50ヌクレオチドの２本鎖水素結合領域を
含む核酸構造を意味し、各鎖は互いに完全に相補的で、
厳密なハイブリダイゼーション条件下においてその領域
は十分に安定であり、化学発光または蛍光検出、オート
ラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を包含する手段
（これらの手段に限らない）により検出される。かかる
ハイブリッドはRNA:RNA、RNA:DNA、またはDNA:DNA2本鎖
分子を含みうる。
ましくは長さ10ないし100ヌクレオチド、最も好ましく
は長さ12ないし50ヌクレオチドの２本鎖水素結合領域を
含む核酸構造を意味し、各鎖は互いに完全に相補的で、
厳密なハイブリダイゼーション条件下においてその領域
は十分に安定であり、化学発光または蛍光検出、オート
ラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を包含する手段
（これらの手段に限らない）により検出される。かかる
ハイブリッドはRNA:RNA、RNA:DNA、またはDNA:DNA2本鎖
分子を含みうる。
「相補的」は、２つの１本鎖核酸の類似領域のヌクレ
オチド配列または同じ１本鎖核酸の別の領域が、厳密な
ハイブリダイゼーション条件下にて、１本鎖がハイブリ
ダイゼーションして安定な２本鎖水素結合領域となるこ
と可能にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味
する。１本鎖領域のヌクレオチドの一続きの配列が一連
の「正しい」水素結合塩基対を他の１本鎖領域のヌクレ
オチドの類似配列とともに形成して、ＡがＵまたはＴと
対になり、ＣがＧと対になる場合、ヌクレオチド配列は
「完全に」相補的である。
オチド配列または同じ１本鎖核酸の別の領域が、厳密な
ハイブリダイゼーション条件下にて、１本鎖がハイブリ
ダイゼーションして安定な２本鎖水素結合領域となるこ
と可能にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味
する。１本鎖領域のヌクレオチドの一続きの配列が一連
の「正しい」水素結合塩基対を他の１本鎖領域のヌクレ
オチドの類似配列とともに形成して、ＡがＵまたはＴと
対になり、ＣがＧと対になる場合、ヌクレオチド配列は
「完全に」相補的である。
「保存的に修飾された変種」は、第１の核酸の第１の
ヌクレオチド配列領域に相補的なヌクレオチド配列を有
する核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。ここ
に、第１のヌクレオチド配列領域は、第２の「リファレ
ンス」核酸中に含まれる第２のヌクレオチド配列領域に
完全に相補的である。保存的に修飾された変種は４個未
満の付加ヌクレオチドを有し、あるいはリファレンス核
酸よりも４ヌクレオチド未満短い。かかる保存的に修飾
された変種は、リファレンスヌクレオチド配列よりも４
ヌクレオチド以上長い5'側の相補的でないヌクレオチド
を有していてもよいことが理解されるであろう。保存的
に修飾された変種は、厳密なハイブリダイゼーション条
件下で、シー・トラコマチスのヌクレオチド配列を有す
る標的核酸領域と安定なハイブリッドを形成するであろ
う。
ヌクレオチド配列領域に相補的なヌクレオチド配列を有
する核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。ここ
に、第１のヌクレオチド配列領域は、第２の「リファレ
ンス」核酸中に含まれる第２のヌクレオチド配列領域に
完全に相補的である。保存的に修飾された変種は４個未
満の付加ヌクレオチドを有し、あるいはリファレンス核
酸よりも４ヌクレオチド未満短い。かかる保存的に修飾
された変種は、リファレンスヌクレオチド配列よりも４
ヌクレオチド以上長い5'側の相補的でないヌクレオチド
を有していてもよいことが理解されるであろう。保存的
に修飾された変種は、厳密なハイブリダイゼーション条
件下で、シー・トラコマチスのヌクレオチド配列を有す
る標的核酸領域と安定なハイブリッドを形成するであろ
う。
「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的ヌクレオチド配
列領域にハイブリダイゼーションでき、そのことにより
核酸合成のためのプライマーとして、あるいはRNA合成
の開始のためのプロモーター鋳型（例えば、相補的な鎖
の合成、そのことによる機能的プロモーター配列の形成
のための）として、あるいはそれらの両方として作用し
うるオリゴヌクレオチドを意味する。RNA合成を開始す
るために増幅オリゴヌクレオチドを設計する場合、オリ
ゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的でないがRNAポリ
メラーゼ（例えば、T7、T3およびSP6 RNAポリメラー
ゼ）によって認識されるヌクレオチド配列領域を有して
いてもよい。増幅オリゴヌクレオチドは、プライマー伸
長を防止または伸長量を減少させるためにブロックされ
た3'末端を有していてもよく、有していなくてもよい。
好ましくは、本明細書定義の増幅オリゴヌクレオチドは
長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ約1
5ないし50ヌクレオチドである。
列領域にハイブリダイゼーションでき、そのことにより
核酸合成のためのプライマーとして、あるいはRNA合成
の開始のためのプロモーター鋳型（例えば、相補的な鎖
の合成、そのことによる機能的プロモーター配列の形成
のための）として、あるいはそれらの両方として作用し
うるオリゴヌクレオチドを意味する。RNA合成を開始す
るために増幅オリゴヌクレオチドを設計する場合、オリ
ゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的でないがRNAポリ
メラーゼ（例えば、T7、T3およびSP6 RNAポリメラー
ゼ）によって認識されるヌクレオチド配列領域を有して
いてもよい。増幅オリゴヌクレオチドは、プライマー伸
長を防止または伸長量を減少させるためにブロックされ
た3'末端を有していてもよく、有していなくてもよい。
好ましくは、本明細書定義の増幅オリゴヌクレオチドは
長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ約1
5ないし50ヌクレオチドである。
「核酸増幅」または「標的増幅」は、少なくとも１の
標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを
意味する。
標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを
意味する。
「アンチセンス」または「負のセンス」は、リファレ
ンス核酸配列に相補的または実質的に相補的な核酸配列
を有することを意味する。
ンス核酸配列に相補的または実質的に相補的な核酸配列
を有することを意味する。
「センス」、「同じセンス」または「正のセンス」
は、リファレンス核酸配列と同一または実質的に同一の
核酸配列を有することを意味する。
は、リファレンス核酸配列と同一または実質的に同一の
核酸配列を有することを意味する。
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、通常には、標識
ハイブリダイゼーションアッセイプローブとは異なる位
置において標的核酸とハイブリダイゼーションし、その
ことにより、標識プローブのハイブリダイゼーション率
が上昇、または標的：標識プローブのハイブリッドの融
解温度（Tm）が上昇、あるいはそれらの両方が上昇する
ように設計された未標識プローブを意味する。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブとは異なる位
置において標的核酸とハイブリダイゼーションし、その
ことにより、標識プローブのハイブリダイゼーション率
が上昇、または標的：標識プローブのハイブリッドの融
解温度（Tm）が上昇、あるいはそれらの両方が上昇する
ように設計された未標識プローブを意味する。
発明の詳細な説明 本発明は、シー・トラコマチスの核酸の特異的検出の
ための増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレ
オチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブ
に指向される。本明細書に開示されクレイムされたすべ
てのオリゴヌクレオチドは共通して、それらがシー・ト
ラコマチスの核酸のオリゴヌクレオチド配列領域に相補
的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列領域を有
するという事実を共有している。
ための増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレ
オチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブ
に指向される。本明細書に開示されクレイムされたすべ
てのオリゴヌクレオチドは共通して、それらがシー・ト
ラコマチスの核酸のオリゴヌクレオチド配列領域に相補
的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列領域を有
するという事実を共有している。
ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマ
ーの設計 本発明増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼ
ーションプローブが、試験試料中に存在する疑いのある
他の非標的核酸よりもシー・トラコマチスのヌクレオチ
ド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーション
するように、ハイブリダイゼーション反応条件、最も重
要にはハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイ
ゼーション溶液中の塩濃度を選択することができる。塩
濃度の低下および／または温度の上昇（厳密性の上昇と
呼ばれる）により、２本鎖ハイブリッド分子において対
になったヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されるた
め核酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する。この
プロセスを融解と呼ぶ。
ーの設計 本発明増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼ
ーションプローブが、試験試料中に存在する疑いのある
他の非標的核酸よりもシー・トラコマチスのヌクレオチ
ド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーション
するように、ハイブリダイゼーション反応条件、最も重
要にはハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイ
ゼーション溶液中の塩濃度を選択することができる。塩
濃度の低下および／または温度の上昇（厳密性の上昇と
呼ばれる）により、２本鎖ハイブリッド分子において対
になったヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されるた
め核酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する。この
プロセスを融解と呼ぶ。
一般的に言えば、最も安定なハイブリッドは、最大数
の一続きの完全にマッチした（すなわち、水素結合し
た）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドである。
よって、通常には、かかるハイブリッドは、ハイブリダ
イゼーション条件の厳密さが上昇した際に最後に融解す
ると考えられる。しかしながら、１個またはそれ以上の
ミスマッチした「正しくない」または不完全な塩基対を
有する２本鎖核酸領域（核酸のヌクレオチド配列におけ
る当該位置において弱い塩基対または存在しない塩基対
を生じる）は、比較的高い厳密性の条件下でもやはり十
分に安定で、試験試料中に存在する他の非標的核酸と交
差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ
において核酸ハイブリッドの検出を可能にする。
の一続きの完全にマッチした（すなわち、水素結合し
た）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドである。
よって、通常には、かかるハイブリッドは、ハイブリダ
イゼーション条件の厳密さが上昇した際に最後に融解す
ると考えられる。しかしながら、１個またはそれ以上の
ミスマッチした「正しくない」または不完全な塩基対を
有する２本鎖核酸領域（核酸のヌクレオチド配列におけ
る当該位置において弱い塩基対または存在しない塩基対
を生じる）は、比較的高い厳密性の条件下でもやはり十
分に安定で、試験試料中に存在する他の非標的核酸と交
差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ
において核酸ハイブリッドの検出を可能にする。
それゆえ、標的生物の核酸と非標的であるがその一方
で密接に関連した生物の核酸との間の配列の相違の程
度、ならびに特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイ
ブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列と標的
核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の相違によっ
て、プローブと標識間の１個またはそれ以上のミスマッ
チは、必ずしも非標的核酸よりも標的核酸にハイブリダ
イゼーションするオリゴヌクレオチドの能力を無に帰す
るものではない。
で密接に関連した生物の核酸との間の配列の相違の程
度、ならびに特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイ
ブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列と標的
核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の相違によっ
て、プローブと標識間の１個またはそれ以上のミスマッ
チは、必ずしも非標的核酸よりも標的核酸にハイブリダ
イゼーションするオリゴヌクレオチドの能力を無に帰す
るものではない。
プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Tm、一定の
反応混合物中の２本鎖分子の半分が１本鎖の変性状態と
なっている温度として定義される）と、試験試料中に存
在すると考えられるが検出する必要のない系統発生論的
に最も密接に関連した生物のrRNAまたはrDNAとプローブ
間に形成されるミスマッチしたハイブリッドのTmとの間
の相違を最大にするように、本発明ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブを選定し、選択し、そして／また
は設計した。未標識増幅オリゴヌクレオチドおよびヘル
パーオリゴヌクレオチドは、本発明において有用な標識
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのようなかか
る極端な特異性を必要としないが、一般的には、それら
は、他の核酸よりも１またはそれ以上の生物の標的核酸
に優先的にハイブリダイゼーションするように、同様の
方法で設計される。
反応混合物中の２本鎖分子の半分が１本鎖の変性状態と
なっている温度として定義される）と、試験試料中に存
在すると考えられるが検出する必要のない系統発生論的
に最も密接に関連した生物のrRNAまたはrDNAとプローブ
間に形成されるミスマッチしたハイブリッドのTmとの間
の相違を最大にするように、本発明ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブを選定し、選択し、そして／また
は設計した。未標識増幅オリゴヌクレオチドおよびヘル
パーオリゴヌクレオチドは、本発明において有用な標識
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのようなかか
る極端な特異性を必要としないが、一般的には、それら
は、他の核酸よりも１またはそれ以上の生物の標的核酸
に優先的にハイブリダイゼーションするように、同様の
方法で設計される。
シー・トラコマチスおよびシー・シッタシおよびシー
・ニューモニエのごとき密接の関連した生物のrRNAのヌ
クレオチド配列は公表されたソースから得られ、あるい
は当該分野においてよく知られた核酸配列決定法を用い
て出願人により独自に決定された。例えば、Lane et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.82:6955（1985）参照。
・ニューモニエのごとき密接の関連した生物のrRNAのヌ
クレオチド配列は公表されたソースから得られ、あるい
は当該分野においてよく知られた核酸配列決定法を用い
て出願人により独自に決定された。例えば、Lane et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.82:6955（1985）参照。
これらの種々の生物のrRNA配列を並置比較することに
より、出願人は、比較的種間で異なる特定の不連続領域
を見いだした。標的生物であるシー・トラコマチスと
「非標的」生物、例えば、シー・シッタシおよびシー・
ニューモニエとの間で最高のヌクレオチド配列の相違を
示した領域を、種特異的ハイブリダイゼーションアッセ
イプローブの設計のための可能性のある標的領域として
選択した。
より、出願人は、比較的種間で異なる特定の不連続領域
を見いだした。標的生物であるシー・トラコマチスと
「非標的」生物、例えば、シー・シッタシおよびシー・
ニューモニエとの間で最高のヌクレオチド配列の相違を
示した領域を、種特異的ハイブリダイゼーションアッセ
イプローブの設計のための可能性のある標的領域として
選択した。
推定上ユニークな可能性のある標的ヌクレオチド配列
を単に同定することは、当該配列を含むシー・トラコマ
チスのrRNAまたはrDNAに機能的に種特異的ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブをハイブリダイゼーション
させうることを保証するものではない。種々の他のファ
クターにより、種特異的プローブに対する標的部位とし
ての核酸の位置の適当性が決定されるであろう。例え
ば、可能性のある標的ヌクレオチド配列のGC含量の増加
（したがって２本鎖プローブ：標的ハイブリッドの増
加）は、一般的には、ハイブリッドの安定性およびTmを
上昇させる。１種またはそれ以上の「非標的」生物と同
じである配列領域中の一続きのヌクレオチド数も安定性
に影響し、よって、シー・トラコマチスのrRNAに完全に
相補的なプローブと非標的生物（複数）のrRNAヌクレオ
チド配列を有する核酸との間で部分的にミスマッチした
ハイブイッドのTmにも影響する。よって、２つのハイブ
リッドの融解温度の相違が十分に大きくない場合、通常
