JP3408564B2 - 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 - Google Patents
結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本出願は１９９２年４月３０日に
出願した通し番号Ｎｏ．８７５，９４０の一部継続出願
である。本発明は抗生物質イソニアジドに抵抗性の結核
菌株の迅速検出に関するものである。より詳しくいえ
ば、本発明は核酸ハイブリダイゼーションにより結核菌
中のイソニアジド抵抗性を検出する方法に関する。本発
明はまた核酸プローブおよび核酸ハイブリダイゼーショ
ンを実施するためのキットに関するものである。
出願した通し番号Ｎｏ．８７５，９４０の一部継続出願
である。本発明は抗生物質イソニアジドに抵抗性の結核
菌株の迅速検出に関するものである。より詳しくいえ
ば、本発明は核酸ハイブリダイゼーションにより結核菌
中のイソニアジド抵抗性を検出する方法に関する。本発
明はまた核酸プローブおよび核酸ハイブリダイゼーショ
ンを実施するためのキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】結核の病原因子としてロベルド・コッホ
により結核菌が発見されて以来一世紀以上にわたる研究
にもかかわらず、結核は依然としてヒトの罹病率と死亡
率の主要な原因の一つになっている。結核による死亡は
毎年３００万人に達しており（Ｓｎｉｄｅｒ，１９８
９）、これらの大半は発展途上国であるが西側でもホー
ムレス人口の増加とＡＩＤＳ流行の影響によって結核は
再び重要な問題となっている（Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅ
ｒ，１９９２）。
により結核菌が発見されて以来一世紀以上にわたる研究
にもかかわらず、結核は依然としてヒトの罹病率と死亡
率の主要な原因の一つになっている。結核による死亡は
毎年３００万人に達しており（Ｓｎｉｄｅｒ，１９８
９）、これらの大半は発展途上国であるが西側でもホー
ムレス人口の増加とＡＩＤＳ流行の影響によって結核は
再び重要な問題となっている（Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８９；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅ
ｒ，１９９２）。
【０００３】イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちイソ
ニアジド（ＩＮＨ）は“結核”群−ヒト型結核菌、ウシ
型結核菌およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍの菌種に対して
強い薬効をもつことから過去４０年間結核の治療に用い
られてきた（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏ
ｕａｔｔ，１９６９）。ＩＮＨの標的は正確にはわから
ないし、また作用機作も知られていないが、本剤の投与
等よっていくつかの代謝系路が乱されることがわかって
いる。ＩＮＨがＮＡＤおよびピリドキサルリン酸の抗代
謝体として作用するらしいことを示すたくさんの証拠が
あり（Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅ
ｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈａｎｄ Ｒａｍａ
ｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ
Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０）、ま
たそのほか結核菌細胞壁の酸抵抗特性の原因となってい
るミコール酸の合成を本剤がブロックすることを示すデ
ータがある（Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ
１９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９
１）。ＩＮＨが使用されるようになって間もなく、ＩＮ
Ｈ−抵抗性の結核菌分離菌が出現し、特性をしらべた結
果カタラーゼ−パーオキシダーゼ活性がなくなり、モル
モットで菌毒性が弱まっていることがわかった（Ｍｉｄ
ｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉ
ｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ
ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０）
ニアジド（ＩＮＨ）は“結核”群−ヒト型結核菌、ウシ
型結核菌およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍの菌種に対して
強い薬効をもつことから過去４０年間結核の治療に用い
られてきた（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，１９５２；Ｙｏ
ｕａｔｔ，１９６９）。ＩＮＨの標的は正確にはわから
ないし、また作用機作も知られていないが、本剤の投与
等よっていくつかの代謝系路が乱されることがわかって
いる。ＩＮＨがＮＡＤおよびピリドキサルリン酸の抗代
謝体として作用するらしいことを示すたくさんの証拠が
あり（Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ ａｎｄ Ｂｒｉｃｋｅ
ｒ，１９６７；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈａｎｄ Ｒａｍａ
ｋｒｉｓｈｎａｎ，１９７０；Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ
Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９６８，１９６９，１９７０）、ま
