JPH10500857A - ミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 可能には含まれているミコバクテリウム種の同定を連動して、試料中に存在するミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルを検出するための方法であって、下記工程：（i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し；（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いて該試料中に存在する抗生物質耐性遺伝子の重要部分を増幅し；（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸を、表２に掲載する少なくとも１つのｒｐｏＢ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションさせ、（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルからミコバクテリウムの抗生物質耐性スペクトルを、そして可能には含まれているミコバクテリウム種を推定するからなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルの検出方法 本発明は、薬剤耐性ミコバクテリアの分野に関する 本発明は、プローブ、プライマー、および生物学的試料中のミコバクテリアの 核酸の検出のための方法ならびにそれらからなるキットに関する。 最も臨床的に重要なミコバクテリウム（Mycobacterium）種、詳細にはミコバ クテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）の同定は、６週 間までを必要としうる培養工程のため、退屈な仕事であり時間がかかる。疾病が 生命を脅かし、非常に感染性があるかもしれないので、ミコバクテリウム感染の 迅速な診断は非常に重要である。ごく最近になって、培養の必要なくミコバクテ リウム種を検出し同定するためのいくつかの方法−すべてが１つまたは別の増幅 プロセスを用いる−が開発された（Claridgeら、１９９３年）。これらの方法の 大部分は評価途中であり、ルーチンでの適用における利益は問題となったままで ある。そのうえ、これらの方法は、なお培養に依存しているミコバクテリウムの 薬剤耐性の検出という問題を解決するものではない。 ツベルクローシスにおける多剤耐性の頻度が着実に増加しているので（Cullit on、１９９２年）、エム・ツベルクローシス（M.tuberclosis）の早期診断およ び主な結核菌抑制剤に対する耐性の認識は、治療および伝染病復活の最適な抑制 にとり必須である。 エム・ツベルクローシス感染の治療み用いられる抗生物質は主にイソニアジド およびリファンピシンであり、別々にあるいは両方を混合して投与される。時折 、ピラジンアミド、エタンブトールおよびストレプトマイシンが用いられる。（ フルオロ）キノロンのような他のクラスの抗生物質は、将来の好ましい結核菌抑 制剤であるかもしれない。 さらに大部分の多剤耐性ミコバクテリアはリファンピシンに対する感受性を失 ったので、リファンピシン耐性は多剤耐性結核菌に関する有効なマーカーである と 考えられる。この理由により、リファンピシン耐性の検出が特に重要であるかも しれない。 試験されたエム・ツベルクローシス株の大部分については、リファンピシン（ およびリファブチンのようなアナログ）に対する耐性の原因となる機構が調べら れている。リファンピシン（およびアナログ）は、ＲＮＡポリメラーゼのβ−サ ブユニットと相互作用することによりこの酵素をブロックする。Telentiら（１ ９９３年ａ）は、エム・ツベルクローシスのＲＮＡポリメラーゼのβ−サブユニ ットに限られた領域での変異はリファンピシン作用に対するＲＮＡポリメラーゼ の不感受性を生じることを見いだした。この領域はｒｐｏＢ遺伝子における２３ 個のコドンの並びに限られる。該著者らは、リファンピシン耐性を引き起こす１ ７個のアミノ酸の変化を記載している（Telentiら、１９９３年ｂ）。これらの アミノ酸変化は、６７個のヌクレオチドまたは２３個のアミノ酸のコドンの並び にそれぞれ分散している１５個のヌクレオチドまたは８個のアミノ酸のコドンに おける点突然変異または欠失により引き起こされる。 Telentiら（１９９３年ａおよびｂ）は、リファンピシン耐性の原因となる関 連変異に関するスクリーニングのためのＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を記載した（ＳＳＣ Ｐは１本鎖コンホーメーションの多型性をいう）。放射活性または蛍光マーカー のいずれかを用いることによりＳＳＣＰ分析を行うことができる。後者の場合、 精巧で高価は装置（自動ＤＮＡ配列決定装置）が必要である。記載されたＳＳＣ Ｐ法は特異性および感度に関する他の限界も有しており、その限界により日常的 な使用が妨げられうる。有意な細菌負荷（顕微鏡スコア：＞９０個／視野）が顕 微鏡で観察される場合には、標本を直接十分に分析できるだけであり、粗ＤＮＡ 試料について結果の解釈を複雑にする鎖分離人工物が観察されうる。 Kaperら、（１９９４年）は、リファンピシン耐性に関する２３個の異なった ｒｐｏＢ対立遺伝子を記載している。Telemtiら（１９９３年ａ）により記載さ れた変異のほかに、いくつかの新たな変異ｒｐｏＢ対立遺伝子が記載されている 。しかしながら、最も頻繁に生じる対立遺伝子は以前記載されたものと同じもの である。 エム・レプラエ（M.leprae）においては、リファンピシン耐性に関する分子の レプラエのＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニットをコードしているｒｐｏＢ 遺伝子における変異により耐性が生じていた。限られた数の耐性エム・レプラエ 株（９種類）が分析されただけであり、その大部分において（９種類のうち８種 類）耐性はＳｅｒ−４２５残基に影響する変異によるものであった。 エム・ツベルクローシスおよびエム・レプラエ以外の臨床的に重要なミコバク テリアは、しばしば、変化するとしても本質的なリファンピシン耐性を示す。か かる場合は、ヒト病原菌であるエム・アビウム（M.avium）およびエム・イント ラセルラレ（M.intracellulare）の場合であって、それらに対しては限られた治 療選択肢が用いられるだけである。Guerreroら、（１９９４年）は、異なるエム ・アビウムおよびエム・イントラセルラレ単離体のｒｐｏＢ遺伝子配列をエム・ ツベルクローシスのそれと比較した。ヌクレオチドレベルで相違が存在したが、 リファンピシン感受性のエム・ツベルクローシスについては全アミノ酸同一性が 見いだされた。これらの知見は、耐性についての別の機構、おそらくは障壁透過 性がエム・アビウムおよびエム・イントラセルラレに適用されることを示唆する ものである。 逆ハイブリダイゼーションアッセイのごときハイブリダイゼーション法を用い て点突然変異または小規模な欠失の特異的検出をうまく行うことができる。しか しながら、ｒｐｏＢ遺伝子の重要な部分において観察された複雑さにより簡単な プローブの開発は可能ではない。さらに説明するように、精巧な装置の必要なく 迅速かつ便利な方法で、すべてではないとしても大部分の変異の検出可能にする 特別なアプローチを設計することが本発明の１つの目的であった。 イソニアジド（ＩＮＨ）に対する耐性の機構は、リファンピシンについての耐 性機構よりもかなり複雑である。少なくとも２つの遺伝子産物がＩＮＨ耐性に関 与している。第１に、ＩＮＨを活性分子に変換すると考えられているカタラーゼ −ペルオキシダーゼがある。ゆえに、ｋａｔＧ遺伝子の欠陥または欠失によって カタラーゼ−ペルオキシダーゼを産生しない株はもはやＩＮＨに感受性がない （Zhangら、１９９２年；Stoeckleら、１９９３年）。この意味からすると、Ｉ ＮＨ耐性とカタラーゼ活性との間の関連はすでに１９５０年代に記録されていた （Middlebrook、１９５４年ａおよびｂ；Youatt、１９６９年）。 関与している第２の分子はｉｎｈＡ遺伝子産物であり、それはミコール酸生合 成において役割を果たしていると考えられている。活性化されたＩＮＨ分子はこ の産物と直接的または間接的に相互作用し、おそらくは正常なミコール酸生合成 を妨げると仮定される。この仮説は、野生型ｉｎｈＡ遺伝子の過剰発現またはｉ ｎｈＡ遺伝子産物における特別なアミノ酸変化（Ｓ９４Ａ）がＩＮＨ耐性を付与 しているという最近の観察結果（Banerjeeら、１９９４年）に基づくものである 。 手短にかついくぶん簡単に言えば、ある種のエム・ツベルクローシス株におい てＩＮＨ耐性は以下のことにより媒介されている可能性がある： − カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性の消失 − ｉｎｈＡ蛋白におけるある種のアミノ酸変化の存在 − 野生型ｉｎｈＡ蛋白の発現レベル。 さらに、ＩＮＨおよび関連薬剤に対する耐性の付与に他の機構が関与している かもしれない。ＩＮＨ耐性機構の全体的なスペクトルにおけるこれらの要因の重 要性はまだ評価されていない。本発明は、利用可能なｋａｔＧ遺伝子（ＥＭＢＬ Ｘ６８０８１番）およびエム・ツベルクローシスのｉｎｈＡ遺伝子（ＥＭＢＬ Ｕ０２４９２番）から信頼できるＤＮＡプローブが開発されうる場合には、ＤＮ Ａプローブ法を手段とすることができる。次いで、これらのプローブ試験物を生 物学的試料における薬剤耐性の検出に適用することができる。 ストレプトマイシンおよび（フルオロ）キノロンに対する耐性の検出に、リフ ァンピシンに関するものと同じアプローチを用いることができる。１またはそれ 以上の遺伝子の限定された領域における点突然変異により、これらの抗生物質に 対する耐性も誘導される。ジャイレース遺伝子における点突然変異は（フルオロ ）キノロン（ＥＭＢＬ Ｌ２７５１２番）に対する耐性を付与する。ストレプト マイシン耐性は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子またはリボゾーム蛋白Ｓ１２の遺伝子 （ｒｐｓＬ）のいずれかにおける変異に関係している（Finkenら、１９９３年； DouglasおよびSteyn、１９９３年；Nairら、１９９３年）。 ｋａｔＧ、ｒｐｏＢおよびｒｐｓＬ遺伝子におけるヌクレオチド変化による耐 性は、国際出願ＷＯ９３／２２４５４に記載されている。エム・ツベルクローシ スにおける異なる遺伝子のそれぞれに関して、可能性のある多くの変異のうちの ただ１つのみが詳細に記載されていた（ｋａｔＧについてはＲ４６１Ｌ、ｒｐｏ ＢについてはＳ４２５Ｌ（Telentiらおよび本発明により記載されたＳ５３１Ｌ と同じ）、およびｒｐｓＬについてはＫ４２Ｒ）。 生物学的試料中に存在するミコバクテリウム種の抗生物質耐性の決定のための 迅速かつ信頼できる検出方法を提供することが本発明の目的である。 より詳細には、生物学的試料中の存在するエム・ツベルクローシスのリファン ピシン（および／またはリファンブチン）に対する耐性の決定のための迅速かつ 信頼できる検出方法を提供することが本発明の目的である。 また、抗生物質耐性スペクトルのモニタリングに直接関連した、生物学的試料 中のミコバクテリウム種の検出および同定を可能にする方法を提供することが本 発明の目的である。 より詳細には、リファンピシン（および／またはリファンブチン）耐性の検出 に直接関連した、生物学的試料中のミコバクテリウム・ツベルクローシスの存在 を検出する方法を提供することが本発明の目的である。 より詳細には、リファンピシン（および／またはリファンブチン）耐性の検出 に直接関連した、生物学的試料中のミコバクテリウム・レプラエの存在を検出す る方法を提供することが本発明の目的である。 さらに、野生型配列と１またはそれ以上の薬剤に対する耐性を付与する変異配 列とを識別しうる特別なプローブを選択することが本発明の目的である。 より詳細には、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチン ）に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる特別なプローブを選択するこ とが本発明の目的である。 より詳細には、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチン ） に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる特別なプローブのセットであっ て、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で用いられる特別なプロー ブのセットを選択することが本発明の目的である。 