には少なくとも２ないし５℃である場合、プローブは、
ユニークな領域を標的としているにもかかわらず種特異
的でなくてもよい。
を単に同定することは、当該配列を含むシー・トラコマ
チスのrRNAまたはrDNAに機能的に種特異的ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブをハイブリダイゼーション
させうることを保証するものではない。種々の他のファ
クターにより、種特異的プローブに対する標的部位とし
ての核酸の位置の適当性が決定されるであろう。例え
ば、可能性のある標的ヌクレオチド配列のGC含量の増加
（したがって２本鎖プローブ：標的ハイブリッドの増
加）は、一般的には、ハイブリッドの安定性およびTmを
上昇させる。１種またはそれ以上の「非標的」生物と同
じである配列領域中の一続きのヌクレオチド数も安定性
に影響し、よって、シー・トラコマチスのrRNAに完全に
相補的なプローブと非標的生物（複数）のrRNAヌクレオ
チド配列を有する核酸との間で部分的にミスマッチした
ハイブイッドのTmにも影響する。よって、２つのハイブ
リッドの融解温度の相違が十分に大きくない場合、通常
には少なくとも２ないし５℃である場合、プローブは、
ユニークな領域を標的としているにもかかわらず種特異
的でなくてもよい。
所望ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイ
ゼーション溶液組成（例えば、塩濃度）は、２本鎖ハイ
ブリッドの安定性に大きく影響する２つの条件である。
群または種特異的プローブを構築する際に、これらの条
件を考慮しなければならない。ハイブリッド核酸の熱安
定性は反応混合物のイオン強度に伴って上昇する。一
方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよび
アルコール類のような水素結合を破壊する化学試薬はハ
イブリッドの熱安定性を大きく低下させうる。
ゼーション溶液組成（例えば、塩濃度）は、２本鎖ハイ
ブリッドの安定性に大きく影響する２つの条件である。
群または種特異的プローブを構築する際に、これらの条
件を考慮しなければならない。ハイブリッド核酸の熱安
定性は反応混合物のイオン強度に伴って上昇する。一
方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよび
アルコール類のような水素結合を破壊する化学試薬はハ
イブリッドの熱安定性を大きく低下させうる。
標的に対するプローブの特異性を最大にするために、
高い厳密性の条件下で標的にハイブリダイゼーションす
るように本発明の主題のプローブを設計した。かかる条
件下で、高度の相補性を有するただ１本鎖核酸のみが互
いにハイブリダイゼーションするであろう。かかる高度
の相補性を有しない１本鎖核酸はハイブリッドを形成し
ない傾向があるだろう。したがって、アッセイ条件の厳
密さ（すなわち、温度およびイオン強度）は、ハイブリ
ッドを形成するための２つの核酸鎖間に存在すべき相補
性の程度を決定しうる。本発明に関しては、プローブと
標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブ
と存在する１本鎖非標的核酸との間に形成される可能性
のあるハイブリッドとの間の安定性の相違を最大にする
ように厳密性を選択する。
高い厳密性の条件下で標的にハイブリダイゼーションす
るように本発明の主題のプローブを設計した。かかる条
件下で、高度の相補性を有するただ１本鎖核酸のみが互
いにハイブリダイゼーションするであろう。かかる高度
の相補性を有しない１本鎖核酸はハイブリッドを形成し
ない傾向があるだろう。したがって、アッセイ条件の厳
密さ（すなわち、温度およびイオン強度）は、ハイブリ
ッドを形成するための２つの核酸鎖間に存在すべき相補
性の程度を決定しうる。本発明に関しては、プローブと
標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブ
と存在する１本鎖非標的核酸との間に形成される可能性
のあるハイブリッドとの間の安定性の相違を最大にする
ように厳密性を選択する。
非標的配列に対するＧおよびＣの豊富な相同領域を避
け、できるだけ非標的配列に対する不安定化ミスマッチ
を多く含むようにプローブを構築することにより、そし
て非標的生物の配列に完全に相補的なヌクレオチド配列
を有するプローブ長を最小にすることにより、正しいプ
ローブの特異性を設計することができる。
け、できるだけ非標的配列に対する不安定化ミスマッチ
を多く含むようにプローブを構築することにより、そし
て非標的生物の配列に完全に相補的なヌクレオチド配列
を有するプローブ長を最小にすることにより、正しいプ
ローブの特異性を設計することができる。
標的核酸配列の長さ、したがってプローブ配列の全長
も、特異性にとり重要である。いくつかの場合、特定の
「可変」領域において、位置および長さの異なる数個の
ヌクレオチド配列が存在する可能性があり、それらを種
特異的プローブ標的として用いてもよい。いくつかの場
合、種特異的プローブを特定のrRNA可変領域に対して設
計できない。なぜなら、配列領域がプローブにアクセス
不可能であるか、または他の理由による。完全には相補
的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能
であるが、一般的には、完全に相同的な塩基配列の最長
部分がハイブリッドの安定性を決定するであろう。異な
る長さで異なる塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブ
を用いてもよい。
も、特異性にとり重要である。いくつかの場合、特定の
「可変」領域において、位置および長さの異なる数個の
ヌクレオチド配列が存在する可能性があり、それらを種
特異的プローブ標的として用いてもよい。いくつかの場
合、種特異的プローブを特定のrRNA可変領域に対して設
計できない。なぜなら、配列領域がプローブにアクセス
不可能であるか、または他の理由による。完全には相補
的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能
であるが、一般的には、完全に相同的な塩基配列の最長
部分がハイブリッドの安定性を決定するであろう。異な
る長さで異なる塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブ
を用いてもよい。
ハイブリダイゼーションを阻害する強力な分子内構造
を形成する標的領域はあまり好ましくない領域である。
同様に、過度の自己相補性を生じるプローブの設計を避
けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼ
ーションは、水素結合した２本鎖ハイブリッドを形成す
る２つの相補的１本鎖核酸の会合である。よって、２つ
の鎖の一方または両方が、全体的にまたは部分的に分子
内または分子間結合に関与している場合、新たな分子間
プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与する可能性は
少ない。例えば、リボゾームRNA分子は水素結合による
非常に安定な分子内ヘリックスおよび２次構造を形成す
ることが知られている。プローブとのハイブリダイゼー
ションまで標的配列の重要な部分が１本鎖状態のままで
あるようにハイブリダイゼーションアッセイを計画する
ことにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼー
ション率および程度を大いに向上させることができる。
このことを行う１の方法は、比較的分子内水素結合に関
与しない配列を標的ヌクレオチド配列として選択するこ
とによる。別法として、あるいはさらに、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーショ
ンに使用しやすい標的部位を作ることのできるヘルパー
オリゴヌクレオチドとともに、ハイブリダイゼーション
アッセイプローブをプローブミックス中に使用してもよ
い。かかるヘルパープローブは広く記載されている。
を形成する標的領域はあまり好ましくない領域である。
同様に、過度の自己相補性を生じるプローブの設計を避
けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼ
ーションは、水素結合した２本鎖ハイブリッドを形成す
る２つの相補的１本鎖核酸の会合である。よって、２つ
の鎖の一方または両方が、全体的にまたは部分的に分子
内または分子間結合に関与している場合、新たな分子間
プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与する可能性は
少ない。例えば、リボゾームRNA分子は水素結合による
非常に安定な分子内ヘリックスおよび２次構造を形成す
ることが知られている。プローブとのハイブリダイゼー
ションまで標的配列の重要な部分が１本鎖状態のままで
あるようにハイブリダイゼーションアッセイを計画する
ことにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼー
ション率および程度を大いに向上させることができる。
このことを行う１の方法は、比較的分子内水素結合に関
与しない配列を標的ヌクレオチド配列として選択するこ
とによる。別法として、あるいはさらに、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーショ
ンに使用しやすい標的部位を作ることのできるヘルパー
オリゴヌクレオチドとともに、ハイブリダイゼーション
アッセイプローブをプローブミックス中に使用してもよ
い。かかるヘルパープローブは広く記載されている。
標的核酸に完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融
解温度についての推定値を提供する多くの公式が利用で
きる。１のかかる公式： Tm＝81.5＋16.6（log10［Na+］）＋0.41（フラクションＧ＋Ｃ）−（600/N） ［式中、Ｎ＝ヌクレオチド数で示したオリゴヌクレオチ
ド長］ は、約14ないし70ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドのTmに関する良好な推定値を提供する。かかる計算
から、スクリーニング法を用いてTmの実験的証明または
「微調整」を行うことができる（ハイブリダイゼーショ
ンおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる
情報については、例えば、Sambrook et al.,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual（Cold Sprong Harbor La
boratory Press 1989）参照、この文献（第11章）を参
照により本明細書に記載されているものとみなす）。ま
た、この文献は、ハイブリッドのTmに対するミスマッチ
の影響についての推定も提供する。
解温度についての推定値を提供する多くの公式が利用で
きる。１のかかる公式： Tm＝81.5＋16.6（log10［Na+］）＋0.41（フラクションＧ＋Ｃ）−（600/N） ［式中、Ｎ＝ヌクレオチド数で示したオリゴヌクレオチ
ド長］ は、約14ないし70ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドのTmに関する良好な推定値を提供する。かかる計算
から、スクリーニング法を用いてTmの実験的証明または
「微調整」を行うことができる（ハイブリダイゼーショ
ンおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる
情報については、例えば、Sambrook et al.,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual（Cold Sprong Harbor La
boratory Press 1989）参照、この文献（第11章）を参
照により本明細書に記載されているものとみなす）。ま
た、この文献は、ハイブリッドのTmに対するミスマッチ
の影響についての推定も提供する。
核酸の増幅 好ましくは、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリ
ゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによ
る特異的プライマー伸長生成物の合成にための鋳型とし
ての使用に十分な長さである。プローブの設計について
本当のことであるが、反応温度、プライマーの構造およ
び塩基組成、ならびにプライマーの用い方を包含するい
くつかのファクターについて最適プライマー長を考慮す
べきである。例えば、最適特異性に関しては、標的核酸
配列の複雑さにもよるが、一般的にはオリゴヌクレオチ
ドプライマーは少なくとも約12ヌクレオチドを含むべき
である。かかる特異性が必須でない場合、短いプライマ
ーを使用してもよい。かかる場合、低温で反応を行って
鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形成すること
が望ましいかもしれない。
ゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによ
る特異的プライマー伸長生成物の合成にための鋳型とし
ての使用に十分な長さである。プローブの設計について
本当のことであるが、反応温度、プライマーの構造およ
び塩基組成、ならびにプライマーの用い方を包含するい
くつかのファクターについて最適プライマー長を考慮す
べきである。例えば、最適特異性に関しては、標的核酸
配列の複雑さにもよるが、一般的にはオリゴヌクレオチ
ドプライマーは少なくとも約12ヌクレオチドを含むべき
である。かかる特異性が必須でない場合、短いプライマ
ーを使用してもよい。かかる場合、低温で反応を行って
鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形成すること
が望ましいかもしれない。
本発明増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる
核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドまたはデオキ
シリボヌクレオチド、あるいはそれらの両方を共有結合
核酸ポリマーまたは鎖にする化学的、物理的または生物
学的な剤をいう。核酸ポリメラーゼの例は、DNA指向DNA
ポリメラーゼ、RNA指向DNAポリメラーゼ、および／また
はRNAポリメラーゼ活性を有する酵素である。
核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドまたはデオキ
シリボヌクレオチド、あるいはそれらの両方を共有結合
核酸ポリマーまたは鎖にする化学的、物理的または生物
学的な剤をいう。核酸ポリメラーゼの例は、DNA指向DNA
ポリメラーゼ、RNA指向DNAポリメラーゼ、および／また
はRNAポリメラーゼ活性を有する酵素である。
DNAポリメラーゼは、鋳型に依存する様式で5'から3'方
向の核酸合成を引き起こす。２本鎖核酸における２つの
鎖が逆方向であるので、この方向は、鋳型の3'領域から
鋳型の5'領域への方向である。DNA指向DNAポリメラーゼ
の例は、イー・コリ（E.coli）・DNAポリメラーゼＩ、
サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）由来の
耐熱性DNAポリメラーゼ（Taq）、およびバチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
由来の耐熱性DNAポリメラーゼ（Bst）である。RNA指向D
NAポリメラーゼの例は、種々のレトロウイルス逆転写酵
素、例えばMMLV逆転写酵素またはAMV逆転写酵素であ
る。
向の核酸合成を引き起こす。２本鎖核酸における２つの
鎖が逆方向であるので、この方向は、鋳型の3'領域から
鋳型の5'領域への方向である。DNA指向DNAポリメラーゼ
の例は、イー・コリ（E.coli）・DNAポリメラーゼＩ、
サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）由来の
耐熱性DNAポリメラーゼ（Taq）、およびバチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
由来の耐熱性DNAポリメラーゼ（Bst）である。RNA指向D
NAポリメラーゼの例は、種々のレトロウイルス逆転写酵
素、例えばMMLV逆転写酵素またはAMV逆転写酵素であ
る。
大部分の核酸増幅反応の間において、核酸ポリメラー
ゼは、標的核酸を鋳型として用いてプライマーの3'末端
にヌクレオチド残基を付加し、かくして、標的核酸の領
域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有
する第２の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応にお
いて、生じた２本鎖構造を含む２つの鎖を化学的または
物理的手段により分離して増幅反応が進行するようにし
なければならない。別法として、新たに合成された鎖を
消化することなく元の標的鎖の一部または全部を消化す
る核酸分解酵素の使用により、新たに合成された鋳型鎖
を第２のプライマーまたはプロモーター−プライマーと
のハイブリダイゼーションに利用可能とすることもでき
る。このようにして、当該プロセスを多サイクル繰り返
して行って、標的ヌクレオチド配列を有する多数の核酸
分子を得ることができる。
ゼは、標的核酸を鋳型として用いてプライマーの3'末端
にヌクレオチド残基を付加し、かくして、標的核酸の領
域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有
する第２の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応にお
いて、生じた２本鎖構造を含む２つの鎖を化学的または
物理的手段により分離して増幅反応が進行するようにし
なければならない。別法として、新たに合成された鎖を
消化することなく元の標的鎖の一部または全部を消化す
る核酸分解酵素の使用により、新たに合成された鋳型鎖
を第２のプライマーまたはプロモーター−プライマーと
のハイブリダイゼーションに利用可能とすることもでき
る。このようにして、当該プロセスを多サイクル繰り返
して行って、標的ヌクレオチド配列を有する多数の核酸
分子を得ることができる。
第１または第２の増幅オリゴヌクレオチドのいずれ
か、あるいはそれらの両方はプロモーター−プライマー
であってもよい。通常には、かかるプロモーター−プラ
イマーは、標的核酸分子またはプライマー伸長生成物の
配列に相補的でないヌクレオチド配列を含んでいる。こ
れらの相補的でない配列は増幅オリゴヌクレオチド上の
相補的配列の5'側に存在していてもよく、さらに核酸ポ
リメラーゼ作用により２本鎖が作られる場合にはRNA合
成開始のための位置を提供してもよい。よって、用意し
たプロモーターが標的核酸配列の多数のRNAコピーのイ
ンビトロ転写を可能にするものであってもよい。本明細
書中でプライマーという場合、特に明確に示さないかぎ
り、プロモーター−プライマーのプライマー態様を含
む。
か、あるいはそれらの両方はプロモーター−プライマー