たそのほか結核菌細胞壁の酸抵抗特性の原因となってい
るミコール酸の合成を本剤がブロックすることを示すデ
ータがある（Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ
１９７０；Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９
１）。ＩＮＨが使用されるようになって間もなく、ＩＮ
Ｈ−抵抗性の結核菌分離菌が出現し、特性をしらべた結
果カタラーゼ−パーオキシダーゼ活性がなくなり、モル
モットで菌毒性が弱まっていることがわかった（Ｍｉｄ
ｄｌｅｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９５４；Ｋｕｂｉ
ｃａ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ
ａｎｄ Ｒａｍａ−Ｋｒｉｓｈｍａｎ，１９７０）
【０００４】ごく最近になって、結核菌の多剤抵抗（Ｍ
ＤＲ）変種によるＵＳＡでの結核の流行（ＣＤＣ，１９
９０；１９９１ａ，ｂ）ならびにこれら変異株がＨＩＶ
−感染者とヘルスケア従事者の広範な院内感染の原因に
なっていることがわかったことから、ＩＮＨ−抵抗性の
問題は新しい重要性をもつに至った（Ｓｎｉｄｅｒａｎ
ｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。この問題の重要性にかん
がみ、ＩＮＨ抵抗性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産
生の関連をはっきりさせる必要がある。
ＤＲ）変種によるＵＳＡでの結核の流行（ＣＤＣ，１９
９０；１９９１ａ，ｂ）ならびにこれら変異株がＨＩＶ
−感染者とヘルスケア従事者の広範な院内感染の原因に
なっていることがわかったことから、ＩＮＨ−抵抗性の
問題は新しい重要性をもつに至った（Ｓｎｉｄｅｒａｎ
ｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９２）。この問題の重要性にかん
がみ、ＩＮＨ抵抗性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産
生の関連をはっきりさせる必要がある。
【０００５】より詳しくいえば、薬剤感受性に含まれる
分子機構を知る必要がある。加えて、ＩＮＨ−抵抗株を
迅速に同定することのできる簡単な試験法を開発する必
要がある。さらに、このような試験法を実施するための
試薬を作ることが必要である。
分子機構を知る必要がある。加えて、ＩＮＨ−抵抗株を
迅速に同定することのできる簡単な試験法を開発する必
要がある。さらに、このような試験法を実施するための
試薬を作ることが必要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明はイ
ソニアジドに抵抗性の結核菌細胞の存在をｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで検出するプロセスを提供することによって上述の
諸要求を満たすことについて手助けする。そのプロセス
は以下の段階から成る： （Ａ） 細胞の核酸を沈着、固定してそれがプローブに
近接できるようにする； （Ｂ） ステップ（Ａ）から得られた固定化核酸をハイ
ブリダイゼーションのできる条件下でプローブと接触さ
せる； （Ｃ） ステップ（Ｂ）からのフィルターを洗滌してハ
イブリッド形成しなかったプローブをすべて除去する；
ついでそのあと （Ｄ） ステップ（Ｃ）から得られた洗滌済みフィルタ
ー上のハイブリッド形成したすべてのプローブを検出す
る。
ソニアジドに抵抗性の結核菌細胞の存在をｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで検出するプロセスを提供することによって上述の
諸要求を満たすことについて手助けする。そのプロセス
は以下の段階から成る： （Ａ） 細胞の核酸を沈着、固定してそれがプローブに
近接できるようにする； （Ｂ） ステップ（Ａ）から得られた固定化核酸をハイ
ブリダイゼーションのできる条件下でプローブと接触さ
せる； （Ｃ） ステップ（Ｂ）からのフィルターを洗滌してハ
イブリッド形成しなかったプローブをすべて除去する；
ついでそのあと （Ｄ） ステップ（Ｃ）から得られた洗滌済みフィルタ
ー上のハイブリッド形成したすべてのプローブを検出す
る。
【０００７】そのプローブはプラスミドｐＹＺ５６の
２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント中に存
在する核酸配列を含んでおり、そのフラグメントの中に
はＢａｍＨＩ開裂部位が含まれる。このフラグメントは
イソニアジド−感受性結核菌の細胞内ＤＮＡと会合する
ことがわかっており、このような抗生物質感受性の微生
物を、以下に述べる条件下でこのフラグメントとハイブ
リッド形成するＤＮＡを含まないような、イソニアジド
−抵抗性結核菌と区別することができる。
２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント中に存
在する核酸配列を含んでおり、そのフラグメントの中に
はＢａｍＨＩ開裂部位が含まれる。このフラグメントは
イソニアジド−感受性結核菌の細胞内ＤＮＡと会合する
ことがわかっており、このような抗生物質感受性の微生
物を、以下に述べる条件下でこのフラグメントとハイブ
リッド形成するＤＮＡを含まないような、イソニアジド
−抵抗性結核菌と区別することができる。
【０００８】さらに本発明は、イソニアジド−抵抗性細
胞からのＤＮＡには存在しないイソニアジド感受性を付
与する結核菌のＫａｔ Ｇ遺伝子領域をコードするとこ
ろの、イソニアジド−抵抗性結核菌のヌクレオチド配列
−ＲＮＡやＤＮＡのような−も用意する。本発明は、本
発明のヌクレオチド配列に結合した、核種のような、標
識から成るプローブも用意する。
胞からのＤＮＡには存在しないイソニアジド感受性を付
与する結核菌のＫａｔ Ｇ遺伝子領域をコードするとこ
ろの、イソニアジド−抵抗性結核菌のヌクレオチド配列
−ＲＮＡやＤＮＡのような−も用意する。本発明は、本