さらにそのうえ、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチ ン）に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる選択プローブのセットを、 生物学的試料中に存在するミコバクテリウム種を同定しうる選択プローブの別の セットと組み合わせることが本発明の目的であり、そのことにより同じハイブリ ダイゼーションおよび洗浄条件下ですべてのプローブが使用可能となる。 対象とする抗生物質耐性の特徴を決定する遺伝子フラグメントの増幅を可能に するプライマーを選択することが本発明の目的である。 より詳細には、リファンピシン（およびアナログ）に対する耐性を決定するｒ ｐｏＢ遺伝子フラグメントの増幅を可能にするプライマーを選択することが本発 明の目的である。 本発明のもう１つの目的は、できれば関連するミコバクテリウム種の同定を含 めた、ミコバクテリアにおける抗生物質耐性の検出のためのキットを提供するこ とである。 本発明のすべての目的は、以下の特別な具体例に応じたものである。 本発明の好ましいプローブの選択は、固体支持体片上に平行線状に固定化され たオリゴヌクレオチドプローブを用いる逆ハイブリダイゼーションアッセイ（re verse hybridization assay）であるライン・プローブ・アッセイ（Line Probe Assay(LiPA)）原理に基づく（Stuyverら、１９９３年；国際出願ＷＯ９４／１２ ６７０）。このアプローチは、迅速かつ簡単に行えるので、特に有利である。逆 ハイブリダイゼーションフォーマット、そしてより詳細にはＬｉＰＡアプローチ は、特に、調査すべき重要な情報を得るためにはプローブの組み合わせの使用が 好ましいかまたは不可避である場合に、他のＤＮＡ法またはハイブリダイゼーシ ョンフォーマットと比較すると多くの実用的な利点を有する。 しかしながら、本発明においてさらに説明される選択プローブのいずれかを用 いる他のいかなるタイプのハイブリダイゼーションアッセイまたはフォーマット であっても本発明に包含されることが理解されよう。 逆ハイブリダイゼーションアプローチは、プローブを固体支持体に固定化し、 標的ＤＮＡを標識して形成されたハイブリッドの検出を可能にすることを包含す る。 以下の定義は、本発明において使用される用語および表現を説明するのに役立 つ。 これらの試料中の標的物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばゲノムＤＮＡまた はメッセンジャーＲＮＡまたはそれらの増幅されたバージョンのいずれであって もよい。これらの分子をポリ核酸ともいう。 用語「プローブ」は、検出すべき標的配列に相補的な配列を有する１本鎖の配 列特異的オリゴヌクレオチドをいう。 本明細書の用語「相補的」は、１本鎖プローブ配列が１本鎖標的の配列に正確 に相補的であることを意味し、該標的は、検出すべき変異が存在する配列として 定義される。本願は単一塩基対のミスマッチの検出を必要とするので、原理的に は正確に相補的な配列のハイブリダイゼーションのみを可能にする非常に厳密な 条件がハイブリダイゼーションのために必要である。しかしながら、プローブの 長さの変更が可能であり（下記参照）、プローブの中央部分がそのハイブリダイ ゼーション特性に必要であるので、標的配列に対するプローブ配列の可能な逸脱 がプローブの頭および尾のほうでは可能であることに注意すべきである。しかし ながら、逸脱が正確に相補的なプローブと同等なハイブリダイゼーション特性を 生じるかどうかをチェックするために、当業者の知識から考えられるこれらの逸 脱を常に実験的に評価すべきである。 好ましくは、プローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり、より好ま しくは、約１０ないし２５ヌクレオチドである。本発明に使用するヌクレオチド はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびノシンまたはハイブリ ダイゼーション特性を変化させない修飾基を有するヌクレオチドのごとき修飾ヌ クレオチドであってよい。本発明においては、プローブ配列を５’から３’末端 への１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして表す。以下に記載するプローブのい ず れかをそれ自体として、あるいはそれらの相補的形態として、あるいはそれらの ＲＮＡ形態（ＴがＵに置換されている）用いることができることは当業者に明ら かである。 対応ヌクレオチド配列を含むインサートを含んでいる組み換えプラスミドのク ローニングによって本発明プローブを製造することができる。必要な場合には、 適当なヌクレアーゼを用いてクローン化プラスミドから対応ヌクレアーゼ配列を 開裂し、それらを、例えば、分子量による濾過により回収する。本発明プローブ を化学的に、例えば、慣用的なホスホトリエステル法により合成することもでき る。 用語「固体支持体」とは、オリゴヌクレオチドプローブを結合させることので きるすべての物質をいうことができるが、オリゴヌクレオチドプローブがそのハ イブリダイゼーション特性を保持し、さらに、ハイブリダイゼーションのバック グラウンドレベルが低いままであることが条件となる。通常には、固体物質はマ イクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）また は微小球（ビーズ）であろう。膜または固定に適用する前に、核酸プローブを修 飾して固定を容易にし、あるいはハイブリダイゼーション効率を改善することが 慣用的である。かかる修飾は、ホモポリマーテイリング、脂肪族基、ＮＨ₂基、 ＳＨ基、カルボキシル基のごとき別の反応性基との結合、またはビオチン、ハプ テンもしくは蛋白との結合を包含する。 用語「標識」は、標識核酸の使用をいう。Saikiら、（１９８８年）またはBej ら、（１９９０年）により説明されているような増幅のポリメラーゼ工程の間に 取り込まれる標識ヌクレオチドを用いることにより標識を行ってもよく、あるい は標識プライマー、または当業者に知られた他のいずれかの方法によって標識を 行ってもよい。標識の性質は同位体（³²Ｐ、³⁵Ｓ等）であってもよく、あるいは 非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってもよい。 用語「プライマー」は、コピーすべき核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物 の合成の開始点として作用しうる１本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。プライ マーの長さおよび配列は、伸長生成物の合成を開始しうるようなものでなくては ならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレオチドの長さであり、個 々の長さおよび配列は、必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑さ、ならびに温度 およびイオン強度のごときプライマー使用条件に依存する。 正しい増幅を保証するには増幅プライマーは対応鋳型配列と正確にマッチする 必要はないという事実は、文献（Kwokら、１９９０年）に十分に開示されている 。 用いられる増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Saikiら、１９８８ 年）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Landgrenら、１９８８年；WuおよびWallace 、１９８９年；Barany、１９９１年）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：Gu atelliら、１９９０年；Compton、１９９１年）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ ：Kwohら、１９８９年）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Duck、１９９０年；Walkerら、 １９９２年）またはＱβレプリカーゼによる増幅（Lizardiら、１９８８年；Lom eliら、１９８９年）もしくは当該分野で知られている他のいずれかの核酸分子 増幅方法のいずれであってもよい。 プライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ホスホロ チエート（Matsukuraら、１９８７年）、アルキルホスホロチエート（Millerら 、１９７９年）またはペプチド核酸（Nielsenら、１９９１年；Nielsenら、１９ ９３年）であってもよく、あるいは挿入剤（intercalating agents）（Asseline ら、１９８４年）を含んでいてもよい。 本発明の元のＤＮＡ配列中に導入される大部分の他の変更または修飾として、 これらの変更は、必要な特異性および感度を得るためにオリゴヌクレオチドが用 いられるべき条件に関する改変を必要とするであろう。 ハイブリダイゼーション動力学、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオ チド分子の生物学的安定性等のごとき特性に積極的に影響を及ぼすために、これ らの修飾の導入は有利であるかもしれない。 「試料」は、感染したヒト（または動物）から直接的に、あるいは培養（豊富 化）後のいずれかから得られるいずれの生物学的物質であってもよい。生物学的 物質は、例えば、すべての種類の喀出物、気管支洗浄物、血液、皮膚組織、生検 材料、リンパ球血液培養物、コロニー、液体培養物、土壌、糞試料、尿等であっ てよい。 同一のハイブリダイゼーション条件下での最適な実行を達成してプローブをセ ットにして同時ハイブリダイゼーションに使用できるように本発明プローブを設 計する。このことにより、これらのプローブの有用性が非常に高まり、時間およ び労力の有意な節約になる。明らかに、他のハイブリダイゼーション条件が好ま しい場合には、それらの先端部において多くのヌクレオチドの付加または欠失を 行うことにより、すべてのプローブを適宜適合させるべきである。これらの随伴 する適合は必然的に同じ結果を生じること、すなわち、個々のプローブはやはり 特異的に一定の標的にハイブリダイゼーションするということが理解されるはず である。ＮＡＳＢＡ系のように、増幅された物質が性質上ＲＮＡであってＤＮＡ でない場合には、かかる適合は必要であろう。 所望特性を有するプローブの設計には、当業者に知られた以下の有用なガイド ラインを適用することができる。 本明細書記載のごときハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は多く の要因により影響を受けるので、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわ らず、それらの要因の１つまたはそれ以上の取り扱いによって個々のプローブの 正確な感度および特異性が決定されるであろう。本明細書においてさらに説明す る種々のアッセイ条件の重要性および影響は当業者に知られている。 第１に、アッセイ条件に適合するように［プローブ：標的］核酸ハイブリッド の安定性を選択すべきである。長いＡＴに富む配列を避けることにより、Ｇ：Ｃ 塩基対でハイブリッドを終結することにより、および適当なＴｍを有するプロー ブを設計することにより、このことを行ってもよい。長さおよび％ＧＣが最終ア ッセイが行われる温度よりも約２〜１０℃高くなるようにプローブの開始点およ び終点を選択すべきである。さらなる水素結合のためにＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩 基対と比較して高い熱安定性を示すので、プローブの塩基組成は重要である。か くして、高いＧ−Ｃ含量の相補的ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションは 比較的高温において安定であろう。 プローブの設計の際には、プローブが用いられるイオン強度およびインキュベ ーション温度のごとき条件も考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加 するにつれハイブリダイゼーションが増加し、イオン強度の増加とともにハイブ リッドの熱安定性が向上することが知られている。一方、水素結合を妨げるホル ムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールのごとき化学試薬はハイブリダイゼ ーションの厳密性を増大させるであろう。かかる試薬による水素結合の不安定化 はＴｍを非常に低下させうる。一般的には、約１０〜５０塩基の長さの合成オリ ゴヌクレオチドプローブに関する最適ハイブリダイゼーションは、生じる２本鎖 の融解温度よりも約５℃低い温度で起こる。