であってもよい。通常には、かかるプロモーター−プラ
イマーは、標的核酸分子またはプライマー伸長生成物の
配列に相補的でないヌクレオチド配列を含んでいる。こ
れらの相補的でない配列は増幅オリゴヌクレオチド上の
相補的配列の5'側に存在していてもよく、さらに核酸ポ
リメラーゼ作用により２本鎖が作られる場合にはRNA合
成開始のための位置を提供してもよい。よって、用意し
たプロモーターが標的核酸配列の多数のRNAコピーのイ
ンビトロ転写を可能にするものであってもよい。本明細
書中でプライマーという場合、特に明確に示さないかぎ
り、プロモーター−プライマーのプライマー態様を含
む。
いくつかの増幅系において、例えば、Dattaguptaらの
上記文献における増幅系において、増幅オリゴヌクレオ
チドは鎖の置換を促進する5'非相補的ヌクレオチドを含
んでいてもよい。さらにそのうえ、5'エキソヌクレアー
ゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと組み合わせて使用す
る場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素消化を回避する
ためにその5'末端に修飾を有していてもよい。別法とし
て、例えば、5'ヌクレアーゼドメインを伴わない活性ポ
リメラーゼフラグメントを生じるプロテアーゼで処理す
ることにより核酸ポリメラーゼを修飾して5'エキソヌク
レアーゼ活性を除去してもよい。かかる場合、オリゴヌ
クレオチドをその5'末端において修飾する必要はない。
上記文献における増幅系において、増幅オリゴヌクレオ
チドは鎖の置換を促進する5'非相補的ヌクレオチドを含
んでいてもよい。さらにそのうえ、5'エキソヌクレアー
ゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと組み合わせて使用す
る場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素消化を回避する
ためにその5'末端に修飾を有していてもよい。別法とし
て、例えば、5'ヌクレアーゼドメインを伴わない活性ポ
リメラーゼフラグメントを生じるプロテアーゼで処理す
ることにより核酸ポリメラーゼを修飾して5'エキソヌク
レアーゼ活性を除去してもよい。かかる場合、オリゴヌ
クレオチドをその5'末端において修飾する必要はない。
オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチドは共有結合したヌクレオチドサブ
ユニットからできている。ヌクレオチドサブユニットの
糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ−メチル
リボースのごときそれらの修飾誘導体であってよい。ヌ
クレオチドサブユニットは、例えば、ホスホジエステル
結合、修飾結合によって、あるいはオリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド
部分によって結合されていてもよい。修飾結合は、標準
的なホスホジエステル結合がホスホオチオエート結合ま
たはメチルホスホネート結合のごとき別の結合で置き換
えられた結合を包含する。上述のごとく、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブとして使用する場合、好ま
しくは、オリゴヌクレオチドはアクリジニウムエステル
または放射性同位元素のごときレポーター基を含んでい
て標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同
定を容易にする。
ユニットからできている。ヌクレオチドサブユニットの
糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ−メチル
リボースのごときそれらの修飾誘導体であってよい。ヌ
クレオチドサブユニットは、例えば、ホスホジエステル
結合、修飾結合によって、あるいはオリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド
部分によって結合されていてもよい。修飾結合は、標準
的なホスホジエステル結合がホスホオチオエート結合ま
たはメチルホスホネート結合のごとき別の結合で置き換
えられた結合を包含する。上述のごとく、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブとして使用する場合、好ま
しくは、オリゴヌクレオチドはアクリジニウムエステル
または放射性同位元素のごときレポーター基を含んでい
て標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同
定を容易にする。
当該分野で知られた方法により、すべての本発明増幅
オリゴヌクレオチドを容易に調製することができる。好
ましくは、固相法を用いてプライマーを合成する。例え
ば、Carruthersらは、標準的なホスホラミダイト固相化
学を用いてホスホジエステル結合によりヌクレオチドを
結合することを記載している（Methods in Enzymology,
第143巻,287ページ（1987））。同様に、Bhattは、ホス
ホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成方
法を記載している（本発明と共有のBhattの米国特許第
5,252,723号）。また、KlemらのPCT出願WO/92/17864に
は、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有する
オリゴヌクレオチドの合成が記載されている。これら３
つの文献を参照により本明細書に記載されているものと
みなす。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成法は当
業者に知られており、すでに参照により本明細書に記載
されているものとみなしたSambrookらの上記文献に記載
されている。
オリゴヌクレオチドを容易に調製することができる。好
ましくは、固相法を用いてプライマーを合成する。例え
ば、Carruthersらは、標準的なホスホラミダイト固相化
学を用いてホスホジエステル結合によりヌクレオチドを
結合することを記載している（Methods in Enzymology,
第143巻,287ページ（1987））。同様に、Bhattは、ホス
ホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成方
法を記載している（本発明と共有のBhattの米国特許第
5,252,723号）。また、KlemらのPCT出願WO/92/17864に
は、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有する
オリゴヌクレオチドの合成が記載されている。これら３
つの文献を参照により本明細書に記載されているものと
みなす。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成法は当
業者に知られており、すでに参照により本明細書に記載
されているものとみなしたSambrookらの上記文献に記載
されている。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリ
ゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドであ
るにせよ、すべての本発明オリゴヌクレオチドを化学基
で修飾して、その品質を向上させ、あるいは増幅生成物
の特徴づけを容易にすることができる。例えば、ある種
のポリメラーゼの核酸分解活性に対してオリゴヌクレオ
チドを耐性とするホスホロチオエートまたはメチルホス
ホネート基を有するオリゴヌクレオチドのごとき骨格を
修飾されたオリゴヌクレオチドは、増幅または他の反応
におけるかかる酵素の使用を可能にする。修飾のさらに
もう１つの例は、プライマーのハイブリダイゼーション
または伸長を妨害しないヌクレオチド間またはオリゴヌ
クレオチド末端に含まれる非ヌクレオチドリンカー（例
えば、Arnoldらの欧州特許出願第88308766−０号、参照
により本明細書に記載されているものとみなす）の使用
を包含する。増幅オリゴヌクレオチドは所望の修飾およ
び天然ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよく、さら
にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混
合物を含んでいてもよい。
ゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドであ
るにせよ、すべての本発明オリゴヌクレオチドを化学基
で修飾して、その品質を向上させ、あるいは増幅生成物
の特徴づけを容易にすることができる。例えば、ある種
のポリメラーゼの核酸分解活性に対してオリゴヌクレオ
チドを耐性とするホスホロチオエートまたはメチルホス
ホネート基を有するオリゴヌクレオチドのごとき骨格を
修飾されたオリゴヌクレオチドは、増幅または他の反応
におけるかかる酵素の使用を可能にする。修飾のさらに
もう１つの例は、プライマーのハイブリダイゼーション
または伸長を妨害しないヌクレオチド間またはオリゴヌ
クレオチド末端に含まれる非ヌクレオチドリンカー（例
えば、Arnoldらの欧州特許出願第88308766−０号、参照
により本明細書に記載されているものとみなす）の使用
を包含する。増幅オリゴヌクレオチドは所望の修飾およ
び天然ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよく、さら
にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混
合物を含んでいてもよい。
本発明と共有のMcDonoughらの米国特許出願第07/925,
405号（参照により本明細書に記載されているものとみ
なす）により記載されたように、増幅オリゴヌクレオチ
ドの3'末端をブロックしてDNA合成を阻害または防止し
てもよい。3'をブロックされた異なるプロモーター−プ
ライマーの混合物、または3'をブロックされたプロモー
ター−プライマーと3'をブロックされていないプロモー
ター−プライマーとの混合物は、該文献に記載されたよ
うに、核酸増幅効率を向上させうる。
405号（参照により本明細書に記載されているものとみ
なす）により記載されたように、増幅オリゴヌクレオチ
ドの3'末端をブロックしてDNA合成を阻害または防止し
てもよい。3'をブロックされた異なるプロモーター−プ
ライマーの混合物、または3'をブロックされたプロモー
ター−プライマーと3'をブロックされていないプロモー
ター−プライマーとの混合物は、該文献に記載されたよ
うに、核酸増幅効率を向上させうる。
上に開示したように、オリゴヌクレオチドの5'末端を
修飾して、ある種の核酸ポリメラーゼに存在する5'−エ
キソヌクレアーゼ活性に耐性としてもよい。例えば、す
でに参照により本明細書に記載されているものとみなし
た「非ヌクレオチド結合試薬（Non−Nucleotide Linkin
g Reagents）」というタイトルのArnoldらの上記特許に
記載されたような方法を用いて、非ヌクレオチド基をプ
ライマーの末端5'ヌクレオチドに付加することにより、
かかる修飾を行うことができる。
修飾して、ある種の核酸ポリメラーゼに存在する5'−エ
キソヌクレアーゼ活性に耐性としてもよい。例えば、す
でに参照により本明細書に記載されているものとみなし
た「非ヌクレオチド結合試薬（Non−Nucleotide Linkin
g Reagents）」というタイトルのArnoldらの上記特許に
記載されたような方法を用いて、非ヌクレオチド基をプ
ライマーの末端5'ヌクレオチドに付加することにより、
かかる修飾を行うことができる。
シー・トラコマチスのrRNAおよびrDNAの修飾 本発明増幅オリゴヌクレオチドは特定のシー・トラコ
マチスの23Sまたは16S rRNAヌクレオチド配列あるいは
それらのrDNA対応物に指向されており、少なくとも１種
のシー・トラコマチス特異的標的ヌクレオチド配列領域
の増幅を起こさせる。本明細書記載の増幅オリゴヌクレ
オチドは２つのセットの増幅オリゴヌクレオチドを含
む。第１のセットの増幅オリゴヌクレオチドのメンバー
は、下記ヌクレオチド配列： のうちの１つを有するrRNAまたはrDNA領域（あるいはチ
ミンのかわりにウラシルを有するかかる配列のRNAバー
ジョン）とハイブリダイゼーションするであろう。
マチスの23Sまたは16S rRNAヌクレオチド配列あるいは
それらのrDNA対応物に指向されており、少なくとも１種
のシー・トラコマチス特異的標的ヌクレオチド配列領域
の増幅を起こさせる。本明細書記載の増幅オリゴヌクレ
オチドは２つのセットの増幅オリゴヌクレオチドを含
む。第１のセットの増幅オリゴヌクレオチドのメンバー
は、下記ヌクレオチド配列： のうちの１つを有するrRNAまたはrDNA領域（あるいはチ
ミンのかわりにウラシルを有するかかる配列のRNAバー
ジョン）とハイブリダイゼーションするであろう。
これらの増幅オリゴヌクレオチドの好ましい具体例は
下記配列： あるいはチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配
列のRNAバージョンを有するか、またはこれらを必須と
してなる。これらのオリゴヌクレオチドは、RNAポリメ
ラーゼに結合し、標的核酸を鋳型として用いるRNA転写
を指令しうるプロモーター配列を含むさらなる非相補的
塩基をその5'末端に有していてもよい。
下記配列： あるいはチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配
列のRNAバージョンを有するか、またはこれらを必須と
してなる。これらのオリゴヌクレオチドは、RNAポリメ
ラーゼに結合し、標的核酸を鋳型として用いるRNA転写
を指令しうるプロモーター配列を含むさらなる非相補的
塩基をその5'末端に有していてもよい。
好ましくは、配列番号:12を有する核酸領域を標的と
する増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:13および／ま
たは14の領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組
み合わせて使用し、配列番号:15を有する核酸領域を標
的とする増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:16を有す
る核酸領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組み
合わせて使用し、配列番号:45を有する核酸領域を標的
とする増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:51を有する
核酸領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組み合
わせて使用する。よって、好ましい具体例において、配
列番号:4の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:5および
／または６の増幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、
配列番号:7の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:8の増
幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、配列番号:44の
増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:50の増幅オリゴヌ
クレオチドとともに使用する。
する増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:13および／ま
たは14の領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組
み合わせて使用し、配列番号:15を有する核酸領域を標
的とする増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:16を有す
る核酸領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組み
合わせて使用し、配列番号:45を有する核酸領域を標的
とする増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:51を有する
核酸領域を標的とする増幅オリゴヌクレオチドと組み合
わせて使用する。よって、好ましい具体例において、配
列番号:4の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:5および
／または６の増幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、
配列番号:7の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:8の増
幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、配列番号:44の
増幅オリゴヌクレオチドを配列番号:50の増幅オリゴヌ
クレオチドとともに使用する。
第２のセットを含む増幅オリゴヌクレオチドは特定の
シー・トラコマチスの23S rRNAヌクレオチド配列、また
はそれらのrDNA対応物に指向されており、少なくとも１
の標的ヌクレオチド配列領域と境を接している。これら
の増幅オリゴヌクレオチドを、第１のセットの増幅オリ
ゴヌクレオチドと同じ方法で使用してもよく、例えば、
プライマーペアー、ネスティッドプライマーペアーのメ
ンバーとして、あるいはRNAポリメラーゼ開始部位とし
て使用してもよい。しかしながら、それらは、後に詳述
する等温鎖置換（isothermal strand displacement）核
酸増幅系における好ましい使用方法において第１のセッ
トのメンバーと異なる。これらのオリゴヌクレオチド
は、下記ヌクレオチド配列： あるいはチミンのかわりにウラシルを有するかかる配列
のRNAバージョンの１つにハイブリダイゼーションする
であろう。
シー・トラコマチスの23S rRNAヌクレオチド配列、また
はそれらのrDNA対応物に指向されており、少なくとも１
の標的ヌクレオチド配列領域と境を接している。これら
の増幅オリゴヌクレオチドを、第１のセットの増幅オリ
ゴヌクレオチドと同じ方法で使用してもよく、例えば、
プライマーペアー、ネスティッドプライマーペアーのメ
ンバーとして、あるいはRNAポリメラーゼ開始部位とし
て使用してもよい。しかしながら、それらは、後に詳述
する等温鎖置換（isothermal strand displacement）核
酸増幅系における好ましい使用方法において第１のセッ
トのメンバーと異なる。これらのオリゴヌクレオチド
は、下記ヌクレオチド配列： あるいはチミンのかわりにウラシルを有するかかる配列
のRNAバージョンの１つにハイブリダイゼーションする
であろう。
第２のセットの増幅オリゴヌクレオチドを含むオリゴ
ヌクレオチドの好ましい具体例は下記ヌクレオチド配
列： ならびにチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配