発明のヌクレオチド配列に結合した、核種のような、標
識から成るプローブも用意する。
【０００９】さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配
列が、ＤＮＡやＲＮＡのような、相補的な塩基配列のヌ
クレオチド配列と水素結合したものから成るハイブリッ
ド二重複合分子を用意する。また、本発明は結核菌のカ
タラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子、またはこのような
ヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配
列を一群のヌクレオチド配列から選択するためのプロセ
スも用意しており、これはどのヌクレオチド配列が本発
明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するかを決め
るステップから成っている。そのヌクレオチド配列はＤ
ＮＡ配列か、またはＲＮＡ配列かである。そのプロセス
はヌクレオチド配列上の標識を検出するステップを含ん
でいる。
列が、ＤＮＡやＲＮＡのような、相補的な塩基配列のヌ
クレオチド配列と水素結合したものから成るハイブリッ
ド二重複合分子を用意する。また、本発明は結核菌のカ
タラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子、またはこのような
ヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配
列を一群のヌクレオチド配列から選択するためのプロセ
スも用意しており、これはどのヌクレオチド配列が本発
明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するかを決め
るステップから成っている。そのヌクレオチド配列はＤ
ＮＡ配列か、またはＲＮＡ配列かである。そのプロセス
はヌクレオチド配列上の標識を検出するステップを含ん
でいる。
【００１０】さらに、本発明はイソニアジドに抵抗性の
結核菌の検出のためのキットを用意している。そのキッ
トは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ
−ＫｐｎＩフラグメントで、その中にＢａｍＨＩ開裂部
位を含むところのヌクレオチド配列を包含するプローブ
を含む容器一式から成る。そのキットは核酸の対照調製
物を含む容器一式も含んでいる。
結核菌の検出のためのキットを用意している。そのキッ
トは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ
−ＫｐｎＩフラグメントで、その中にＢａｍＨＩ開裂部
位を含むところのヌクレオチド配列を包含するプローブ
を含む容器一式から成る。そのキットは核酸の対照調製
物を含む容器一式も含んでいる。
【００１１】本発明はまた酵素カタラーゼ、または類似
の酵素がイソニアジドに作用して生じた生成物として得
られた化合物をも包含する。Ｋａｔ Ｇ遺伝子または同
様の活性を保持する誘導体はカタラーゼ蛋白質のソース
として使用することができる。新化合物はＩＳＢＮ Ｎ
゜０９９５−２４５４、パスツール研究所により編集さ
れたＨ．Ｄａｖｉｄらの“マイコバクテリア臨床のため
の実験室の方法”に述べられているようなアンチバイオ
グラム法を用いて、ＩＮＨ−抵抗性結核菌株に対する反
応性により選別される。
の酵素がイソニアジドに作用して生じた生成物として得
られた化合物をも包含する。Ｋａｔ Ｇ遺伝子または同
様の活性を保持する誘導体はカタラーゼ蛋白質のソース
として使用することができる。新化合物はＩＳＢＮ Ｎ
゜０９９５−２４５４、パスツール研究所により編集さ
れたＨ．Ｄａｖｉｄらの“マイコバクテリア臨床のため
の実験室の方法”に述べられているようなアンチバイオ
グラム法を用いて、ＩＮＨ−抵抗性結核菌株に対する反
応性により選別される。
【００１２】図の簡単な説明
本発明は以下の図を引用することによりさらに一層詳し
く記述されるであろうし、それらはつぎの如くである：
図１（Ａ）はシャトルコスミドｐＢＨ４中でクローン化
した結核菌ＤＮＡのフィジカルマップである。ＣｌａＩ
（Ｃ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）に
対する制限部位を示してある。ＤｒａＩとＡｓｎＩに対
する制限部位は見出されておらず、コスミドは結核菌中
に記載されている付加的既知遺伝子または挿入配列のい
ずれも有していない。Ｋａｔ Ｇ遺伝子の位置とスケー
ルバーを示す。
く記述されるであろうし、それらはつぎの如くである：
図１（Ａ）はシャトルコスミドｐＢＨ４中でクローン化
した結核菌ＤＮＡのフィジカルマップである。ＣｌａＩ
（Ｃ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）に
対する制限部位を示してある。ＤｒａＩとＡｓｎＩに対
する制限部位は見出されておらず、コスミドは結核菌中
に記載されている付加的既知遺伝子または挿入配列のい
ずれも有していない。Ｋａｔ Ｇ遺伝子の位置とスケー
ルバーを示す。
【００１３】図１（Ｂ）はｐＹＺ５６中に存在する挿入
体の制限マップであり、Ｋａｇの位置と転写の方向を示
している。図２は結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼ
ポリペプチドの部分配列および大腸菌とＢ．ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＨＰＩ酵素との比較
である。同じ残基は＊で示してある。図３は活性染色に
よる組換え結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼの検出
を示す。細胞抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、ペルオキシダーゼ（レーン１−５）とカタラ
ーゼ活性に関して染色した。試料は結核菌からがレーン
１；大腸菌ＴＧ１，レーン２，６；ＴＧ１／ｐＹＺ５６
（Ｋａｔ Ｇ＋），レーン３と７；ＴＧ１／ｐＢＡＫ１