最適温度以下の温度でのインキュベ ーションはミスマッチの塩基配列のハイブリダイゼーションを可能にし、それゆ え、特異性が低下しうる。 高い厳密性の条件下でのみハイブリダイゼーションするプローブを有すること が望ましい。高い厳密性の条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが 形成するであろう：すなわち、十分な相補性を有しないハイブリッドは形成しな いであろう。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを生じる２個 の核酸鎖間に必要とされる相補性の量を決定する。標的とともに形成されるハイ ブリッドと非標的核酸との間の安定性の相違が最大となるように厳密性の程度を 選択する。本発明の場合、単一の塩基対の変化を検出する必要があり、非常に高 い厳密性の条件が必要である。 第２に、［プローブ：非標的］核酸ハイブリッドの安定性を最小にするように プローブの位置決めをすべきである。非標的生物に対して完全な相補性のある部 分の長さを最小にすることにより、非標的配列に対して相同性のあるＧＣに富む 領域を避けることにより、および可能な限り多くの不安定化ミスマッチをまたぐ ようにプローブの位置決めをすることにより、このことを行ってもよい。配列が 特異的なタイプの生物のみを検出するのに有用であるかどうかは、[プローブ： 標的］ハイブリッドと［プローブ：非標的］ハイブリッドとの間の熱安定性の相 違に大きく依存する。プローブの設計において、これらのＴｍ値の相違はできる だけ大きくすべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。 標的核酸配列の長さ、したがって、プローブ配列の長さも重要である。いくつ かの場合、位置および長さを変えて、特定の領域から数個の配列が存在すること もあり、そのことにより所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブが 得られるであろう。他の場合には、１の配列が、単一塩基のみが異なるもう１つ の配列よりも有意に良いものであるかもしれない。完全には相補的でない核酸が ハイブリダイゼーションすることは可能であるが、完全に相補的な塩基配列の最 大長は、通常、主としてハイブリッドの安定性を決定するであろう。異なる長さ および塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよいが、本発明の好ま しいオリゴヌクレオチドプローブは約５ないし５０（より詳細には１０〜２５） 塩基の長さであり、標的核酸配列に完全に相補的な配列の十分な伸長部分を有す る。 第３に、ハイブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成することが 知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡにおける領域は好ましくない。同様に、非 常に自己相補的なプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリ ダイゼーションは、水素結合した２本鎖を形成する２個の１本鎖の相補的核酸の 結合である。２つの鎖の一方が全体的にあるいは部分的にハイブリッドに包含さ れる場合には新たなハイブリッドの形成に関与しにくくなるであろうと考えられ る。十分な自己相補性がある場合には、あるタイプのプローブ分子中で分子内お よび分子間ハイブリッドが形成されうる。注意深いプローブの設計によってかか る構造を避けることができる。対象配列の実質的な部分が１本鎖であるようにプ ローブを設計することにより、稀であって広範囲のハイブリダイゼーションを非 常に増加させてもよい。このタイプの相互作用を検索するためにコンピューター プログラムが使用可能である。しかしながら、ある場合においては、このタイプ の相互作用を避けることは不可能であるかもしれない。 本発明は、その最も一般的な形態において、可能には含まれているミコバクテ リウム種の同定と連動して、試料中に存在するミコバクテリウム種の抗生物質耐 性スペクトルを検出するための方法であって、下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し ； （ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いて該試 料中に存在する抗生物質耐性遺伝子の重要部分を増幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸を、表２に掲載する少なくとも１つのｒｐｏＢ遺伝子プローブ とハイブリダイゼーションさせ、 （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルからミコ バクテリウムの抗生物質耐性を、そして可能には含まれているミコバクテリウム 種を推定する からなる方法を提供する。 抗生物質耐性遺伝子の重要部分とは、上記リファンピシン、イソニアジド、スト レプトマイシンおよび（フルオロ）キノロンに対する耐性を生じさせる変異を有 するｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ、ｒｐｓＬおよびジャイ レース遺伝子をいう。 本発明の好ましい具体例によれば、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄 条件に用いた場合に所望の結果を示すように慎重に設計されたプローブのセット を用いて工程（iii）を行う。 より詳細には、本発明は、生物学的試料に存在するエム・ツベルクローシスの リファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出方法であって、下記 工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し ； （ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いて該ポ リ核酸に存在するｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し： （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸を、ｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって下記 プローブ（表２参照）： Ｓ１ （配列番号：１） Ｓ１１ （配列番号：２） Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ３ （配列番号：４） Ｓ３３ （配列番号：５） Ｓ４ （配列番号：６） Ｓ４４ （配列番号：７） Ｓ４４４ （配列番号：４３） Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５ （配列番号：９） Ｓ５５ （配列番号：１０） Ｓ５５５ （配列番号：３９） Ｓ５５５５ （配列番号：４０） Ｓ５５Ｃ （配列番号：４４） Ｓ５５Ｍ （配列番号：４５） Ｓ６ （配列番号：１１） Ｓ６６ （配列番号：１２） のうち少なくとも１つからなるセットとハイブリダイゼーションさせ； （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから試料 に存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン感応性（耐性対感受性）を 推定する からなる方法を提供する。 用語「感応性」は、インビトロ培養法により決定される、薬剤、より詳細には 、リファンピシン（および／またはリファブチン）に対する耐性または感受性の いずれかであるエム・ツベルクローシス株の表現型の特性をいう。リファンピシ ン耐性は、Ｓ−プローブの少なくとも１つとハイブリダイゼーションしないこと によって示される。 標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例えば、３ＸＳＳＣ（セ イライン、クエン酸ナトリウム）、２０％脱イオンＦＡ（ホルマリン）、５０℃ である。他の溶液（ＳＳＰＥ（セイライン、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）、Ｔ ＭＡＣｌ（テトラメチルアンモニウムクロリド））および温度を用いることもで きるが、プローブの特異性および感度が維持されることが条件である。必要なら ば、長さまたは配列についてプローブをわずかに変更して、与えられた環境で必 要とされる特異性および感度を維持しなければならない。本発明プローブを用い 、１.４ＸＳＳＣ、０.０７％ＳＤＳ、６２℃に条件を変更することにより、標準 的条件で得られるハイブリダイゼーション結果と同じハイブリダイゼーション結 果が得られ、プローブの配列または長さを適合させる必要はない。 下記プライマーペアーのリストから適当なプライマーペアーを選択することが できる。 より好ましい具体例において、上記工程（i）または（ii）からのポリ核酸を 、一緒になってｒｐｏＢ遺伝子の「変異領域」をカバーする少なくとも２、３、 ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１ ７種の上記Ｓ−プローブ、好ましくは５または６種のＳ−プローブとハイブリダ イゼーションさせる。 用語「変異領域」は、すべてではないとしても、リファンピシン耐性の原因と なる大部分の変異が存在しているｒｐｏＢ遺伝子配列中の領域を意味する。この 変異領域を図１に示す。 より好ましい具体例において、上記工程（i）または（ii）からのポリ核酸を 、ｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって、下記プローブ（表２参 照）： Ｓ１１ （配列番号：２） Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ３３ （配列番号：５） Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５５またはＳ５５５５ （配列番号：１０または４０） のうち少なくとも１種、好ましくはすべてからなるセットとハイブリダイゼーシ ョ ンさせる。 もう１つの特別な具体例において、上記Ｓ−プローブのセットまたはそれらの うちの少なくとも１種を、ＳＩＬ−プローブのうちの１種またはそれ以上と組み 合わせて、ｒｐｏＢ遺伝子中のサイレント変異を検出することができる。好まし いＳＩＬ−プローブはＳＩＬ−１（配列番号：１３、表２参照）である。 本発明のもう１つの具体例において、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プ ローブのセットを、少なくとも１種のＲ−プローブと組み合わせて、リファンピ シリン耐性に関連した特異的変異を検出することができる。 Ｒ−プローブを下記プローブ群（表２参照）： Ｒ１ （配列番号：４６） Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ２Ｂ （配列番号：４７） Ｒ２Ｃ （配列番号：４８） Ｒ３ （配列番号：４９） Ｒ４Ａ （配列番号：１５） Ｒ４４Ａ （配列番号：１６） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４Ｂ （配列番号：１８） Ｒ４４Ｂ （配列番号：１９） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０） Ｒ４Ｃ （配列番号：５０） Ｒ４Ｄ （配列番号：５１） Ｒ４Ｅ （配列番号：５２） Ｒ５ （配列番号：２１） Ｒ５５ （配列番号：２２） Ｒ５Ｂ （配列番号：５３） Ｒ５Ｃ （配列番号：５４） から選択する。 好ましくは、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プローブのセットを、少な くとも２、３、４、５、６、またはそれ以上のＲ−プローブと組み合わせること ができる。 より好ましくは、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プローブのセットを、 下記の限定されたプローブ群： Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０） Ｒ５５ （配列番号：２２） からの少なくとも１種のＲ−プローブと組み合わせる。 ＳおよびＲプローブを組み合わせる場合、Ｓプローブの１種とハイブリダイゼ ーションしないことによって、およびできれば対応Ｒ−プローブとの陽性ハイブ リダイゼーションシグナルによってリファンピシン耐性が示される。 