JP2005503165A - 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｒｐｏＢ配列の検出 - Google Patents
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Abstract
生物学的試料に存在する結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｒｐｏＢ配列を検出する方法であって、特異的プライマー配列を含む核酸増幅混合物において、結核菌ｒｐｏＢ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅することを含む、前記方法を開示する。試料中の結核菌のｒｐｏＢ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための組成物を開示する。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、病原性細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検出に関し、そして特に、ｒｐｏＢ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅および増幅された産物の検出を用いることによって、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のリファンピン耐性と関連する核酸配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リファンピン（ＲＩＦ）はリファマイシンＢから合成された抗生物質であり、結核菌に対する薬剤療法の重要な構成要素である。リファンピンは、原核ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニット上に、特有の作用部位を有する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子（ｒｐｏＢ）の中央領域にミスセンス突然変異および短い欠失が起こると、リファンピンに耐性な株が生じる（Ｌｉｓｉｔｙｎら， １９８４， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９６：１７３−１７４）。同様に、結核菌において、リファンピン耐性を与える、ｒｐｏＢ遺伝子中の非常に多様な突然変異が同定されてきている（Ｔｅｌｅｎｔｉら， １９９３， Ｌａｎｃｅｔ ３４１：６４７−６５０）。９０％を超えるリファンピン耐性結核菌単離体はまた、イソニアジドにも耐性であり、そしてしたがって、リファンピン耐性は、多剤耐性の有用な代理マーカーである。したがって、感染個体の適切な治療につながる診断のため、リファンピン耐性の遺伝的基礎を迅速に検出可能な試験に関する必要性がある。
【０００３】
適切な治療には、そして耐性株の蔓延を防ぐには、臨床的結核菌単離体の薬剤耐性を早期に検出することが重要である。固形培地上の結核菌の増殖によって薬剤耐性を検出する慣用法、およびより最近の、液体培地中の増殖に頼る方法は、３日〜４週間以上掛けて、感受性結果を提供してきた（Ｒｕｓｃｈ−Ｇｅｒｄｅｓら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４５−４８）。
【０００４】
リファンピン耐性を検出するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に頼る遺伝的技術が考案されてきている。こうした技術には、ＰＣＲ産物の直接配列決定、一本鎖コンホメーション多型解析、ヘテロ二重鎖形成およびジデオキシ・フィンガープリンティングが含まれる（Ｔｅｌｅｎｔｉら， １９９３， Ｌａｎｃｅｔ ３４２：８４１−８４４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９９４， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３８：２３８０−２３８６；Ｄｅ Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒ， １９９５， Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ７６：４２５−４３０）。結核菌単離体におけるリファンピン耐性を検出するか、またはｒｐｏＢ遺伝子を用いてミコバクテリウム属種を同定するための他のアッセイおよび試薬が先に開示されてきており、例えば米国特許第５，６４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇら）、第５，８５１，７６３号（Ｈｅｙｍら）、第６，２２８，５７５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）、および第６，２４２，５８４号（Ｋｏｏｋら）に開示されてきている。
【０００５】
本発明は、臨床試料に存在する可能性がある結核菌中のリファンピン耐性を検出する組成物および単純な診断法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明の１つの側面にしたがって、生物学的試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する方法を提供する。該方法は、ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を含んでなる結核菌由来の核酸を含有する生物学的試料を提供し；少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号１〜配列番号３、配列番号８、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を有する少なくとも２つのプライマーを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物において、結核菌ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を増幅して、増幅された結核菌核酸を産生し；そして増幅された結核菌核酸と関連する標識を検出することによって、増幅された結核菌核酸を検出する工程を含む。１つの態様において、該方法はまた、結核菌ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチド、および捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定核酸を、ハイブリダイズ条件下で、生物学的試料に添加して、結核菌ＤＮＡ配列、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定核酸を含んでなるハイブリダイゼーション複合体を産生し；そして増幅工程前に、生物学的試料の他の構成要素からハイブリダイゼーション複合体を分離する工程も含む。いくつかの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブを用いる。１つの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識検出プローブを用い、一方、別の態様は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、複数の検出プローブを用いる。１つの態様において、増幅工程は、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーの組み合わせを用い、ここで第一のプライマーは配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号３の配列を有するか；第一のプライマーは配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号８の配列を有するか；または第一のプライマーは配列番号１０の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号１１の配列を有する。
【０００７】
本発明の別の側面は、結核菌のｒｐｏＢ配列を検出するための組成物であって、配列番号１〜配列番号６および配列番号８〜配列番号１２からなる群より選択される配列を有する、１以上のオリゴヌクレオチドを含んでなる、前記組成物を提供する。１つの態様において、組成物は、配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４〜配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含んでなる。別の態様において、組成物は、配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、配列番号４の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号５、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第三のオリゴヌクレオチドを含んでなる。組成物の１つの態様は、配列番号１０および配列番号１１のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１２の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含んでなる。本発明の別の態様は、前述のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの組み合わせのいずれかを含有するキットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
詳細な説明
本発明は、ヒト由来の生物学的試料、好ましくはプロセシングした痰試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する方法を含む。本発明はまた、生物学的試料に存在する結核菌配列に特異的にハイブリダイズし、それによって試料構成要素から標的配列を捕捉する手段を提供する核酸捕捉オリゴマー、ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列の選択した部分を特異的に増幅する核酸増幅オリゴマー（またはプライマー）、およびこうした増幅された配列を検出する核酸プローブオリゴマー（または検出プローブ）を含む組成物も含む。
【０００９】
本発明の核酸配列は、生物学的試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ遺伝子を捕捉し、増幅し、そして該遺伝子の突然変異を検出するのに有用である。本発明の方法は、結核菌感染患者の適切な治療を決定するのに有用な情報を臨床医に提供することによって、結核菌の薬剤耐性表現型の診断に重要である。
【００１０】
以下の定義は、記載する発明の理解を補助するために提供する。
「生物学的試料」によって、結核菌核酸を含有する可能性がある、生存しているまたは死亡したヒト由来の組織または材料いずれかを意味する。試料には、例えば、痰、呼吸組織または滲出物、末梢血、血漿または血清、子宮頚スワブ試料、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。試料にはまた、細菌培養（液体または固形培地由来）および環境試料も含まれる。生物学的試料を処理して、物理的に組織または細胞構造を破壊し、こうして、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有可能な溶液中に、細胞内構成要素を遊離させて、解析用の試料を調製するのに用いることが可能である。
【００１１】
「核酸」によって、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を有し、主鎖構造を介して共有結合されて、ポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなる多量体化合物を意味する。この用語には、慣用的なＲＮＡ、ＤＮＡ、並びにＲＮＡおよびＤＮＡの類似体が含まれる。核酸の主鎖は、既知の多様な連結を含んでなることが可能であり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（「ペプチド核酸」；ＰＣＴ第ＷＯ ９５／３２３０５号（Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら））、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、または既知の連結の組み合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシおよび／または２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であることが可能である。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、既知の塩基類似体（例えばイノシン；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら監修， 第１１版， １９９２を参照されたい）、あるいはプリンまたはピリミジン塩基類の既知の誘導体（ＰＣＴ第ＷＯ ９３／１３１２１号（Ｃｏｏｋ））および１以上の残基に関して、主鎖に窒素性塩基が含まれない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（米国特許第５，５８５，４８１号（Ａｒｎｏｌｄら））であることが可能である。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、あるいは慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の類似体を含む核酸）を含むことが可能である。
【００１２】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」によって、一般的に１，０００残基未満を有する核酸を意味し、約２〜５ヌクレオチド残基の下限および約５００〜９００ヌクレオチド残基の上限を有するサイズ範囲にある核酸が含まれる。オリゴマーは、約５〜約１５残基の下限および約５０〜６００残基の上限を有するサイズ範囲に；そして好ましくは、約１０残基の下限および約１００残基の上限を有するサイズ範囲にあることが可能である。オリゴマーは、天然供給源から精製可能であるが、一般的には、公知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する。
【００１３】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」によって、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを意味する。これらは、３’端にヌクレオチド単量体を付加する酵素活性によって、テンプレートからの重合を開始するため、「プライマー」と称することが可能である。増幅オリゴヌクレオチドは、一般的に、標的核酸配列（またはその相補鎖）のある領域に相補的である、少なくとも１０〜１２の隣接塩基を含有する。隣接塩基は、増幅オリゴヌクレオチドが結合する配列に、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ約１０〜約６０塩基であり、そして修飾ヌクレオチド、塩基類似体またはさらなる機能配列、例えばＲＮＡポリメラーゼに認識される５’プロモーター配列を含む（こうした増幅オリゴヌクレオチドは「プロモーター・プライマー」と称することが可能である）ことが可能である。
【００１４】
当業者は、プライマーとして機能可能なオリゴマーはいずれも、５’プロモーター配列を含み、そしてしたがってプロモーター・プライマーとして機能するよう修飾することが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター・プライマーも、そのプロモーター配列と独立に、プライマーとして作用することが可能である。
【００１５】
「増幅」によって、多コピーの標的核酸配列あるいはその相補体または断片を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を意味する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅は、完全標的領域配列またはその相補体より少ない配列を含有することが可能な、増幅された核酸の産生を指す。既知の増幅法には、例えば、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱベータ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを用いる（米国特許第４，７８６，６００号（Ｋｒａｍｅｒら）および第５，１１２，７３４号（Ｌｉｚａｒｄｉら））。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常、２以上のプライマーと共に、熱反復を用いて、多コピーの２つの相補ＤＮＡ鎖を合成する（Ｍｕｌｌｉｓら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５５：３３５−３５０；米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら））。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の多数の周期を用いることにより、標的およびその相補鎖を増幅する（ＥＰ特許第０３２０３０８号（Ｗａｎｇら））。ＳＤＡは、標的配列が含まれる半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを形成するであろう制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、一連のプライマー伸長および鎖置換工程が続いてＤＮＡを増幅する（米国特許第５，４２２，２５２号（Ｗａｌｋｅｒら））。本発明の好ましい態様では、転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる。当業者は、プライマー伸長に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法いずれでも、本発明のオリゴヌクレオチド配列を容易に使用可能であることを理解するであろう。