列のRNAバージョンを有する。最も好ましい具体例にお
いて、これらのオリゴヌクレオチドはさらなる非相補的
ヌクレオチドをその5'末端に有し、プライマー伸長生成
物の置換をさらに促進する。
ヌクレオチドの好ましい具体例は下記ヌクレオチド配
列： ならびにチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配
列のRNAバージョンを有する。最も好ましい具体例にお
いて、これらのオリゴヌクレオチドはさらなる非相補的
ヌクレオチドをその5'末端に有し、プライマー伸長生成
物の置換をさらに促進する。
すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドは、未修飾ヌ
クレオチド配列、あるいは上記配列に対して欠失または
付加を含む配列を有していてもよい。しかしながら、さ
らに、あるいはこれとは別に、増幅オリゴヌクレオチド
は、ブロックされ、そして／または修飾された3'および
／または5'末端、あるいはRNAポリメラーゼにより認識
される特異的ヌクレオチド配列（例えば、T7、T3または
SP6RNAポリメラーゼの対するプロモーター配列）の付
加、を包含する付加、RNAポリメラーゼによるRNA転写の
開始または伸長を引き起こしまたは促進する配列領域の
付加、あるいは分子内塩基対を提供し核酸の２次もしく
は３次構造の形成を促進しうる配列領域の付加を包含す
る付加（これらの付加に限らない）を有していてもよ
い。
クレオチド配列、あるいは上記配列に対して欠失または
付加を含む配列を有していてもよい。しかしながら、さ
らに、あるいはこれとは別に、増幅オリゴヌクレオチド
は、ブロックされ、そして／または修飾された3'および
／または5'末端、あるいはRNAポリメラーゼにより認識
される特異的ヌクレオチド配列（例えば、T7、T3または
SP6RNAポリメラーゼの対するプロモーター配列）の付
加、を包含する付加、RNAポリメラーゼによるRNA転写の
開始または伸長を引き起こしまたは促進する配列領域の
付加、あるいは分子内塩基対を提供し核酸の２次もしく
は３次構造の形成を促進しうる配列領域の付加を包含す
る付加（これらの付加に限らない）を有していてもよ
い。
KacianおよびFultz（上記文献）、Dattaguptaら（上
記文献）、およびSninskyらの米国特許第5,079,351号
（いずれも参照により本明細書に記載されているものと
見なす。それらの最初の２つは本明細書と共有である）
により記載されたポリメラーゼ連鎖反応またはRNAポリ
メラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNAse H活性を用いる
核酸増幅法において増幅オリゴヌクレオチドを使用す
る。
記文献）、およびSninskyらの米国特許第5,079,351号
（いずれも参照により本明細書に記載されているものと
見なす。それらの最初の２つは本明細書と共有である）
により記載されたポリメラーゼ連鎖反応またはRNAポリ
メラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNAse H活性を用いる
核酸増幅法において増幅オリゴヌクレオチドを使用す
る。
増幅された標的配列を検出するために種々の方法が使
用できる。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマー
は、新たに合成されるDNA中に取り込まれる検出可能標
識を含んでいてもよい。次いで、得られた標識増幅生成
物を未使用ヌクレオチドまたはプライマーから分離する
ことができ、分離された生成物フラクション中の標識を
検出する。
用できる。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマー
は、新たに合成されるDNA中に取り込まれる検出可能標
識を含んでいてもよい。次いで、得られた標識増幅生成
物を未使用ヌクレオチドまたはプライマーから分離する
ことができ、分離された生成物フラクション中の標識を
検出する。
有用な検出可能標識として役立ちうる物質は当該分野
においてよく知られており、放射性同位元素、蛍光化合
物、化学発光化合物、発色基、ならびに直接検出できな
いが標識された形態の特異的結合パートナー、例えば、
それぞれアビジンおよび抗体との反応により検出されう
るビオチンおよびハプテンのごときリガンドを包含す
る。
においてよく知られており、放射性同位元素、蛍光化合
物、化学発光化合物、発色基、ならびに直接検出できな
いが標識された形態の特異的結合パートナー、例えば、
それぞれアビジンおよび抗体との反応により検出されう
るビオチンおよびハプテンのごときリガンドを包含す
る。
別のアプローチは、検出可能な核酸プローブとのハイ
ブリダイゼーションによる増幅生成物を検出し、得られ
た標識ハイブリッドを慣用的方法で測定することであ
る。好ましい使用において、化学発光アクリジニウムエ
ステル標識核酸プローブを標的配列にハイブリダイゼー
ションさせ、未ハイブリダイゼーションプローブ上に存
在するアクリジニウムエステルを加水分解し、次いで、
残存アクリジニウムエステルから生じる化学発光をルミ
ノメーターで測定することにより生成物をアッセイする
ことができる。例えば、Arnoldらの上記文献、PCT出願U
S88/02746、ArnoldおよびNelsonの米国特許第5,283,174
号、ならびにNelsonらの「非アイソトープDNAプローブ
法（Non−Isotopic DNA Probe Technologies）」（Acad
emic Press,San Diego（KRICKA編1992年）参照（これら
の文献を参照により本明細書に記載されているものとみ
なし、はじめの２つは本発明と共有である）。
ブリダイゼーションによる増幅生成物を検出し、得られ
た標識ハイブリッドを慣用的方法で測定することであ
る。好ましい使用において、化学発光アクリジニウムエ
ステル標識核酸プローブを標的配列にハイブリダイゼー
ションさせ、未ハイブリダイゼーションプローブ上に存
在するアクリジニウムエステルを加水分解し、次いで、
残存アクリジニウムエステルから生じる化学発光をルミ
ノメーターで測定することにより生成物をアッセイする
ことができる。例えば、Arnoldらの上記文献、PCT出願U
S88/02746、ArnoldおよびNelsonの米国特許第5,283,174
号、ならびにNelsonらの「非アイソトープDNAプローブ
法（Non−Isotopic DNA Probe Technologies）」（Acad
emic Press,San Diego（KRICKA編1992年）参照（これら
の文献を参照により本明細書に記載されているものとみ
なし、はじめの２つは本発明と共有である）。
シー・トラコマチスのrRNAおよびrDNAに対するオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書に開示されクレイムされているオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、系
統発生論的に密接な関連のある細菌種、好ましくは、シ
ー・シッタシおよびシー・ニューモニエの核酸よりも、
シー・トラコマチスのrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列
を含む標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションする
ことができる。シー・トラコマチスおよび上記系統発生
論的に密接に関連した種のリボゾームRNAの対応領域の
ヌクレオチド配列の比較に基づいて、これらのハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブを設計し、選択および
／または選定した。
クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書に開示されクレイムされているオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、系
統発生論的に密接な関連のある細菌種、好ましくは、シ
ー・シッタシおよびシー・ニューモニエの核酸よりも、
シー・トラコマチスのrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列
を含む標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションする
ことができる。シー・トラコマチスおよび上記系統発生
論的に密接に関連した種のリボゾームRNAの対応領域の
ヌクレオチド配列の比較に基づいて、これらのハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブを設計し、選択および
／または選定した。
本発明ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、
下記標的rDNAヌクレオチド配列： またはそれらに完全に相補的なヌクレオチド配列、 あるいはチミンのかわりにウラシルを有するそれらのRN
Aバージョンに相補的である。
下記標的rDNAヌクレオチド配列： またはそれらに完全に相補的なヌクレオチド配列、 あるいはチミンのかわりにウラシルを有するそれらのRN
Aバージョンに相補的である。
これらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
アッセイプローブの好ましい具体例は下記ヌクレオチド
配列： およびチミンのかわりにウラシルを有するそれらのRNA
バージョンを有する。
アッセイプローブの好ましい具体例は下記ヌクレオチド
配列： およびチミンのかわりにウラシルを有するそれらのRNA
バージョンを有する。
好ましくは、本発明オリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブを、放射性同位元素、蛍光
もしくは化学発光部分、酵素もしくは他のリガンドのご
とき検出可能標識で標識するが、それらの標識は、プロ
ーブが標的配列にハイブリダイゼーションしたことの検
出または確認に使用することができるものである。出願
人は、標識として化学発光アクリジニウムエステルの使
用を好む。本発明と共有であり、参照により本明細書に
記載されているものとみなされるArnoldらの米国特許第
5,185,439号参照。相補的部分における水素結合による
２つの鎖のアニーリングを可能にするのに適したハイブ
リダイゼーション条件下にて標的配列を有する核酸を含
有する疑いのある試料とアッセイプローブを混合する。
プローブを１またはそれ以上の未標識ヘルパーオリゴヌ
クレオチドと組み合わせて、標的クラミジア・トラコマ
チスのヌクレオチド配列を有する核酸への結合を容易に
してもよい。次いで、プローブは試料中に存在する標的
核酸にハイブリダイゼーションする。ヒドロキシアパタ
イト吸着および放射活性モニタリングのごとき当該分野
でよく知られた種々の方法によって、得られたハイブリ
ッド２本鎖を分離し検出することができる。本発明と共
有であり、参照により本明細書に記載されているものと
みなされるArnoldらの米国特許第5,283,174号に開示さ
れたような、未ハイブリダイゼーションプローブ上に存
在する標識を選択的に分解し、次いで、残存するハイブ
リダイゼーションしたプローブに結合した標識量を測定
することを含む方法も、これらの方法に包含される。出
願人はこの後者の方法を好む。
ゼーションアッセイプローブを、放射性同位元素、蛍光
もしくは化学発光部分、酵素もしくは他のリガンドのご
とき検出可能標識で標識するが、それらの標識は、プロ
ーブが標的配列にハイブリダイゼーションしたことの検
出または確認に使用することができるものである。出願
人は、標識として化学発光アクリジニウムエステルの使
用を好む。本発明と共有であり、参照により本明細書に
記載されているものとみなされるArnoldらの米国特許第
5,185,439号参照。相補的部分における水素結合による
２つの鎖のアニーリングを可能にするのに適したハイブ
リダイゼーション条件下にて標的配列を有する核酸を含
有する疑いのある試料とアッセイプローブを混合する。
プローブを１またはそれ以上の未標識ヘルパーオリゴヌ
クレオチドと組み合わせて、標的クラミジア・トラコマ
チスのヌクレオチド配列を有する核酸への結合を容易に
してもよい。次いで、プローブは試料中に存在する標的
核酸にハイブリダイゼーションする。ヒドロキシアパタ
イト吸着および放射活性モニタリングのごとき当該分野
でよく知られた種々の方法によって、得られたハイブリ
ッド２本鎖を分離し検出することができる。本発明と共
有であり、参照により本明細書に記載されているものと
みなされるArnoldらの米国特許第5,283,174号に開示さ
れたような、未ハイブリダイゼーションプローブ上に存
在する標識を選択的に分解し、次いで、残存するハイブ
リダイゼーションしたプローブに結合した標識量を測定
することを含む方法も、これらの方法に包含される。出
願人はこの後者の方法を好む。
シー・トラコマチスの検出に使用するヘルパーオリゴヌ
クレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、標的核
酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイ
ブリダイゼーションを容易にした。ヘルパーオリゴヌク
レオチドは、本願と共有のHoganおよびMillimanの米国
特許第5,030,557号に記載されており、これを参照によ
り本明細書に記載されているものとみなす。シー・トラ
コマチスの特異的検出を容易にする特異的ヘルパーオリ
ゴヌクレオチドは、下記シー・トラコマチスのヌクレオ
チド配列： およびチミンをウラシルで置換したそれらのRNAバージ
ョンに相補的なヌクレオチド配列を有する。
クレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、標的核
酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイ
ブリダイゼーションを容易にした。ヘルパーオリゴヌク
レオチドは、本願と共有のHoganおよびMillimanの米国
特許第5,030,557号に記載されており、これを参照によ
り本明細書に記載されているものとみなす。シー・トラ
コマチスの特異的検出を容易にする特異的ヘルパーオリ
ゴヌクレオチドは、下記シー・トラコマチスのヌクレオ
チド配列： およびチミンをウラシルで置換したそれらのRNAバージ
ョンに相補的なヌクレオチド配列を有する。
このヘルパーオリゴヌクレオチドの好ましい具体例
は、下記ヌクレオチド配列： を有するオリゴヌクレオチドである。
は、下記ヌクレオチド配列： を有するオリゴヌクレオチドである。
一般的には、厳密なハイブリダイゼーション条件下で
ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることができるが、
必ずしもそれらの選択性において種特異的であるとは限
らない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドに対す
る標的ヌクレオチド配列は、必ずしも種シー・トラコマ
チスに対するユニークなものであるとは限らない。
ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることができるが、
必ずしもそれらの選択性において種特異的であるとは限
らない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドに対す
る標的ヌクレオチド配列は、必ずしも種シー・トラコマ
チスに対するユニークなものであるとは限らない。
好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブを増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いること
ができ、さらにシー・トラコマチスの検出用ヘルパーオ
リゴヌクレオチドとともに用いることができる。好まし
い組み合わせにおいて、示されたヌクレオチド配列を有
する本発明オリゴヌクレオチドを下記組み合わせにおい
てシー・トラコマチスの検出のために使用する。
ブを増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いること
ができ、さらにシー・トラコマチスの検出用ヘルパーオ
リゴヌクレオチドとともに用いることができる。好まし
い組み合わせにおいて、示されたヌクレオチド配列を有
する本発明オリゴヌクレオチドを下記組み合わせにおい
てシー・トラコマチスの検出のために使用する。
シー・トラコマチス増幅用プライマー配置において用い
る増幅オリゴヌクレオチドの好ましい使用方法 すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドを上記方法お
よび下記実施例に開示のごときシー・トラコマチス核酸
の増幅のための多くの核酸増幅法と組み合わせて用いる
ことができるが、好ましい具体例において、本願と共有
で参照により本開示の一部とされるDattaguptaらの上記
文献に開示されたように、リボゾームヌクレオチド配列
番号:30ないし42を有する核酸を標的とする増幅オリゴ
ヌクレオチドをプライマー配置（primer array）におい
て一緒に使用する。そこに開示された修飾法によれば、
サーモサイクリングまたは各プライマー伸長反応後の２
つの鎖の一方の分解を必要とせずに、プライマー配置を
用いて１つの標的核酸配列を増幅することができる。
る増幅オリゴヌクレオチドの好ましい使用方法 すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドを上記方法お
よび下記実施例に開示のごときシー・トラコマチス核酸
の増幅のための多くの核酸増幅法と組み合わせて用いる
ことができるが、好ましい具体例において、本願と共有
で参照により本開示の一部とされるDattaguptaらの上記
文献に開示されたように、リボゾームヌクレオチド配列
番号:30ないし42を有する核酸を標的とする増幅オリゴ
ヌクレオチドをプライマー配置（primer array）におい
て一緒に使用する。そこに開示された修飾法によれば、
サーモサイクリングまたは各プライマー伸長反応後の２
つの鎖の一方の分解を必要とせずに、プライマー配置を
用いて１つの標的核酸配列を増幅することができる。
好ましい使用において、配列番号:17から29までを有
する増幅オリゴヌクレオチドは、5'から3'方向のエキソ
ヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼと組み合わせ
て使用するプライマー配置を含む。最初の標的核酸（シ
ー・トラコマチスのrRNAまたはrDNA）に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第１のサブセットのプライマー（配
列番号:17〜23を有する）およびシー・トラコマチスの
標的rRNAまたはrDNAの領域の同じセンスのヌクレオチド
配列を有する第２のサブセットの各プライマー（配列番
号:24〜29を有する）からプライマー配置を作る。これ
ら２つのサブセットのプライマーを、それぞれ相補性プ
ライマーおよびセンスプライマーという。各プライマー