例えば、特定の位置の領域（例えば、表５参照）において、あるいは特異的な 環境（例えば、やや近接したコミュニティー）において、いくつかの変異は他の 変異よりも頻発するので、Ｓおよび／またはＲプローブの選択されたセットを用 いて特異的な変異についてのみスクリーニングすることが適当であるかもしれな い。このことにより、より単純な試験を行うことができ、該試験は一定の環境下 での必要性を満たすであろう。Telentiら、（１９９３年ａおよびｂ）によれば 、彼の刊行物に記載された大部分の変異は比較的まれ（３％またはそれ未満）な ものであり、主な変異はＳ５３１Ｌ（５１.６％）、Ｈ５２６Ｙ（１２.５％）、 Ｄ５１６Ｖ（９.４％）およびＨ５２６Ｄ（７.８％）である。 本発明の特別な具体例において、２種または３種のＳ−プローブの選択された セットを用いる。プローブのそれぞれのセットは： Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５５（またはＳ５５５５） （配列番号：１０または４０） あるいは Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５５（またはＳ５５５５） （配列番号：１０または４０） である。 この限定されたＳ−プローブのセットを用いて、これらのプローブの少なくと も１種とのハイブリダイゼーションシグナルが存在しないことによって、大部分 のリファンピシン耐性の場合を検出することができる。 本発明のもう１つの具体例において、少なくとも１種のＲプローブを用いるが 、できれば２種または３種のＳプローブの選択されたセットとともに用いる。Ｒ プローブは下記プローブのリスト： Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０） Ｒ５５ （配列番号：２２） から選択される。 この場合、Ｒ−プローブの１種との陽性ハイブリダイゼーションシグナルおよ び／または対応Ｓ−プローブとのハイブリダイゼーションの不存在から、リファ ンピシン耐性表現型の原因となっている特異的変異を推定することができる。 本発明のもう１つの具体例において、上記Ｓ、ＳＩＬまたはＲプローブを、エ ム・ツベルクローシスに関する少なくとも１つの種特異的プローブと組み合わせ て、ミコバクテリウム・ツベルクローシスの同定とリファンピシン耐性の検出を 同時に行ってもよく、該種特異的プローブは以下のプローブ群（表２参照）： ＭＴ−ＰＯＬ−１ （配列番号：２３） ＭＴ−ＰＯＬ−２ （配列番号：２４） ＭＴ−ＰＯＬ−３ （配列番号：２５） ＭＴ−ＰＯＬ−４ （配列番号：２６） ＭＴ−ＰＯＬ−５ （配列番号：２７） から選択される。 最も好ましくは、種特異的エム・ツベルクローシスのプローブは： ＭＴ−ＰＯＬ−１ （配列番号：２３） である。 本発明のさらにもう１つの具体例において、上記Ｓ、ＳＩＬ、ＲまたはＭＴ− ＰＯＬプローブを、それぞれ、ＭＰ−ＰＯＬ−１（配列番号：２８）、ＭＡ−Ｐ ＯＬ−１（配列番号：２９）、ＭＳ−ＰＯＬ−１（配列番号：３８）、ＭＫ−Ｐ ＯＬ−１（配列番号：５５）、ＭＩ−ＰＯＬ−１（配列番号：６８）およびＭＬ −ＰＯＬ−１（配列番号：５７）（表２Ｂ参照）である、エム・パラツベルクロ ーシス（M.paratuberculosis）、エム・アビウム（M.avium）、エム・スクロフ ラセウム（M.scrophlaceum）、エム・カンサイイ（M.kansaii）、エム・イント ラセルラレ（M.intracellulare）（およびＭＡＣ−株）またはエム・レプラエ（ M.leprae）に対する少なくとも１つの種特異的プローブ、または図５、６、７、 ８ならびに１１に示すエム・パラツベルクローシス（配列番号：３５）、エム・ アビウム（配列番号：３６）、エム・スクロフラセウム（配列番号：３７）、エ ム・カンサイイ（配列番号：５６）もしくはＭＡＣ−株（配列番号：６９）のｒ ｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列に由来するいずれかの種特異的プローブと組み合 わせることができる。図５〜８および１１に示す配列は新規であることに注意す べきである。エム・イントラセルラレおよびエム・レプラエのｒｐｏＢ遺伝子フ ラグメントの配列は、他人（Guerreroら、１９９４年；HonoreおよびCole、１９ ９３年）によって記載されている。 用語「ＭＡＣ−株」は、ミコバクテリア分類学の当業者に知られた「エム・ア ビウム複合」株を意味する。しかしながら、このどちらかといえば異成分からな るＭＡＣ−株の群は、遺伝子型的にはエム・イントラセルラレ類似の株からなっ ている。また、このことは、単離体ＩＴＧ９２６の場合にもあてはまり、そのｒ ｐｏＢ配列を図１１に示す。それゆえ、配列番号：６９由来のＭＬ−ＰＯＬ−１ プローブおよび公表されているエム・イントラセルラレのｒｐｏＢ配列は、エム ・イントラセルラレおよびいくつかのＭＡＣ株に対して同時に特異的である。 種特異的プローブを包含する上記プローブのすべてはｒｐｏＢ遺伝子配列、よ り詳細には増幅されたｒｐｏＢ遺伝子フラグメント配列に含まれることを強調す べきである。そのうえ、さらに実施例にて説明するように、上記プローブを「好 ましいもの」として設計して、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に おいてそれらがすべて同時に使用できるようにする。これら２つの判断基準は、 単一の増幅およびハイブリダイゼーション工程は、リファンピシン耐性の検出お よび含まれているミコバクテリウム種の同定について十分なものであることを意 味する。 好ましい具体例において、一例として、エム・ツベルクローシスおよびそのリ ファンピシン耐性を検出するための方法であって、下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し； （ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いてｒｐ ｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸を下記プローブ： ＭＴ−ＰＯＬ−１ Ｓ１１ Ｓ２ Ｓ３３ Ｓ４４４４ Ｓ５５またはＳ５５５５ Ｒ２ Ｒ４４４Ａ Ｒ４４４Ｂ Ｒ５５ のセットとハイブリダイゼーションさせ； （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから、エ ム・ツベルクローシスの存在およびそのリファンピシンに対する感受性を推定す る からなる方法が開示される。 ミコバクテリウムの生物および／またはそれらの耐性パターンをオリゴヌクレオ チドプローブの選択されたセットを用いて検出するためには、当該分野で知られ たすべてのハイブリダイゼーション法を用いることができる（慣用的なドットブ ロット、サザンブロット、サンドイッチ等）。 しかしながら、多数のプローブが関与している場合に迅速かつ簡単な結果を得 るためには、逆ハイブリダイゼーションフォーマットが最も便利であるかもしれ ない。 好ましい具体例において、プローブの選択されたセットを固体支持体上に固定 化する。もう１つの好ましい具体例において、プローブの選択されたセットを膜 片に線状に固定化する。該プローブを固体支持体上に別々に固定化してもよく、 あるいは線形でない位置に混合物として固定化してもよい。 上記好ましい方法の特別かつ使用者に好意的な具体例はＬｉＰＡ法であり、上 記プローブのセットは、さらに実施例で説明するように膜上に平行線状に固定化 される。 上記Ｒ−プローブは、すでに先行技術（Telentiら、１９９３年ａおよび１９ ９３年ｂ）において記載されている変異を検出する。しかしながら、さらに実施 例において説明するように、他人によってまだ記載されていない、エム・ツベル クローシスにおけるリファンピシン耐性に関連した４つの新たな変異が本発明に より開示される。本発明Ｓ−プローブを用いて、新たな変異ならびに当該分野で すでに記載されている変異を検出することができる。ｒｐｏＢ遺伝子における完 全な変異領域をカバーするＳ−プローブのセットを用いるというユニークな考え は、すべてではないにしてもリファンピシン耐性の原因となっているｒｐｏＢ遺 伝子における大部分の変異を検出することを可能にし、さらに現在まで記載され ていなかった変異でさえも検出可能とする。 ４種の新たなｒｐｏＢ変異（Ｄ５１６Ｇ、Ｈ５２６Ｃ、Ｈ５２６ＴおよびＲ５ ２９Ｑ）を表１においてアステリスクでマークしてある。一例として、ｒｐｏＢ 変異体対立遺伝子Ｈ５２６Ｃの配列を図２（配列番号：３４）に示す。 また、本発明は、これらの新たなｒｐｏＢ変異を特異的に検出し、あるいは特 異的に増幅するように設計されたプローブまたはプライマーセット、および該プ ライマーセットまたはプローブを用いる方法またはキットを提供する。 もう１つの具体例において、さらに本発明は、生物学的試料に存在するエム・ レプラエのリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出方法であ って、下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し； （ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いてｒｐ ｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸をｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって下記プ ローブ（表２参照）： ＭＬ−Ｓ１ （配列番号：５８） ＭＬ−Ｓ２ （配列番号：５９） ＭＬ−Ｓ３ （配列番号：６０） ＭＬ−Ｓ４ （配列番号：６１） ＭＬ−Ｓ５ （配列番号：６２） ＭＬ−Ｓ６ （配列番号：６３） のうちの少なくとも１つからなるセットとハイブリダイゼーションさせ； （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから、試 料中に存在するエム・レプラエのリファンピシン感受性（耐性とは逆の感受性） を推定する からなる方法を提供する。 少なくとも１種のＭＬ−Ｓ−プローブとハイブリダイゼーションしないことに より、リファンピシン耐性が示される。 本発明のもう１つの具体例において、上記ＭＬ−Ｓプローブを、エム・レプラ エに対する種特異的プローブＭＬ−ＰＯＬ−１と組み合わせて、エム・レプラエ の同定とリファンピシン耐性の検出を同時に行ってもよい。該種特異的プローブ を配列番号：５７に示す。 上記ＭＬ−ＳプローブおよびＭＬ−ＰＯＬ−１プローブはすべて、エム・レプ ラエの増幅された同一のｒｐｏＢ遺伝子フラグメント中に含まれており、同一の ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で使用できるように設計されたもので ある。 さらに本発明は、上記プローブのいずれか、ならびにこれらのプローブの少な くとも１つからなる組成物を提供する。 また、本発明は、エム・ツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子の変異領域の増幅 を可能にするプライマーのセットを提供する。プライマーのセットを下記のセッ トの群： Ｐ１およびＰ５ （配列番号：３０および３３） Ｐ３およびＰ４ （配列番号：３１および３２） Ｐ７およびＰ８ （配列番号：４１および４２） （Ｐ１およびＰ５）もしくは（Ｐ３およびＰ４）もしくは（Ｐ７およびＰ８）と 組み合わされたＰ２およびＰ６ から選択することができる。 もっとも好ましくは、プライマーのセットは以下のものである： Ｐ３およびＰ４ （配列番号：３１および３２）。 さらに本発明は、一般的にマイコバクテリアにおける、すなわち、少なくとも エム・ツベルクローシス、エム・アビウム、エム・パラツベルクローシス、エム ・イントラセルラレ・エム・レプラエ、エム・スクロフラセウムにおけるｒｐｏ Ｂ遺伝子の変異領域の増幅を可能にするプライマーのセットを提供する。例えば 、エム・ツベルクローシス以外のミコバクテリアの存在が疑わしい試料、および より一般的な検出方法を有することが望ましい場合に、これらの一般的プライマ ーを用いることができる。プライマーのセットは、下記セット： ＭＧＲＰＯ−１ （配列番号：６４） ＭＧＲＰＯ−２ （配列番号：６５） から選択される５’−プライマー、および下記セット： ＭＧＲＰＯ−３ （配列番号：６６） ＭＧＲＰＯ−４ （配列番号：６７） から選択される３’−プライマーからなる。 これらのプライマーの配列を表２Ｂに示す。 プライマーを選択された標識（例えば、ビオチン）で標識してもよい。プライ マーに基づく標的増幅系、好ましくは、実施例に示すＰＣＲ増幅を用いてもよい 。単一ラウンドまたはネスティッドＰＣＲ（nested PCR）を用いてもよい。 