【００１６】
「転写仲介増幅」または「転写関連増幅」によって、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する、核酸増幅を意味する。ＴＭＡは、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、並びにプロモーター・プライマーおよび第二のプライマーを用い、そして場合によって、１以上のさらなるオリゴヌクレオチド（ときに「ヘルパー」または「置換体（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）」オリゴヌクレオチドと呼ばれる）を含むことが可能である。これらの増幅法は、別の箇所に詳細に記載されるように、当該技術分野に公知である（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）、米国特許第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）、ＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号（Ｋａｃｉａｎら）；米国特許第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）；ＰＣＴ第ＷＯ ８８／０１３０２号および第ＷＯ ８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）；米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）；ＰＣＴ第ＷＯ ９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）；およびＰＣＴ第ＷＯ ９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒら））。好ましいＴＭＡ法が、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号および第５，７８６，１８３号、およびＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号に開示されている。
【００１７】
「プローブ」によって、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸またはその相補体において、好ましくは増幅された核酸において、標的配列に特異的にハイブリダイズし、それによって、標的または増幅された核酸の検出を可能にする、核酸オリゴマーを意味する。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅された核酸に直接ハイブリダイズしているプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅された核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズしているプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合形成（すなわち塩基対形成）によって、プローブ配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列中の配列（すなわちサブセット）を指す。「十分に相補的な」配列は、２つの配列が完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。プローブは、当該技術分野に公知の、使用する検出法にしたがって、標識されていても、標識されていなくてもよい。
【００１８】
「十分に相補的な」によって、ハイブリダイゼーション条件下で、一連の相補塩基間の水素結合形成により、別の塩基配列とハイブリダイズする、隣接核酸塩基配列を意味する。配列は、標準的塩基対形成（すなわちＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）を用いて、配列中の各位で相補的であることが可能であるし、または標準的水素結合形成によっては相補的でない１以上の残基（無塩基性残基が含まれる）を含有することが可能であるが、この場合、適切なハイブリダイゼーション条件下で、塩基配列全体が別の塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能である。隣接塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズする配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、配列組成および条件に基づいて、容易に予測可能であるか、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７）。
【００１９】
「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」または「捕捉プローブ」によって、塩基対ハイブリダイゼーションに基づいて、標的配列および固定オリゴマーを特異的に連結する手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴマーを意味する（米国特許第６，１１０，６７８号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））。一般的に、捕捉オリゴマーには２つの結合領域：標的特異的結合領域および固定プローブ特異的結合領域が含まれる。
【００２０】
「固定プローブ」または「固定オリゴマー」によって、捕捉オリゴマーを固体支持体に直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定プローブは、固体支持体に連結されたオリゴヌクレオチドであり、結合した標的配列を他の試料構成要素から分離する手段を提供する。適切な固体支持体には、既知の材料いずれか（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび金属粒子、好ましくは常磁性粒子）で作成したマトリックスおよび溶液中の粒子が含まれる。好ましい支持体は、固定プローブが直接（例えば直接共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介して）、または間接的に（例えば１以上のリンカーとのハイブリダイゼーションを介して）安定して連結され、こうして溶液中の別の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする、単分散常磁性球体（すなわち±約５％でサイズが均一）である。
【００２１】
「分離」または「精製」によって、生物学的試料の１以上の構成要素を他の試料構成要素から取り除くことを意味する。試料構成要素は、一般的に、核酸および他の成分（例えばタンパク質、炭水化物、脂質および／または核酸）を含む、水性溶液である。分離または精製工程は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の他の試料構成要素を取り除く。
【００２２】
「標識」によって、検出可能であるか、または検出可能な反応を導くことが可能な分子部分または化合物を意味する。標識は、核酸プローブに、または検出しようとする核酸（例えば増幅された核酸）に直接または間接的に連結する。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて（例えば共有結合または非共有相互作用を介して）生じることが可能である。間接的標識は、直接または間接的いずれかで標識されている、さらなるオリゴヌクレオチド（類）などの、架橋部分またはリンカーの使用を通じて生じることが可能である。架橋部分を用いて、検出可能シグナルを増幅することが可能である。標識は、既知の検出可能部分いずれか（例えば放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、発色団、例えば色素または有色粒子、生物発光、燐光、化学発光および蛍光化合物を含む発光化合物）であることが可能である。好ましくは、標識プローブ上の標識は、均質アッセイ系で検出可能である（すなわち、混合物において、非結合標識プローブに比較して、結合した標識プローブが検出可能な変化を示す）。均質検出アッセイにおいて好ましい化学発光標識およびその使用が詳細に記載されてきている（米国特許第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら））である。こうした標識にはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体が含まれる。均質検出可能標識は、非ハイブリダイズ標識または標識プローブから、ハイブリダイズした標識を物理的に分離することなく検出可能であるという利点を有する。核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；米国特許第５，７３１，１４８号（Ｂｅｃｋｅｒら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎら）、第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら）、および第４，５８１，３３３号（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら））。
【００２３】
「ＤＮＡプローブアレイ」によって、少なくとも２、そして好ましくは１０以上の異なる捕捉オリゴヌクレオチドが固定されている、固体支持体を意味する。こうしたＤＮＡプローブアレイの例は、当該技術分野に公知である（Ｒａｍｓａｙ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４０−４４；Ｃｈｅｎｇら， １９９６， Ｍｏｌｅｃ． ｄｉａｇｎｏｓｉｓ １（３）：１８３−２００；Ｌｉｖａｃｈｅら， １９９４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２（１５）：２９１５−２９２１；Ｃｈｅｎｇら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：５４１−５４６；米国特許第４，９８１，７８３号（Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ）、第５，７００，６３７号（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、第５，４４５，９３４号および第５，７４４，３０５号（Ｆｏｄｏｒ）、および第５，８０７，５２２号（Ｂｒｏｗｎ））。
【００２４】
「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる構成要素（類）、組成物（類）または方法工程（類）が、本発明の組成物、キットまたは方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、生物学的試料において、試料あたり約２０〜２００コピー以上で、結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する能力が含まれる。本発明の基本的な特性に実質的な影響を有する、いかなる構成要素、組成物または方法工程も、この用語の外に属するであろう。
【００２５】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。一般的な定義は、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク）またはＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， １９９１， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ニューヨーク州ニューヨーク）に提供される。別に言及しない限り、本明細書に使用されるかまたは意図される技術は、当該技術分野で公知の標準法である。
【００２６】
本発明には、ヒト生物学的試料中の結核菌ｒｐｏＢ核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよびプローブ）および方法が含まれる。こうした使用に適したＤＮＡ配列を選択するため、同一または同様の配列領域をマッチングすることによって、公的にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な、既知の突然変異を含む、異なるミコバクテリウム属単離体由来の既知のｒｐｏＢ配列を並列させ、そして公知の分子生物学的技術を用いて比較した。アルゴリズムの使用は、配列比較を容易にすることが可能であるが、当業者は、手で、そして視覚的に、容易にこうした比較を行うことが可能である。一般的に、ｒｐｏＢ領域の結核菌核酸配列の捕捉および増幅、並びに増幅された配列の検出に使用するのに適した合成オリゴマーを設計する基礎として、比較配列間で、相対的に少数の変動を含有する配列部分を選択した。オリゴマーを設計する際の他の検討材料には、配列のＴｍに影響を与える相対的ＧＣ含量および配列内の予測される二次構造の相対的欠如が含まれ、これらはすべて当該技術分野に公知であった。これらの解析に基づいて、配列番号１〜配列番号６および配列番号８〜配列番号１２の配列を有するオリゴマーを設計し、そして合成した。
【００２７】
標的捕捉を含んで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅前に標的核酸の濃度または純度を増加させることが可能である。好ましくは、標的捕捉は、別の箇所に詳細に記載されるように（米国特許第６，１１０，６７８号およびＰＣＴ第ＷＯ ９８／５０５８３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））、標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を単離する、比較的単純な方法を伴う。簡潔には、結核菌ＤＮＡを含有する可能性がある試料を、結核菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含有する捕捉オリゴマー、および捕捉オリゴマーの別の部分にハイブリダイズ可能な、固体支持体に付着する固定オリゴヌクレオチドと、適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる。結核菌ＤＮＡに、そしてその後、固定オリゴヌクレオチドに、捕捉オリゴマーをハイブリダイズさせた後、固体支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料構成要素から分離する。その後、固体支持体に連結された結核菌標的核酸を洗浄し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応において、ｒｐｏＢ配列を増幅する。
【００２８】
捕捉オリゴマー配列には、結核菌ＤＮＡ標的配列に特異的に結合する５’標的結合配列、および固体支持体上の相補固定配列（例えばポリｄＴ）に結合する３’テール配列（例えばポリｄＡ）が含まれる。捕捉オリゴマーは、標準的デオキシリボース−リン酸連結およびＯ−メトキシ連結を含めて、塩基配列を連結する、いかなる主鎖を用いることも可能である。好ましい捕捉オリゴマーは：ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴ（Ａ）30（配列番号５）、ＣＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＣ（Ａ）30（配列番号６）、およびＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＣＡＣ（Ａ）30（配列番号９）の配列を有する。
【００２９】
捕捉されたｒｐｏＢ領域の増幅は、多様な既知の核酸増幅反応を用いて達成可能であるが、好ましくは転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる。こうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法を用いると、標的核酸の単一コピーから多数の核酸鎖が産生され、したがって、増幅されたｒｐｏＢ配列を１以上の検出プローブに特異的に結合させることによって、標的の検出が可能になる。ＴＭＡは先に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら））。簡潔には、この増幅法は、溶液中で、２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有する「プロモーター・プライマー」）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに適切な塩および緩衝剤を使用して、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。まず、プロモーター・プライマーがその標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして逆転写酵素がプロモーター・プライマーの３’端からの伸長によって、第一鎖ＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡは、相補鎖を分解する酵素活性（例えば逆転写酵素のＲＮアーゼＨ活性）によって、または二重鎖の局所もしくは完全変性によって、第二のプライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能になる。第二のプライマーがｃＤＮＡに結合し、そして逆転写酵素を用いて、第二のプライマーの３’端からＤＮＡの新規鎖が合成されて、一端に機能するプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡが生成される。ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖プロモーター配列に結合し、そして転写によって、多数の転写物または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」が生じる。単位複製配列は、方法のさらなる工程で用いられ、各々、上述のような複製の新規周期のテンプレートとして働き、こうして、実質的に等温の方法で、多量の増幅された一本鎖核酸を生成する。例えば、単一テンプレートから、約１００〜約３，０００コピーのＲＮＡ転写物が合成される。