のヌクレオチド配列は鋳型の正しい配列を反映している
必要はないが、一定の増幅条件下で鋳型鎖と安定なハイ
ブリッドを形成できなくてはならない。新たに形成され
た各プライマー伸長生成物は、いったん置換されると、
それ自身さらなる核酸合成のための鋳型として作用する
ことができる。そのうえ、当該方法に用いる核酸ポリメ
ラーゼが一定ハイブリダイゼーションおよび鎖置換温度
において活性があるかぎり、その一定温度および反応条
件において増幅反応が起こりうる。
する増幅オリゴヌクレオチドは、5'から3'方向のエキソ
ヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼと組み合わせ
て使用するプライマー配置を含む。最初の標的核酸（シ
ー・トラコマチスのrRNAまたはrDNA）に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第１のサブセットのプライマー（配
列番号:17〜23を有する）およびシー・トラコマチスの
標的rRNAまたはrDNAの領域の同じセンスのヌクレオチド
配列を有する第２のサブセットの各プライマー（配列番
号:24〜29を有する）からプライマー配置を作る。これ
ら２つのサブセットのプライマーを、それぞれ相補性プ
ライマーおよびセンスプライマーという。各プライマー
のヌクレオチド配列は鋳型の正しい配列を反映している
必要はないが、一定の増幅条件下で鋳型鎖と安定なハイ
ブリッドを形成できなくてはならない。新たに形成され
た各プライマー伸長生成物は、いったん置換されると、
それ自身さらなる核酸合成のための鋳型として作用する
ことができる。そのうえ、当該方法に用いる核酸ポリメ
ラーゼが一定ハイブリダイゼーションおよび鎖置換温度
において活性があるかぎり、その一定温度および反応条
件において増幅反応が起こりうる。
このプライマー配置の増幅オリゴヌクレオチドをDatt
aguptaらの上記文献の好ましい方法に使用する場合、ハ
イブリダイゼーションした相補的プライマー間の距離が
好ましくは１ないし200ヌクレオチド、最も好ましくは
２ないし10ヌクレオチドとなるように、相補的サブセッ
トのプライマーの各メンバーは標的シー・トラコマチス
核酸のあらかじめ決められた位置にハイブリダイゼーシ
ョンする。適当な反応条件下での核酸ポリメラーゼ（好
ましくは、DNAポリメラーゼ）およびヌクレオチド三リ
ン酸（好ましくは、デオキシリボヌクレオチド三リン
酸）の添加により、プライマー配置を含むオリゴヌクレ
オチドの3'末端へのヌクレオチド付加が開始しうる。
aguptaらの上記文献の好ましい方法に使用する場合、ハ
イブリダイゼーションした相補的プライマー間の距離が
好ましくは１ないし200ヌクレオチド、最も好ましくは
２ないし10ヌクレオチドとなるように、相補的サブセッ
トのプライマーの各メンバーは標的シー・トラコマチス
核酸のあらかじめ決められた位置にハイブリダイゼーシ
ョンする。適当な反応条件下での核酸ポリメラーゼ（好
ましくは、DNAポリメラーゼ）およびヌクレオチド三リ
ン酸（好ましくは、デオキシリボヌクレオチド三リン
酸）の添加により、プライマー配置を含むオリゴヌクレ
オチドの3'末端へのヌクレオチド付加が開始しうる。
理論に拘束されることを望むのではないが、出願人
は、この増幅反応は以下の様式で進行すると信ずる。形
成期の核酸鎖が別のプライマーが元々ハイブリダイゼー
ションしていた位置まで伸長する場合（そして今度はそ
こから第２の形成期の鎖が伸長する）、新たに形成され
た鎖は、しばしば、第２の鎖の5'末端において第２の鎖
と置換し、かくして、第１の形成期の鎖のさらなる伸長
のための鋳型としてその下に存在する標的核酸鎖を利用
可能とする。一方、第２の形成期の鎖は伸長に伴って第
３の形成期の鎖と置換し、そのようなことが続いて起こ
って、存在する相補的プライマーと同数の形成期の鎖が
生じることとなる。増幅が望まれる標的ヌクレオチド配
列の部分の3'側（標的核酸に対して）の標的核酸に結合
するようにこれらすべてのプライマーを設計する。
は、この増幅反応は以下の様式で進行すると信ずる。形
成期の核酸鎖が別のプライマーが元々ハイブリダイゼー
ションしていた位置まで伸長する場合（そして今度はそ
こから第２の形成期の鎖が伸長する）、新たに形成され
た鎖は、しばしば、第２の鎖の5'末端において第２の鎖
と置換し、かくして、第１の形成期の鎖のさらなる伸長
のための鋳型としてその下に存在する標的核酸鎖を利用
可能とする。一方、第２の形成期の鎖は伸長に伴って第
３の形成期の鎖と置換し、そのようなことが続いて起こ
って、存在する相補的プライマーと同数の形成期の鎖が
生じることとなる。増幅が望まれる標的ヌクレオチド配
列の部分の3'側（標的核酸に対して）の標的核酸に結合
するようにこれらすべてのプライマーを設計する。
形成期の鎖が標的ヌクレオチド配列を通過して伸長し
た場合、それらはプライマー配置の「センスプライマ
ー」サブセットのためのハイブリダイゼーション基質を
提供するヌクレオチド配列を含むであろう。また、同じ
極性のプライマーが１ないし200ヌクレオチドが離れて
存在するようにこれらのプライマーを設計する。より好
ましくは、１ないし10ヌクレオチド離れて存在するよう
にプライマーを離す。相補的プライマーと同様、これら
のプライマーはある種の伸長および鎖置換を受けるとい
うのが出願人の考えである。相補的プライマーおよびセ
ンスプライマーのサブセットの伸長と鎖置換とが一緒に
なった効果は、反応混合物中の標的ヌクレオチド配列を
有する核酸数の非常に迅速な増加を引き起こす。
た場合、それらはプライマー配置の「センスプライマ
ー」サブセットのためのハイブリダイゼーション基質を
提供するヌクレオチド配列を含むであろう。また、同じ
極性のプライマーが１ないし200ヌクレオチドが離れて
存在するようにこれらのプライマーを設計する。より好
ましくは、１ないし10ヌクレオチド離れて存在するよう
にプライマーを離す。相補的プライマーと同様、これら
のプライマーはある種の伸長および鎖置換を受けるとい
うのが出願人の考えである。相補的プライマーおよびセ
ンスプライマーのサブセットの伸長と鎖置換とが一緒に
なった効果は、反応混合物中の標的ヌクレオチド配列を
有する核酸数の非常に迅速な増加を引き起こす。
各プライマーのセットのメンバーは核酸鎖の鋳型依存
的合成のための開始点として用いられ、それらは同じセ
ンスの隣のプライマーの伸長により生じる合成鎖の置換
を促進すると考えられる。よって、鎖置換および核酸合
成は１工程で行われると考えられる。このことは驚くべ
き知見であり、出願人は、その工程が進行する正確な機
構をはっきりと知らない。
的合成のための開始点として用いられ、それらは同じセ
ンスの隣のプライマーの伸長により生じる合成鎖の置換
を促進すると考えられる。よって、鎖置換および核酸合
成は１工程で行われると考えられる。このことは驚くべ
き知見であり、出願人は、その工程が進行する正確な機
構をはっきりと知らない。
核酸合成中の鎖置換を引き起こすためには単一センス
の２つのプライマーのみが必要であるが、好ましくは、
相補的なプライマーおよびセンスプライマーの両方を含
むプライマー置換を用いて最初の核酸鋳型およびその相
補鎖の両方を増幅し、標的核酸配列を有する核酸の指数
的増幅を引き起こす。
の２つのプライマーのみが必要であるが、好ましくは、
相補的なプライマーおよびセンスプライマーの両方を含
むプライマー置換を用いて最初の核酸鋳型およびその相
補鎖の両方を増幅し、標的核酸配列を有する核酸の指数
的増幅を引き起こす。
好ましくは、この方法に用いる核酸ポリメラーゼは5'
エキソヌクレアーゼ活性を欠くものであり、イー・コリ
DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントのごとき酵
素が作動するよりも高温で当該方法を行う。反応は37℃
よりも43℃で効果的に行われる。耐熱性DNAポリメラー
ゼは当該分野において知られており（例えば、Taq DNA
ポリメラーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス
由来のDNAポリメラーゼ）、5'−3'エキソヌクレアーゼ
活性を欠くこれらの酵素のクレノウ−タイプの蛋白分解
フラグメントが作られ、報告されている。本発明増幅オ
リゴヌクレオチドと組み合わせてこの増幅方法を用いた
場合の最適効率は、50℃ないし70℃の間の温度で得られ
る。
エキソヌクレアーゼ活性を欠くものであり、イー・コリ
DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントのごとき酵
素が作動するよりも高温で当該方法を行う。反応は37℃
よりも43℃で効果的に行われる。耐熱性DNAポリメラー
ゼは当該分野において知られており（例えば、Taq DNA
ポリメラーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィルス
由来のDNAポリメラーゼ）、5'−3'エキソヌクレアーゼ
活性を欠くこれらの酵素のクレノウ−タイプの蛋白分解
フラグメントが作られ、報告されている。本発明増幅オ
リゴヌクレオチドと組み合わせてこの増幅方法を用いた
場合の最適効率は、50℃ないし70℃の間の温度で得られ
る。
配列番号:17から29までの配列を有することにより例
示されるすべての増幅オリゴヌクレオチドは、好ましい
方法を用いる場合でさえも、標的シー・トラコマチス核
酸の増幅には１のプライマー配置中で一緒に使用される
必要がない。好ましくは、このプライマー配置から選択
された少なくとも２個の相補的プライマーおよび少なく
とも２個のセンスプライマーを一緒に用いて、最初の鋳
型核酸上に含まれる標的配列およびその相補鎖を増幅す
る。しかしながら、増幅の程度はプライマー数の増加と
ともに増大することが見いだされており、相補的プライ
マーのセットおよびセンスプライマーのセットはそれぞ
れ２個よりも多いプライマーを含む。最も好ましい具体
例において、少なくとも４個のセンスプライマーおよび
４個の相補的プライマーを用いるか、あるいは少なくと
も７個のセンスプライマーおよび少なくとも６個の相補
的プライマーを用いる。
示されるすべての増幅オリゴヌクレオチドは、好ましい
方法を用いる場合でさえも、標的シー・トラコマチス核
酸の増幅には１のプライマー配置中で一緒に使用される
必要がない。好ましくは、このプライマー配置から選択
された少なくとも２個の相補的プライマーおよび少なく
とも２個のセンスプライマーを一緒に用いて、最初の鋳
型核酸上に含まれる標的配列およびその相補鎖を増幅す
る。しかしながら、増幅の程度はプライマー数の増加と
ともに増大することが見いだされており、相補的プライ
マーのセットおよびセンスプライマーのセットはそれぞ
れ２個よりも多いプライマーを含む。最も好ましい具体
例において、少なくとも４個のセンスプライマーおよび
４個の相補的プライマーを用いるか、あるいは少なくと
も７個のセンスプライマーおよび少なくとも６個の相補
的プライマーを用いる。
本発明の具体例についての以下の実施例は説明のため
だけのものであり、本発明の範囲を何ら限定するもので
ない。
だけのものであり、本発明の範囲を何ら限定するもので
ない。
実施例1: この実施例において、異なる量の精製シー・トラコマ
チス（ATCC番号VR−886）のrRNAを、シー・トラコマチ
ス23S rRNAに相補的なヌクレオチド配列を有する負のセ
ンスの２個のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。シ
ー・トラコマチスから標的23S rRNAを得て（Gilsen et
al.,Biochemistry 13:2633（1974）参照）、バッファー
（50mM Tris−HCl（pH8.3）、37.5mM KCl、1.5mM Mg
Cl2、10mM DTT）中に希釈した。それぞれ配列番号:4の
ヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドの5'末端に共有
結合した配列番号:43のヌクレオチド配列のT7RNAポリメ
ラーゼプロモーターを含む２種のプロモーター−プライ
マーを合成した。
チス（ATCC番号VR−886）のrRNAを、シー・トラコマチ
ス23S rRNAに相補的なヌクレオチド配列を有する負のセ
ンスの２個のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。シ
ー・トラコマチスから標的23S rRNAを得て（Gilsen et
al.,Biochemistry 13:2633（1974）参照）、バッファー
（50mM Tris−HCl（pH8.3）、37.5mM KCl、1.5mM Mg
Cl2、10mM DTT）中に希釈した。それぞれ配列番号:4の
ヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドの5'末端に共有
結合した配列番号:43のヌクレオチド配列のT7RNAポリメ
ラーゼプロモーターを含む２種のプロモーター−プライ
マーを合成した。
遊離の3'末端ヒドロキシル基を有する該プロモーター
−プライマーの１つを合成し、１の反応につき２ピコモ
ル使用した。プライマー伸長をブロックまたは減少させ
るために3'末端に共有結合したアルカンジオール基を有
する第２のプロモーター−プライマーを合成し、１の反
応につき13ピコモル使用した。プライマーおよび種々の
量の標的核酸を95℃で15分加熱し、次いで42℃まで冷却
し、次いで900ユニットのMoloney Murine白血病ウイル
ス（MMLV）の逆転写酵素および400ユニットのT7 RNAポ
リメラーゼを溶液に添加した。最終増幅混合物は50mM
Tris HCl（pH8.5）、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM
ATP、4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1
mM dCTP、1mM dGTP、20mM MgCl2、20mM Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−システインおよび５％グリセロールを含んでい
た。42℃で２時間インキュベーション後、配列番号:2の
配列を有する未標識ヘルパープローブを含有するプロー
ブミックス中の配列番号:1の配列を有するアクリジニウ
ムエステル標識プローブと100μｌの増幅反応混合物と
のハイブリダイゼーションにより、増幅をアッセイし
た。0.05M コハク酸リチウム（pH5）、0.6M LiCl、１
％（w/v）ラウリル硫酸リチウム（LLS）、10mM エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、10mM エチレングリコール
ビス（ベータ−アミノエチルエステル）N,N,N',N'四酢
酸（EGTA）を含有する溶液中、60℃で15分ハイブリダイ
ゼーションを行った。0.15M 四ホウ酸ナトリウム（pH
8.5）、１％ Triton Ｘ−100を含有する300μｌの溶
液を各試験管に添加し、各反応物を60℃で５〜７分イン
キュベーションし、次いで室温まで冷却し、次いでGen
−Probe LEADER Ｉルミノメーター（Gen−Probe Incor
porated,San Diego,CA）で分析した。ルミノメーターは
２つの試薬を自動的に注入し、第１の試薬は1mM硝酸お
よび0.1％過酸化水素を含み、第２の試薬は1N水酸化ナ
トリウムを含んでいた。アッセイ結果は相対光ユニット
（RLU）で示され、それはルミノメーターにより検出さ
れた光子数の測定値である。各反応を３系で行い、結果
を下に示す。
−プライマーの１つを合成し、１の反応につき２ピコモ
ル使用した。プライマー伸長をブロックまたは減少させ
るために3'末端に共有結合したアルカンジオール基を有
する第２のプロモーター−プライマーを合成し、１の反
応につき13ピコモル使用した。プライマーおよび種々の
量の標的核酸を95℃で15分加熱し、次いで42℃まで冷却
し、次いで900ユニットのMoloney Murine白血病ウイル
ス（MMLV）の逆転写酵素および400ユニットのT7 RNAポ
リメラーゼを溶液に添加した。最終増幅混合物は50mM
Tris HCl（pH8.5）、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM
ATP、4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1
mM dCTP、1mM dGTP、20mM MgCl2、20mM Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−システインおよび５％グリセロールを含んでい
た。42℃で２時間インキュベーション後、配列番号:2の
配列を有する未標識ヘルパープローブを含有するプロー
ブミックス中の配列番号:1の配列を有するアクリジニウ
ムエステル標識プローブと100μｌの増幅反応混合物と
のハイブリダイゼーションにより、増幅をアッセイし
た。0.05M コハク酸リチウム（pH5）、0.6M LiCl、１
％（w/v）ラウリル硫酸リチウム（LLS）、10mM エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、10mM エチレングリコール
ビス（ベータ−アミノエチルエステル）N,N,N',N'四酢
酸（EGTA）を含有する溶液中、60℃で15分ハイブリダイ
ゼーションを行った。0.15M 四ホウ酸ナトリウム（pH
8.5）、１％ Triton Ｘ−100を含有する300μｌの溶
液を各試験管に添加し、各反応物を60℃で５〜７分イン
キュベーションし、次いで室温まで冷却し、次いでGen
−Probe LEADER Ｉルミノメーター（Gen−Probe Incor
porated,San Diego,CA）で分析した。ルミノメーターは
２つの試薬を自動的に注入し、第１の試薬は1mM硝酸お
よび0.1％過酸化水素を含み、第２の試薬は1N水酸化ナ
トリウムを含んでいた。アッセイ結果は相対光ユニット
（RLU）で示され、それはルミノメーターにより検出さ
れた光子数の測定値である。各反応を３系で行い、結果
を下に示す。
これらのデータは、少なくとも0.025pg程度のシー・
トラコマチス核酸の増幅が成功し、核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイにおいてバックグラウンドの600倍以
上のシグナルレベルで検出が可能であることを示す。
トラコマチス核酸の増幅が成功し、核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイにおいてバックグラウンドの600倍以
上のシグナルレベルで検出が可能であることを示す。
実施例2: この実施例において、同じヌクレオチド配列の２種の
プロモーター−プライマーを再度使用した。増幅および
ハイブリダイゼーション反応条件は本質的に実施例１と
同じであるが、以下の相違があった。
プロモーター−プライマーを再度使用した。増幅および
ハイブリダイゼーション反応条件は本質的に実施例１と
同じであるが、以下の相違があった。
配列番号:43のT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列
を5'末端に、そして配列番号:7のヌクレオチド配列の標
的ハイブリダイゼーション領域を3'末端に有する各プロ