また、本発明は、可能には含まれているミコバクテリア種の同定と連動して、 生物学的試料に存在するミコバクテリアの抗生物質耐性スペクトルを推定するた めのキットであって、下記成分： （i）適当な場合には、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮す るための手段； （ii）適当な場合には、少なくとも１つの上記プライマーのセット； （iii）可能には固体支持体に固定されている少なくとも１つの上記プローブ 、 （iv）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを製造するの に必要な成分； （v）洗浄溶液、または該溶液を製造するのに必要な成分； （vi）適当な場合には、上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッ ドを検出する手段 からなるキットを提供する。 用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、プローブと試料中に存在する ポリ核酸との間、または適当な厳密な条件下で増幅された生成物との間でハイブ リダイゼーション反応が起こることを可能にするバッファーを意味する。 用語「洗浄溶液」は、適当な厳密な条件下で形成されるハイブリッドの洗浄を 可能にする溶液を意味する。 より詳細には、本発明は、エム・ツベルクローシスおよびそのリファンピシン 耐性を同時に検出するための上記キットを提供する。 もう１つの特別な場合において、本発明は、エム・レプラエおよびそのリファ ンピシン耐性を同時に検出するための上記キットを提供する。 表の説明 表１は、リファンピシン耐性エム・ツベルクローシス単離体のｒｐｏＢ遺伝子 フラグメントにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸の変化（Telentiら（１９９ ３年ａおよびｂ）、Kapurら１９９４年、および本発明により記載されている） をまとめたものである。図１と同様にコドンに番号を付す。本発明による新たな 変異をアステリスク（＊）で示す。 表２は、ｒｐｏＢ遺伝子から選択されるプライマーおよびプローブの配列を掲 載する。 ２Ａ：エム・ツベルクローシス ２Ｂ：他のミコバクテリウム種 表３は、プローブＭＴ−ＰＯＬ−１と異なるミコバクテリウム種ならびに非ミ コバクテリウム種由来のＤＮＡとで得られたハイブリダイゼーション結果を示す 。 表４は、配列決定されたいくつかのエム・ツベルクローシス単離体についてＬ ｉＰＡを用いて得られたいくつかの代表的な結果、および異なるＬｉＰＡパター ンの解釈を示す。 表５は、異なる地域のエム・ツベルクローシスにおける異なるｒｐｏＢ変異の 発生を示す。略号：Ｂｅｌ＝ベルギー、Ｂｅｎｇｌａ＝バングラデシュ、Ｂｕｒ −Ｆａ＝ブルキナ・ファソ、Ｂｕｒｕ＝ブルンジ、Ｃａｎ＝カナダ、Ｃｈｉ＝チ リ、Ｃｏｌ＝コロンビア、Ｅｇｙ＝エジプト、Ｇｕｉ＝ギアナ、Ｈｏｎ＝ホンジ ュラス、Ｐａｋ＝パキスタン、Ｒｗａ＝ルワンダ、Ｔｎｕ＝チュニジア。 表６は、エム・ツベルクローシスに関する培養におけるリファンピシン耐性の 決定とＬｉＰＡの結果との比較を示す。Ｓ＝感受性、Ｒ＝耐性。 図面の説明 図１は、それぞれ、ｒｐｏＢ遺伝子および野生型（すなわち、耐性でない）ミ コバクテリウム・ツベルクローシス株（ＩＴＧ９０８１）のＲＮＡポリメラーゼ のβ−サブユニットの変異領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 コドン（アミノ酸）番号はTelentiら（１９９３年ａ）と同じである。耐性誘導 変化に関与しているヌクレオチドまたはアミノ酸に下線を付す。観察された変異 をボックスに入れてある。横向きのバーはいくつかのオリゴヌクレオチドプロー ブの位置を示す（１つのグループにつき１つのプローブを示す）。 図２は、新たに記載されたエム・ツベルクローシス株ＩＴＧ９００３のｒｐｏ Ｂ変異体対立遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：３４）を示す。 図３は、異なる濃度で膜片に適用されたプローブＳ４４およびＳ４４４４を用 いてＬｉＰＡ片上に得られた結果を示す。標的物質として、エム・ツベルクロー シス株ＩＴＧ８８７２およびＩＴＧ９０８１の核酸標品を用いた。 図４は、ラインプローブアッセイ配置（Line probe assay conformation）で のプローブS４４およびＳ４４４４の品質を比較したものである。片ＡおよびＢ 上のプローブは、Ｓ４４およびＳ４４４４を除いては同じである。エム・ツベル クローシス株ＩＴＧ８８７２由来の増幅材料を用いてハイブリダイゼーションを 行った。 図５は、エム・パラツベルクローシス株３１６Ｆの推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分 ヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。 図６は、エム・アビウム株ＩＴＧ５８８７の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレ オチド配列（配列番号：３６）を示す。 図７は、エム・スクロフラセウム株ＩＴＧ４９７９の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部 分ヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す。 図８は、エム・カンサイイ株ＩＴＧ４９８７の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌク レオチド配列（配列番号：５６）を示す。 図９は、エム・ツベルクローシスにおけるいくつかのｒｐｏＢの変異およびそ れらの対応するＬｉＰＡパターンを示す。変異の命名法は表１と同じ。ＬｉＰＡ パターンの命名法は以下のとおり： ｗｔ＝すべてのＳ−プローブとハイブリダイゼーション陽性であり、すべてのＲ −プローブとハイブリダイゼーション陰性； ΔＳ１−５＝それぞれのＳ−プローブとハイブリダイゼーションせず； Ｒ２、４Ａ、４Ｂ、５＝それぞれのＲ−プローブとハイブリダイゼーション陽性 であり、対応するＳ−プローブとハイブリダイゼーションしない； Ｃ＝陽性対照線：試験を正しく行う場合に陽性となるべきもの； Ｍｔｂ＝ＭＴ−ＰＯＬ−プローブ； 各群の１個のプローブのみを述べるが、それは全群を表す：例えば、Ｓ５は、Ｓ ５、Ｓ５５、Ｓ５５５、Ｓ５５５５、Ｓ５５Ｃ、Ｓ５５Ｍを表す。 図１０は、ＬｉＰＡにより分析されたリファンピシン耐性エム・ツベルクロー シス株において出現した異なる変異の頻度を示す。命名法は図９と同じ。 「Ｍｉｘ」は、株の混合物が試料中に存在したことを意味する。「Ｄｏｕｂｌｅ 」は、１つの株に２つの変異が存在することを意味する。 図１１は、ＭＡＣ株ＩＴＧ９２６の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配 列（配列番号：６９）を示す。実施例１ ：エム・ツベルクローシスにおけるｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの増幅 ミコバクテリウム単離体（培養または体液もしくは組織中のもの）から核酸抽 出後、２μｌの抽出物を用い、５’−プライマー（Ｐ１（配列番号：３０）、Ｐ ２、Ｐ３（配列番号：３１）およびＰ７（配列番号：４１））と３’−プライマ ー（Ｐ４（配列番号：３２）、Ｐ５（配列番号：３３）、Ｐ６およびＰ８（配列 番号：４２））との１またはそれ以上の組み合わせを用いることによりｒｐｏＢ 遺伝子の重要部分を増幅した。 これらのプライマーの配列は表２に示されており、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、 Ｐ７およびＰ８は本発明により記載される新たなプライマー配列であり、Ｐ２お よびＰ６は以前に記載されている（Telentiら、１９９３年ａ）。 これらのプライマーを選択した標識（例えば、ビオチン）で標識してもよい。 異なるプライマーに基づく標的増幅系を用いてもよい。ＰＣＲを用いる増幅には 、 以下に記載する条件を用いる。プライマーＰ１およびＰ５単一ラウンドの増幅は 、４５秒／９４℃、４５秒／５８℃、４５秒／７２℃の３５サイクルを包含して いた。ネスティッドＰＣＲ（nested PCR）が好ましい場合には、第２ラウンドに おいてプライマーＰ３およびＰ４を用い、１μｌの第１ラウンド生成物から、２ ５サイクル（４５秒／９４℃、６０秒／６８℃）を行った。 Ｐ３およびＰ４を単一ラウンドのＰＣＲに用いる場合には、下記サイクリング プロトコールを用いた：１分／９５℃、１分／５５℃、１分／７２℃を３０サイ クル。同じサイクリングプロトコールをプライマーのセットＰ２／Ｐ６に用いた 。 通常には、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、 ２.２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２００μｌの各ｄＮＴＰ、０.０１％ゼラチンおよび１ ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する全体積５０μｌ中でＰＣＲを行った。 プライマー濃度は１０ないし２５ｐｍｏｌ／反応の範囲であった。 プライマーＰ３／Ｐ４のセットはハイブリダイゼーション後にＰ２／Ｐ６のプ ライマーセットよりも有意に強いシグナルを生じたので、当該第１のプライマー セットを以後すべてのハイブリダイゼーション実験に使用した。プライマーＰ２ ／Ｐ６のセットを配列分析に使用した。Ｐ２およびＰ６を外側のプアイマーとし て用いＰ３およびＰ４内側の（ビオチン化）セットとして用いるネスティッドＰ ＣＲを、臨床試料（喀出物および生検材料）における直接検出に用いた。 アガロースゲル電気泳動によりモニターされる増幅生成物の長さは下記のごと し： プライマーセットＰ１／Ｐ５：３７９塩基対 プライマーセットＰ３／Ｐ４：２５７塩基対 プライマーセットＰ２／Ｐ６：４１１塩基対 プライマーセットＰ７／Ｐ８：３３９塩基対実施例２ ：エム・ツベルクローシス株由来のｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの配列 決定 リファンピシン耐性または感受性であることが知られているミコバクテリウム 単離体から抽出したＤＮＡを、プライマーＰ２／Ｐ６のセット（そのうちＰ６は ５’末端がビオチン化されていた）を用いて増幅した。ストレプトアビジン被覆 ビーズおよびTaq Dye Deoxy Terminator/Cycle Sequencingキットを用いてＡＢ Ｉ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA ）により製造者が推奨したようにして１本鎖ＰＣＲ生成物の直接配列決定を行っ た。配列決定に用いたプライマーは、増幅に用いたもの（Ｐ２またはＰ６）以外 の同じものであった。 予想したように、配列決定されたすべての感受性（＝培養において感受性であ り、感受性のＬｉＰＡパターンを示す）株（７株）は野生型配列（変異せず）を 生じた。大部分の耐性株において、変異を確認することができた。これらの変異 の大部分は以前記載されていたものであった（Telentiら、１９９３年ａ、１９ ９３年ｂ、Kapurら、１９９４年）。しかしながら、４つの新たな変異が本発明 に記載されている：Ｄ５１６Ｇ、Ｈ５２６Ｃ、Ｈ５２６ＴおよびＲ５２９Ｑ（表 １の（＊）参照）。対立遺伝子変異体Ｈ５２６Ｃ（単離体ＩＴＧ９００３）の増 幅されたｒｐｏＢフラグメントの全配列を図２（配列番号：３４）に一例として 示す。 少数の株（１８０株中３株、表６参照）は、培養においてはリファンピシン耐 性であったが、野生型ＬｉＰＡパターンを示した。配列決定後、これらの単離体 はすべて野生型ｒｐｏＢ遺伝子配列を示し、ハイブリダイゼーションの結果が確 認された。それゆえ、これらの単離体についてはリファンピシン耐性についての 別の分子機構を適用することができる。実施例３ ：ライン・プローブ・アッセイ（LiPA）片の開発 ライン・プローブ・アッセイの原理およびプロトコールは、少数の例外はある が以前に記載されている（Stuyverら、１９９３年）。ビオチン化ｄＵＴＰを組 み入れるかわりに、ビオチン化プライマーを用い、ハイブリダイゼーションおよ び厳密な洗浄を５０℃において３ｘＳＳＣ／２０％脱イオンホルムアミド中で行 った。 リファンピシン耐性を生じるｒｐｏＢ遺伝子における変異は、主に、６７個の ヌクレオチド（２３個のアミノ酸のコドン）にわたる小さな領域に位置している 。この領域に均等に散在している少なくとも１７個のヌクレオチドが少なくとも ２８個のアミノ酸の変化を生じる変異に関与している。かかるヌクレオチド変化 の複雑性は、単一のハイブリダイゼーション工程におけるこれらすべてのの変化 の検出についての問題を提起する。原理的には、１つの変異部位につき１つの野 生型プローブが必要であり、１つのヌクレオチド変化につき特定の変異を特異的 に検出する１つの変異プローブが必要となろう。