【００３０】
プライマー配列（例えば配列番号１〜配列番号３および配列番号８、配列番号１０および配列番号１１）は、ｒｐｏＢ標的配列またはその相補体に特異的に結合するが、こうしたプライマー配列は、標的配列またはその相補体に結合しない配列を含有することが可能である。例えば、プロモーター・プライマー（例えば配列番号２、配列番号１０）は、配列の５’部分として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号７）を含むことが可能である。
【００３１】
本発明の態様を、以下の実施例に記載する。簡潔には、方法は、標的結核菌ｒｐｏＢ遺伝子を含有する可能性がある生物学的試料を提供し、ｒｐｏＢ配列を含有するＤＮＡを標的捕捉し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を増幅し、そして増幅された核酸産物を検出して、増幅された核酸中にｒｐｏＢ突然変異が存在するかどうかを決定する工程を含む。ｒｐｏＢ突然変異が検出されたら、これはアッセイした試料がＲＩＦ耐性結核菌を含有したことを示す。転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる好ましい態様において、増幅混合物には、捕捉された標的ＤＮＡ、標的特異的配列およびＴ７プロモーター配列を含む少なくとも１つのＴ７プロモーター・プライマー、Ｔ７プロモーター・プライマーを用いて標的から作成された第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの第二のプライマー、並びに逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる酵素重合の基質および補助因子が含まれる。捕捉された標的は、ＴＭＡ反応に使用するために固体支持体から分離する必要はない。機能するＴ７プロモーター配列をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせると、多数の転写物が生じ、１以上の相補プローブ配列に、増幅された産物またはその一部を特異的にハイブリダイズさせることを含む、多様な既知の方法のいずれかを用いて、この転写物を検出することが可能である。いくつかの態様において、標識プローブを用いて増幅された産物を検出し、一方、他の態様においては、増幅された産物を標識し、そして固定プローブに、好ましくは多くのプローブのアレイにハイブリダイズさせる。プローブおよび増幅された産物のハイブリダイゼーション複合体を検出する。異なるプローブのアレイを用いる場合、アレイ上のハイブリダイゼーションパターンは、増幅されたｒｐｏＢ遺伝子の配列を示し、これは、結核菌のｒｐｏＢ突然変異がアッセイした試料に存在するかどうかに関する情報を提供する。
【００３２】
試料調製。試料（例えば０．５ｍｌの痰沈降物または細菌培養）を、等体積の２ｘ溶解緩衝液（例えば２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨ８）と混合した。細菌から核酸を遊離させるため、ガラスビーズの存在下で混合物を１５分間ボルテックスするか、または超音波処理し、そしてその後、混合物を９５℃で１５分間加熱した。陽性対照反応では、痰沈降物または細菌培養の代わりに、既知の量の結核菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含有する等体積の水または緩衝液を用いた。先に詳細に記載されている標準法の組み合わせを用いて、ｇＤＮＡを調製した。簡潔には、ブロス中で後期対数期まで細胞を増殖させ、そして１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌ Ｄ−シクロセリンで１８時間処理した（Ｃｒａｗｆｏｒｄら， １９７９， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ２４：９７９−８１）。その後、細胞を収集し、そしてＳＤＳで溶解し、そしてプロテイナーゼＫで処理して水性溶液中にＤＮＡを遊離させ、これを過塩素酸ナトリウムおよびフェノール／クロロホルム混合物で２回抽出し、そして約２体積のエタノールを添加した後、溶液からＤＮＡを巻き取った（Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８２）， ｐｐ．２８０−８１および４５８−５９；並びにＭａｒｍｕｒ， １９６１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２０９−１８）。
【００３３】
標的捕捉。一般的に、標的捕捉工程には、試料から調製した溶解物を用いた（米国特許第６，１１０，６７８号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））。標的結核菌ＤＮＡを捕捉するため、混合物は、２５０μｌの調製した試料溶解物、３ｐｍｏｌの配列番号５および３ｐｍｏｌの配列番号６または３ｐｍｏｌの配列番号９を含有する２５０μｌの標的捕捉溶液、並びに固定ポリｄＴ14オリゴマーが付着した４０μｇの常磁性粒子（０．７〜１．０５μ、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）を含んだ（Ｌｕｎｄら， １９８８， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８６１−１０８８０）。標的捕捉混合物を６０℃で約２０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却した。磁場を５分間適用し、反応容器上のある部位に、標的ＤＮＡを含有する付着した複合体と共に、磁気粒子を誘引した（実質的に米国特許第４，８９５，６５０号（Ｗａｎｇ）に記載されるとおり）。洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）１ｍｌに、ハイブリダイゼーション複合体が付着した粒子を再懸濁し、そしてその後、磁気分離工程を反復することによって、粒子を洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【００３４】
増幅。転写仲介増幅は、実質的に先に記載されるように行った（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら））。標的捕捉工程由来の洗浄粒子を７５μｌの増幅試薬溶液（０．０８ｍＭ ｒＵＴＰ、１．３ｍＭ ｒＡＴＰ、４ｍＭ ｒＣＴＰ、６ｍＭ ｒＧＴＰ、各１．３ｍＭ ｄＮＴＰ、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ、１７．３ｍＭ ＭｇＣｌ2）に懸濁した。ｒＵＴＰが比較的低濃度であることが、ｒｐｏＢ標的ＤＮＡの効率よい増幅には重要である。増幅反応には、少なくとも２つの増幅オリゴマー、すなわち少なくとも１つのプロモーター・プライマーおよび第二のプライマーを、通常、最終濃度０．０８μＭで含んだ（増幅オリゴマーはまた、ヘルパーまたは置換体オリゴマーを含むことも可能であり、そして他の増幅試薬を混合物に添加する前に、標的にハイブリダイズさせることが可能である）。反応混合物を不活性油の層（２００μｌ）で覆い、蒸発を防止し、そして４２℃で５分間インキュベーションした。その後、２５μｌの酵素試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮTMＸ−１００）、１２０ｍＭ ＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液中、反応あたり約１７５０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素および４００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を添加した（１単位のＭＭＬＶ逆転写酵素は、２００〜４００μＭオリゴ（ｄＴ）でプライミングされるポリＡテンプレートを用いて、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込み；そして１単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーター配列を含有するＤＮＡテンプレートを用いて、３７℃で１時間に１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに取り込む）。穏やかに混合した後、反応を４２℃で１時間インキュベーションした。陰性対照は、すべて同一の試薬からなったが、試料の代わりに、標的核酸をまったく含有しない、等体積の水または緩衝液を用いた。
【００３５】
検出。いくつかの場合、増幅された結核菌配列は、発光測定装置（例えばＬＥＡＤＥＲTM発光測定装置、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）中で化学発光によって検出する、アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブ（例えば５’−ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡ（配列番号４））を用いて検出し、そして実質的に先に記載されるように（米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）第２５欄第２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：８４２９−８４３８、８４３２ページ）、相対光単位（ＲＬＵ）でシグナルを表す。一般的に、反復アッセイで検出されたＲＬＵの平均を報告する。好ましい態様において、標識検出プローブは、２’−Ｏ−メトキシ主鎖に連結される配列番号４の塩基配列を有する。
【００３６】
他の場合、先に詳細に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４９−５５）、結核菌ｒｐｏＢ配列の検出に特異的なＤＮＡプローブの固定アレイ上で、増幅された配列を検出した。増幅反応で生成された単位複製配列を蛍光標識で標識し、その後、実質的に別の箇所に詳細に記載されるような方法を用いて、アレイにハイブリダイズさせた（ＰＣＴ第ＷＯ ９９／６５９２６号および第ＷＯ ０１／４４５０７号（Ｌａａｙｏｕｎら））。簡潔には、５０μｌの単位複製配列を、３０ｍＭ ＭｎＣｌ2、３０ｍＭイミダゾール、２ｍＭの５−（ブロモメチル）フルオレセインおよび水（最終体積１５０μｌ）と混合した。６５℃で３０分間インキュベーションした後、カラムクロマトグラフィーによって（例えば、製造者の指示にしたがって、６Ｓ ＱＩＡＶＡＣ（登録商標）カラム、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨを使用して）、遊離標識を除去した。
【００３７】
プローブアレイのハイブリダイゼーションは、実質的に先に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４９−５５）、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM液体ステーション（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて行った。別の箇所に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０６（Ｌａａｙｏｕｎら））、さらなる工程、抗体染色によって、シグナル増幅が可能になる。簡潔には、Ｔｒｏｅｓｃｈらのプロトコルを用いて、ＤＮＡＣＨＩＰTM上でハイブリダイゼーションを行った後、ＤＮＡＣＨＩＰTMを洗い流し（ｆｌｕｓｈ）、そして３００μｌの２Ｍ ＭＥＳ、２．４μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、６μｌの正常ヤギＩｇＧ、１．２μｌの抗フルオレセイン抗体、および水（最終体積６００μｌ）を含有する染色溶液を用いて、染色の第二の工程を行った。抗フルオレセイン、ウサギＩｇＧ分画、ビオチン−ＸＸコンジュゲートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）に供給され；アセチル化ＢＳＡ溶液は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）に供給され；そしてヤギＩｇＧ（試薬等級）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミズーリ州セントルイス）に供給された。１０分間のハイブリダイゼーション後、チップを洗い流し、６ｘＳＳＰＥ、０．０１％ポリオキシエチレンソルビタン（ＴＷＥＥＮTM２０）を含有する洗浄緩衝液で洗浄し、そして３００μｌの２Ｍ ＭＥＳ、６μｌのＢＳＡおよび６μｌのストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート、並びに水（最終体積６００μｌ）の第二の染色溶液を用いて、第三のハイブリダイゼーション工程を行った。ストレプトアビジンおよびＲ−フィコエリトリン・コンジュゲートはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）に供給された。１０分間のハイブリダイゼーション後、チップを洗い流し、そして上述の洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ＧＥＮＥＣＨＩＰTM計測系（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）上で、ハイブリダイゼーションアレイ上の蛍光シグナル（相対蛍光単位またはＲＦＵとして表す）の強度およびパターンを検出する解析を行った。この系は、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM液体ステーション、ＧＥＮＥＡＲＲＡＹTMスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、カリフォルニア州パロアルト）およびＧＥＮＥＣＨＩＰTM解析ソフトウェア、すなわち、ヌクレオチド・ベースコーリングを決定し、そして増幅された核酸に存在する核酸配列を決定するアルゴリズムを含んでなる。この系は、チップに適用された、増幅された核酸配列に存在するｒｐｏＢ突然変異のレポートを生成する。
【００３８】
以下の実施例は、本発明の態様を示す。
【実施例１】
【００３９】
実施例１： 結核菌特異的オリゴヌクレオチドを用いた転写仲介増幅の感度
本実施例は、ＴＭＡ反応で用いた際の、本発明の増幅オリゴヌクレオチドの感度を示す。結核菌を特異的に増幅し、そして他のミコバクテリウム属種を増幅しないように、プライマーを設計した。上述の標的捕捉および増幅法を用い、以下の組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドを用いて、転写仲介増幅の効率を試験した：ヘルパーオリゴマーとして配列番号１（ＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧ）、プロモーター・プライマーとして配列番号２（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＴＧ）、およびプライマーとして配列番号３（ＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧ）。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応あたり、２０、２００または１０3コピーで提供した、精製ｇＤＮＡであった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌ＤＮＡをまったく含有しない等体積の水をｇＤＮＡ試料の代わりに用いた。増幅は、実質的に別の箇所に詳細に記載されるように行った均質検出アッセイ（米国特許第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら））を用いて、検出された化学発光（ＲＬＵ）に基づいて評価した。配列番号４（ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡ）のＡＥ標識検出プローブを同一配列の非標識プローブと混合し（標識プローブ／非標識プローブの比は１／５０００であった）、ＬＥＡＤＥＲTM発光測定装置（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）によって検出可能な直線範囲内のシグナルを提供した。２ｘ１０4以上のＲＬＵシグナルを陽性とみなした。ＲＬＵ結果（各アッセイ条件に関して１０アッセイの平均）を表１に示す。
【００４０】
表１に示す結果は、増幅反応がｇＤＮＡ２０コピー程度に少なくても感受性であり、通常は少なくとも１０００細菌を含有する臨床塗沫陽性標本の望ましい感度より感度が高いレベルであったことを立証する。
【００４１】
表１
【００４２】
【表１】
【００４３】
他の実験において、同様に、しかしヘルパーオリゴマーとして配列番号１、プロモーター・プライマーとして配列番号２、およびプライマーとして配列番号８（ＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧ）の増幅オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ｒｐｏＢ領域を増幅した。これらの実験におけるアッセイ感度は、ＡＥ標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出すると、反応あたり、少なくとも標的約２００コピーであった。これらの実験では、反応あたり８００、５００および２００コピーで標的を提供した（各条件に関して５反応）。すべての反応は、反応中に結核菌ＤＮＡがない陰性対照（２反応に関して、１．９３ｘ１０3平均ＲＬＵを生じた）に比較して、陽性結果（７．８８ｘ１０5〜２．６６ｘ１０6平均ＲＬＵ）を生じた。
【実施例２】
【００４４】