モーター−プライマーを合成した。遊離の3'−ヒドロキ
シル基を有する１のプロモーター−プライマーを合成
し、１の反応につき２ピコモル使用した。3'−アルカン
ジオール修飾基を有するもう一方のプロモーター−プラ
イマーを合成し、１の反応につき13ピコモル使用した。
増幅条件は実施例１記載のものと同じであった。42℃で
２時間インキュベーション後、20μｌの増幅反応物を、
配列番号:3のヌクレオチド配列のアクリジニウムエステ
ル標識プローブを用いてアッセイした。標的核酸を含有
する反応物３系で反応させ、負の対照を２系で反応させ
た。
を5'末端に、そして配列番号:7のヌクレオチド配列の標
的ハイブリダイゼーション領域を3'末端に有する各プロ
モーター−プライマーを合成した。遊離の3'−ヒドロキ
シル基を有する１のプロモーター−プライマーを合成
し、１の反応につき２ピコモル使用した。3'−アルカン
ジオール修飾基を有するもう一方のプロモーター−プラ
イマーを合成し、１の反応につき13ピコモル使用した。
増幅条件は実施例１記載のものと同じであった。42℃で
２時間インキュベーション後、20μｌの増幅反応物を、
配列番号:3のヌクレオチド配列のアクリジニウムエステ
ル標識プローブを用いてアッセイした。標的核酸を含有
する反応物３系で反応させ、負の対照を２系で反応させ
た。
表2:配列番号:7の標的結合ヌクレオチド配列を有する増
幅オリゴヌクレオチドを用いるシー・トラコマチスRNA
の増幅、次いで、配列番号:3のヌクレオチド配列のプロ
ーブによる検出 実施例3: この実施例は、逆方向のプライマーおよびプロモータ
ー−プライマーを用いるシー・トラコマチスrRNAの増幅
を示す。増幅およびハイブリダイゼーション反応条件は
本質的に実施例１に記載したものと同じであるが、以下
の変更を行った。配列番号:4のヌクレオチド配列の標的
結合配列領域の5'末端にT7プロモーター配列（配列番
号:43）を有する１のプロモーター−プライマーを合成
した。配列番号:5または配列番号:6のいずれかの配列を
有するプライマー15pmolを含有する反応物において、１
の反応につきこのプロモーター−プライマーを15pmol用
いた。42℃で２時間インキュベーション後、実施例１に
記載のごとく、配列番号:1のアクリジニウムエステル標
識プローブおよび配列番号:2の未標識ヘルパーオリゴヌ
クレオチドを用いるハイブリダイゼーションにより20μ
ｌの反応物をアッセイした。標的含有反応物の反応を３
系で行い、標的不含対照の反応を２系で行った。結果を
RLUで下に示す。
幅オリゴヌクレオチドを用いるシー・トラコマチスRNA
の増幅、次いで、配列番号:3のヌクレオチド配列のプロ
ーブによる検出 実施例3: この実施例は、逆方向のプライマーおよびプロモータ
ー−プライマーを用いるシー・トラコマチスrRNAの増幅
を示す。増幅およびハイブリダイゼーション反応条件は
本質的に実施例１に記載したものと同じであるが、以下
の変更を行った。配列番号:4のヌクレオチド配列の標的
結合配列領域の5'末端にT7プロモーター配列（配列番
号:43）を有する１のプロモーター−プライマーを合成
した。配列番号:5または配列番号:6のいずれかの配列を
有するプライマー15pmolを含有する反応物において、１
の反応につきこのプロモーター−プライマーを15pmol用
いた。42℃で２時間インキュベーション後、実施例１に
記載のごとく、配列番号:1のアクリジニウムエステル標
識プローブおよび配列番号:2の未標識ヘルパーオリゴヌ
クレオチドを用いるハイブリダイゼーションにより20μ
ｌの反応物をアッセイした。標的含有反応物の反応を３
系で行い、標的不含対照の反応を２系で行った。結果を
RLUで下に示す。
表3:配列番号:4のプロモーター−プライマーおよび配列
番号:5または配列番号:6のプライマーを用いるシー・ト
ラコマチスrRNAの増幅、次いで、配列番号:1のプローブ
での検出 実施例4: 配列番号:4からなり、5'末端に実施例１のT7プロモー
ター配列を有する15pmolのプロモーター−プライマー、
ならびに配列番号:6の配列を有する15pmolのプライマー
を用いて異なる量のシー・トラコマチスrRNAを増幅する
ことにより、増幅および検出系の感度を調べた。増幅お
よびハイブリダイゼーション反応を本質的に実施例１と
同様に行った。増幅反応後、実施例１に記載のごとく、
配列番号:1のアクリジニウムエステル標識プローブおよ
び配列番号:2の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用
いて100μｌの増幅反応物をアッセイした。２系または
３系で反応を行い、結果を下に示す。結果を実施例で論
じる。
番号:5または配列番号:6のプライマーを用いるシー・ト
ラコマチスrRNAの増幅、次いで、配列番号:1のプローブ
での検出 実施例4: 配列番号:4からなり、5'末端に実施例１のT7プロモー
ター配列を有する15pmolのプロモーター−プライマー、
ならびに配列番号:6の配列を有する15pmolのプライマー
を用いて異なる量のシー・トラコマチスrRNAを増幅する
ことにより、増幅および検出系の感度を調べた。増幅お
よびハイブリダイゼーション反応を本質的に実施例１と
同様に行った。増幅反応後、実施例１に記載のごとく、
配列番号:1のアクリジニウムエステル標識プローブおよ
び配列番号:2の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用
いて100μｌの増幅反応物をアッセイした。２系または
３系で反応を行い、結果を下に示す。結果を実施例で論
じる。
表4:シー・トラコマチスRNAの増幅、次いで、配列番号
１のプローブでの検出 実施例5: 下記の相違を除き、本質的に実施例１と同様に増幅お
よびハイブリダイゼーション反応を行った。配列番号７
の配列を有し、5'末端に実施例１のT7プロモーター配列
を含むプロモーター−プライマー、ならびに配列番号:8
のプライマーを用いてシー・トラコマチスrRNAを増幅し
た。配列番号:3のアクリジニウムエステル標識プローブ
を用いて１μｌの増幅核酸をアッセイした。
１のプローブでの検出 実施例5: 下記の相違を除き、本質的に実施例１と同様に増幅お
よびハイブリダイゼーション反応を行った。配列番号７
の配列を有し、5'末端に実施例１のT7プロモーター配列
を含むプロモーター−プライマー、ならびに配列番号:8
のプライマーを用いてシー・トラコマチスrRNAを増幅し
た。配列番号:3のアクリジニウムエステル標識プローブ
を用いて１μｌの増幅核酸をアッセイした。
表5:配列番号:7の配列を含むプロモーター−プライマー
および配列番号:8からなるプライマーを用いるシー・ト
ラコマチスrRNA増幅、次いで、配列番号:3からなるプロ
ーブの検出 この実験および先の実験から得られたデータは、5'末
端に結合したT7プロモーターヌクレオチド配列を含む配
列番号:4の標的結合領域を有するプロモーター−プライ
マーを配列番号:5または配列番号:6と対にして用いて増
幅し、その後、配列番号:1の標識プローブおよび配列番
号:2のヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて検出するこ
とにより、あるいはT7プロモーター配列を含む配列番
号:7のプライマーを配列番号:8と対にして用いて、次い
で配列番号:3のプローブを用いて検出することにより、
シー・トラコマチスrRNAが検出されたことを示す。
および配列番号:8からなるプライマーを用いるシー・ト
ラコマチスrRNA増幅、次いで、配列番号:3からなるプロ
ーブの検出 この実験および先の実験から得られたデータは、5'末
端に結合したT7プロモーターヌクレオチド配列を含む配
列番号:4の標的結合領域を有するプロモーター−プライ
マーを配列番号:5または配列番号:6と対にして用いて増
幅し、その後、配列番号:1の標識プローブおよび配列番
号:2のヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて検出するこ
とにより、あるいはT7プロモーター配列を含む配列番
号:7のプライマーを配列番号:8と対にして用いて、次い
で配列番号:3のプローブを用いて検出することにより、
シー・トラコマチスrRNAが検出されたことを示す。
実施例6: この実施例は、増幅および検出アッセイの反応性およ
び特異性を示す。すべての既知の異なるシー・トラコマ
チス血液型亜型からリボゾームRNAを単離精製した。5'
末端の共有結合した実施例１のT7プロモーター配列を有
する配列番号:4のプロモーター−プライマーを１の反応
あたり30pmol、ならびに配列番号:6のプライマーを１の
反応あたり30pmolを用いてこれらのrRNA種を増幅した。
実施例１記載の増幅混合物を用いて、0.05pgのrRNAを含
有する単一の反応物および0.005pgのrRNAを含有する２
系の反応物で反応を行った。試料を95℃で５分間加熱
し、次いで42℃まで冷却し、900ユニットのMMLV逆転写
酵素および400ユニットのT7RNAポリメラーゼを各反応物
に添加した。42℃で２時間インキュベーション後、配列
番号:1のアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼー
ションアッセイプローブおよび配列番号:2の未標識ヘル
パープローブを用い、実施例１記載のハイブリダイゼー
ション条件を用いて100μｌの増幅核酸を検出した。結
果をRLUで示す。
び特異性を示す。すべての既知の異なるシー・トラコマ
チス血液型亜型からリボゾームRNAを単離精製した。5'
末端の共有結合した実施例１のT7プロモーター配列を有
する配列番号:4のプロモーター−プライマーを１の反応
あたり30pmol、ならびに配列番号:6のプライマーを１の
反応あたり30pmolを用いてこれらのrRNA種を増幅した。
実施例１記載の増幅混合物を用いて、0.05pgのrRNAを含
有する単一の反応物および0.005pgのrRNAを含有する２
系の反応物で反応を行った。試料を95℃で５分間加熱
し、次いで42℃まで冷却し、900ユニットのMMLV逆転写
酵素および400ユニットのT7RNAポリメラーゼを各反応物
に添加した。42℃で２時間インキュベーション後、配列
番号:1のアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼー
ションアッセイプローブおよび配列番号:2の未標識ヘル
パープローブを用い、実施例１記載のハイブリダイゼー
ション条件を用いて100μｌの増幅核酸を検出した。結
果をRLUで示す。
表6:配列番号:6のT7プロモーター−プライマーを有する
配列番号:4のプロモーター−プライマー、配列番号:1の
標識プローブおよび配列番号:2のヘルパープローブを用
いる、異なる血液型亜型由来のシー・トラコマチスrRNA
の増幅および検出 データは、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブに
よりすべての血液型亜型のシー・トラコマチスが増幅さ
れ検出されたことを示す。そのうえ、細胞１個あたり約
2000コピーの23S rRNAが存在すると考えられる。このこ
とは、細胞１個あたり約3x10-21モルの23S rRNAとな
る。この実施例は、本発明増幅オリゴヌクレオチドを用
いると3x10-21モルのrRNAを検出できることを示すの
で、これらの増幅オリゴヌクレオチドは１つの試料につ
き１個のクラミジア・トラコマチスのrRNA標的ヌクレオ
チド配列を増幅できることが理解されよう。このこと
は、ゲノム（リボゾームよりもむしろ）の核酸配列に指
向されたプライマーの増幅感度よりも明らかに優れてい
る。
配列番号:4のプロモーター−プライマー、配列番号:1の
標識プローブおよび配列番号:2のヘルパープローブを用
いる、異なる血液型亜型由来のシー・トラコマチスrRNA
の増幅および検出 データは、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブに
よりすべての血液型亜型のシー・トラコマチスが増幅さ
れ検出されたことを示す。そのうえ、細胞１個あたり約
2000コピーの23S rRNAが存在すると考えられる。このこ
とは、細胞１個あたり約3x10-21モルの23S rRNAとな
る。この実施例は、本発明増幅オリゴヌクレオチドを用
いると3x10-21モルのrRNAを検出できることを示すの
で、これらの増幅オリゴヌクレオチドは１つの試料につ
き１個のクラミジア・トラコマチスのrRNA標的ヌクレオ
チド配列を増幅できることが理解されよう。このこと
は、ゲノム（リボゾームよりもむしろ）の核酸配列に指
向されたプライマーの増幅感度よりも明らかに優れてい
る。
実施例7: この実施例において、実施例６に示す増幅オリゴヌク
レオチドを用いて3x10-20モルのシー・トラコマチス、
シー・ニューモニエまたはシー・シッタシ由来の精製RN
Aを個々に増幅し、次いで、上記のごとく配列番号:1の
プローブで検出を行った。データは、クラミジアの密接
に関連した種由来のRNAはシー・トラコマチスの検出が
可能な条件下では検出されなかったことを示す。また、
結果は、実施例６に示すように鋭敏な感度でシー・トラ
コマチスの各既知血液型亜型を検出しうる同一の増幅オ
リゴヌクレオチドは、シー・トラコマチスの核酸および
その密接な既知系統発生論的近縁種クラミジア・シッタ
シおよびクラミジア・ニューモニエの核酸間の識別も可
能であることを示す。
レオチドを用いて3x10-20モルのシー・トラコマチス、
シー・ニューモニエまたはシー・シッタシ由来の精製RN
Aを個々に増幅し、次いで、上記のごとく配列番号:1の
プローブで検出を行った。データは、クラミジアの密接
に関連した種由来のRNAはシー・トラコマチスの検出が
可能な条件下では検出されなかったことを示す。また、
結果は、実施例６に示すように鋭敏な感度でシー・トラ
コマチスの各既知血液型亜型を検出しうる同一の増幅オ
リゴヌクレオチドは、シー・トラコマチスの核酸および
その密接な既知系統発生論的近縁種クラミジア・シッタ
シおよびクラミジア・ニューモニエの核酸間の識別も可
能であることを示す。
表7:配列番号:4および６の配列を含むプライマーでの増
幅、次いで、配列番号:1のプローブでの検出の特異性 実施例8: この実施例は、配列番号:30〜42の標的ヌクレオチド
配列に結合しうる本発明増幅オリゴヌクレオチドの１の
具体例に関する。以下の実施例は本発明オリゴヌクレオ
チドの種々の具体例および使用を示すものであるが、本
発明の範囲はかかる実施例に限定されない。
幅、次いで、配列番号:1のプローブでの検出の特異性 実施例8: この実施例は、配列番号:30〜42の標的ヌクレオチド
配列に結合しうる本発明増幅オリゴヌクレオチドの１の
具体例に関する。以下の実施例は本発明オリゴヌクレオ
チドの種々の具体例および使用を示すものであるが、本
発明の範囲はかかる実施例に限定されない。
この実施例は、まずDNA鋳型を作り、次いで、プライ
マー配置および5'−エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメ
ラーゼを用いて鋳型を増幅することによるリボゾームRN
A（rRNA）標的核酸の増幅を説明する。rRNAからのDNA鋳
型の生成および鋳型の増幅を、DNA鋳型の生成および増
幅に必要な試薬の入った同じ反応容器で行った。
マー配置および5'−エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメ
ラーゼを用いて鋳型を増幅することによるリボゾームRN
A（rRNA）標的核酸の増幅を説明する。rRNAからのDNA鋳
型の生成および鋳型の増幅を、DNA鋳型の生成および増
幅に必要な試薬の入った同じ反応容器で行った。
この実施例に用いたプライマー配置は13個のプライマ
ーを含んでいた。上記の標準的ホスホラミダイト化学に
よりプライマーを調製した。プライマーのうち７個は相
補的プライマーである（rRNA標的に関して）。これらの
プライマーは以下の核酸配列を有する： プライマーのうち６個はセンスプライマーである（rR
NA標的に関して）。
ーを含んでいた。上記の標準的ホスホラミダイト化学に
よりプライマーを調製した。プライマーのうち７個は相
補的プライマーである（rRNA標的に関して）。これらの
プライマーは以下の核酸配列を有する： プライマーのうち６個はセンスプライマーである（rR
NA標的に関して）。
これらのプライマーは以下の核酸配列を有する： 標的23S rRNAをシー・トラコマチスから得て（Glisen
et al.,Biochemistry 13:2633（1974）参照）、バッフ
ァー（50mM Tris−HCl（pH8.3）、37.5mM KCl、1.5mM
MgCl2、10mM DTT）で希釈した。20μｌのバッファー
（７％ DMSO、50mM Tris−HCl（pH8.3）、75mM KC
l、3mM MgCl2および2mM DTT）中で異なる量のrRNA標
的をプライマー（各７ピコモル）と混合し、60℃で30分
インキュベーションしてプライマーをプレハイブリダイ
ゼーションさせた。次いで、プレハイブリダイゼーショ
ンしたプライマーを0.2mM ATP、0.2mM TTP、0.2mM G
TP、0.2mM CTP、200ユニットのMoloney Murine白血病
ウイルス逆転写酵素（MMLV−RT）、およびバチルス・ス
テアロサーモフィルス（Bst）のDNAポリメラーゼＩの大
ズブチリシンフラグメントとして得られる5'エキソヌク
レアーゼ欠損DNAポリメラーゼ２ユニットに暴露した。
増幅を37℃で60分行い、次いで、60℃で120分行った。
et al.,Biochemistry 13:2633（1974）参照）、バッフ
ァー（50mM Tris−HCl（pH8.3）、37.5mM KCl、1.5mM
MgCl2、10mM DTT）で希釈した。20μｌのバッファー
（７％ DMSO、50mM Tris−HCl（pH8.3）、75mM KC
l、3mM MgCl2および2mM DTT）中で異なる量のrRNA標
的をプライマー（各７ピコモル）と混合し、60℃で30分
インキュベーションしてプライマーをプレハイブリダイ
ゼーションさせた。次いで、プレハイブリダイゼーショ
ンしたプライマーを0.2mM ATP、0.2mM TTP、0.2mM G
TP、0.2mM CTP、200ユニットのMoloney Murine白血病
ウイルス逆転写酵素（MMLV−RT）、およびバチルス・ス
テアロサーモフィルス（Bst）のDNAポリメラーゼＩの大
ズブチリシンフラグメントとして得られる5'エキソヌク
レアーゼ欠損DNAポリメラーゼ２ユニットに暴露した。
増幅を37℃で60分行い、次いで、60℃で120分行った。
次いで、95℃で５分間インキュベーションすることに
より増幅生成物を変性させ、Nelsonらの上記文献に従っ
て、アクリジニウムエステル標識プローブを用いてアッ
セイした。Nelsonらにより記載されたようにしてアクリ
ジニウムエステルでのプローブ標識を行った。配列番
号:44に対応する核酸配列を有するようにシー・トラコ
マチス特異的アクリジニウムエステル標識プローブを合
成した。100μｌのハイブリダイゼーションバッファー
（100mM コハク酸リチウム（pH5.2）、８％ ドデシル
硫酸リチウム、1.5mM EDTAおよび1.5mM EGTA）中で、
アクリジニウム標識プローブ（2x10-11モル）を増幅生
成物とともに60℃で５分インキュベーションした。次い
で、アルカリ溶液（0.15M 四ホウ酸ナトリウム（pH7.