それゆえ、ハイブリダイゼーシ ョン試験には約３５種の配列特異的オリゴヌクレオチドが必要であり、この試験 の製造および使用を複雑にし、結果的にこの試験を商業的により魅力のないもの とする。 それゆえ、１つ以上の多型性部位にまたがっており、重要な完全領域（図１参 照）が重複している野生型（Ｓ−）プローブを注意深く選択することにより、特 別なアプローチを開発した。そのようにすることにより、少なくとも１０種の野 生型プローブのセットを全部で５種または６種のプローブに減らすことができた 。これらのプローブを実験的に慎重に調節して、ｒｐｏＢ変異領域における耐性 の原因となる各変異の存在が、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に おける標的とこれらのプローブの少なくとも１つとの間における明確に検出可能 なハイブリッド安定性の低下を生じるようにした。 このプローブの組み合わせを用いて記載されたすべての重要な変異を検出でき るので、リファンピシン耐性をミコバクテリウム・ツベルクローシス単離体にお いてモニターすることができる。このプローブのセットは所望でない変異、例え ば、ＩＴＧ９００３株における位置５２６におけるＴＧＣの変異の存在を検出す ることができる。 野生型プローブの選択パネルに対する変異（Ｒ−）プローブの添加は厳密に見 ると時代遅れであるが、科学的な目的には、正確な点突然変異の存在を検出する ことは有益であるかもしれない。それゆえ、最も頻繁に起こる変異に対応してお り、一緒になってすべての変異の場合の７０％以上を明確に同定することのでき る４つの変異プローブ（Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５）を設計した（図１０参照 ）。さらなる変異プローブ（例えば、Ｒ１、Ｒ２Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ３、Ｒ４Ｃ、Ｒ ４Ｄ、Ｒ４Ｅ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ）をこの４つのプローブのセットに付加して大部 分の臨床的に重要な耐性のケースを明確に同定することができる。混合感染を取 り扱うものでない場合には変異プローブの出現は不可避的に野生型プローブの消 失を引き起こすので、これらのプローブの付加はアッセイの信頼性をも付加する 。いくつかの場合、存在可能な異なる変異の間を識別することは臨床的に重要で あるかもしれない。例えば、位置５１６のアミノ酸において、この状況が生じる かもしれない。その位置において正常（野生型）アミノ酸（アスパラギン酸）が 存在するならば、バリンまたはチロシンへの変化、すなわち、リファンピシンに 対する高レベルの耐性または中レベルの耐性が誘導される。しかしながら、公表 されていないデータは、リファブチンに対する感受性が維持されることを示すよ うである。それゆえ、この変異を有する株による感染については、リファンピシ ンが有効でない場合にリファブチンがなお有効であろう。同じことがコドン５１ １にも言えるかもしれないが、われわれの知識では、これらはリファンピシンと リファブチンの効果が異なりうる唯一の変異部位であり、通常は、リファンピシ ン耐性株はリファブチンにも耐性である。 ＬｉＰＡ片を開発してエム・ツベクローシスにおけるリファンピシン（および ／またはリファブチン）耐性を生じる変異の存在を検出するために、全部で３６ 種のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、逆ハイブリダイゼーション試験にお いて評価した。これらのプローブの配列を表２Ａ（野生型および変異プローブ） に示す。試験した第１のプローブのセットは：Ｓ１１、Ｓ３３、Ｓ４４、Ｓ４４ ４４、Ｓ５５５５、Ｒ４４Ａ、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４Ｂ、Ｒ４４４Ｂ、Ｒ５５であ った。プローブの全パネルから、同じ実験条件下で特異性および感度に関して最 適の特徴を示すプローブを、さらなる使用のために選択した。 一緒になって対象とする全ｒｐｏＢ領域を覆う野生型配列を有する好ましいプ ローブは：Ｓ１１、Ｓ２、Ｓ３３、Ｓ４４４４およびＳ５５またはＳ５５５５（ 表２参照）である。これらのＳ−プローブのいずれかとのハイブリダイゼーショ ン シグナルの消失により耐性が検出されるであろう。 好ましい変異プローブ（Ｒ−プローブ）は：Ｒ２、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４４Ｂお よびＲ５５（表２参照）である。いくつかの耐性の場合、Ｓ−プローブとのハイ ブリダイゼーションシグナルの消失に対応するＲ−プローブとの陽性ハイブリダ イゼーションシグナルが伴うことがありうる。 一例として、いくつかのｒｐｏＢ変異およびそれらの対応ＬｉＰＡパターンを 図９に示す。 同じグループからのプローブ（例えば、Ｓ４、Ｓ４４、Ｓ４４４およびＳ４４ ４４）は互いにわずかに異なるだけであるが、それらのハイブリダイゼーション 特性はかなり異なる。一例として、プローブＳ４４およびＳ４４４４の標的領域 における野生型配列をともに示す２種のエム・ツベルクローシス株（ＩＴＧ８８ ７２およびＩＴＧ９０８１）から得たＰＣＲ生成物を用いるプローブＳ４４およ びＳ４４４４の品質を比較する実験において、このことが説明される。両プロー ブ間の相違を以下に示す： 知られている遺伝子配列（Telentiら、１９９３年ａ）からの理論的基礎に基 づいてプローブＳ４４を選択した。理論的には、このプローブは、ＣＡＣコドン におけるミスマッチを識別するために最良のプローブであろう。なぜなら、この コドンはプローブの中央部分にあるからである。しかしながら、一般的法則とは 対照的に、プローブＳ４４４４の品質が有意により良いものであることがわかっ た（下記実験において説明）。 異なる量（２.４、１.２および０.６ｐｍｏｌ／片）の両方のプローブをニト ロセルロース片に適用した。片の固定およびブロッキング後、上記のごとくプロ ーブをビオチン化ＰＣＲフラグメント（ＩＴＧ８８７２およびＩＴＧ９０８１株 由来）とハイブリダイゼーションさせた。結果を図３に示す。 使用したハイブリダイゼーション条件下で（３ｘＳＳＣ、２０％脱イオンホル ムアミド、５０℃）、プローブＳ４４を用いて得られたシグナルは非常に弱い。 一方、プローブＳ４４４４は非常に強力で信頼できるシグナルを生じる。結果的 に、ＬｉＰＡ片における使用については、プローブＳ４４４４がＳ４４よりも好 ましい。この劇的な効果を両プローブの長さの違いのせいにすることはできない だけでなく、その位置も重要であるように思われる。最も可能性があることには 、プローブの標的領域の２次構造がハイブリダイゼーション特性に非常に影響す るのであろう。 図４において、もう１つの実験結果を示すが、該実験においては両プローブの 品質が他のプローブとの関係において比較される。ＩＴＧ８８７２株から得られ た増幅生成物を用いて両方の片ＡおよびＢを同様に処理する。片ＡがプローブＳ ４４（０.６ｐｍｏｌ）を含み、片ＢがＳ４４４４（０.１ｐｍｏｌ）を含み、片 に適用するプローブの順番が異なる以外は、両方の片はほとんど同じである。両 方の場合に標的とプローブとの間には完璧な合致が存在し、両方の場合に陽性の 結果が得られたであろうが、片ＡにおいてはプローブＳ４４は陰性であるり、片 ＢにおいてはプローブＳ４４４４は明確に陽性である。 これらの結果は、特に、逆ハイブリダイゼーションフォーマットの固定条件に おけるプローブの設計は単純でなく、プローブを逆ハイブリダイゼーションフォ ーマットに使用する前にプローブを慎重に評価しなくてはならないことを明確に 示す。 一般的には、我々は、知られている遺伝子配列による理論的基礎に基づいて適 当なプローブがいつも簡単に誘導されるとは限らないと述べることができる。 本発明において試験された単離体において検出されないとしても、サイレント 変異の存在は、株が感受性であっても片上に耐性パターン（１の野生型プローブ がない）を生じうる。現在まで、ただ１つのサイレント置換が記載されている（ コドン５２８において、ＣＧＣ→ＣＧＴ：Telentiら、１９９３年ａ）。この変 異はプローブＳ−４４４４とのハイブリッドの不安定化を生じるであろう。しか しながら、サイレント変異に特異的なプローブ（プローブＳＩＬ−１,表２）を 片に添加することによって、このサイレント変異を変異を誘導する耐性から識別 す ることができ、観察されたパターンの誤解が防止されるであろう。そのうえ、Ｓ ＩＬ−プローブを、対応Ｓ−プローブ以外の同じ位置において片に適用すること ができる（混合プローブ）。そのようにすることにより、サイレント変異の結果 としてハイブリダイゼーションシグナルの消失は観察されない。 リファンピシン耐性を付与する挿入変異である５１４ｉｎｓＦおよび５１４ｉ ｎｓＦＭ（図１参照）を検出するために、２つの新たな野生型プローブＳ６およ びＳ６６（配列を表２に示す）を設計した。これらの挿入変異を有する株から得 られた核酸とのハイブリダイゼーションにより、Ｓ６およびＳ６６とのハイブリ ダイゼーションシグナルが消失した（表１参照）。 Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４ＢおよびＲ５のセットにより検出された変異よりも多くの 変異を陽性として同定するために、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件 下で用いるＬｉＰＡ片に付加されうる多くのさらなるＲ−プローブを設計した。 上記Ｒ−プローブと一緒になって、さらなるＲ−プローブ（Ｒ１、Ｒ２Ｂ、Ｒ２ Ｃ、Ｒ３、Ｒ４Ｃ、Ｒ４Ｄ、Ｒ４Ｅ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ）は、本願において試験し た株のコレクションに最も頻繁に出現する変異の陽性の同定を可能にする。実施例４ ：エム・ツベルクローシス複合体に特異的なプローブ エム・ツベルクローシスにおける病因の検出に直接連動した、リファンピシン 耐性を引き起こす変異の同時検出を可能にするためにライン・プローブ・アッセ イを開発した。 エム・ツベルクローシスの存在および薬剤耐性を引き起こす遺伝子または変異 の存在または不存在を同時に検出できることは極めて有利であるので、目的は、 同定されるべき重要な耐性マーカーの少なくとも１つと同じＰＣＲフラグメント に含まれているエム・ツベルクローシスのプローブを開発することであった。そ れゆえ、エム・ツベルクローシスでない単離体のｒｐｏＢ遺伝子を配列決定した 。これらの生物は：エム・パラツベルクローシス３１６Ｆ、エム・アビウムＩＴ Ｇ５８８７、エム・スクロフラセウムＩＴＧ４９７９およびエム・カンサイイＩ ＴＧ４９８７であった。対応ｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの配列を図５から８ にそれぞれ示す。さらに、エム・レプラエおよびエム・イントラセルラレの Guerreroら、１９９４年）。これらの配列とエム・ツベルクローシスのｒｐｏＢ 遺伝子との比較により、エム・ツベルクローシスに対して潜在的に特異的なプロ ーブの開発が可能と思われるｒｐｏＢ遺伝子フラグメント中の特異的領域（耐性 の原因となっている領域の外側）の輪郭を描くことが可能となった。下記配列： を有する当該領域由来のオリゴヌクレオチドプローブ（ＭＴ−ＰＯＬ−１という ）を、ＬｉＰＡ片上でのハイブリダイゼーションにより、その感度および特異性 についてさらに評価した。結果を表３にまとめる。表３に掲載した４種のエム・ ツベルクローシスのほかに、５２１個のさらなるエム・ツベルクローシスの臨床 単離体を試験した。すべての単離体は陽性のハイブリダイゼーションシグナルを 生じた。明らかに、エム・ボビス（M.bovis）株も該プローブとハイブリダイゼ ーションしたが、この目的もためにエム・ツベルクローシスをエム・ボビスから 識別することは臨床的に重要でない。実際、本願全体において、用語「エム・ツ ベルクローシス」を「エム・ツベルクローシス複合体」と置き換えることができ 、結果の有意さに影響することなく、エム・ツベルクローシスｓ．ｓ、エム・ボ ビス、エム・アフリカヌム（M.africanum）およびエム・ミクロチ（M.microti） をいう。 実施例１に記載したプライマーのセットを用いて、いくつかの他のミコバクテ リウム種および気道に存在しうる遺伝学的に関連のない微生物のＤＮＡとともに ＰＣＲ生成物を得てもよいが、これらの細菌は選択されたＭＴ−ＰＯＬ−１プロ ーブとハイブリダイゼーションを示さなかった。結論として、我々は、選択され たプローブはエム・ツベルクローシス複合体に非常に特異的であり、エム・ツベ ルクローシスに対して１００％感度があるといえる。ＭＴ−ＰＯＬ−２、ＭＴ− ＰＯＬ−３、ＭＴ−ＰＯＬ−４およびＭＴ−ＰＯＬ−５のごときこの領域由来の 他のプローブ（表２参照）も、エム・ツベルクローシス複合体株の特異的検出に 有用でありうる。 