実施例２： 増幅の特異性
本実施例は、実質的に実施例１および上記に記載するような増幅オリゴマーおよび方法を用いて行うＴＭＡ反応を用いて立証されるような、本発明の増幅オリゴマーの特異性を示す。このアッセイの標的配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」、バージニア州マナサス）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨカルチャー・コレクション（「ＤＳＭ」、ドイツ・ブラウンシュワイク）から得て、そして標準的微生物学的方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細菌から抽出した、精製ミコバクテリウムｇＤＮＡであった。試験した種には：結核菌（ＡＴＣＣ寄託番号２７２９４）、Ｍ．カンサシ（Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＤＳＭ寄託番号４３２２４）、鳥型結核菌（Ｍ． ａｖｉｕｍ）（ＡＴＣＣ寄託番号２５２９１）、およびＭ．ゴルドネ（Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ）（ＡＴＣＣ寄託番号１４４７０）が含まれた。増幅反応において、アッセイあたり２００、１０3、１０4、１０5、および１０6コピーの標的ＤＮＡを提供した。陰性対照反応は、ミコバクテリウムＤＮＡをまったく含有しなかった（すなわち試料体積の代わりに等体積の水を用いた）。
【００４５】
増幅された核酸を検出するため、未希釈の標識プローブを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、標識プローブを用いた均質検出アッセイを用いた。これらのアッセイから得た平均ＲＬＵ結果（種ＤＮＡあたり４アッセイ）を表２に示す。これらに関しては、５ｘ１０4ＲＬＵ以上のシグナルを陽性とみなした。
【００４６】
表２
【００４７】
【表２】
【００４８】
表２の結果によって示されるように、該アッセイは、反応において２００コピーの結核菌ＤＮＡを増幅し、そして検出した。アッセイした他のミコバクテリウム属種のすべてに関しては、はるかにより多くの標的ＤＮＡ（反応あたり１０3〜１０5コピー）を用いた場合でさえ、結果は陰性であった。したがって、これらの増幅オリゴマーおよびプローブを用いた際の結核菌に対する特異性は、より多くのＤＮＡを提供した場合でさえ、他のミコバクテリウム属種に関して、最小限の検出可能シグナルしか得られないことによって立証された。
【００４９】
直前に記載するのと同一の増幅法を用いて、ＤＮＡプローブアレイ上でも単位複製配列を検出した。実質的に先に記載されるような方法（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０７号（Ｌａａｙｏｕｎら））を用いて、単位複製配列を化学的に断片化し、そして蛍光的に標識した。上述のように、結核菌配列を検出するため、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM系を用いて、ＤＮＡプローブアレイ上で標識断片を検出した。
【００５０】
試験した各種に関して、表３に示す結果は、結核菌の診断に用いる、あらかじめ決定した配列を同定するのに用いた、正しいベースコーリングの割合を示す。すなわち、表３に列挙されるミコバクテリウム属種の各々由来の試料ＤＮＡから得た単位複製配列に関して、結核菌特異的ＤＮＡプローブチップ上の正しいベースコーリングの相対量と、検出されたシグナルの平均シグナル強度（平均相対蛍光単位またはＲＦＵ）を示す。８５％を超えるベースコーリング結果を、結核菌配列の陽性同定とみなす。
【００５１】
このプローブアレイ検出系で得た結果によって、上で論じた均質検出アッセイで得た標識プローブ検出結果が確認され、そして増幅が結核菌に特異的であることがさらに確認された。
【００５２】
表３
【００５３】
【表３】
【実施例３】
【００５４】
実施例３： 突然変異体クローンの検出
本実施例は、標的捕捉、増幅および検出後のｒｐｏＢ配列の検出を示す。均質検出アッセイにおいて標識プローブ結合を用いることによって、そして実質的に実施例２に記載するように、ＤＮＡプローブアレイに標識単位複製配列を結合させることによって、検出を行った。検出のため、各クローンに関する同一増幅反応を２つの部分に分けた。
【００５５】
Ｔｒｏｅｓｃｈら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９９， ３７：４９−５５）に記載される方法を用いて、ＰＣＲによって増幅され、そしてプラスミドベクター（ｐＧＥＭTM−Ｔ ＥＡＳＹ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に連結された、約７００ｂｐの断片に含有される、クローニングされたｒｐｏＢ配列から、検出しようとする細菌ｒｐｏＢクローンを生成した。ＤＮＡ配列決定によって、挿入配列を性質決定した。既知の突然変異を含有するこれらのクローンを、次に、上述の方法を用いた標的捕捉、増幅および検出のための結核菌標的配列として利用した。
【００５６】
表４に示した結果では、クローニングしたｒｐｏＢ配列中で検出される突然変異は、Ｔｒｏｅｓｃｈら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９９， ３７：４９−５５）に記載されるように、アミノ酸置換（１文字暗号）およびコドンの位置によって特定される。例えば、「Ｑ５１３Ｌ」は、突然変異が、最初のコドンから５１３の位に影響を与え、この位は野生型株ではグルタミン（Ｑ）を有するが、この突然変異体ではロイシン（Ｌ）置換を有することを意味する。表４の第１列は、クローニングされた挿入物の独立した配列決定に基づく、予期される配列を示し、そして第２列は、ＤＮＡプローブアレイへの単位複製配列のハイブリダイゼーションによって決定された結果を示す。各クローンのプローブアレイに関して観察された、ベースコーリングの割合（ＢＣ％）およびシグナル強度（ＲＦＵ）を、それぞれ第３列および第４列に示す。表４の最終列は、上述のように、ＡＥ標識プローブへのハイブリダイゼーションによって決定され、そして相対光単位（ＲＬＵ）として検出されるような、１つのアッセイにおいて各クローンに関して得られる結核菌単位複製配列の相対量を示す。表４の結果は、増幅および検出法の結果、結核菌突然変異体のｒｐｏＢ配列で生じる、異なる変動が、正しく同定されることを示す。
【００５７】
表４
【００５８】
【表４】
【実施例４】
【００５９】
実施例４： 臨床標本における結核菌の検出
本実施例は、野生型結核菌を含有する臨床試料のＴＭＡ増幅および増幅されたＲＮＡの検出に用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。実質的に実施例１に記載されるように、増幅を行った。均質検出アッセイにおいて、固定プローブのアレイを有する固体支持体（ＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で、そして標識プローブを用いることによって、実質的に実施例２に記載するように、単位複製配列を検出した。
【００６０】
試料を消化し、そして汚染除去した後、痰（すなわち臨床標本）から結核菌（野生型）の陽性沈降物を得た。ミコバクテリウム培養のため受け取った標本は大部分、多様な量の有機破片および多様な汚染、正常、または一過性細菌フロラを含有する。化学的汚染除去法は、汚染菌を殺し、一方、ミコバクテリウムの回復を可能にする。用いた消化および汚染除去法は、標準的Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−２％水酸化ナトリウム（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ）法であった（Ｋｅｎｔら， １９８５， Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． 米国保険社会福祉省、疾病対策予防センター、ジョージア州アトランタ）。ＮＡＬＣは、粘液溶解（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ）剤として作用して、標本の液化を確実にし、そして水酸化ナトリウムは汚染除去剤である。ミコバクテリウム培養の通常の臨床的分類に基づいて、塗沫強度を決定し、ここで「１＋」は低陽性を意味し、そして「４＋」は高陽性を意味する。
【００６１】
１２標本に関して得た結果を表５に要約する。結果は、標識プローブを用いた均質検出アッセイで得たプローブ検出結果（単一アッセイＲＬＵ結果、第３列）およびＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーション後に得た結果（第４列、ＢＣ％、および第５列、シグナル強度）と比較した、各標本の塗沫強度（第２列）を示す。
【００６２】
表５
【００６３】
【表５】
【００６４】
表５に示す結果は、臨床標本を用いた増幅の効率を立証する。試験したすべての沈降物に関して、標識プローブ検出結果（ＲＬＵ）は、陰性対照（未提示）に比較して、すべて陽性であり、そしてＤＮＡプローブアレイ検出結果は、同様に陽性であった。プローブアレイ解析において、試験した沈降物はすべて、野生型結核菌として検出された。
【実施例５】
【００６５】
実施例５： ＰＣＲ増幅および単位複製配列の検出
本実施例は、別の増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。固定プローブのアレイを有する固体支持体（すなわちＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で、増幅後に得たＤＮＡを検出した。標的調製のため、標準的微生物学的方法を用いて、野生型結核菌（ＡＴＣＣ寄託番号２７１７７）をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。水中で細菌ストック懸濁物を作成し、そしてｍｌあたり約６ｘ１０8細菌の濃度に調整した。水中の連続希釈を作成して、μｌあたり１０4細菌（μｌあたり１０4コピーの細菌ＤＮＡと同等）の濃度を産生し、これをその後、９５℃で１５分間加熱することによって不活性化した。
【００６６】
サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＡＳＴ ＳＴＡＲＴTM Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、プラスチック試験管中で、ＰＣＲ増幅を行った。簡潔には、増幅混合物（最終体積５０μｌ）は、５μｌの１０ｘ ａｍｐ緩衝液、０．４μｌのｄＮＴＰ混合物（各２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ）、各１．５μｌの配列番号２および配列番号３のプライマー（１０μＭ）、０．４μｌのＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ）、５μｌの標的（または陰性対照では水）を含有した。自動化サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ ９６００TM）を用いて、熱サイクリングを行い、これは、最初に９５℃４分間の変性工程、次に、各々、９５℃３０秒間、５０℃３０秒間および７２℃４５秒間からなる３５周期、そして７２℃７分間の最終周期であった。
【００６７】
ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミドでの染色によって増幅産物を解析して、増幅されたＤＮＡの１６８ｎｔバンドの存在または欠如を検出した。陰性対照（すなわち標的ＤＮＡなし）では、ゲル上に見えるバンドはなかった。反応に１０4コピー以上の標的を用いた際、ＤＮＡバンドが見られた。
【００６８】
次に、実質的に先に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７（１）：４９−５５）、ＤＮＡプローブアレイ（ＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で増幅産物を検出した。プロモーターでタグ付けしたＰＣＲ単位複製配列を用いて、各々、およそ５０ｎｇのＰＣＲ産物、２０ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ Ｍｇ（アセテート）2、１０ｍＭジチオスレイトール、各１．２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰを含有し、そして３７℃で１時間インキュベーションする、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（２０μｌ）によって、一本鎖ＲＮＡ標的を生成した。
【００６９】
実質的に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０７号）、ＲＮＡを蛍光標識し、そして標識ＲＮＡをプローブアレイにハイブリダイズさせ、そして解析した（Ｔｒｏｅｓｃｈら、上記）。ハイブリダイゼーションには、５μｌ標識ＲＮＡを７００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．９０Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、および０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）で希釈し、プローブアレイに適用し、そして４５℃で３０分間インキュベーションした。その後、３ｘＳＳＰＥ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００で、プローブアレイを３０℃で２回洗浄し、そしてアレイに結合した蛍光シグナルを検出した。システムアルゴリズム（ＧＥＮＥＣＨＩＰTMソフトウェア、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いることによって、検出されるシグナル強度（平均、中央値および最大ＲＦＵ）、ヌクレオチド・ベースコーリング％および配列決定を生成した。実験に由来する配列およびアレイ上に存在する参照配列間の相同性パーセントによって、候補選択指数を決定した。この実験から得た結果は、標的１０4コピーでは、９１．９％のベースコーリング、および１０１ＲＦＵのバックグラウンドシグナルに比較される１３１２ＲＦＵのシグナル強度に基づいて、プローブアレイ上で決定される配列が野生型結核菌のものであることを示した。
【実施例６】
【００７０】
実施例６： ｒｐｏＢ（＋）鎖標的の増幅
本実施例は、該アッセイがｒｐｏＢ領域から作成した単位複製配列を増幅し、そして検出することが可能であるが、実施例１に記載した（−）ＤＮＡ鎖増幅と対照的に、（＋）ＤＮＡ鎖から単位複製配列が作成されることを示す。実施例１におけるのと実質的に同一の増幅条件を用いて、（＋）鎖増幅反応で用いた増幅オリゴヌクレオチドは：プロモーター・プライマーとして配列番号１０（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＣ）、およびプライマーとして配列番号１１（ＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧ）であった。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そして増幅反応あたり５ｘ１０3コピーで提供する精製ｇＤＮＡ、またはブロス培養で増殖させ、増幅反応あたり約５ｘ１０3コピーで提供する超音波処理結核菌細胞の未精製溶解物であった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌ＤＮＡをまったく含有しない等体積の水をＤＮＡ含有試料の代わりに用いた。実質的に上述のように行うが、配列番号１２（ＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧ）のＡＥ標識検出プローブを用いる、均質検出アッセイ後に検出された化学発光（ＲＬＵ）に基づいて、増幅を評価した。精製ｇＤＮＡおよび未精製溶解試料両方に関して、陽性シグナルを検出した。精製ｇＤＮＡ標的を用いた２回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは５．６６ｘ１０6ＲＬＵであり、そして未精製溶解物ＤＮＡ標的を用いた５回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは５．２５ｘ１０6ＲＬＵであった。陰性対照（２回の反復アッセイ）は６．１５ｘ１０2ＲＬＵを生じた。これらの結果は、アッセイが、増幅される結核菌ＤＮＡの鎖と独立にｒｐｏＢ配列を特異的に検出可能であることを示す。
【０００１】
発明の分野
本発明は、病原性細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検出に関し、そして特に、ｒｐｏＢ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅および増幅された産物の検出を用いることによって、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のリファンピン耐性と関連する核酸配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リファンピン（ＲＩＦ）はリファマイシンＢから合成された抗生物質であり、結核菌に対する薬剤療法の重要な構成要素である。リファンピンは、原核ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニット上に、特有の作用部位を有する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子（ｒｐｏＢ）の中央領域にミスセンス突然変異および短い欠失が起こると、リファンピンに耐性な株が生じる（Ｌｉｓｉｔｙｎら， １９８４， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９６：１７３−１７４）。同様に、結核菌において、リファンピン耐性を与える、ｒｐｏＢ遺伝子中の非常に多様な突然変異が同定されてきている（Ｔｅｌｅｎｔｉら， １９９３， Ｌａｎｃｅｔ ３４１：６４７−６５０）。９０％を超えるリファンピン耐性結核菌単離体はまた、イソニアジドにも耐性であり、そしてしたがって、リファンピン耐性は、多剤耐性の有用な代理マーカーである。したがって、感染個体の適切な治療につながる診断のため、リファンピン耐性の遺伝的基礎を迅速に検出可能な試験に関する必要性がある。