６（ｌａｃＺ′：：ＫａｔＧ），レーン４と８；ＴＧ１
／ｐＹＺ５６（１．４Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラ
グメントを欠失したｐＹＺ５５と同じ）。
体の制限マップであり、Ｋａｇの位置と転写の方向を示
している。図２は結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼ
ポリペプチドの部分配列および大腸菌とＢ．ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＨＰＩ酵素との比較
である。同じ残基は＊で示してある。図３は活性染色に
よる組換え結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼの検出
を示す。細胞抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、ペルオキシダーゼ（レーン１−５）とカタラ
ーゼ活性に関して染色した。試料は結核菌からがレーン
１；大腸菌ＴＧ１，レーン２，６；ＴＧ１／ｐＹＺ５６
（Ｋａｔ Ｇ＋），レーン３と７；ＴＧ１／ｐＢＡＫ１
６（ｌａｃＺ′：：ＫａｔＧ），レーン４と８；ＴＧ１
／ｐＹＺ５６（１．４Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラ
グメントを欠失したｐＹＺ５５と同じ）。
【００１４】図４は４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメント
をプローブとして用いての種々の結核菌株のサウザーン
ブロット分析の結果を示す。ＫｐｎＩで切断したゲノム
ＤＮＡはＨ３７ＲＶ株からのものがレーン１；株１２，
レーン２；Ｂ１４５３，レーン３；株２４，レーン４；
７９１１２，レーン５；１２６４６，レーン６；７９６
６５，レーン７。株Ｂ１４５３と２４は高濃度のＩＮＨ
に抵抗性、株１２は低濃度のＩＮＨに抵抗性であるのに
対してその他はＩＮＨ感受性である。対照として、同じ
ブロットをｓｏｄＡ遺伝子に対するプローブとハイブリ
ッドさせた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
Ｂ１４５３と関連したＩＳ６１１０−仲介多型現象に注
目のこと。
をプローブとして用いての種々の結核菌株のサウザーン
ブロット分析の結果を示す。ＫｐｎＩで切断したゲノム
ＤＮＡはＨ３７ＲＶ株からのものがレーン１；株１２，
レーン２；Ｂ１４５３，レーン３；株２４，レーン４；
７９１１２，レーン５；１２６４６，レーン６；７９６
６５，レーン７。株Ｂ１４５３と２４は高濃度のＩＮＨ
に抵抗性、株１２は低濃度のＩＮＨに抵抗性であるのに
対してその他はＩＮＨ感受性である。対照として、同じ
ブロットをｓｏｄＡ遺伝子に対するプローブとハイブリ
ッドさせた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
Ｂ１４５３と関連したＩＳ６１１０−仲介多型現象に注
目のこと。
【００１５】図５はＩＮＨ−抵抗性Ｍ．スメグマの株を
示し、ＢＨ１１１（ｍｃ２−１５５１０株の誘導体）は
結核菌Ｈ３７ＲＶシャトルコスミド（ニューヨークの
Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｏｂ博士より提供された）のプールでト
ランスフォームし、それぞれのクローンをＩＮＨ−感受
性に関して数をかぞえた。コスミドｐＢＨ４は終始一貫
して薬剤感受性を付与し、トランスフォーマントはカタ
ラーゼを過剰産生した（Ｈｅｙｍ中としてアッセイし
た）。ｐＢＨ４からのＤＮＡ挿入体の制限マップをｐＹ
Ｚ５５からの挿入体のマップと並べて示してある。この
ｐＹＺ５５は結核菌Ｈ３７ＲＶのＫａｔ Ｇを含むプラ
スミドで、大腸菌ＨＰＩの保存領域からのアミノ酸配列
とマッチするように計画されたつぎのようなオリゴヌク
レオチドプローブとのハイブリダイゼーションを基礎に
分離されたものである：
示し、ＢＨ１１１（ｍｃ２−１５５１０株の誘導体）は
結核菌Ｈ３７ＲＶシャトルコスミド（ニューヨークの
Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｏｂ博士より提供された）のプールでト
ランスフォームし、それぞれのクローンをＩＮＨ−感受
性に関して数をかぞえた。コスミドｐＢＨ４は終始一貫
して薬剤感受性を付与し、トランスフォーマントはカタ
ラーゼを過剰産生した（Ｈｅｙｍ中としてアッセイし
た）。ｐＢＨ４からのＤＮＡ挿入体の制限マップをｐＹ
Ｚ５５からの挿入体のマップと並べて示してある。この
ｐＹＺ５５は結核菌Ｈ３７ＲＶのＫａｔ Ｇを含むプラ
スミドで、大腸菌ＨＰＩの保存領域からのアミノ酸配列
とマッチするように計画されたつぎのようなオリゴヌク
レオチドプローブとのハイブリダイゼーションを基礎に
分離されたものである：
【００１６】（５′−ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣ
ＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−
３′）。以下の酵素に対する制限部位が示されている：
Ｂ，ＢａｍＨ１；Ｃ，Ｃａ１；Ｅ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，Ｈ
ｉｎｄ１１１，Ｋ，Ｋｐｎ１；Ｍ，Ｓｍａ１；Ｎ，Ｎｏ
ｔ１；Ｒ，ＥｃｏＲ１；Ｓ，Ｓａｃ１．ｐＹＺ５５から
の４．５Ｋｂの挿入体を含むマイコバクテリアシャトル
プラスミド，ＰＢＡＫ１４，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１，によるＢＨ１のトランスフォーメーシ
ョンは同じようにＩＮＨ−感受性を供与する。ＭＩＣ′
ＳもまたｐＹＺ５５から導出されたサブフラグメントで
トランスフォームされたＢＨ１に関して示され、１つ
（＋）または他の（−）配位でｐＢＡＫ１４中に挿入さ
れる。Ｋａｔ Ｇ遺伝子およびＩＮＨ−感受性を供与す
る能力の両方とも２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フ