同様にして、以下のプローブ：ＭＡ−ＰＯＬ−１、ＭＰ−ＰＯＬ−１、ＭＳ− ＰＯＬ−１、ＭＫ−ＰＯＬ−１、ＭＩ−ＰＯＬ−１およびＭＬ−ＰＯＬ−１（表 ２Ｂ参照）をそれぞれ用いてエム・アビウム、エム・パラツベルクローシス、エ ム・スクロフラセウム、エム・カンサイイ、エム・イントラセルラレおよびエム ・レプラエ株を互いに、そして他のミコバクテリアから識別することができる。実施例５ ：エム・ツベルクローシスに関するＬｉＰＡ片の評価 以下のプローブ：ＭＴ−ＰＯＬ−１、Ｓ１１、Ｓ２、Ｓ３３、Ｓ４４４４、Ｓ ５５５５、Ｒ２、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４４Ｂ、Ｒ５５を有するＬＩＰＡ片を調製し た（陽性対照線のほかに）。 これらの片を、重要なｒｐｏＢ遺伝子配列が決定されたエム・ツベルクローシ ス株由来のＰＣＲ生成物とハイブリダイゼーションさせた。 いくつかの代表的な結果を表４にまとめる。 ハイブリダイゼーションの結果は配列決定の結果と完全に対応し、使用プロー ブは単一のミスマッチのレベルで識別可能であることが示される。野生型プロー ブ（Ｓ−プローブ）のうちの１つの不存在により、あるいは対応変異プローブ（ Ｒ−プローブ）の存在を伴う野生型プローブに不存在により、スクリーニングさ れた各変異を検出することができた。後者の場合、存在する正確な変異はハイブ リダイゼーション結果から得ることができる。しかしながら、スクリーニングさ れた各変異が耐性を付与するので、リファンピシン耐性株を取り扱うのか否かを 決定するためには存在する正確な変異についての知識は必要ない。感受性株、す なわち、ｒｐｏＢ遺伝子の重要部分に変異を有していない株はすべてのＳ−プロ ーブについて陽性の反応を示すが、すべてのＲ−プローブスコアは陰性である（ ＝ｗｔパターン）。実施例６ ：臨床試料中のエム・ツベルクローシス株およびリファンピシン耐性の 直接検出 エム・ツベルクローシスに関する培養においてすべて陽性であり、−２０℃に 保存された、異なる地域から得た６８個の臨床試料（１３個および３５個の痰試 料はそれぞれベルギーおよびルワンダから、２０個のリンパ節生検材料はブルン ジから）を分析した。増幅のための試料の調製は、De Beenhouwerら（投稿中） により改変されたBoomら（１９９０年）の手順によった。ｒｐｏＢ遺伝子の重要 領域に対するネスティッドＰＣＲ法を、ビオチン化内部プライマー（Ｐ３および Ｐ４）を用いて行った。サーマルサイクリングの後、増幅された生成物をＬｉＰ Ａ片とともにインキュベーションした。Canettiら（１９６３年）の比例 株について、７Ｈ１０寒天（Heifets、１９８８年）上でリファンピシンのＭＩ Ｃ（最小阻害濃度）を決定した。 顕微鏡により、Ziehl-Neeisen染色で、２０個（２９.４％）の試料が陰性であ り、１５個（２２.１％）が弱い陽性（アメリカ胸部協会のスケールによれば＋ １またはそれ未満）であり、３３個（４８.５％）が強い陽性（≧＋２）であっ た。 ＬｉＰＡにより、４９個の標本においてリファンピシン感受性が検出され（エ ム・ツベルクローシスのみ、および野生型プローブ陽性）、１９個の標本におい て耐性が検出された（エム・ツベルクローシスプローブ陽性、野生型プローブの １つが消失、結局は変異プローブの１つ陽性）。インビトロでのリファンピシン 感受性試験により、３つの例外があったがこれらの結果が確認された。すべての 感受性株については、感受性プローブのパターンが観察され、可能性のあるサイ レント変異はこのシリーズにおいては検出されないことが示された。耐性パター ンを示すすべての株は、慣用的方法により、耐性であることがわかった。３つの 標本（ルワンダからの３人の多剤耐性患者由来のもの）については、ＰＣＲ−Ｌ ｉＰＡにより感受性のパターンが観察されたが、培養により耐性が明らかとなっ た（７Ｈ１０上でＭＩＣ＞２μｇ／ｍｌ）。これらの株のｒｐｏＢ領域の配列決 定により野生型遺伝子配列が確認され、おそらく、これらのケースにおいては別 のリファンピシン耐性機構またはｒｐｏＢ遺伝子の別の部分における変異が示唆 された。ネスティッドＰＣＲ系により、２０個のZiehl-Neeisen陰性標本を含む 、培養における陽性試験標本すべてについて陽性の結果が生じたことも注目に値 する。培養において陰性である臨床的に結核の疑いのあるケースから得られた１ ７個のあいまいに陰性の痰標本を包含する別の実験（データ示さず）においては 、ＬｉＰＡ系では全くシグナルを得られず、最も可能性の高いことには感染がエ ム・ツベルクローシスによって引き起こされたものではないことが示された。 引き続いて行った実験において、異なる地域からの大規模な臨床標本のコレク ションをＬｉＰＡにおいて試験した。結果を表５に示す。見いだされた１３７個 の耐性株のうち、非常に大多数がＲ−プローブ（Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５） により示される変異の１つによるものとすることができた。興味深いことに、い くつかの変異は、他の国と比較すると、いくつかの国においてより頻発するよう に思える（例えば、チュニジアおよびエジプトにおいてＲ４Ｂ（＝Ｈ５２６Ｄ） 、ルワンダにおいてＲ５（Ｓ５３１Ｌ））。結局、このことは異なる国に関する 異なる試験フォーマットにつながる。 本願においてＬｉＰＡにより分析された全部で２１３個のリファンピシン耐性 株について、１５１個（７１％）が変異Ｓ５３１Ｌ、Ｈ５２６Ｄ、Ｄ５１６Ｖま たはＨ５２６Ｙによるものとすることができ、よって、それぞれプローブＲ５、 Ｒ４Ｂ、Ｒ２およびＲ４Ａとの陽性シグナルによって検出された（図１０参照） 。 培養およびＬｉＰＡの両方により分析された全部で１８０株につき、正確な同 定（感受性／耐性）を１６４株（＝９１.１％）において行った（表６参照）。 ３つの耐性株において、ＬｉＰＡの結果および配列決定により野生型ｒｐｏＢ遺 伝子フラグメントが示され、そのことは、リファンピシン耐性に関する機構はｒ ｐｏＢ遺伝子の調べられた部分における変異によるものとすることができないと いうことを示す。 分析された１８０株中３０株はＬｉＰＡにおいて耐性であったが、培養におい ては感受性であるように見えた。しかしながら、これら１３株のうちの２株は、 かくリファンピシン耐性に変化した。いままで公表されていないこの知見は、慣 の卵中の痕跡量の抗生物質の存在による）。それゆえ、培養を７Ｈ１１のような 合成培地で行う場合には、ＬｉＰＡにおいては耐性であるが培養においては感受 性である矛盾した株のパーセンテージ（この場合１３／１８０＝７.２％）はず っと低く、おそらく０％と予想できる。 興味深いことに、本願において試験された大部分のリファンピシン耐性単離体 は、さらにイソニアジド耐性であり、よって多剤耐性であった（多剤耐性の定義 ＝少なくともイソニアジドおよびリファンピシンに耐性）。よって、リファンピ シン耐性を多剤耐性の可能性のあるマーカーと考えることができ、それゆえ、上 記ＬｉＰＡ試験は多剤耐性結核菌の対照のための重要な道具でありうる。 結論として、上記方法は、前培養を行わずに、臨床標本中における直接的なエ ム・ツベルクローシスの正しい同定およびリファンピシン耐性の同時検出を可能 にするものである。該方法は、２４時間以内に、臨床標本中における直接的なリ ファンピシン耐性の容易な検出を可能にする。実施例７ ：エム・レプラエにおけるリファンピシン耐性の検出 上記検出方法を、リファンピシン耐性の検出に連動した、生物学的試料に存在 するエム・レプラエの検出にも適用することもできる。エム・レプラエの た。それらは、エム・レプラエにおけるリファンピシン耐性の原因となる限られ た数の変異が同定されただけであった。エム・ツベルクローシスと同様に、他の 多くの変異がエム・レプラエにおけるリファンピシン耐性を引き起こしうるもの であり、これらの変異の大部分が、むしろ、本願で先に述べた「変異領域」に対 応したｒｐｏＢ遺伝子の限られた領域に局在化しているであろうと合理的に考え ることができる。 それゆえ、エム・レプラエのｒｐｏＢ遺伝子における推定上の変異領域にまた がっている野生型プローブのセット： ＭＬ−Ｓ１ （配列番号：５８） ＭＬ−Ｓ２ （配列番号：５９） ＭＬ−Ｓ３ （配列番号：６０） ＭＬ−Ｓ４ （配列番号：６１） ＭＬ−Ｓ５ （配列番号：６２） ＭＬ−Ｓ６ （配列番号：６３） を選択する（表２Ｂ参照）。 これらのＭＬ−Ｓプローブの少なくとも１つとのハイブリダイゼーションの不 存在によってリファンピシン耐性が示される。これらの変異配列がまだ特定され ていないとしても、このＭＬ−Ｓプローブのセットは、この領域におけるリファ ンピシン耐性を引き起こす変異を検出するであろう。 上記ＭＬ−Ｓプローブを、それらすべてが同じハイブリダイゼーションおよび 洗浄条件下で用いることのできるように、注意深く設計した。同じことが、ＭＬ −Ｓプローブが一緒になってエム・レプラエおよびリファンピシン耐性の同時検 出を可能にすることのできる種特異的ＭＬ−ＰＯＬ−１プローブについてもいえ る。 この実施例において述べたすべてのプローブはエム・レプラエの同じｒｐｏＢ 遺伝子に含まれており、ＭＧＰＲＯ−１もしくはＭＧＰＲＯ−２（５’プライマ ー）およびＭＧＰＲＯ−３もしくはＭＧＰＲＯ−４（３’プライマー）から選択 されるプライマーのセットを用いるＰＣＲにより得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 マフテリンクス，リーフェ ベルギー、ベー−8560ギュルジャン、メケ ルプラ20番 (72)発明者 ヤネス，ヘールト ベルギー、ベー−3010ケッセル−ロ、エ ー・ファン・ホーレンベケラーン23ブス１ 番 (72)発明者 ロサウ，ルディ ベルギー、ベー−2180エケーレン、ウィル ヘフーフェストラート45番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．可能には含まれているミコバクテリウム種の同定と連動して、試料中に存 在するミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルを検出するための方法であ って、下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し ； （ii）必要ならば、請求項２２ないし２４記載の少なくとも１つの適当なプラ イマーのペアーを用いて該試料中に存在する抗生物質耐性遺伝子の重要部分を増 幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸を、表２に掲載された少なくとも１つのｒｐｏＢ遺伝子プロー ブとハイブリダイゼーションさせ、 （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルからミコ バクテリウムの抗生物質耐性スペクトルを、そして可能には含まれているミコバ クテリウム種を推定する からなる方法。 ２．生物学的試料に存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン（およ び／またはリファブチン）耐性を検出するための請求項１記載の方法であって、 下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し ； （ii）必要ならば、請求項２２ないし２３に記載の少なくとも１つの適当なプ ライマーのペアーを用いて該ポリ核酸に存在するｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増 幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸を、表２に掲載されたｒｐｏＢ野生型またはＳ−プローブ： Ｓ１ （配列番号：１） Ｓ１１ （配列番号：２） Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ３ （配列番号：４） Ｓ３３ （配列番号：５） Ｓ４ （配列番号：６） Ｓ４４ （配列番号：７） Ｓ４４４ （配列番号：４３） Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５ （配列番号：９） Ｓ５５ （配列番号：１０） Ｓ５５５ （配列番号：３９） Ｓ５５５５ （配列番号：４０） Ｓ５５Ｃ （配列番号：４４） Ｓ５５Ｍ （配列番号：４５） Ｓ６ （配列番号：１１）および／または Ｓ６６ （配列番号：１２） のうち少なくとも１つからなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさせ ； （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから試料 に存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン感応性（耐性対感受性）を 推定する からなる方法。 ３．