JP4455881B2 - 結核菌(Mycobacteriumtuberculosis)のrpoB配列の検出 - Google Patents
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Description
本発明は、病原性細菌のin vitro診断検出に関し、そして特に、rpoB遺伝子のin vitro核酸増幅および増幅された産物の検出を用いることによって、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のリファンピン耐性と関連する核酸配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。
リファンピン(RIF)はリファマイシンBから合成された抗生物質であり、結核菌に対する薬剤療法の重要な構成要素である。リファンピンは、原核RNAポリメラーゼのベータサブユニット上に、特有の作用部位を有する。大腸菌(Escherichia coli)において、RNAポリメラーゼサブユニット遺伝子(rpoB)の中央領域にミスセンス突然変異および短い欠失が起こると、リファンピンに耐性な株が生じる(Lisitynら, 1984, Mol. Gen. Genet. 196:173−174)。同様に、結核菌において、リファンピン耐性を与える、rpoB遺伝子中の非常に多様な突然変異が同定されてきている(Telentiら, 1993, Lancet 341:647−650)。90%を超えるリファンピン耐性結核菌単離体はまた、イソニアジドにも耐性であり、そしてしたがって、リファンピン耐性は、多剤耐性の有用な代理マーカーである。したがって、感染個体の適切な治療につながる診断のため、リファンピン耐性の遺伝的基礎を迅速に検出可能な試験に関する必要性がある。
本発明の1つの側面にしたがって、生物学的試料に存在する結核菌のrpoB配列を検出する方法を提供する。該方法は、rpoB DNA配列を含んでなる結核菌由来の核酸を含有する生物学的試料を提供し;少なくとも1つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号1〜配列番号3、配列番号8、配列番号10および配列番号11からなる群より選択される配列を有する少なくとも2つのプライマーを含んでなる、in vitro核酸増幅混合物において、結核菌rpoB DNA配列を増幅して、増幅された結核菌核酸を産生し;そして増幅された結核菌核酸と関連する標識を検出することによって、増幅された結核菌核酸を検出する工程を含む。1つの態様において、該方法はまた、結核菌DNA配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの捕捉オリゴヌクレオチド、および捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定核酸を、ハイブリダイズ条件下で、生物学的試料に添加して、結核菌DNA配列、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定核酸を含んでなるハイブリダイゼーション複合体を産生し;そして増幅工程前に、生物学的試料の他の構成要素からハイブリダイゼーション複合体を分離する工程も含む。いくつかの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの検出プローブを用いる。1つの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの標識検出プローブを用い、一方、別の態様は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、複数の検出プローブを用いる。1つの態様において、増幅工程は、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーの組み合わせを用い、ここで第一のプライマーは配列番号2の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号3の配列を有するか;第一のプライマーは配列番号2の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号8の配列を有するか;または第一のプライマーは配列番号10の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号11の配列を有する。
本発明は、ヒト由来の生物学的試料、好ましくはプロセシングした痰試料に存在する結核菌のrpoB配列を検出する方法を含む。本発明はまた、生物学的試料に存在する結核菌配列に特異的にハイブリダイズし、それによって試料構成要素から標的配列を捕捉する手段を提供する核酸捕捉オリゴマー、rpoB DNA配列の選択した部分を特異的に増幅する核酸増幅オリゴマー(またはプライマー)、およびこうした増幅された配列を検出する核酸プローブオリゴマー(または検出プローブ)を含む組成物も含む。
「生物学的試料」によって、結核菌核酸を含有する可能性がある、生存しているまたは死亡したヒト由来の組織または材料いずれかを意味する。試料には、例えば、痰、呼吸組織または滲出物、末梢血、血漿または血清、子宮頚スワブ試料、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。試料にはまた、細菌培養(液体または固形培地由来)および環境試料も含まれる。生物学的試料を処理して、物理的に組織または細胞構造を破壊し、こうして、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有可能な溶液中に、細胞内構成要素を遊離させて、解析用の試料を調製するのに用いることが可能である。