ラグメント（ｐＢＡＫ−ＫＥ＋）にマップされた。
ＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−
３′）。以下の酵素に対する制限部位が示されている：
Ｂ，ＢａｍＨ１；Ｃ，Ｃａ１；Ｅ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，Ｈ
ｉｎｄ１１１，Ｋ，Ｋｐｎ１；Ｍ，Ｓｍａ１；Ｎ，Ｎｏ
ｔ１；Ｒ，ＥｃｏＲ１；Ｓ，Ｓａｃ１．ｐＹＺ５５から
の４．５Ｋｂの挿入体を含むマイコバクテリアシャトル
プラスミド，ＰＢＡＫ１４，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１，によるＢＨ１のトランスフォーメーシ
ョンは同じようにＩＮＨ−感受性を供与する。ＭＩＣ′
ＳもまたｐＹＺ５５から導出されたサブフラグメントで
トランスフォームされたＢＨ１に関して示され、１つ
（＋）または他の（−）配位でｐＢＡＫ１４中に挿入さ
れる。Ｋａｔ Ｇ遺伝子およびＩＮＨ−感受性を供与す
る能力の両方とも２．９Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎ１フ
ラグメント（ｐＢＡＫ−ＫＥ＋）にマップされた。
【００１７】図６は前に記載した活性ゲル分析１８のた
めに調製した種々のプラスミド構造によってトランスフ
ォームした結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌から
のそれを示す。Ｗａｙｎｅ ａｎｄ Ｄｉａｚ１９によ
り記載されたように、８％ポリアクリルアミドを含む非
変性ゲルがカタラーゼ（パネルＡ）とペルオキシダーゼ
（パネルＢ）活性に対して染色された。レーン１，結核
菌Ｈ３７ＲＶ；２，大腸菌ＵＭ２（Ｋａｔ Ｅ，Ｋａｔ
Ｇ，ｒｅｆ．１５）；３，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５
５；４，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５６（図１中のｐＢＡＫ
−ＫＥ＋に対応する、ｐＵＣ１９中の２．９Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント）；５，大腸菌ＵＭ２／
ｐＹＺ５７（図１中のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に対応する、Ｂ
ａｍＨ１−Ｋｐｎ１欠失を有するｐＹＺ５５）。これら
の条件下で結核菌カタラーゼとペルオキシダーゼ活性は
２つのバンドとして移動した（レーン１）；同じパター
ンがｐＹＺ５５で発現した組換え酵素についてみられた
（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに
示したベクターからのＫａｔ Ｇとｌａｃ Ｚ′の間へ
の融合によって分子量の増大した蛋白質を発現する。パ
ネルＣも大腸菌ＨＰ１をもった部分配列の並びを示す
（遺伝子の完全配列はどこかで発表されるであろう）。
めに調製した種々のプラスミド構造によってトランスフ
ォームした結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌から
のそれを示す。Ｗａｙｎｅ ａｎｄ Ｄｉａｚ１９によ
り記載されたように、８％ポリアクリルアミドを含む非
変性ゲルがカタラーゼ（パネルＡ）とペルオキシダーゼ
（パネルＢ）活性に対して染色された。レーン１，結核
菌Ｈ３７ＲＶ；２，大腸菌ＵＭ２（Ｋａｔ Ｅ，Ｋａｔ
Ｇ，ｒｅｆ．１５）；３，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５
５；４，大腸菌ＵＭ２／ｐＹＺ５６（図１中のｐＢＡＫ
−ＫＥ＋に対応する、ｐＵＣ１９中の２．９Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＶ−Ｋｐｎ１フラグメント）；５，大腸菌ＵＭ２／
ｐＹＺ５７（図１中のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に対応する、Ｂ
ａｍＨ１−Ｋｐｎ１欠失を有するｐＹＺ５５）。これら
の条件下で結核菌カタラーゼとペルオキシダーゼ活性は
２つのバンドとして移動した（レーン１）；同じパター
ンがｐＹＺ５５で発現した組換え酵素についてみられた
（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに
示したベクターからのＫａｔ Ｇとｌａｃ Ｚ′の間へ
の融合によって分子量の増大した蛋白質を発現する。パ
ネルＣも大腸菌ＨＰ１をもった部分配列の並びを示す
（遺伝子の完全配列はどこかで発表されるであろう）。
【００１８】図７はＫａｔ ＧとＫａｔ Ｅ（ＵＭ２，
ｒｅｆ．１５）両方に突然変異を有する大腸菌株で、こ
れはＰＵＣ１９ベクターだけ（ハッチしたバー）、結核
菌Ｋａｔ Ｇを発現するｐＹＺ５５（白色バー）、およ
び結核菌Ｋａｔ Ｇを多量に発現するｐＹＺ５６（黒バ
ー）でトランスフォームされたものである。適当量の抗
生物質を加えたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨン中
で終夜培養したものを種々の濃度のＩＮＨの存在下でプ
レートし、コロニー生成ユニットを数えた。典型的な実
験の結果を３重試料での標準偏差を示す誤差バーととも
に示す。結核菌Ｋａｔ Ｇの過剰発現は同様に大腸菌Ｕ
Ｍ２５５中で高濃度のＩＮＨに対して感受性を付与した
が（Ｋａｔ Ｇ，Ｋａｔ Ｅ，Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８８）、大腸菌ＴＧ１のようなカタラーゼ陽
性株に対しては作用しなかった。いくつかの実験におい
て、高濃度のＩＮＨはＵＭ２とＵＭ２５５だけの増殖に
対して検出できる阻害作用を示したが、すべての実験で
ｐＹＺ５６−トランスフォーマントの阻害は対応するベ
クター対照で観察された阻害よりも少なくとも１０−１
００倍大きかった。
ｒｅｆ．１５）両方に突然変異を有する大腸菌株で、こ