【０００３】
適切な治療には、そして耐性株の蔓延を防ぐには、臨床的結核菌単離体の薬剤耐性を早期に検出することが重要である。固形培地上の結核菌の増殖によって薬剤耐性を検出する慣用法、およびより最近の、液体培地中の増殖に頼る方法は、３日〜４週間以上掛けて、感受性結果を提供してきた（Ｒｕｓｃｈ−Ｇｅｒｄｅｓら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４５−４８）。
【０００４】
リファンピン耐性を検出するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に頼る遺伝的技術が考案されてきている。こうした技術には、ＰＣＲ産物の直接配列決定、一本鎖コンホメーション多型解析、ヘテロ二重鎖形成およびジデオキシ・フィンガープリンティングが含まれる（Ｔｅｌｅｎｔｉら， １９９３， Ｌａｎｃｅｔ ３４２：８４１−８４４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９９４， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３８：２３８０−２３８６；Ｄｅ Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒ， １９９５， Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ７６：４２５−４３０）。結核菌単離体におけるリファンピン耐性を検出するか、またはｒｐｏＢ遺伝子を用いてミコバクテリウム属種を同定するための他のアッセイおよび試薬が先に開示されてきており、例えば米国特許第５，６４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇら）、第５，８５１，７６３号（Ｈｅｙｍら）、第６，２２８，５７５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）、および第６，２４２，５８４号（Ｋｏｏｋら）に開示されてきている。
【０００５】
本発明は、臨床試料に存在する可能性がある結核菌中のリファンピン耐性を検出する組成物および単純な診断法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明の１つの側面にしたがって、生物学的試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する方法を提供する。該方法は、ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を含んでなる結核菌由来の核酸を含有する生物学的試料を提供し；少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号１〜配列番号３、配列番号８、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を有する少なくとも２つのプライマーを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物において、結核菌ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を増幅して、増幅された結核菌核酸を産生し；そして増幅された結核菌核酸と関連する標識を検出することによって、増幅された結核菌核酸を検出する工程を含む。１つの態様において、該方法はまた、結核菌ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチド、および捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定核酸を、ハイブリダイズ条件下で、生物学的試料に添加して、結核菌ＤＮＡ配列、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定核酸を含んでなるハイブリダイゼーション複合体を産生し；そして増幅工程前に、生物学的試料の他の構成要素からハイブリダイゼーション複合体を分離する工程も含む。いくつかの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブを用いる。１つの態様において、検出工程は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識検出プローブを用い、一方、別の態様は、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、複数の検出プローブを用いる。１つの態様において、増幅工程は、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーの組み合わせを用い、ここで第一のプライマーは配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号３の配列を有するか；第一のプライマーは配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号８の配列を有するか；または第一のプライマーは配列番号１０の配列を有し、そして第二のプライマーは配列番号１１の配列を有する。
【０００７】
本発明の別の側面は、結核菌のｒｐｏＢ配列を検出するための組成物であって、配列番号１〜配列番号６および配列番号８〜配列番号１２からなる群より選択される配列を有する、１以上のオリゴヌクレオチドを含んでなる、前記組成物を提供する。１つの態様において、組成物は、配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４〜配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含んでなる。別の態様において、組成物は、配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、配列番号４の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号５、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第三のオリゴヌクレオチドを含んでなる。組成物の１つの態様は、配列番号１０および配列番号１１のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１２の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含んでなる。本発明の別の態様は、前述のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの組み合わせのいずれかを含有するキットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
詳細な説明
本発明は、ヒト由来の生物学的試料、好ましくはプロセシングした痰試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する方法を含む。本発明はまた、生物学的試料に存在する結核菌配列に特異的にハイブリダイズし、それによって試料構成要素から標的配列を捕捉する手段を提供する核酸捕捉オリゴマー、ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列の選択した部分を特異的に増幅する核酸増幅オリゴマー（またはプライマー）、およびこうした増幅された配列を検出する核酸プローブオリゴマー（または検出プローブ）を含む組成物も含む。
【０００９】
本発明の核酸配列は、生物学的試料に存在する結核菌のｒｐｏＢ遺伝子を捕捉し、増幅し、そして該遺伝子の突然変異を検出するのに有用である。本発明の方法は、結核菌感染患者の適切な治療を決定するのに有用な情報を臨床医に提供することによって、結核菌の薬剤耐性表現型の診断に重要である。
【００１０】
以下の定義は、記載する発明の理解を補助するために提供する。
「生物学的試料」によって、結核菌核酸を含有する可能性がある、生存しているまたは死亡したヒト由来の組織または材料いずれかを意味する。試料には、例えば、痰、呼吸組織または滲出物、末梢血、血漿または血清、子宮頚スワブ試料、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。試料にはまた、細菌培養（液体または固形培地由来）および環境試料も含まれる。生物学的試料を処理して、物理的に組織または細胞構造を破壊し、こうして、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有可能な溶液中に、細胞内構成要素を遊離させて、解析用の試料を調製するのに用いることが可能である。
【００１１】
「核酸」によって、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を有し、主鎖構造を介して共有結合されて、ポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなる多量体化合物を意味する。この用語には、慣用的なＲＮＡ、ＤＮＡ、並びにＲＮＡおよびＤＮＡの類似体が含まれる。核酸の主鎖は、既知の多様な連結を含んでなることが可能であり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（「ペプチド核酸」；ＰＣＴ第ＷＯ ９５／３２３０５号（Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら））、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、または既知の連結の組み合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシおよび／または２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であることが可能である。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、既知の塩基類似体（例えばイノシン；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら監修， 第１１版， １９９２を参照されたい）、あるいはプリンまたはピリミジン塩基類の既知の誘導体（ＰＣＴ第ＷＯ ９３／１３１２１号（Ｃｏｏｋ））および１以上の残基に関して、主鎖に窒素性塩基が含まれない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（米国特許第５，５８５，４８１号（Ａｒｎｏｌｄら））であることが可能である。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、あるいは慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の類似体を含む核酸）を含むことが可能である。
【００１２】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」によって、一般的に１，０００残基未満を有する核酸を意味し、約２〜５ヌクレオチド残基の下限および約５００〜９００ヌクレオチド残基の上限を有するサイズ範囲にある核酸が含まれる。オリゴマーは、約５〜約１５残基の下限および約５０〜６００残基の上限を有するサイズ範囲に；そして好ましくは、約１０残基の下限および約１００残基の上限を有するサイズ範囲にあることが可能である。オリゴマーは、天然供給源から精製可能であるが、一般的には、公知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する。
【００１３】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」によって、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを意味する。これらは、３’端にヌクレオチド単量体を付加する酵素活性によって、テンプレートからの重合を開始するため、「プライマー」と称することが可能である。増幅オリゴヌクレオチドは、一般的に、標的核酸配列（またはその相補鎖）のある領域に相補的である、少なくとも１０〜１２の隣接塩基を含有する。隣接塩基は、増幅オリゴヌクレオチドが結合する配列に、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ約１０〜約６０塩基であり、そして修飾ヌクレオチド、塩基類似体またはさらなる機能配列、例えばＲＮＡポリメラーゼに認識される５’プロモーター配列を含む（こうした増幅オリゴヌクレオチドは「プロモーター・プライマー」と称することが可能である）ことが可能である。
【００１４】
当業者は、プライマーとして機能可能なオリゴマーはいずれも、５’プロモーター配列を含み、そしてしたがってプロモーター・プライマーとして機能するよう修飾することが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター・プライマーも、そのプロモーター配列と独立に、プライマーとして作用することが可能である。
【００１５】
「増幅」によって、多コピーの標的核酸配列あるいはその相補体または断片を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を意味する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅は、完全標的領域配列またはその相補体より少ない配列を含有することが可能な、増幅された核酸の産生を指す。既知の増幅法には、例えば、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱベータ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを用いる（米国特許第４，７８６，６００号（Ｋｒａｍｅｒら）および第５，１１２，７３４号（Ｌｉｚａｒｄｉら））。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常、２以上のプライマーと共に、熱反復を用いて、多コピーの２つの相補ＤＮＡ鎖を合成する（Ｍｕｌｌｉｓら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５５：３３５−３５０；米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら））。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の多数の周期を用いることにより、標的およびその相補鎖を増幅する（ＥＰ特許第０３２０３０８号（Ｗａｎｇら））。ＳＤＡは、標的配列が含まれる半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを形成するであろう制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、一連のプライマー伸長および鎖置換工程が続いてＤＮＡを増幅する（米国特許第５，４２２，２５２号（Ｗａｌｋｅｒら））。本発明の好ましい態様では、転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる。当業者は、プライマー伸長に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法いずれでも、本発明のオリゴヌクレオチド配列を容易に使用可能であることを理解するであろう。
【００１６】
「転写仲介増幅」または「転写関連増幅」によって、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する、核酸増幅を意味する。ＴＭＡは、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、並びにプロモーター・プライマーおよび第二のプライマーを用い、そして場合によって、１以上のさらなるオリゴヌクレオチド（ときに「ヘルパー」または「置換体（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）」オリゴヌクレオチドと呼ばれる）を含むことが可能である。これらの増幅法は、別の箇所に詳細に記載されるように、当該技術分野に公知である（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）、米国特許第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）、ＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号（Ｋａｃｉａｎら）；米国特許第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）；ＰＣＴ第ＷＯ ８８／０１３０２号および第ＷＯ ８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）；米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）；ＰＣＴ第ＷＯ ９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）；およびＰＣＴ第ＷＯ ９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒら））。好ましいＴＭＡ法が、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号および第５，７８６，１８３号、およびＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号に開示されている。
【００１７】