6）および５％（v/v）TRITON Ｘ−100）を添加し、次
いで、60℃で10分インキュベーションすることにより未
ハイブリダイゼーションプローブ上のアクリジニウムエ
ステルを加水分解した。残存化学発光をルミノメーター
で測定した。表８に示す結果は標的核酸の増幅を示す。
より増幅生成物を変性させ、Nelsonらの上記文献に従っ
て、アクリジニウムエステル標識プローブを用いてアッ
セイした。Nelsonらにより記載されたようにしてアクリ
ジニウムエステルでのプローブ標識を行った。配列番
号:44に対応する核酸配列を有するようにシー・トラコ
マチス特異的アクリジニウムエステル標識プローブを合
成した。100μｌのハイブリダイゼーションバッファー
（100mM コハク酸リチウム（pH5.2）、８％ ドデシル
硫酸リチウム、1.5mM EDTAおよび1.5mM EGTA）中で、
アクリジニウム標識プローブ（2x10-11モル）を増幅生
成物とともに60℃で５分インキュベーションした。次い
で、アルカリ溶液（0.15M 四ホウ酸ナトリウム（pH7.
6）および５％（v/v）TRITON Ｘ−100）を添加し、次
いで、60℃で10分インキュベーションすることにより未
ハイブリダイゼーションプローブ上のアクリジニウムエ
ステルを加水分解した。残存化学発光をルミノメーター
で測定した。表８に示す結果は標的核酸の増幅を示す。
これらのデータは、プライマー配置フォーマット中の
配列番号:30〜42とハイブリダイゼーションしうる本発
明増幅オリゴヌクレオチドの使用は、がシー・トラコマ
チス標的ヌクレオチド配列を有する核酸の増加を引き起
こすことを示す。また当該実施例は、この実験において
プライマー配置は少なくとも4x10-19モル程度の少量の
標的RNAを検出可能に増幅しうることも示す。
配列番号:30〜42とハイブリダイゼーションしうる本発
明増幅オリゴヌクレオチドの使用は、がシー・トラコマ
チス標的ヌクレオチド配列を有する核酸の増加を引き起
こすことを示す。また当該実施例は、この実験において
プライマー配置は少なくとも4x10-19モル程度の少量の
標的RNAを検出可能に増幅しうることも示す。
実施例9: この実施例は、臨床標本（ヒト・子宮頸管綿棒かきと
り物）中に存在するシー・トラコマチスrRNA標的ヌクレ
オチド配列の増幅を説明する。この実施例に用いたオリ
ゴヌクレオチド、増幅手順、および検出手順は実施例８
に記載したのと同じであった。使用試料のタイプおよび
試料調製において、この実施例は実施例８と異なる。
り物）中に存在するシー・トラコマチスrRNA標的ヌクレ
オチド配列の増幅を説明する。この実施例に用いたオリ
ゴヌクレオチド、増幅手順、および検出手順は実施例８
に記載したのと同じであった。使用試料のタイプおよび
試料調製において、この実施例は実施例８と異なる。
子宮頸管綿棒かきとり物試料を集め、アニオン性界面
活性剤含有緩衝液（60mM リン酸バッファー（pH6.
8）、６％ ドデシル硫酸リチウム、2mMEDTAおよび2mM
EGTA）に懸濁した。臨床標本に2x10-18モルの23S シ
ー・トラコマチスrRNAを加え、プライマー配置を含む増
幅オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ
た。実施例８に記載のごとく標的核酸を増幅し、検出し
た。臨床試料中の標的核酸の増幅がうまく行われた。増
幅RNAを添加した試料のハイブリダイゼーションアッセ
イにおいて得られたシグナル量は、シー・トラコマチス
rRNAを添加しなかった臨床標本を含む同様の混合物中に
おいて検知されるシグナルの50倍以上であった。
活性剤含有緩衝液（60mM リン酸バッファー（pH6.
8）、６％ ドデシル硫酸リチウム、2mMEDTAおよび2mM
EGTA）に懸濁した。臨床標本に2x10-18モルの23S シ
ー・トラコマチスrRNAを加え、プライマー配置を含む増
幅オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ
た。実施例８に記載のごとく標的核酸を増幅し、検出し
た。臨床試料中の標的核酸の増幅がうまく行われた。増
幅RNAを添加した試料のハイブリダイゼーションアッセ
イにおいて得られたシグナル量は、シー・トラコマチス
rRNAを添加しなかった臨床標本を含む同様の混合物中に
おいて検知されるシグナルの50倍以上であった。
実施例10: シー・シッタシおよびシー・ニューモニエの23S rRNA
よりもシー・トラコマチスの23S rRNAに優先的にハイブ
リダイゼーションするように配列番号:4および６のプラ
イマーを設計した。異なる増幅フォーマットにおけるシ
ー・トラコマチスに対するプライマーの特異性を示すた
めに、それらをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における
プライマーとして試験した。5mM MgCl2、50mM KCl、1
0mM Tris HCl（pH8.3）、1mM dTTP、1mM dATP、1mM
dGTP、1mM dCTP、20ユニットのRNasin、60ユニット
のMMLV逆転写酵素および配列番号:4のプライマーに対す
る結合部位の下流にハイブリダイゼーションするように
設計された配列番号:103 GTCGCCTGGG CCATTTCTCT GCGGC
CCCCC GGGGのシー・トラコマチスrRNAに相補的なプライ
マー100pmolを含有する20μｌの溶液中で各クラミジアr
RNA（0.008x10-15モル）を42℃で15分、次いで95℃で10
分、最後に80℃で３分インキュベーションした。25mM
MgCl2、50mM KCl、10mM Tris HCl（pH8.3）、2.5ユ
ニットのTaqポリメラーゼ、5'末端の配列番号:43のT7プ
ロモーター配列および配列番号:4の3'プライマー配列を
有するプロモーター−プライマー50pmol、および配列番
号:6のプライマー50pmolを含有する溶液をこの溶液に添
加した。対照として、シー・ニューモニエrRNA配列領域
に相補的な標的結合領域を有するプライマーおよびプロ
モーター−プライマーのペアーを同様の増幅フォーマッ
トに使用した。プロモーター−プライマーのプロモータ
ー領域は5'末端に同じR7プロモーター配列を有してい
た。選択した核酸増幅フォーマットがPCRであったた
め、プロモーター配列は増幅反応に必要でなかった。反
応混合物を35回サーモサイクルさせ（55℃で0.5分、72
℃で１分、次いで95℃で１分）、その後、最後に72℃で
７分インキュベーションし、次いで、ハイブリダイゼー
ションまたはゲル分析の前に４℃まで冷却した。各反応
混合物20μｌを、Trisホウ酸EDTAバッファーを用いる２
％アガロースゲル上の電気泳動により分析し、次いで、
臭化エチジウム染色した。紫外線下で核酸を可視化し
た。結果を以下にまとめる： 表9:PCRを使用した場合の配列番号:4および６を有する
増幅オリゴヌクレオチドの標的特異性 これらの結果は、選択したハイブリダイゼーション条
件下で、配列番号:4および６の配列を有するシー・トラ
コマチスのプライマーは特異的にシー・トラコマチスの
核酸を増幅するが、シー・ニューモニエまたはシー・シ
ッタシのrRNA配列を増幅しないことを示す。
よりもシー・トラコマチスの23S rRNAに優先的にハイブ
リダイゼーションするように配列番号:4および６のプラ
イマーを設計した。異なる増幅フォーマットにおけるシ
ー・トラコマチスに対するプライマーの特異性を示すた
めに、それらをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における
プライマーとして試験した。5mM MgCl2、50mM KCl、1
0mM Tris HCl（pH8.3）、1mM dTTP、1mM dATP、1mM
dGTP、1mM dCTP、20ユニットのRNasin、60ユニット
のMMLV逆転写酵素および配列番号:4のプライマーに対す
る結合部位の下流にハイブリダイゼーションするように
設計された配列番号:103 GTCGCCTGGG CCATTTCTCT GCGGC
CCCCC GGGGのシー・トラコマチスrRNAに相補的なプライ
マー100pmolを含有する20μｌの溶液中で各クラミジアr
RNA（0.008x10-15モル）を42℃で15分、次いで95℃で10
分、最後に80℃で３分インキュベーションした。25mM
MgCl2、50mM KCl、10mM Tris HCl（pH8.3）、2.5ユ
ニットのTaqポリメラーゼ、5'末端の配列番号:43のT7プ
ロモーター配列および配列番号:4の3'プライマー配列を
有するプロモーター−プライマー50pmol、および配列番
号:6のプライマー50pmolを含有する溶液をこの溶液に添
加した。対照として、シー・ニューモニエrRNA配列領域
に相補的な標的結合領域を有するプライマーおよびプロ
モーター−プライマーのペアーを同様の増幅フォーマッ
トに使用した。プロモーター−プライマーのプロモータ
ー領域は5'末端に同じR7プロモーター配列を有してい
た。選択した核酸増幅フォーマットがPCRであったた
め、プロモーター配列は増幅反応に必要でなかった。反
応混合物を35回サーモサイクルさせ（55℃で0.5分、72
℃で１分、次いで95℃で１分）、その後、最後に72℃で
７分インキュベーションし、次いで、ハイブリダイゼー
ションまたはゲル分析の前に４℃まで冷却した。各反応
混合物20μｌを、Trisホウ酸EDTAバッファーを用いる２
％アガロースゲル上の電気泳動により分析し、次いで、
臭化エチジウム染色した。紫外線下で核酸を可視化し
た。結果を以下にまとめる： 表9:PCRを使用した場合の配列番号:4および６を有する
増幅オリゴヌクレオチドの標的特異性 これらの結果は、選択したハイブリダイゼーション条
件下で、配列番号:4および６の配列を有するシー・トラ
コマチスのプライマーは特異的にシー・トラコマチスの
核酸を増幅するが、シー・ニューモニエまたはシー・シ
ッタシのrRNA配列を増幅しないことを示す。
実施例11: 3'部分に配列番号:50のヌクレオチド配列を有し、5'
末端の配列番号:106のT7プロモーター配列を有する30pm
olのプロモーター−プライマー、ならびに配列番号:44
の配列を有する30pmolのプライマーを用いて異なる量の
シー・トラコマチスのrRNAを増幅することにより、シー
・トラコマチスの16S rRNAヌクレオチド配列に指向され
た増幅および検出系の感度について説明する。特に断ら
ないかぎり、増幅およびハイブリダイゼーション反応を
実施例１記載のごとく行った。増幅反応後、実施例１記
載のごとく配列番号:46の配列を有するアクリジニウム
エステル標識プローブおよび配列番号:48の配列を有す
る未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて20μｌの
増幅反応物をアッセイした。反応を３系で行った。結果
を以下に示す。
末端の配列番号:106のT7プロモーター配列を有する30pm
olのプロモーター−プライマー、ならびに配列番号:44
の配列を有する30pmolのプライマーを用いて異なる量の
シー・トラコマチスのrRNAを増幅することにより、シー
・トラコマチスの16S rRNAヌクレオチド配列に指向され
た増幅および検出系の感度について説明する。特に断ら
ないかぎり、増幅およびハイブリダイゼーション反応を
実施例１記載のごとく行った。増幅反応後、実施例１記
載のごとく配列番号:46の配列を有するアクリジニウム
エステル標識プローブおよび配列番号:48の配列を有す
る未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて20μｌの
増幅反応物をアッセイした。反応を３系で行った。結果
を以下に示す。
表10:16S rRNAに指向された配列番号:43および44のオリ
ゴヌクレオチドを用いるシー・トラコマチスのRNAの増
幅、次いで、配列番号:46のプローブでの検出 結果は、１個のクラミジア・トラコマチス細胞中に含
まれるrRNAに近いレベルでの溶液中におけるシー・トラ
コマチス核酸を増幅し存在を検出する、プローブおよび
シー・トラコマチスの16S rRNAに指向された増幅オリゴ
ヌクレオチドの能力を示す。
ゴヌクレオチドを用いるシー・トラコマチスのRNAの増
幅、次いで、配列番号:46のプローブでの検出 結果は、１個のクラミジア・トラコマチス細胞中に含
まれるrRNAに近いレベルでの溶液中におけるシー・トラ
コマチス核酸を増幅し存在を検出する、プローブおよび
シー・トラコマチスの16S rRNAに指向された増幅オリゴ
ヌクレオチドの能力を示す。
実施例12: 種々の生物から得た細胞溶解物または精製RNAのいず
れかを実施例11記載の増幅オリゴヌクレオチドを用いて
増幅することにより、クラミジア・トラコマチスの16S
rRNAに指向された増幅および検出系の特異性を示した。
検出すべく選択された生物は、ヒトの尿道および生殖器
管から普通に単離される生物ならびに系統発生論的に交
差する部分を示す生物の範囲内である。各試料は少なく
とも250000個の細胞に相当する細胞溶解物または2x10
-15モルの精製RNAのいずれかを含んでいた。実施例11記
載のごとく、これを増幅反応に供した。配列番号:46の
プローブおよび配列番号:48の未標識ヘルパープローブ
を用いて実施例１記載のごとく核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより全部で100μｌの反応物をアッセ
イした。下表11および12に示す結果は３系の平均であ
る。
れかを実施例11記載の増幅オリゴヌクレオチドを用いて
増幅することにより、クラミジア・トラコマチスの16S
rRNAに指向された増幅および検出系の特異性を示した。
検出すべく選択された生物は、ヒトの尿道および生殖器
管から普通に単離される生物ならびに系統発生論的に交
差する部分を示す生物の範囲内である。各試料は少なく
とも250000個の細胞に相当する細胞溶解物または2x10
-15モルの精製RNAのいずれかを含んでいた。実施例11記
載のごとく、これを増幅反応に供した。配列番号:46の
プローブおよび配列番号:48の未標識ヘルパープローブ
を用いて実施例１記載のごとく核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより全部で100μｌの反応物をアッセ
イした。下表11および12に示す結果は３系の平均であ
る。
実施例13: MMLV逆転写酵素を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）フォーマットにおいて配列番号:44および50の配列の
プライマーを試験した。5mM MgCl2、50mM KCl、10mM
Tris HCl（pH8.3）、1mM dATP、1mM dGTP、1mM d
CTP、20ユニットのRNasin、50ユニットのMMLV逆転写酵
素および１ナノモルのランダムヌクレオチドヘキサマー
［Boehringer Mannheimから購入］を含有する20μｌの
溶液中でクラミジアのrRNA（2x10-16モル）を42℃で15
分、次いで95℃で10分、最後に80℃で３分インキュベー
ションした。1.25mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris
HCl（pH8.3）、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ、5'末端
に配列番号:106のT7プロモーターを有し3'末端に配列番
号:50の標的結合領域を有するプロモーター−プライマ
ー50pmol、および配列番号:44のプライマー50pmolを含
有する80μｌの溶液をこの溶液に添加した。反応混合物
を35回サイクルさせ（55℃で0.5分、72℃で１分、次い
で95℃で１分）、その後、最後に72℃で７分インキュベ
ーションし、次いで、ハイブリダイゼーションまたはゲ
ル分析の前に４℃まで冷却した。Trisホウ酸EDTAバッフ
ァーを用いる２％アガロースゲル上の電気泳動、次い
で、臭化エチジウム染色を用いる核酸可視化により各反
応物20μｌを分析した。
R）フォーマットにおいて配列番号:44および50の配列の
プライマーを試験した。5mM MgCl2、50mM KCl、10mM
Tris HCl（pH8.3）、1mM dATP、1mM dGTP、1mM d
CTP、20ユニットのRNasin、50ユニットのMMLV逆転写酵
素および１ナノモルのランダムヌクレオチドヘキサマー
［Boehringer Mannheimから購入］を含有する20μｌの
溶液中でクラミジアのrRNA（2x10-16モル）を42℃で15
分、次いで95℃で10分、最後に80℃で３分インキュベー
ションした。1.25mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris
HCl（pH8.3）、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ、5'末端
に配列番号:106のT7プロモーターを有し3'末端に配列番
号:50の標的結合領域を有するプロモーター−プライマ
ー50pmol、および配列番号:44のプライマー50pmolを含
有する80μｌの溶液をこの溶液に添加した。反応混合物
を35回サイクルさせ（55℃で0.5分、72℃で１分、次い
で95℃で１分）、その後、最後に72℃で７分インキュベ
ーションし、次いで、ハイブリダイゼーションまたはゲ
ル分析の前に４℃まで冷却した。Trisホウ酸EDTAバッフ
ァーを用いる２％アガロースゲル上の電気泳動、次い
で、臭化エチジウム染色を用いる核酸可視化により各反
応物20μｌを分析した。
次いで、配列番号:46のアクリジニウムエステル標識
プローブおよび配列番号:48のヘルパープローブを用い
て反応混合物をアッセイした。結果を下表13に示す。
プローブおよび配列番号:48のヘルパープローブを用い
て反応混合物をアッセイした。結果を下表13に示す。
これらの結果は、密接に関連した生物由来の大量のRN
Aを含む試料においてさえもクラミジア・トラコマチス
を特異的に検出する、プローブ／ヘルパーオリゴヌクレ
オチドの組み合わせの能力を示す。
Aを含む試料においてさえもクラミジア・トラコマチス
を特異的に検出する、プローブ／ヘルパーオリゴヌクレ
オチドの組み合わせの能力を示す。
実施例14: この実施例は、単一のヌクレオチド配列であるプロモ
ーター−プライマーのクラミジア・トラコマチスの16S
rRNA配列を増幅する能力を示す。この実験において、種
々の量の精製シー・トラコマチス（ATCC番号VR−886）
のrRNAを、シー・トラコマチスの16S rRNAに相補的なヌ
クレオチド配列を有する負のセンスの２種のオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。それぞれ配列番号:50のオ
リゴヌクレオチドの5'末端に共有結合した配列番号:106
のR7プロモーターヌクレオチド配列を含む２種のプロモ
ーター−プライマーを合成した。
ーター−プライマーのクラミジア・トラコマチスの16S
rRNA配列を増幅する能力を示す。この実験において、種
々の量の精製シー・トラコマチス（ATCC番号VR−886）
のrRNAを、シー・トラコマチスの16S rRNAに相補的なヌ
クレオチド配列を有する負のセンスの２種のオリゴヌク
レオチドを用いて増幅した。それぞれ配列番号:50のオ
リゴヌクレオチドの5'末端に共有結合した配列番号:106
のR7プロモーターヌクレオチド配列を含む２種のプロモ
ーター−プライマーを合成した。
遊離の3'末端ヒドロキシル基を有するプロモーター−
プライマーの１つを合成し、１の反応につき2pmol使用
した。プライマー伸長をブロックまたは伸長量を減少さ
せるために3'末端に共有結合したアルカンジオール基を
有する第２のプロモーター−プライマーを合成し、１の
反応につき13pmol使用した。実施例１記載のごとく増幅
反応およびハイブリダイゼーションアッセイを行った。
アクリジニウムエステル標識プローブは配列番号:46の
ヌクレオチド配列からなっており、配列番号:48の未標
識ヘルパープローブとともに使用した。結果は、各条件
での３系の平均値である。
プライマーの１つを合成し、１の反応につき2pmol使用
した。プライマー伸長をブロックまたは伸長量を減少さ
せるために3'末端に共有結合したアルカンジオール基を
有する第２のプロモーター−プライマーを合成し、１の
反応につき13pmol使用した。実施例１記載のごとく増幅
反応およびハイブリダイゼーションアッセイを行った。
アクリジニウムエステル標識プローブは配列番号:46の
ヌクレオチド配列からなっており、配列番号:48の未標
識ヘルパープローブとともに使用した。結果は、各条件
での３系の平均値である。
表14:配列番号:106のT7プロモーターおよび配列番号:50
の標的結合領域を有する、ブロックされたプロモーター
−プライマーおよびブロックされていないプロモーター
−プライマーを用いる16S rRNAの増幅 上記の種々の実施例に示した具体例は、本明細書記載
のオリゴヌクレオチドはクラミジア・トラコマチスの核
酸を増幅および／または検出する能力を有し、クラミジ
ア・トラコマチスをその既知の系統発生論的に最も近縁
した種から識別しうることを確認するものである。本明
細書記載の実施例は、本発明を上記開示具体例に限定す
るものではない。さらなる具体例は以下の請求の範囲の
範囲内である。
の標的結合領域を有する、ブロックされたプロモーター
−プライマーおよびブロックされていないプロモーター
−プライマーを用いる16S rRNAの増幅 上記の種々の実施例に示した具体例は、本明細書記載
のオリゴヌクレオチドはクラミジア・トラコマチスの核
酸を増幅および／または検出する能力を有し、クラミジ
ア・トラコマチスをその既知の系統発生論的に最も近縁
した種から識別しうることを確認するものである。本明
細書記載の実施例は、本発明を上記開示具体例に限定す
るものではない。さらなる具体例は以下の請求の範囲の
範囲内である。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ジェン−プローブ・インコーポレイテ