工程（iii）が、請求項２に掲載されたＳ−プローブのうちの少なくとも ５または６個からなるプローブのセットとのハイブリダイゼーションからなり、 該プローブは一緒になってｒｐｏＢ遺伝子の変異領域をカバーするものである、 請求項２記載の方法。 ４．表２に掲載された下記Ｓ−プローブのセット： Ｓ１１ （配列番号：２） Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ３３ （配列番号：５） Ｓ４４４４ （配列番号：８）および／または Ｓ５５またはＳ５５５５（配列番号：１０または４０） のうちの少なくとも１種、好ましくはすべてからなるプローブのセットとハイブ リダイゼーションさせることからなる、請求項２または３に記載の方法。 ５．工程（iii）が、請求項２ないし４のいずれかにおいて定義されたプロー ブのセットであって、さらに、 ＳＩＬ−１ （配列番号：１３） のごとき表２に掲載された少なくとも１つのｒｐｏＢサイレント変異プローブか らなるセットとハイブリダイゼーションさせることからなる、請求項２ないし４ のいずれかに記載の方法。 ６．工程（iii）が請求項２ないし５のいずれかに定義されたプローブのセッ トとハイブリダイゼーションさせることからなり、該セットはさらに少なくとも １つのｒｐｏＢ変異またはＲ−プローブからなり、該プローブは表２に掲載され たｒｐｏＢ変異またはＲ−プローブのリスト： Ｒ１ （配列番号：４６） Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ２Ｂ （配列番号：４７） Ｒ２Ｃ （配列番号：４８） Ｒ３ （配列番号：４９） Ｒ４Ａ （配列番号：１５） Ｒ４４Ａ （配列番号：１６） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４Ｂ （配列番号：１８） Ｒ４４Ｂ （配列番号：１９） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０） Ｒ４Ｃ （配列番号：５０） Ｒ４Ｄ （配列番号：５１） Ｒ４Ｅ （配列番号：５２） Ｒ５ （配列番号：２１） Ｒ５５ （配列番号：２２） Ｒ５Ｂ （配列番号：５３）および／または Ｒ５Ｃ （配列番号：５４） から選択されるものである、請求項２ないし５のいずれかに記載の方法。 ７．工程（iii）が、表２に掲載された下記のＲ−プローブ： Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０）および／または Ｒ５５ （配列番号：２２） のうちの少なくとも１つからなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさ せることからなる、請求項６記載の方法。 ８．工程（iii）が、少なくとも表２に掲載された下記のＳ−プローブ： Ｓ４４４４ （配列番号：８）および Ｓ５５（またはＳ５５５５） （配列番号：１０または４０） からなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなる、請求 項２記載の方法。 ９．工程（iii）が、少なくとも表２に掲載された下記のＳ−プローブ： Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ４４４４ （配列番号：８）および Ｓ５５（またはＳ５５５５） （配列番号：１０または４０） からなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなる、請求 項２記載の方法。 １０．工程（iii）が、さらに表２に掲載されたＲ−プローブの下記リスト： Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０）および／または Ｒ５５ （配列番号：２２） から選択される少なくとも１つのＲ−プローブからなるプローブのセットとハイ ブリダイゼーションさせることからなる、請求項８または９のいずれかに記載の 方法。 １１．試料中に存在するミコバクテリウム・ツベルクローシスの同定およびそ のリファンピシン（および／またはリファンブチン）耐性の検出を同時に行うた めの請求項２ないし１０のいずれかに記載の方法であって、工程（iii）が、さ らに、ミコバクテリウム・ツベルクローシスに特異的な少なくとも１つのプロー ブであって、増幅されたｒｐｏＢ遺伝子フラグメント中に優先的に含まれており 、表２に掲載された下記プローブ群： ＭＴ−ＰＯＬ−１ （配列番号：２３） ＭＴ−ＰＯＬ−２ （配列番号：２４） ＭＴ−ＰＯＬ−３ （配列番号：２５） ＭＴ−ＰＯＬ−４ （配列番号：２６）および／または ＭＴ−ＰＯＬ−５ （配列番号：２７） から優先的に選択されるプローブからなるプローブのセットとハイブリダイゼー ションさせることからなる方法。 １２．工程（iii）が、表２に掲載された下記プローブ： ＭＴ−ＰＯＬ−１ （配列番号：２３） からなるプローブのセットにハイブリダイゼーションさせることからなる、請求 項１１記載の方法。 １３．エム・ツベルクローシスのリファンピシン耐性の検出と連動した、エム ・ツベルクローシスおよびエム・ツベルクローシス以外のミコバクテリアの同定 方法であって、工程（iii）が、さらに表２において特定される下記種特異的プ ローブ： ＭＰ−ＰＯＬ−１（配列番号：２８）、 ＭＡ−ＰＯＬ−１（配列番号：２９）、 ＭＳ−ＰＯＬ−１（配列番号：３８）、 ＭＫ−ＰＯＬ−１（配列番号：５５）、 ＭＩ−ＰＯＬ−１（配列番号：６８）および／または ＭＬ−ＰＯＬ−１（配列番号：５７）、 および／またはエム・パラツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列 （配列番号：３５）由来のいずれかのエム・パラツベルクローシス特異的プロー ブ、 および／またはエム・アビウムのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号： ３６）由来のいずれかのエム・アビウム特異的プローブ、 および／またはエム・スクロフラセウムのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配 列番号：３７）由来のいずれかのエム・スクロフラセウム特異的プローブ、 および／またはエム・カンサイイのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号 ：５６）由来のいずれかのエム・カンサイイ特異的プローブ、 および／またはＭＡＣ株のｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：６９） 由来のいずれかのＭＡＣ株特異的プローブ の少なくとも１つからなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさせるこ とからなる、請求項１１または１２記載の方法。 １４．工程（iii）が、表２に掲載された下記プローブ： ＭＴ−ＰＯＬ−１ （配列番号：２３） Ｓ１１ （配列番号：２） Ｓ２ （配列番号：３） Ｓ３３ （配列番号：５） Ｓ４４４４ （配列番号：８） Ｓ５５またはＳ５５５５ （配列番号：１０または４０） Ｒ２ （配列番号：１４） Ｒ４４４Ａ （配列番号：１７） Ｒ４４４Ｂ （配列番号：２０）および Ｒ５５ （配列番号：２２） のセットとハイブリダイゼーションさせることからなる、請求項１２記載の方法 。 １５．新たなｒｐｏＢ遺伝子の変異であるＤ５１６Ｇ、Ｈ５２６Ｃ、Ｈ５２６ ＴおよびＲ５２９Ｑを特異的に検出し増幅するように設計されたプローブまたは プライマーのセットを用いる、試料中に存在するリファンピシン（および／また はリファンブチン）耐性ミコバクテリウム・ツベルクローシスの検出のための請 求項２ないし１４のいずれかに記載の方法。 １６．生物学的試料に存在するエム・レプラエのリファンピシン（および／ま たはリファブチン）耐性の検出方法であって、下記工程： （i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し； （ii）必要ならば、請求項２４記載の少なくとも１つの適当なプライマーのペ アーを用いてｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し； （iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または （ii）のポリ核酸をｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって表２に 掲載された下記プローブ： ＭＬ−Ｓ１ （配列番号：５８） ＭＬ−Ｓ２ （配列番号：５９） ＭＬ−Ｓ３ （配列番号：６０） ＭＬ−Ｓ４ （配列番号：６１） ＭＬ−Ｓ５ （配列番号：６２）または ＭＬ−Ｓ６ （配列番号：６３） のうちの少なくとも１つからなるセットとハイブリダイゼーションさせ； （iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し； （v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから、試 料中に存在するエム・レプラエのリファンピシン感受性（耐性とは逆の感受性） を推定する からなる方法。 １７．エム・レプラエの同定およびエム・レプラエのリファンピシン耐性の検 出を同時に行う請求項１６記載の方法であって、工程（iii）が、さらに、表２ に掲載された下記プローブ： ＭＬ−ＰＯＬ−１ （配列番号：５７） からなるプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなる方法。 １８．該オリゴヌクレオチドプローブが固体支持体に固定化される請求項１な いし１７のいずれかにおいて定義されたいずれかのプローブからなる逆相ハイブ リダイゼーション方法（reverse phase hybridization method）。 １９．該オリゴヌクレオチドプローブが膜片上に固定化される請求項１８記載 の逆相ハイブリダイゼーション法。 ２０．請求項１ないし１７のいずれかに記載のプローブ。 ２１．請求項１ないし１７において定義されたいずれかのプローブからなる組 成物。 ２２．表２に掲載された下記プライマー： Ｐ１およびＰ５ （配列番号：３０および３３） Ｐ３およびＰ４ （配列番号：３１および３２） Ｐ７およびＰ８ （配列番号：４１および４２）、または （Ｐ１およびＰ５）もしくは（Ｐ３およびＰ４）もしくは（Ｐ７およびＰ８）と 組み合わされたＰ２およびＰ６ のセットから選択される、エム・ツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子の変異領域 の増幅を可能にするプライマーのセット。 ２３．該プライマーが、表２に掲載された下記プライマー： Ｐ３およびＰ４ （配列番号：３２） である、請求項２２記載のプライマーのセット。 ２４．ＭＧＲＰＯ−１ （配列番号：６４）または ＭＧＲＰＯ−２ （配列番号：６５） から選択される５’−プライマー、および下記セット： ＭＧＲＰＯ−３ （配列番号：６６）または ＭＧＲＰＯ−４ （配列番号：６７） から選択される３’−プライマーからなる、エム・ツベルクローシス以外のミコ バクテリアにおけるｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの増幅を可能にするプライマー のセット。 ２５．可能には含まれているミコバクテリア種の同定と連動して、生物学的試 料に存在するミコバクテリアの抗生物質耐性スペクトルを推定するためのキット であって、下記成分： （i）適当な場合には、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮す るための手段； （ii）適当な場合には、少なくとも１つの上記プライマーのセット； （iii）可能には固体支持体に固定されている少なくとも１つの上記プローブ 、 （iv）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを製造するの に必要な成分； （v）洗浄溶液、または該溶液を製造するのに必要な成分； （vi）適当な場合には、上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッ トを検出する手段 からなるキット。 ２６．エム・ツベルクローシスおよびそのリファンピシン耐性の同時検出のた めの請求項２５記載のキットであって、工程（ii）のプライマーのセットが請求 項２２ないし２３において定義されるものであり、工程（iii）のプローブが請 求項２ないし１５のいずれかにおいて定義されるものであるキット。 ２７．エム・レプラエおよびそのリファンピシン耐性の同時検出のための請求 項２５記載のキットであって、工程（ii）のプライマーのセットが請求項２４に おいて定義されるものであり、工程（iii）のプローブが請求項１６ないし１７ のいずれかにおいて定義されるものであるキット。