「プローブ」によって、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸またはその相補体において、好ましくは増幅された核酸において、標的配列に特異的にハイブリダイズし、それによって、標的または増幅された核酸の検出を可能にする、核酸オリゴマーを意味する。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅された核酸に直接ハイブリダイズしているプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅された核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズしているプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合形成（すなわち塩基対形成）によって、プローブ配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列中の配列（すなわちサブセット）を指す。「十分に相補的な」配列は、２つの配列が完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。プローブは、当該技術分野に公知の、使用する検出法にしたがって、標識されていても、標識されていなくてもよい。
【００１８】
「十分に相補的な」によって、ハイブリダイゼーション条件下で、一連の相補塩基間の水素結合形成により、別の塩基配列とハイブリダイズする、隣接核酸塩基配列を意味する。配列は、標準的塩基対形成（すなわちＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）を用いて、配列中の各位で相補的であることが可能であるし、または標準的水素結合形成によっては相補的でない１以上の残基（無塩基性残基が含まれる）を含有することが可能であるが、この場合、適切なハイブリダイゼーション条件下で、塩基配列全体が別の塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能である。隣接塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズする配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、配列組成および条件に基づいて、容易に予測可能であるか、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７）。
【００１９】
「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」または「捕捉プローブ」によって、塩基対ハイブリダイゼーションに基づいて、標的配列および固定オリゴマーを特異的に連結する手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴマーを意味する（米国特許第６，１１０，６７８号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））。一般的に、捕捉オリゴマーには２つの結合領域：標的特異的結合領域および固定プローブ特異的結合領域が含まれる。
【００２０】
「固定プローブ」または「固定オリゴマー」によって、捕捉オリゴマーを固体支持体に直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定プローブは、固体支持体に連結されたオリゴヌクレオチドであり、結合した標的配列を他の試料構成要素から分離する手段を提供する。適切な固体支持体には、既知の材料いずれか（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび金属粒子、好ましくは常磁性粒子）で作成したマトリックスおよび溶液中の粒子が含まれる。好ましい支持体は、固定プローブが直接（例えば直接共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介して）、または間接的に（例えば１以上のリンカーとのハイブリダイゼーションを介して）安定して連結され、こうして溶液中の別の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする、単分散常磁性球体（すなわち±約５％でサイズが均一）である。
【００２１】
「分離」または「精製」によって、生物学的試料の１以上の構成要素を他の試料構成要素から取り除くことを意味する。試料構成要素は、一般的に、核酸および他の成分（例えばタンパク質、炭水化物、脂質および／または核酸）を含む、水性溶液である。分離または精製工程は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の他の試料構成要素を取り除く。
【００２２】
「標識」によって、検出可能であるか、または検出可能な反応を導くことが可能な分子部分または化合物を意味する。標識は、核酸プローブに、または検出しようとする核酸（例えば増幅された核酸）に直接または間接的に連結する。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて（例えば共有結合または非共有相互作用を介して）生じることが可能である。間接的標識は、直接または間接的いずれかで標識されている、さらなるオリゴヌクレオチド（類）などの、架橋部分またはリンカーの使用を通じて生じることが可能である。架橋部分を用いて、検出可能シグナルを増幅することが可能である。標識は、既知の検出可能部分いずれか（例えば放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、発色団、例えば色素または有色粒子、生物発光、燐光、化学発光および蛍光化合物を含む発光化合物）であることが可能である。好ましくは、標識プローブ上の標識は、均質アッセイ系で検出可能である（すなわち、混合物において、非結合標識プローブに比較して、結合した標識プローブが検出可能な変化を示す）。均質検出アッセイにおいて好ましい化学発光標識およびその使用が詳細に記載されてきている（米国特許第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら））である。こうした標識にはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体が含まれる。均質検出可能標識は、非ハイブリダイズ標識または標識プローブから、ハイブリダイズした標識を物理的に分離することなく検出可能であるという利点を有する。核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；米国特許第５，７３１，１４８号（Ｂｅｃｋｅｒら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎら）、第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．ら）、および第４，５８１，３３３号（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら））。
【００２３】
「ＤＮＡプローブアレイ」によって、少なくとも２、そして好ましくは１０以上の異なる捕捉オリゴヌクレオチドが固定されている、固体支持体を意味する。こうしたＤＮＡプローブアレイの例は、当該技術分野に公知である（Ｒａｍｓａｙ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４０−４４；Ｃｈｅｎｇら， １９９６， Ｍｏｌｅｃ． ｄｉａｇｎｏｓｉｓ １（３）：１８３−２００；Ｌｉｖａｃｈｅら， １９９４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２（１５）：２９１５−２９２１；Ｃｈｅｎｇら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：５４１−５４６；米国特許第４，９８１，７８３号（Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ）、第５，７００，６３７号（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、第５，４４５，９３４号および第５，７４４，３０５号（Ｆｏｄｏｒ）、および第５，８０７，５２２号（Ｂｒｏｗｎ））。
【００２４】
「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる構成要素（類）、組成物（類）または方法工程（類）が、本発明の組成物、キットまたは方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、生物学的試料において、試料あたり約２０〜２００コピー以上で、結核菌のｒｐｏＢ配列を検出する能力が含まれる。本発明の基本的な特性に実質的な影響を有する、いかなる構成要素、組成物または方法工程も、この用語の外に属するであろう。
【００２５】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。一般的な定義は、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク）またはＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， １９９１， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ニューヨーク州ニューヨーク）に提供される。別に言及しない限り、本明細書に使用されるかまたは意図される技術は、当該技術分野で公知の標準法である。
【００２６】
本発明には、ヒト生物学的試料中の結核菌ｒｐｏＢ核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよびプローブ）および方法が含まれる。こうした使用に適したＤＮＡ配列を選択するため、同一または同様の配列領域をマッチングすることによって、公的にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な、既知の突然変異を含む、異なるミコバクテリウム属単離体由来の既知のｒｐｏＢ配列を並列させ、そして公知の分子生物学的技術を用いて比較した。アルゴリズムの使用は、配列比較を容易にすることが可能であるが、当業者は、手で、そして視覚的に、容易にこうした比較を行うことが可能である。一般的に、ｒｐｏＢ領域の結核菌核酸配列の捕捉および増幅、並びに増幅された配列の検出に使用するのに適した合成オリゴマーを設計する基礎として、比較配列間で、相対的に少数の変動を含有する配列部分を選択した。オリゴマーを設計する際の他の検討材料には、配列のＴｍに影響を与える相対的ＧＣ含量および配列内の予測される二次構造の相対的欠如が含まれ、これらはすべて当該技術分野に公知であった。これらの解析に基づいて、配列番号１〜配列番号６および配列番号８〜配列番号１２の配列を有するオリゴマーを設計し、そして合成した。
【００２７】
標的捕捉を含んで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅前に標的核酸の濃度または純度を増加させることが可能である。好ましくは、標的捕捉は、別の箇所に詳細に記載されるように（米国特許第６，１１０，６７８号およびＰＣＴ第ＷＯ ９８／５０５８３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））、標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を単離する、比較的単純な方法を伴う。簡潔には、結核菌ＤＮＡを含有する可能性がある試料を、結核菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含有する捕捉オリゴマー、および捕捉オリゴマーの別の部分にハイブリダイズ可能な、固体支持体に付着する固定オリゴヌクレオチドと、適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる。結核菌ＤＮＡに、そしてその後、固定オリゴヌクレオチドに、捕捉オリゴマーをハイブリダイズさせた後、固体支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料構成要素から分離する。その後、固体支持体に連結された結核菌標的核酸を洗浄し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応において、ｒｐｏＢ配列を増幅する。
【００２８】
捕捉オリゴマー配列には、結核菌ＤＮＡ標的配列に特異的に結合する５’標的結合配列、および固体支持体上の相補固定配列（例えばポリｄＴ）に結合する３’テール配列（例えばポリｄＡ）が含まれる。捕捉オリゴマーは、標準的デオキシリボース−リン酸連結およびＯ−メトキシ連結を含めて、塩基配列を連結する、いかなる主鎖を用いることも可能である。好ましい捕捉オリゴマーは：ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴ（Ａ）30（配列番号５）、ＣＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＣ（Ａ）30（配列番号６）、およびＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＣＡＣ（Ａ）30（配列番号９）の配列を有する。
【００２９】
捕捉されたｒｐｏＢ領域の増幅は、多様な既知の核酸増幅反応を用いて達成可能であるが、好ましくは転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる。こうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法を用いると、標的核酸の単一コピーから多数の核酸鎖が産生され、したがって、増幅されたｒｐｏＢ配列を１以上の検出プローブに特異的に結合させることによって、標的の検出が可能になる。ＴＭＡは先に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら））。簡潔には、この増幅法は、溶液中で、２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有する「プロモーター・プライマー」）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに適切な塩および緩衝剤を使用して、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。まず、プロモーター・プライマーがその標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして逆転写酵素がプロモーター・プライマーの３’端からの伸長によって、第一鎖ＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡは、相補鎖を分解する酵素活性（例えば逆転写酵素のＲＮアーゼＨ活性）によって、または二重鎖の局所もしくは完全変性によって、第二のプライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能になる。第二のプライマーがｃＤＮＡに結合し、そして逆転写酵素を用いて、第二のプライマーの３’端からＤＮＡの新規鎖が合成されて、一端に機能するプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡが生成される。ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖プロモーター配列に結合し、そして転写によって、多数の転写物または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」が生じる。単位複製配列は、方法のさらなる工程で用いられ、各々、上述のような複製の新規周期のテンプレートとして働き、こうして、実質的に等温の方法で、多量の増幅された一本鎖核酸を生成する。例えば、単一テンプレートから、約１００〜約３，０００コピーのＲＮＡ転写物が合成される。
【００３０】
プライマー配列（例えば配列番号１〜配列番号３および配列番号８、配列番号１０および配列番号１１）は、ｒｐｏＢ標的配列またはその相補体に特異的に結合するが、こうしたプライマー配列は、標的配列またはその相補体に結合しない配列を含有することが可能である。例えば、プロモーター・プライマー（例えば配列番号２、配列番号１０）は、配列の５’部分として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号７）を含むことが可能である。
【００３１】
本発明の態様を、以下の実施例に記載する。簡潔には、方法は、標的結核菌ｒｐｏＢ遺伝子を含有する可能性がある生物学的試料を提供し、ｒｐｏＢ配列を含有するＤＮＡを標的捕捉し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を増幅し、そして増幅された核酸産物を検出して、増幅された核酸中にｒｐｏＢ突然変異が存在するかどうかを決定する工程を含む。ｒｐｏＢ突然変異が検出されたら、これはアッセイした試料がＲＩＦ耐性結核菌を含有したことを示す。転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる好ましい態様において、増幅混合物には、捕捉された標的ＤＮＡ、標的特異的配列およびＴ７プロモーター配列を含む少なくとも１つのＴ７プロモーター・プライマー、Ｔ７プロモーター・プライマーを用いて標的から作成された第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの第二のプライマー、並びに逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる酵素重合の基質および補助因子が含まれる。捕捉された標的は、ＴＭＡ反応に使用するために固体支持体から分離する必要はない。機能するＴ７プロモーター配列をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせると、多数の転写物が生じ、１以上の相補プローブ配列に、増幅された産物またはその一部を特異的にハイブリダイズさせることを含む、多様な既知の方法のいずれかを用いて、この転写物を検出することが可能である。いくつかの態様において、標識プローブを用いて増幅された産物を検出し、一方、他の態様においては、増幅された産物を標識し、そして固定プローブに、好ましくは多くのプローブのアレイにハイブリダイズさせる。プローブおよび増幅された産物のハイブリダイゼーション複合体を検出する。異なるプローブのアレイを用いる場合、アレイ上のハイブリダイゼーションパターンは、増幅されたｒｐｏＢ遺伝子の配列を示し、これは、結核菌のｒｐｏＢ突然変異がアッセイした試料に存在するかどうかに関する情報を提供する。