ッド アメリカ合衆国カリフォルニア州92121 サン・ディエゴ、キャンパス・ポイント・ドライブ9880 （ii）発明の名称：クラミジア・トラコマチスの検出
のための組成物および方法 （iii）配列の数:109 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）メディウムタイプ:3.5インチディスケット，
用量1.44Mb （Ｂ）コンピューター:IBM PC （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（バージョン5.
1） （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （vii）先の出願データ： （Ａ）出願番号:08/323,257 （Ｂ）出願日:1994年10月14日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名:Heber,Sheldon 0. （Ｂ）登録番号:38,179 （Ｃ）代理人等における処理番号:210/087−PCT （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：（213）489−1600 （Ｂ）ファックス番号：（213）955−0440 （Ｃ）テレックス番号:67−3510 （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号:17に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号:18に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号:19に関する情報： 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（ii）配列の記載：配列番号:101: （２）配列番号:102に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:102: （２）配列番号:103に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:103: （２）配列番号:104に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:104: （２）配列番号:105に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:105: （２）配列番号:106に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:106: （２）配列番号:107に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:107: （２）配列番号:108に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:108: （２）配列番号:109に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:109:
ッド アメリカ合衆国カリフォルニア州92121 サン・ディエゴ、キャンパス・ポイント・ドライブ9880 （ii）発明の名称：クラミジア・トラコマチスの検出
のための組成物および方法 （iii）配列の数:109 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）メディウムタイプ:3.5インチディスケット，
用量1.44Mb （Ｂ）コンピューター:IBM PC （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（バージョン5.
1） （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （vii）先の出願データ： （Ａ）出願番号:08/323,257 （Ｂ）出願日:1994年10月14日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名:Heber,Sheldon 0. （Ｂ）登録番号:38,179 （Ｃ）代理人等における処理番号:210/087−PCT （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：（213）489−1600 （Ｂ）ファックス番号：（213）955−0440 （Ｃ）テレックス番号:67−3510 （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号:17に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号:18に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号:19に関する情報： 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（Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:29: （２）配列番号:30に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:30: （２）配列番号:31に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:31: （２）配列番号:32に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:32: （２）配列番号:33に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:33: （２）配列番号:34に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:34: （２）配列番号:35に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:35: （２）配列番号:36に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:36: （２）配列番号:37に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:37: （２）配列番号:38に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の記載：配列番号:38: （２）配列番号:39に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スタル，ポール・ディ アメリカ合衆国92122カリフォルニア州 サン・ディエゴ、ノベル・ドライブ 3717番 アパートメント・ナンバー1317 (72)発明者 スピンゴラ，マーク アメリカ合衆国87108ニューメキシコ州 アルバカーキ、チュラ・ビスタ・プレイ ス207番 (56)参考文献 特開 平６−133800（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−503356（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500309（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】ａ）配列番号:1のヌクレオチド配列を有す
るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
プローブ、および ｂ）１価カチオンの0.8M溶液、60℃、15分間に相当ハイ
ブリダイゼーション条件下にて、クラミジア・トラコマ
チス由来のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドポリ
マーの特定領域と安定なハイブリッドを形成する少なく
とも１のヘルパーオリゴヌクレオチド（該特定領域は配
列番号:11およびウラシルのかわりにチミジンを有する
そのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有する） を含む、クラミジア・トラコマチスの特異的検出のため
のプローブミックス。 - 【請求項２】該ヘルパープローブが配列番号:2のヌクレ
オチド配列を有するものである請求項１のプローブミッ
クス。 - 【請求項３】下記工程ａ）〜ｃ）： ａ）１価カチオンの0.8M溶液、60℃、15分間に相当する
ハイブリダイゼーション条件下にて、配列番号:1の配列
を含むハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび
配列番号:2の配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに
試料を接触させ、 ｂ）該試料および該ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブおよび該ヘルパーオリゴヌクレオチドに該ハイブ
リダイゼーション条件を適用して、クラミジア・トラコ
マチスのrRNAまたはrDNA配列をコードしている核酸が存
在する場合にはこれに該ハイブリダイゼーションアッセ
イプローブおよび該ヘルパーオリゴヌクレオチドをハイ
ブリダイゼーションさせて安定なハイブリッドを形成さ
せ、次いで ｃ）試料中に存在する場合には、試料中のクラミジア・
トラコマチスの核酸の存在を示すものとして該ハイブリ
ッドを検出する を含む、試料中のクラミジア・トラコマチスの核酸の存
在の検出方法。
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| US7569342B2 (en) * | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| US6261769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-07-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Intergenic spacer target sequence for detecting and distinguishing Chlamydial species or strains |
| DK1177317T3 (da) * | 1999-05-03 | 2006-12-11 | Gen Probe Inc | Polynukleotidprober til eksklusiv sporing og kvantisering af staphy-lococcus |
| US6821770B1 (en) | 1999-05-03 | 2004-11-23 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms |
| WO2000066785A2 (en) * | 1999-05-03 | 2000-11-09 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide probes for detection and quantitation of bacteria in the family enterobacteriaceae |
| DE19957827C2 (de) * | 1999-11-25 | 2003-06-12 | Epigenomics Ag | Verwendung eines Oligomer-Arrays mit PNA- und/oder DNA-Oligomeren auf einer Oberfläche |
| US20030096315A1 (en) | 2000-05-03 | 2003-05-22 | Sanders Mitchell C. | Device for detecting bacterial contamination and method of use |
| DE10021947A1 (de) * | 2000-05-05 | 2001-11-08 | Max Planck Gesellschaft | Helferoligonukleotide für die in situ Hybridisierung |
| GB0016814D0 (en) | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (3) |
| US6682889B1 (en) | 2000-11-08 | 2004-01-27 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family |
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| DE60230787D1 (de) * | 2001-08-31 | 2009-02-26 | Gen Probe Inc | Sonden mit affinitätsverschiebung zur quantifizierung von analytenpolynukleotiden |
| CA2474458A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Mitchell C. Sanders | Method for detecting microorganisms |
| DE10237284A1 (de) * | 2002-08-14 | 2004-03-04 | Advalytix Ag | Nukleinsäurenachweis |
| EP1587948A2 (en) * | 2003-01-31 | 2005-10-26 | Ethicon, Inc. | Method for detecting escherichia coli |
| AU2004286342B2 (en) | 2003-11-03 | 2008-10-02 | Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. | Methods, peptides and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria |
| JP5254012B2 (ja) * | 2005-06-06 | 2013-08-07 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
| AU2008224883A1 (en) * | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Sierra Molecular Corporation | Compositions, systems, and methods for preservation and/or stabilization of a cell and/or macromolecule |
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| JP5838550B2 (ja) * | 2010-12-22 | 2016-01-06 | 東ソー株式会社 | クラミジア・トラコマチスｒｎａの検出方法及び検出試薬 |
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| CN114540525B (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的引物组合物及其应用 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE98300T1 (de) * | 1983-01-10 | 1993-12-15 | Gen Probe Inc | Verfahren zum aufspueren, identifizieren und quantifizieren von organismen und viren. |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| GB2197363B (en) * | 1986-11-14 | 1990-09-12 | Univ Waterloo | Packing seal for boreholes |
| ES2112824T5 (es) * | 1986-11-24 | 2008-03-01 | Gen-Probe Incorporated | Sondas de acidos nucleicos para deteccion y/o cuantificacion de organismos no virales. |
| US5079351A (en) * | 1986-11-26 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Oligonucleotides and kits for detection of htlvi and htlvii viruses by hybridization |
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| WO1989001050A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| SE459586B (sv) * | 1987-09-14 | 1989-07-17 | Mta Szegedi Biolog Koezponti | Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning |
| AU630076B2 (en) * | 1987-09-21 | 1992-10-22 | Gen-Probe Incorporated | Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes |
| ES2074051T3 (es) * | 1987-09-21 | 1995-09-01 | Gen Probe Inc | Ensayo de proteccion homogeneo. |
| US5283174A (en) * | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
| US5185439A (en) * | 1987-10-05 | 1993-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
| US5030557A (en) * | 1987-11-24 | 1991-07-09 | Ml Technology Venture | Means and method for enhancing nucleic acid hybridization |
| US5449769A (en) * | 1989-03-06 | 1995-09-12 | Gen-Probe Incorporated | Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds |
| WO1990015159A2 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Gene-Trak Systems | Nucleic acid probes for the detection of chlamydia trachomatis |
| US5480784A (en) * | 1989-07-11 | 1996-01-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| IE65771B1 (en) * | 1990-01-25 | 1995-11-15 | Zeneca Ltd | Amplification of nucleotide sequences using vectorette units |
| WO1993004163A1 (en) * | 1991-08-23 | 1993-03-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Strain of chlamydia |
| AU681082B2 (en) * | 1992-05-06 | 1997-08-21 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
| CA2141430C (en) * | 1992-08-04 | 2009-05-12 | Sherrol H. Mcdonough | Nucleic acid sequence amplification |
| US5374718A (en) * | 1992-08-26 | 1994-12-20 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to chlamydia pneumoniae |
| DE69327454T2 (de) * | 1992-10-09 | 2000-05-11 | Vysis Inc | Analytisches verfahren |
| WO1994009159A2 (en) * | 1992-10-09 | 1994-04-28 | Amoco Corporation | Insertion elements and amplifiable nucleic acids |
| KR100238833B1 (ko) * | 1994-03-10 | 2000-03-02 | 다니엘 엘. 캐시앙 | 이온성 세제에 의한 효소 개재 반응의 억제를 방지하는 방법 |
| AU687535B2 (en) * | 1994-03-16 | 1998-02-26 | Gen-Probe Incorporated | Isothermal strand displacement nucleic acid amplification |
-
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