本実施例は、TMA反応で用いた際の、本発明の増幅オリゴヌクレオチドの感度を示す。結核菌を特異的に増幅し、そして他のミコバクテリウム属種を増幅しないように、プライマーを設計した。上述の標的捕捉および増幅法を用い、以下の組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドを用いて、転写仲介増幅の効率を試験した:ヘルパーオリゴマーとして配列番号1(GACCACCCAGGACGTG)、プロモーター・プライマーとして配列番号2(AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGATCACACCGCAGACGTTG)、およびプライマーとして配列番号3(GCTCGCGCTCACGTG)。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そしてin vitro増幅反応あたり、20、200または103コピーで提供した、精製gDNAであった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌DNAをまったく含有しない等体積の水をgDNA試料の代わりに用いた。増幅は、実質的に別の箇所に詳細に記載されるように行った均質検出アッセイ(米国特許第5,283,174号(Arnold Jr.ら)、第5,658,737号(Nelsonら)および第5,639,604号(Arnold Jr.ら))を用いて、検出された化学発光(RLU)に基づいて評価した。配列番号4(GTTGTTCTGGTCCATGAA)のAE標識検出プローブを同一配列の非標識プローブと混合し(標識プローブ/非標識プローブの比は1/5000であった)、LEADERTM発光測定装置(Gen−Probe Incorporated、カリフォルニア州サンディエゴ)によって検出可能な直線範囲内のシグナルを提供した。2x104以上のRLUシグナルを陽性とみなした。RLU結果(各アッセイ条件に関して10アッセイの平均)を表1に示す。
本実施例は、実質的に実施例1および上記に記載するような増幅オリゴマーおよび方法を用いて行うTMA反応を用いて立証されるような、本発明の増幅オリゴマーの特異性を示す。このアッセイの標的配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(「ATCC」、バージニア州マナサス)またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHカルチャー・コレクション(「DSM」、ドイツ・ブラウンシュワイク)から得て、そして標準的微生物学的方法を用いてin vitroで増殖させた細菌から抽出した、精製ミコバクテリウムgDNAであった。試験した種には:結核菌(ATCC寄託番号27294)、M.カンサシ(M. kansasii)(DSM寄託番号43224)、鳥型結核菌(M. avium)(ATCC寄託番号25291)、およびM.ゴルドネ(M. gordonae)(ATCC寄託番号14470)が含まれた。増幅反応において、アッセイあたり200、103、104、105、および106コピーの標的DNAを提供した。陰性対照反応は、ミコバクテリウムDNAをまったく含有しなかった(すなわち試料体積の代わりに等体積の水を用いた)。
本実施例は、標的捕捉、増幅および検出後のrpoB配列の検出を示す。均質検出アッセイにおいて標識プローブ結合を用いることによって、そして実質的に実施例2に記載するように、DNAプローブアレイに標識単位複製配列を結合させることによって、検出を行った。検出のため、各クローンに関する同一増幅反応を2つの部分に分けた。
本実施例は、野生型結核菌を含有する臨床試料のTMA増幅および増幅されたRNAの検出に用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。実質的に実施例1に記載されるように、増幅を行った。均質検出アッセイにおいて、固定プローブのアレイを有する固体支持体(GENECHIPTM)上で、そして標識プローブを用いることによって、実質的に実施例2に記載するように、単位複製配列を検出した。
本実施例は、別の増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。固定プローブのアレイを有する固体支持体(すなわちGENECHIPTM)上で、増幅後に得たDNAを検出した。標的調製のため、標準的微生物学的方法を用いて、野生型結核菌(ATCC寄託番号27177)をin vitroで増殖させた。水中で細菌ストック懸濁物を作成し、そしてmlあたり約6x108細菌の濃度に調整した。水中の連続希釈を作成して、μlあたり104細菌(μlあたり104コピーの細菌DNAと同等)の濃度を産生し、これをその後、95℃で15分間加熱することによって不活性化した。
本実施例は、該アッセイがrpoB領域から作成した単位複製配列を増幅し、そして検出することが可能であるが、実施例1に記載した(−)DNA鎖増幅と対照的に、(+)DNA鎖から単位複製配列が作成されることを示す。実施例1におけるのと実質的に同一の増幅条件を用いて、(+)鎖増幅反応で用いた増幅オリゴヌクレオチドは:プロモーター・プライマーとして配列番号10(AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCTCACGTGACAGAC)、およびプライマーとして配列番号11(GGTCGCCGCGATCAAG)であった。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そして増幅反応あたり5x103コピーで提供する精製gDNA、またはブロス培養で増殖させ、増幅反応あたり約5x103コピーで提供する超音波処理結核菌細胞の未精製溶解物であった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌DNAをまったく含有しない等体積の水をDNA含有試料の代わりに用いた。