【００３２】
試料調製。試料（例えば０．５ｍｌの痰沈降物または細菌培養）を、等体積の２ｘ溶解緩衝液（例えば２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨ８）と混合した。細菌から核酸を遊離させるため、ガラスビーズの存在下で混合物を１５分間ボルテックスするか、または超音波処理し、そしてその後、混合物を９５℃で１５分間加熱した。陽性対照反応では、痰沈降物または細菌培養の代わりに、既知の量の結核菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含有する等体積の水または緩衝液を用いた。先に詳細に記載されている標準法の組み合わせを用いて、ｇＤＮＡを調製した。簡潔には、ブロス中で後期対数期まで細胞を増殖させ、そして１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌ Ｄ−シクロセリンで１８時間処理した（Ｃｒａｗｆｏｒｄら， １９７９， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ２４：９７９−８１）。その後、細胞を収集し、そしてＳＤＳで溶解し、そしてプロテイナーゼＫで処理して水性溶液中にＤＮＡを遊離させ、これを過塩素酸ナトリウムおよびフェノール／クロロホルム混合物で２回抽出し、そして約２体積のエタノールを添加した後、溶液からＤＮＡを巻き取った（Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８２）， ｐｐ．２８０−８１および４５８−５９；並びにＭａｒｍｕｒ， １９６１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２０９−１８）。
【００３３】
標的捕捉。一般的に、標的捕捉工程には、試料から調製した溶解物を用いた（米国特許第６，１１０，６７８号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））。標的結核菌ＤＮＡを捕捉するため、混合物は、２５０μｌの調製した試料溶解物、３ｐｍｏｌの配列番号５および３ｐｍｏｌの配列番号６または３ｐｍｏｌの配列番号９を含有する２５０μｌの標的捕捉溶液、並びに固定ポリｄＴ14オリゴマーが付着した４０μｇの常磁性粒子（０．７〜１．０５μ、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）を含んだ（Ｌｕｎｄら， １９８８， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８６１−１０８８０）。標的捕捉混合物を６０℃で約２０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却した。磁場を５分間適用し、反応容器上のある部位に、標的ＤＮＡを含有する付着した複合体と共に、磁気粒子を誘引した（実質的に米国特許第４，８９５，６５０号（Ｗａｎｇ）に記載されるとおり）。洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）１ｍｌに、ハイブリダイゼーション複合体が付着した粒子を再懸濁し、そしてその後、磁気分離工程を反復することによって、粒子を洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【００３４】
増幅。転写仲介増幅は、実質的に先に記載されるように行った（米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら））。標的捕捉工程由来の洗浄粒子を７５μｌの増幅試薬溶液（０．０８ｍＭ ｒＵＴＰ、１．３ｍＭ ｒＡＴＰ、４ｍＭ ｒＣＴＰ、６ｍＭ ｒＧＴＰ、各１．３ｍＭ ｄＮＴＰ、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ、１７．３ｍＭ ＭｇＣｌ2）に懸濁した。ｒＵＴＰが比較的低濃度であることが、ｒｐｏＢ標的ＤＮＡの効率よい増幅には重要である。増幅反応には、少なくとも２つの増幅オリゴマー、すなわち少なくとも１つのプロモーター・プライマーおよび第二のプライマーを、通常、最終濃度０．０８μＭで含んだ（増幅オリゴマーはまた、ヘルパーまたは置換体オリゴマーを含むことも可能であり、そして他の増幅試薬を混合物に添加する前に、標的にハイブリダイズさせることが可能である）。反応混合物を不活性油の層（２００μｌ）で覆い、蒸発を防止し、そして４２℃で５分間インキュベーションした。その後、２５μｌの酵素試薬（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮTMＸ−１００）、１２０ｍＭ ＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液中、反応あたり約１７５０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素および４００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を添加した（１単位のＭＭＬＶ逆転写酵素は、２００〜４００μＭオリゴ（ｄＴ）でプライミングされるポリＡテンプレートを用いて、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込み；そして１単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーター配列を含有するＤＮＡテンプレートを用いて、３７℃で１時間に１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに取り込む）。穏やかに混合した後、反応を４２℃で１時間インキュベーションした。陰性対照は、すべて同一の試薬からなったが、試料の代わりに、標的核酸をまったく含有しない、等体積の水または緩衝液を用いた。
【００３５】
検出。いくつかの場合、増幅された結核菌配列は、発光測定装置（例えばＬＥＡＤＥＲTM発光測定装置、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）中で化学発光によって検出する、アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブ（例えば５’−ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡ（配列番号４））を用いて検出し、そして実質的に先に記載されるように（米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）第２５欄第２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：８４２９−８４３８、８４３２ページ）、相対光単位（ＲＬＵ）でシグナルを表す。一般的に、反復アッセイで検出されたＲＬＵの平均を報告する。好ましい態様において、標識検出プローブは、２’−Ｏ−メトキシ主鎖に連結される配列番号４の塩基配列を有する。
【００３６】
他の場合、先に詳細に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４９−５５）、結核菌ｒｐｏＢ配列の検出に特異的なＤＮＡプローブの固定アレイ上で、増幅された配列を検出した。増幅反応で生成された単位複製配列を蛍光標識で標識し、その後、実質的に別の箇所に詳細に記載されるような方法を用いて、アレイにハイブリダイズさせた（ＰＣＴ第ＷＯ ９９／６５９２６号および第ＷＯ ０１／４４５０７号（Ｌａａｙｏｕｎら））。簡潔には、５０μｌの単位複製配列を、３０ｍＭ ＭｎＣｌ2、３０ｍＭイミダゾール、２ｍＭの５−（ブロモメチル）フルオレセインおよび水（最終体積１５０μｌ）と混合した。６５℃で３０分間インキュベーションした後、カラムクロマトグラフィーによって（例えば、製造者の指示にしたがって、６Ｓ ＱＩＡＶＡＣ（登録商標）カラム、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨを使用して）、遊離標識を除去した。
【００３７】
プローブアレイのハイブリダイゼーションは、実質的に先に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４９−５５）、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM液体ステーション（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて行った。別の箇所に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０６（Ｌａａｙｏｕｎら））、さらなる工程、抗体染色によって、シグナル増幅が可能になる。簡潔には、Ｔｒｏｅｓｃｈらのプロトコルを用いて、ＤＮＡＣＨＩＰTM上でハイブリダイゼーションを行った後、ＤＮＡＣＨＩＰTMを洗い流し（ｆｌｕｓｈ）、そして３００μｌの２Ｍ ＭＥＳ、２．４μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、６μｌの正常ヤギＩｇＧ、１．２μｌの抗フルオレセイン抗体、および水（最終体積６００μｌ）を含有する染色溶液を用いて、染色の第二の工程を行った。抗フルオレセイン、ウサギＩｇＧ分画、ビオチン−ＸＸコンジュゲートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）に供給され；アセチル化ＢＳＡ溶液は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）に供給され；そしてヤギＩｇＧ（試薬等級）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミズーリ州セントルイス）に供給された。１０分間のハイブリダイゼーション後、チップを洗い流し、６ｘＳＳＰＥ、０．０１％ポリオキシエチレンソルビタン（ＴＷＥＥＮTM２０）を含有する洗浄緩衝液で洗浄し、そして３００μｌの２Ｍ ＭＥＳ、６μｌのＢＳＡおよび６μｌのストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート、並びに水（最終体積６００μｌ）の第二の染色溶液を用いて、第三のハイブリダイゼーション工程を行った。ストレプトアビジンおよびＲ−フィコエリトリン・コンジュゲートはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）に供給された。１０分間のハイブリダイゼーション後、チップを洗い流し、そして上述の洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ＧＥＮＥＣＨＩＰTM計測系（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）上で、ハイブリダイゼーションアレイ上の蛍光シグナル（相対蛍光単位またはＲＦＵとして表す）の強度およびパターンを検出する解析を行った。この系は、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM液体ステーション、ＧＥＮＥＡＲＲＡＹTMスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、カリフォルニア州パロアルト）およびＧＥＮＥＣＨＩＰTM解析ソフトウェア、すなわち、ヌクレオチド・ベースコーリングを決定し、そして増幅された核酸に存在する核酸配列を決定するアルゴリズムを含んでなる。この系は、チップに適用された、増幅された核酸配列に存在するｒｐｏＢ突然変異のレポートを生成する。
【００３８】
以下の実施例は、本発明の態様を示す。
【実施例１】
【００３９】
実施例１： 結核菌特異的オリゴヌクレオチドを用いた転写仲介増幅の感度
本実施例は、ＴＭＡ反応で用いた際の、本発明の増幅オリゴヌクレオチドの感度を示す。結核菌を特異的に増幅し、そして他のミコバクテリウム属種を増幅しないように、プライマーを設計した。上述の標的捕捉および増幅法を用い、以下の組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドを用いて、転写仲介増幅の効率を試験した：ヘルパーオリゴマーとして配列番号１（ＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧ）、プロモーター・プライマーとして配列番号２（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＴＧ）、およびプライマーとして配列番号３（ＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧ）。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応あたり、２０、２００または１０3コピーで提供した、精製ｇＤＮＡであった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌ＤＮＡをまったく含有しない等体積の水をｇＤＮＡ試料の代わりに用いた。増幅は、実質的に別の箇所に詳細に記載されるように行った均質検出アッセイ（米国特許第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら））を用いて、検出された化学発光（ＲＬＵ）に基づいて評価した。配列番号４（ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡ）のＡＥ標識検出プローブを同一配列の非標識プローブと混合し（標識プローブ／非標識プローブの比は１／５０００であった）、ＬＥＡＤＥＲTM発光測定装置（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）によって検出可能な直線範囲内のシグナルを提供した。２ｘ１０4以上のＲＬＵシグナルを陽性とみなした。ＲＬＵ結果（各アッセイ条件に関して１０アッセイの平均）を表１に示す。
【００４０】
表１に示す結果は、増幅反応がｇＤＮＡ２０コピー程度に少なくても感受性であり、通常は少なくとも１０００細菌を含有する臨床塗沫陽性標本の望ましい感度より感度が高いレベルであったことを立証する。
【００４１】
表１
【００４２】
【表１】
他の実験において、同様に、しかしヘルパーオリゴマーとして配列番号１、プロモーター・プライマーとして配列番号２、およびプライマーとして配列番号８（ＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧ）の増幅オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ｒｐｏＢ領域を増幅した。これらの実験におけるアッセイ感度は、ＡＥ標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出すると、反応あたり、少なくとも標的約２００コピーであった。これらの実験では、反応あたり８００、５００および２００コピーで標的を提供した（各条件に関して５反応）。すべての反応は、反応中に結核菌ＤＮＡがない陰性対照（２反応に関して、１．９３ｘ１０3平均ＲＬＵを生じた）に比較して、陽性結果（７．８８ｘ１０5〜２．６６ｘ１０6平均ＲＬＵ）を生じた。
【実施例２】
【００４４】
実施例２： 増幅の特異性
本実施例は、実質的に実施例１および上記に記載するような増幅オリゴマーおよび方法を用いて行うＴＭＡ反応を用いて立証されるような、本発明の増幅オリゴマーの特異性を示す。このアッセイの標的配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」、バージニア州マナサス）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨカルチャー・コレクション（「ＤＳＭ」、ドイツ・ブラウンシュワイク）から得て、そして標準的微生物学的方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細菌から抽出した、精製ミコバクテリウムｇＤＮＡであった。試験した種には：結核菌（ＡＴＣＣ寄託番号２７２９４）、Ｍ．カンサシ（Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＤＳＭ寄託番号４３２２４）、鳥型結核菌（Ｍ． ａｖｉｕｍ）（ＡＴＣＣ寄託番号２５２９１）、およびＭ．ゴルドネ（Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ）（ＡＴＣＣ寄託番号１４４７０）が含まれた。増幅反応において、アッセイあたり２００、１０3、１０4、１０5、および１０6コピーの標的ＤＮＡを提供した。陰性対照反応は、ミコバクテリウムＤＮＡをまったく含有しなかった（すなわち試料体積の代わりに等体積の水を用いた）。
【００４５】
増幅された核酸を検出するため、未希釈の標識プローブを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、標識プローブを用いた均質検出アッセイを用いた。これらのアッセイから得た平均ＲＬＵ結果（種ＤＮＡあたり４アッセイ）を表２に示す。これらに関しては、５ｘ１０4ＲＬＵ以上のシグナルを陽性とみなした。
【００４６】
表２
【００４７】
【表２】
表２の結果によって示されるように、該アッセイは、反応において２００コピーの結核菌ＤＮＡを増幅し、そして検出した。アッセイした他のミコバクテリウム属種のすべてに関しては、はるかにより多くの標的ＤＮＡ（反応あたり１０3〜１０5コピー）を用いた場合でさえ、結果は陰性であった。したがって、これらの増幅オリゴマーおよびプローブを用いた際の結核菌に対する特異性は、より多くのＤＮＡを提供した場合でさえ、他のミコバクテリウム属種に関して、最小限の検出可能シグナルしか得られないことによって立証された。
【００４９】
直前に記載するのと同一の増幅法を用いて、ＤＮＡプローブアレイ上でも単位複製配列を検出した。実質的に先に記載されるような方法（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０７号（Ｌａａｙｏｕｎら））を用いて、単位複製配列を化学的に断片化し、そして蛍光的に標識した。上述のように、結核菌配列を検出するため、ＧＥＮＥＣＨＩＰTM系を用いて、ＤＮＡプローブアレイ上で標識断片を検出した。