れはＰＵＣ１９ベクターだけ（ハッチしたバー）、結核
菌Ｋａｔ Ｇを発現するｐＹＺ５５（白色バー）、およ
び結核菌Ｋａｔ Ｇを多量に発現するｐＹＺ５６（黒バ
ー）でトランスフォームされたものである。適当量の抗
生物質を加えたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨン中
で終夜培養したものを種々の濃度のＩＮＨの存在下でプ
レートし、コロニー生成ユニットを数えた。典型的な実
験の結果を３重試料での標準偏差を示す誤差バーととも
に示す。結核菌Ｋａｔ Ｇの過剰発現は同様に大腸菌Ｕ
Ｍ２５５中で高濃度のＩＮＨに対して感受性を付与した
が（Ｋａｔ Ｇ，Ｋａｔ Ｅ，Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８８）、大腸菌ＴＧ１のようなカタラーゼ陽
性株に対しては作用しなかった。いくつかの実験におい
て、高濃度のＩＮＨはＵＭ２とＵＭ２５５だけの増殖に
対して検出できる阻害作用を示したが、すべての実験で
ｐＹＺ５６−トランスフォーマントの阻害は対応するベ
クター対照で観察された阻害よりも少なくとも１０−１
００倍大きかった。
【００１９】図８は、異なる結核菌株からＫＰｎ１で切
断し、（Ａ）Ｋａｔ Ｇ（４．５Ｋｂ Ｋｐｎ１フラグ
メント）、および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子（１．１Ｋｂ Ｅ
ｃｏＲ１−Ｋｐｎ１フラグメント，Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９１）でプローブしたゲノムＤＮＡを用い
て調製したサウザーンブロットを示す。プローブの標識
とブロットのプロセッシングは前に記載した１６とおり
に実施した。レーン１，Ｈ３７ＲＶ；２，株１２−ＭＩ
Ｃ １．６μｇ／ｍｌ１ＮＨ；３，Ｂ１４５３−ＭＩＣ
＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ２０；４，株２４−ＭＩＣ＞
５０μｇ／ｍｌＩＮＨ；５，７９１１２−ＩＮＨ−感受
性２１；６，１２６４６−ＩＮＨ−感受性２１；７，７
９６６５−ＩＮＨ−感受性２１。ＩＮＨ感受性は異なる
ＩＮＨ濃度を含むＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ
ｓ ｏｐｅｓの播種によって確認した。
断し、（Ａ）Ｋａｔ Ｇ（４．５Ｋｂ Ｋｐｎ１フラグ
メント）、および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子（１．１Ｋｂ Ｅ
ｃｏＲ１−Ｋｐｎ１フラグメント，Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９１）でプローブしたゲノムＤＮＡを用い
て調製したサウザーンブロットを示す。プローブの標識
とブロットのプロセッシングは前に記載した１６とおり
に実施した。レーン１，Ｈ３７ＲＶ；２，株１２−ＭＩ
Ｃ １．６μｇ／ｍｌ１ＮＨ；３，Ｂ１４５３−ＭＩＣ
＞５０μｇ／ｍｌ ＩＮＨ２０；４，株２４−ＭＩＣ＞
５０μｇ／ｍｌＩＮＨ；５，７９１１２−ＩＮＨ−感受
性２１；６，１２６４６−ＩＮＨ−感受性２１；７，７
９６６５−ＩＮＨ−感受性２１。ＩＮＨ感受性は異なる
ＩＮＨ濃度を含むＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ
ｓ ｏｐｅｓの播種によって確認した。
【００２０】好ましい態様の詳細な記述
米国で最近多剤抵抗性を示す多数の結核菌株が出現した
ことは最も驚くべき出来事であり、これはこの菌の並は
ずれて強い接触感受性による。この危険はいくつかの小
さな結核流行域についてはっきりと示されていて、そこ
ではＭＤＲ結核菌に感染した１人の患者がＨＩＶ陽性の
刑務所看守と健常な看護スタッフ両方に感染させた（Ｃ
ＤＣ１９９０，１９９１；Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，
１９９２；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９
２）。ＨＩＶの流行が世界的な拡がりを見せている現状
の重大さからみて、西側のＡＩＤＳ患者がアフリカの患
者のようにＭＤＲ結核菌株（トリ結核菌／細胞内マイコ
バクテリウム複合体よりもむしろ）に感染したとすれ
ば、この病気が世界的な規模で伝播するだろうと予測さ
れる。イソニアジド（ＩＮＨ）はマイコバクテリアの結
核菌群−ヒト結核菌、ウシ結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎ
ｕｍ−に対して特に強力な殺菌作用をもつ薬剤であり、
結核の治療に特別な効力を発揮してきている。標準的な
抗結核治療方式は一般にはＩＮＨとリファンピシンを与
えるが、しばしばもっと弱い薬であるピラジナミド、エ
タンブトールまたはストレプトマイシンとの組み合わせ
が用いられる。治療に用いるほかにＩＮＨは予防の方法
として患者と直接に接触する人達に対しても投与され
る。
ことは最も驚くべき出来事であり、これはこの菌の並は
ずれて強い接触感受性による。この危険はいくつかの小
さな結核流行域についてはっきりと示されていて、そこ
ではＭＤＲ結核菌に感染した１人の患者がＨＩＶ陽性の
刑務所看守と健常な看護スタッフ両方に感染させた（Ｃ
ＤＣ１９９０，１９９１；Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，
１９９２；Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｒｏｐｅｒ，１９９
２）。ＨＩＶの流行が世界的な拡がりを見せている現状
の重大さからみて、西側のＡＩＤＳ患者がアフリカの患
者のようにＭＤＲ結核菌株（トリ結核菌／細胞内マイコ
バクテリウム複合体よりもむしろ）に感染したとすれ
ば、この病気が世界的な規模で伝播するだろうと予測さ
れる。イソニアジド（ＩＮＨ）はマイコバクテリアの結
核菌群−ヒト結核菌、ウシ結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎ
ｕｍ−に対して特に強力な殺菌作用をもつ薬剤であり、
結核の治療に特別な効力を発揮してきている。標準的な
抗結核治療方式は一般にはＩＮＨとリファンピシンを与
えるが、しばしばもっと弱い薬であるピラジナミド、エ
タンブトールまたはストレプトマイシンとの組み合わせ
が用いられる。治療に用いるほかにＩＮＨは予防の方法
として患者と直接に接触する人達に対しても投与され
る。
【００２１】ヒトの病気の原因物質であるヒト結核菌の
ＩＮＨ−抵抗変異体は２つのレベルの抵抗性を示す：す
なわち低（１〜１０μｇ／ｍｌ）と高（１０〜１００μ
ｇ／ｍｌ）である。ＩＮＨ−抵抗性はしばしばカタラー
ゼ活性および菌毒性の消失を伴う。最近、ＡＩＤＳの流
行とホームレスの増大や社会条件の悪化によって、先進
諸国とくに米国において結核が重大な公衆衛生上の問題
として再び現われてきた。今日におけるこの病気の恐る
べき一面は多剤薬剤に抵抗性の細菌の出現とへルスケア
従事者やＨＩＶ−感染患者への急速な院内感染である。
このためＣＤＣは多剤抵抗株（少くともＩＮＨとリファ
ンピシン）の処置と伝染予防に関する新しい勧告を提起
した。ＩＮＨ−抵抗性の問題に新しい見通しを得るとと
もに迅速な診断テスト法を開発するために以下の研究が
行われた。当然のこととして、必須なことは主な抗結核
薬であるＩＮＨとリファンピシンに対する抵抗性のメカ
ニズムを明らかにすることであり、それによって開発す
べき新しい化学療法上の戦略が立てられ、ＭＤＲ株を抑
える新化合物の計画が可能になる。
ＩＮＨ−抵抗変異体は２つのレベルの抵抗性を示す：す
なわち低（１〜１０μｇ／ｍｌ）と高（１０〜１００μ
ｇ／ｍｌ）である。ＩＮＨ−抵抗性はしばしばカタラー
ゼ活性および菌毒性の消失を伴う。最近、ＡＩＤＳの流
行とホームレスの増大や社会条件の悪化によって、先進
諸国とくに米国において結核が重大な公衆衛生上の問題
として再び現われてきた。今日におけるこの病気の恐る
べき一面は多剤薬剤に抵抗性の細菌の出現とへルスケア
従事者やＨＩＶ−感染患者への急速な院内感染である。
このためＣＤＣは多剤抵抗株（少くともＩＮＨとリファ
ンピシン）の処置と伝染予防に関する新しい勧告を提起
した。ＩＮＨ−抵抗性の問題に新しい見通しを得るとと
もに迅速な診断テスト法を開発するために以下の研究が
行われた。当然のこととして、必須なことは主な抗結核
薬であるＩＮＨとリファンピシンに対する抵抗性のメカ
ニズムを明らかにすることであり、それによって開発す
べき新しい化学療法上の戦略が立てられ、ＭＤＲ株を抑
える新化合物の計画が可能になる。
【００２２】本発明は以上のものとしてカタラーゼ−ペ
ルオキシダーゼ酵素、ＨＰＩ、が有効であることを証明
しており、この酵素単独で毒性を仲介するものと考えて
いる。このような結論を支持する証拠として以下のこと
が挙げられる。すなわち、大腸菌のカタラーゼ陰性変異
体中の結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子の発現によってこの細菌
がＩＮＨ感受性になるということである。さらに、結核
菌ＩＮＨ−感受性遺伝子、Ｋａｔ Ｇの分離は、ハイブ
リダイゼーションとＰＣＲを用いたアプローチによって
ＩＮＨ−抵抗性株の迅速な検出を容易にするという点で
重要である。臨床株中にＫａｔ Ｇ欠失が高頻度でみら
れることは、ここに示すように、この手続きを簡単化す
る。
ルオキシダーゼ酵素、ＨＰＩ、が有効であることを証明
しており、この酵素単独で毒性を仲介するものと考えて
いる。このような結論を支持する証拠として以下のこと
が挙げられる。すなわち、大腸菌のカタラーゼ陰性変異
体中の結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子の発現によってこの細菌
がＩＮＨ感受性になるということである。さらに、結核
菌ＩＮＨ−感受性遺伝子、Ｋａｔ Ｇの分離は、ハイブ
リダイゼーションとＰＣＲを用いたアプローチによって
ＩＮＨ−抵抗性株の迅速な検出を容易にするという点で
重要である。臨床株中にＫａｔ Ｇ欠失が高頻度でみら
れることは、ここに示すように、この手続きを簡単化す
る。
【００２３】ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子
の同定 ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子を分離するの
に一つの異種的アプローチを用いた。ＢＨ１は容易にト
ランスフォームするスメグマ菌株ＭＣ２１５５の偶発変
異体であり（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９
０）、５１２μｇ／ｍｌのＩＮＨに抵抗性でカタラーゼ
−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Ｈｅｙｍ ｅｔ
ａｌ．，１９９２）。ＩＮＨ−感受性とこれらの酵素
の活性との間には厳密な相関関係があるので、結核菌か
らの適当な遺伝子を運ぶプラスミドによるＢＨ１のトラ
ンスフォーメーションは、それらの回復と同時に起こる
ＩＮＨ−抵抗性に導くべきである。したがって、ＤＮＡ
を大腸菌中の結核菌シャトルコスミドのプールから調製
し、ついでエレクトロ−トランスフォーメーションによ
ってＢＨ１中に導入した。すると１０００以上のカナマ
イシン−抵抗性トランスフォーマントがＩＮＨ−抵抗性
に関して数えられ、３２ｇ／ｍｌのＩＮＨを含む培地上
で増殖できない４つのクローン、すなわち野生型ＭＣ２
１５５からのＭＩＣが得られた。
の同定 ＩＮＨ−感受性中に含まれる結核菌遺伝子を分離するの
に一つの異種的アプローチを用いた。ＢＨ１は容易にト
ランスフォームするスメグマ菌株ＭＣ２１５５の偶発変
異体であり（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９
０）、５１２μｇ／ｍｌのＩＮＨに抵抗性でカタラーゼ
−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Ｈｅｙｍ ｅｔ
ａｌ．，１９９２）。ＩＮＨ−感受性とこれらの酵素
の活性との間には厳密な相関関係があるので、結核菌か