実質的に上述のように行うが、配列番号12(CATGAATTGGCTCAGCTG)のAE標識検出プローブを用いる、均質検出アッセイ後に検出された化学発光(RLU)に基づいて、増幅を評価した。精製gDNAおよび未精製溶解試料両方に関して、陽性シグナルを検出した。精製gDNA標的を用いた2回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは5.66x106RLUであり、そして未精製溶解物DNA標的を用いた5回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは5.25x106RLUであった。陰性対照(2回の反復アッセイ)は6.15x102RLUを生じた。これらの結果は、アッセイが、増幅される結核菌DNAの鎖と独立にrpoB配列を特異的に検出可能であることを示す。
Claims (11)
- 生物学的試料に存在する結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のrpoB配列を検出する方法であって:
rpoB 遺伝子配列を含む結核菌由来の核酸を含有する生物学的試料を提供し;
結核菌DNA配列に特異的にハイブリダイズする、配列番号:5、配列番号:6、及び配列番号:9からなる群より選ばれる少なくとも1つの捕捉オリゴヌクレオチド、及び捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定核酸を、ハイブリダイズ条件下で、生物学的試料に添加して、結核菌DNA配列、捕捉オリゴヌクレオチド及び固定核酸を含むハイブリダイゼーション複合体を産生して、増幅工程前に、生物学的試料の他の構成要素からハイブリダイゼーション複合体を分離し;
少なくとも1つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号1〜3、8、10及び11からなる群より選択される配列を有する少なくとも2つのプライマーを含む、in vitro核酸増幅混合物において、結核菌rpoB 遺伝子配列を含む結核菌核酸の一部を特異的に増幅して、増幅された結核菌核酸を産生し;そして
増幅された結核菌核酸に関連する標識を検出することによって、増幅された結核菌核酸をrpoB遺伝子配列において検出する
工程を含む、前記方法。 - 検出工程が、rpoB遺伝子配列において増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの検出プローブを用いる、請求項1記載の方法。
- 検出工程が、rpoB遺伝子配列において増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号4又は12で表される配列からなる少なくとも1つの標識検出プローブを用いる、請求項1又は2記載の方法。
- 検出工程が、rpoB遺伝子配列において増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、複数の検出プローブを用いる、請求項1〜3いずれか1項記載の方法。
- 複数の検出プローブが、rpoB 遺伝子配列中のF505L/L511P/S531C、Q513L、H526D、D516Y、H526Y、L511P又はH526Rにより特徴付けられる変異を検出する、請求項4記載の方法。
- 増幅工程が、少なくとも第1のプライマー及び第2のプライマーの組み合わせを用いる、請求項1〜5いずれか1項記載の方法であって
第1のプライマーが配列番号2で表される配列からなり、そして第2のプライマーが配列番号3で表される配列からなるか;
第1のプライマーが配列番号2で表される配列からなり、そして第2のプライマーが配列番号8で表される配列からなるか;又は
第1のプライマーが配列番号10で表される配列からなり、そして第2のプライマーが配列番号11で表される配列からなる;
前記方法。 - 配列番号1〜配列番号6及び配列番号8〜12からなる群より選択される配列を有する、少なくとも3のオリゴヌクレオチドを含んでなる、結核菌のrpoB配列を検出するための組成物であって、配列番号5、6及び9からなる群から選択される捕捉オリゴマーを含み;及び
配列番号2及び10からなる群から選択される第1プライマー及び配列番号3、8及び11からなる群から選択される第2プライマーを組合わせて含む;
、前記組成物。 - 組成物がさらに、配列番号1で表される配列からなるヘルパーオリゴヌクレオチド及び/又は配列番号4又は12で表される配列からなる検出プローブを含む、請求項7記載の組成物。
- 組成物が:
配列番号1で表される配列からなるヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号2で表される配列からなる第1プライマー及び配列番号3で表される配列からなる第2プライマー;
配列番号2で表される配列からなる第1プライマー及び配列番号3で表される配列からなる第2プライマー;
配列番号2で表される配列からなる第1プライマー及び配列番号8で表される配列からなる第2プライマー;又は
配列番号10で表される配列からなる第1プライマー及び配列番号11で表される配列からなる第2プライマー;
を含む、請求項7又は8記載の組成物。 - 組成物が:
配列番号10で表される配列からなる第1プライマー及び配列番号11で表される配列からなる第2プライマー及び配列番号12で表される配列からなる検出プローブ
を含む、請求項7又は8の組成物。 - 請求項7〜10のいずれか1項記載の組成物を含有するキット。
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