【００５０】
試験した各種に関して、表３に示す結果は、結核菌の診断に用いる、あらかじめ決定した配列を同定するのに用いた、正しいベースコーリングの割合を示す。すなわち、表３に列挙されるミコバクテリウム属種の各々由来の試料ＤＮＡから得た単位複製配列に関して、結核菌特異的ＤＮＡプローブチップ上の正しいベースコーリングの相対量と、検出されたシグナルの平均シグナル強度（平均相対蛍光単位またはＲＦＵ）を示す。８５％を超えるベースコーリング結果を、結核菌配列の陽性同定とみなす。
【００５１】
このプローブアレイ検出系で得た結果によって、上で論じた均質検出アッセイで得た標識プローブ検出結果が確認され、そして増幅が結核菌に特異的であることがさらに確認された。
【００５２】
表３
【００５３】
【表３】
【００５４】
実施例３： 突然変異体クローンの検出
本実施例は、標的捕捉、増幅および検出後のｒｐｏＢ配列の検出を示す。均質検出アッセイにおいて標識プローブ結合を用いることによって、そして実質的に実施例２に記載するように、ＤＮＡプローブアレイに標識単位複製配列を結合させることによって、検出を行った。検出のため、各クローンに関する同一増幅反応を２つの部分に分けた。
【００５５】
Ｔｒｏｅｓｃｈら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９９， ３７：４９−５５）に記載される方法を用いて、ＰＣＲによって増幅され、そしてプラスミドベクター（ｐＧＥＭTM−Ｔ ＥＡＳＹ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に連結された、約７００ｂｐの断片に含有される、クローニングされたｒｐｏＢ配列から、検出しようとする細菌ｒｐｏＢクローンを生成した。ＤＮＡ配列決定によって、挿入配列を性質決定した。既知の突然変異を含有するこれらのクローンを、次に、上述の方法を用いた標的捕捉、増幅および検出のための結核菌標的配列として利用した。
【００５６】
表４に示した結果では、クローニングしたｒｐｏＢ配列中で検出される突然変異は、Ｔｒｏｅｓｃｈら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９９， ３７：４９−５５）に記載されるように、アミノ酸置換（１文字暗号）およびコドンの位置によって特定される。例えば、「Ｑ５１３Ｌ」は、突然変異が、最初のコドンから５１３の位に影響を与え、この位は野生型株ではグルタミン（Ｑ）を有するが、この突然変異体ではロイシン（Ｌ）置換を有することを意味する。表４の第１列は、クローニングされた挿入物の独立した配列決定に基づく、予期される配列を示し、そして第２列は、ＤＮＡプローブアレイへの単位複製配列のハイブリダイゼーションによって決定された結果を示す。各クローンのプローブアレイに関して観察された、ベースコーリングの割合（ＢＣ％）およびシグナル強度（ＲＦＵ）を、それぞれ第３列および第４列に示す。表４の最終列は、上述のように、ＡＥ標識プローブへのハイブリダイゼーションによって決定され、そして相対光単位（ＲＬＵ）として検出されるような、１つのアッセイにおいて各クローンに関して得られる結核菌単位複製配列の相対量を示す。表４の結果は、増幅および検出法の結果、結核菌突然変異体のｒｐｏＢ配列で生じる、異なる変動が、正しく同定されることを示す。
【００５７】
表４
【００５８】
【表４】
【００５９】
実施例４： 臨床標本における結核菌の検出
本実施例は、野生型結核菌を含有する臨床試料のＴＭＡ増幅および増幅されたＲＮＡの検出に用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。実質的に実施例１に記載されるように、増幅を行った。均質検出アッセイにおいて、固定プローブのアレイを有する固体支持体（ＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で、そして標識プローブを用いることによって、実質的に実施例２に記載するように、単位複製配列を検出した。
【００６０】
試料を消化し、そして汚染除去した後、痰（すなわち臨床標本）から結核菌（野生型）の陽性沈降物を得た。ミコバクテリウム培養のため受け取った標本は大部分、多様な量の有機破片および多様な汚染、正常、または一過性細菌フロラを含有する。化学的汚染除去法は、汚染菌を殺し、一方、ミコバクテリウムの回復を可能にする。用いた消化および汚染除去法は、標準的Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−２％水酸化ナトリウム（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ）法であった（Ｋｅｎｔら， １９８５， Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． 米国保険社会福祉省、疾病対策予防センター、ジョージア州アトランタ）。ＮＡＬＣは、粘液溶解（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ）剤として作用して、標本の液化を確実にし、そして水酸化ナトリウムは汚染除去剤である。ミコバクテリウム培養の通常の臨床的分類に基づいて、塗沫強度を決定し、ここで「１＋」は低陽性を意味し、そして「４＋」は高陽性を意味する。
【００６１】
１２標本に関して得た結果を表５に要約する。結果は、標識プローブを用いた均質検出アッセイで得たプローブ検出結果（単一アッセイＲＬＵ結果、第３列）およびＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーション後に得た結果（第４列、ＢＣ％、および第５列、シグナル強度）と比較した、各標本の塗沫強度（第２列）を示す。
【００６２】
表５
【００６３】
【表５】
表５に示す結果は、臨床標本を用いた増幅の効率を立証する。試験したすべての沈降物に関して、標識プローブ検出結果（ＲＬＵ）は、陰性対照（未提示）に比較して、すべて陽性であり、そしてＤＮＡプローブアレイ検出結果は、同様に陽性であった。プローブアレイ解析において、試験した沈降物はすべて、野生型結核菌として検出された。
【実施例５】
【００６５】
実施例５： ＰＣＲ増幅および単位複製配列の検出
本実施例は、別の増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いた際の、本発明のプライマーの感度を示す。固定プローブのアレイを有する固体支持体（すなわちＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で、増幅後に得たＤＮＡを検出した。標的調製のため、標準的微生物学的方法を用いて、野生型結核菌（ＡＴＣＣ寄託番号２７１７７）をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。水中で細菌ストック懸濁物を作成し、そしてｍｌあたり約６ｘ１０8細菌の濃度に調整した。水中の連続希釈を作成して、μｌあたり１０4細菌（μｌあたり１０4コピーの細菌ＤＮＡと同等）の濃度を産生し、これをその後、９５℃で１５分間加熱することによって不活性化した。
【００６６】
サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＡＳＴ ＳＴＡＲＴTM Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、プラスチック試験管中で、ＰＣＲ増幅を行った。簡潔には、増幅混合物（最終体積５０μｌ）は、５μｌの１０ｘ ａｍｐ緩衝液、０．４μｌのｄＮＴＰ混合物（各２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ）、各１．５μｌの配列番号２および配列番号３のプライマー（１０μＭ）、０．４μｌのＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ）、５μｌの標的（または陰性対照では水）を含有した。自動化サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ ９６００TM）を用いて、熱サイクリングを行い、これは、最初に９５℃４分間の変性工程、次に、各々、９５℃３０秒間、５０℃３０秒間および７２℃４５秒間からなる３５周期、そして７２℃７分間の最終周期であった。
【００６７】
ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミドでの染色によって増幅産物を解析して、増幅されたＤＮＡの１６８ｎｔバンドの存在または欠如を検出した。陰性対照（すなわち標的ＤＮＡなし）では、ゲル上に見えるバンドはなかった。反応に１０4コピー以上の標的を用いた際、ＤＮＡバンドが見られた。
【００６８】
次に、実質的に先に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら， １９９９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７（１）：４９−５５）、ＤＮＡプローブアレイ（ＧＥＮＥＣＨＩＰTM）上で増幅産物を検出した。プロモーターでタグ付けしたＰＣＲ単位複製配列を用いて、各々、およそ５０ｎｇのＰＣＲ産物、２０ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ Ｍｇ（アセテート）2、１０ｍＭジチオスレイトール、各１．２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰを含有し、そして３７℃で１時間インキュベーションする、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（２０μｌ）によって、一本鎖ＲＮＡ標的を生成した。
【００６９】
実質的に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ ０１／４４５０７号）、ＲＮＡを蛍光標識し、そして標識ＲＮＡをプローブアレイにハイブリダイズさせ、そして解析した（Ｔｒｏｅｓｃｈら、上記）。ハイブリダイゼーションには、５μｌ標識ＲＮＡを７００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．９０Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、および０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）で希釈し、プローブアレイに適用し、そして４５℃で３０分間インキュベーションした。その後、３ｘＳＳＰＥ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００で、プローブアレイを３０℃で２回洗浄し、そしてアレイに結合した蛍光シグナルを検出した。システムアルゴリズム（ＧＥＮＥＣＨＩＰTMソフトウェア、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いることによって、検出されるシグナル強度（平均、中央値および最大ＲＦＵ）、ヌクレオチド・ベースコーリング％および配列決定を生成した。実験に由来する配列およびアレイ上に存在する参照配列間の相同性パーセントによって、候補選択指数を決定した。この実験から得た結果は、標的１０4コピーでは、９１．９％のベースコーリング、および１０１ＲＦＵのバックグラウンドシグナルに比較される１３１２ＲＦＵのシグナル強度に基づいて、プローブアレイ上で決定される配列が野生型結核菌のものであることを示した。
【実施例６】
【００７０】
実施例６： ｒｐｏＢ（＋）鎖標的の増幅
本実施例は、該アッセイがｒｐｏＢ領域から作成した単位複製配列を増幅し、そして検出することが可能であるが、実施例１に記載した（−）ＤＮＡ鎖増幅と対照的に、（＋）ＤＮＡ鎖から単位複製配列が作成されることを示す。実施例１におけるのと実質的に同一の増幅条件を用いて、（＋）鎖増幅反応で用いた増幅オリゴヌクレオチドは：プロモーター・プライマーとして配列番号１０（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＣ）、およびプライマーとして配列番号１１（ＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧ）であった。このアッセイの標的配列は、結核菌の溶解細菌培養から抽出し、そして増幅反応あたり５ｘ１０3コピーで提供する精製ｇＤＮＡ、またはブロス培養で増殖させ、増幅反応あたり約５ｘ１０3コピーで提供する超音波処理結核菌細胞の未精製溶解物であった。陰性対照として、陽性試料でのようにプロセシングした別個の増幅反応において、結核菌ＤＮＡをまったく含有しない等体積の水をＤＮＡ含有試料の代わりに用いた。実質的に上述のように行うが、配列番号１２（ＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧ）のＡＥ標識検出プローブを用いる、均質検出アッセイ後に検出された化学発光（ＲＬＵ）に基づいて、増幅を評価した。精製ｇＤＮＡおよび未精製溶解試料両方に関して、陽性シグナルを検出した。精製ｇＤＮＡ標的を用いた２回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは５．６６ｘ１０6ＲＬＵであり、そして未精製溶解物ＤＮＡ標的を用いた５回の反復アッセイでは、検出された平均シグナルは５．２５ｘ１０6ＲＬＵであった。陰性対照（２回の反復アッセイ）は６．１５ｘ１０2ＲＬＵを生じた。これらの結果は、アッセイが、増幅される結核菌ＤＮＡの鎖と独立にｒｐｏＢ配列を特異的に検出可能であることを示す。
Claims (11)
- 生物学的試料に存在する結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｒｐｏＢ配列を検出する方法であって：
ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を含んでなる結核菌由来の核酸を含有する生物学的試料を提供し；
少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号１〜配列番号３、配列番号８、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を有する少なくとも２つのプライマーを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物において、結核菌ｒｐｏＢ ＤＮＡ配列を増幅して、増幅された結核菌核酸を産生し；そして
増幅された結核菌核酸と関連する標識を検出することによって、増幅された結核菌核酸を検出する
工程を含んでなる、前記方法。 - 結核菌ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチド、および捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定核酸を、ハイブリダイズ条件下で、生物学的試料に添加して、結核菌ＤＮＡ配列、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定核酸を含んでなるハイブリダイゼーション複合体を産生し；そして
増幅工程前に、生物学的試料の他の構成要素からハイブリダイゼーション複合体を分離する
工程をさらに含んでなる、請求項１の方法。 - 検出工程が、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１または請求項２の方法。
- 検出工程が、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識検出プローブを用いる、請求項３の方法。
- 検出工程が、増幅された結核菌核酸に特異的にハイブリダイズする、複数の検出プローブを用いる、請求項３の方法。
- 増幅工程が、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーの組み合わせを用いる、請求項１の方法であって
第一のプライマーが配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号３の配列を有するか；
第一のプライマーが配列番号２の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号８の配列を有するか；または
第一のプライマーが配列番号１０の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１１の配列を有する
前記方法。 - 結核菌のｒｐｏＢ配列を検出するための組成物であって、配列番号１〜配列番号６および配列番号８〜配列番号１２からなる群より選択される配列を有する、１以上のオリゴヌクレオチドを含んでなる、前記組成物。
- 組成物が：
配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに
配列番号４〜配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド
を含んでなる、請求項７の組成物。 - 組成物が：
配列番号１〜配列番号３および配列番号８のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、
配列番号４の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、並びに
配列番号５、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第三のオリゴヌクレオチド
を含んでなる、請求項７の組成物。 - 組成物が：
配列番号１０および配列番号１１のいずれか１つの配列を含有する、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、並びに
配列番号１２の配列を含有する、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド
を含んでなる、請求項７の組成物。 - 請求項７〜１０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドのいずれかを含有するキット。
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