らの適当な遺伝子を運ぶプラスミドによるＢＨ１のトラ
ンスフォーメーションは、それらの回復と同時に起こる
ＩＮＨ−抵抗性に導くべきである。したがって、ＤＮＡ
を大腸菌中の結核菌シャトルコスミドのプールから調製
し、ついでエレクトロ−トランスフォーメーションによ
ってＢＨ１中に導入した。すると１０００以上のカナマ
イシン−抵抗性トランスフォーマントがＩＮＨ−抵抗性
に関して数えられ、３２ｇ／ｍｌのＩＮＨを含む培地上
で増殖できない４つのクローン、すなわち野生型ＭＣ２
１５５からのＭＩＣが得られた。
【００２４】ＢＨ１を再トランスフォーメーションして
のち、これらのうちのたった１つ、ｐＢＨ４だけが終始
一貫してＩＮＨ−感受性表現型を付与した。制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩによる切断によってｐＢＨ４によって運ばれる
クロモソームＤＮＡの大きさは約３０Ｋｂであることが
わかった。上記の酵素のうちの終りの方の３つによって
生じたマップを図１に示した。
のち、これらのうちのたった１つ、ｐＢＨ４だけが終始
一貫してＩＮＨ−感受性表現型を付与した。制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩによる切断によってｐＢＨ４によって運ばれる
クロモソームＤＮＡの大きさは約３０Ｋｂであることが
わかった。上記の酵素のうちの終りの方の３つによって
生じたマップを図１に示した。
【００２５】ｐＢＨ４をハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いてライブラリー中の相同クローンを検出し
たところ、さらに８つのシャトルコスミドが分離され
た。ＢＨ１へのトランスフォーメーションによって、こ
れらのうちの５つ（Ｔ３５，Ｔ６４６，Ｔ６７３，Ｔ７
９，Ｔ５５６）がＩＮＨ−抵抗性を取り戻してｐＢＨ４
と類似の制限プロフィルを示した（データは示さず）。
とくに、４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントはすべての
場合に存在していた。
ブとして用いてライブラリー中の相同クローンを検出し
たところ、さらに８つのシャトルコスミドが分離され
た。ＢＨ１へのトランスフォーメーションによって、こ
れらのうちの５つ（Ｔ３５，Ｔ６４６，Ｔ６７３，Ｔ７
９，Ｔ５５６）がＩＮＨ−抵抗性を取り戻してｐＢＨ４
と類似の制限プロフィルを示した（データは示さず）。
とくに、４．５ＫｂのＫｐｎＩフラグメントはすべての
場合に存在していた。
【００２６】個々のＢａｍＨＩフラグメントをサブクロ
ーンすることを試みたが、ＢＨ１中の傷害を補足して完
全にすることのできるトランスフォーマントは生じなか
ったことから、ＢａｍＨＩ部位は興味ある遺伝子の中に
位置すると示唆された。それとは逆に、ｐＢＨ４の誘導
体であるｐＢＨ５はＥｃｏＲＩフラグメントの欠失によ
って作り上げられ、このことはＩＮＨ−感受性の回復の
ためには７Ｋｂフラグメントは必要でないことを示して
いる。
ーンすることを試みたが、ＢＨ１中の傷害を補足して完
全にすることのできるトランスフォーマントは生じなか
ったことから、ＢａｍＨＩ部位は興味ある遺伝子の中に
位置すると示唆された。それとは逆に、ｐＢＨ４の誘導
体であるｐＢＨ５はＥｃｏＲＩフラグメントの欠失によ
って作り上げられ、このことはＩＮＨ−感受性の回復の
ためには７Ｋｂフラグメントは必要でないことを示して
いる。
【００２７】ＢＨ１のＩＮＨ−抵抗性変異と相補的であ
るシャトルコスミドを包含するトランスフォーマントを
注意深くしらべて、いくつかの抗生物質に対するＭＩＣ
ｓを確立した。すべての場合に、ＩＮＨに関するＭＩＣ
は５１２から８μｇ／ｍｌへ減少し、これは感受性株Ｍ
Ｃ２１５５（３２μｇ／ｍｌ）の値よりも低い。このよ
うな過剰感受性表現型は組換えクローンがＩＮＨ−毒性
を強化する能力をもつ酵素を過剰産生したかもしれない
ことを示唆している。酵素学的研究から、これらのトラ
ンスフォーマントはすべてＩＮＨ−感受性である野生型
ＭＣ２１５５株よりも約２倍多いペルオキシダーゼとカ
タラーゼを産生することがわかった（データは示さ
ず）。
るシャトルコスミドを包含するトランスフォーマントを
注意深くしらべて、いくつかの抗生物質に対するＭＩＣ
ｓを確立した。すべての場合に、ＩＮＨに関するＭＩＣ
は５１２から８μｇ／ｍｌへ減少し、これは感受性株Ｍ
Ｃ２１５５（３２μｇ／ｍｌ）の値よりも低い。このよ
うな過剰感受性表現型は組換えクローンがＩＮＨ−毒性
を強化する能力をもつ酵素を過剰産生したかもしれない
ことを示唆している。酵素学的研究から、これらのトラ
ンスフォーマントはすべてＩＮＨ−感受性である野生型
ＭＣ２１５５株よりも約２倍多いペルオキシダーゼとカ
タラーゼを産生することがわかった（データは示さ
ず）。
【００２８】結核菌のＭＤＲ株の多くのものが、ＩＮＨ
だけでなくリファンピシン、ストレプトマイシン、エタ
ンブトールおよびピラジンアミドに対して感受性を失っ
ている。ＩＮＨとこれらの化合物に対する抵抗性の間に
相関関係があるかもしれないという可能生をしらべるた
めに、種々のＭ．スメグマチス株と、それらのｐＢＨ４
トランスフォーマントに対するいくつかの薬剤のＭＩＣ
ｓを決定したが、なんらの差異は見出されなかった。
だけでなくリファンピシン、ストレプトマイシン、エタ
ンブトールおよびピラジンアミドに対して感受性を失っ
ている。ＩＮＨとこれらの化合物に対する抵抗性の間に
相関関係があるかもしれないという可能生をしらべるた
めに、種々のＭ．スメグマチス株と、それらのｐＢＨ４
トランスフォーマントに対するいくつかの薬剤のＭＩＣ
ｓを決定したが、なんらの差異は見出されなかった。
【００２９】結核菌カタラーゼ遺伝子のクローニング
大腸菌（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１
９８９）およびバチルスｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８
８）のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素中の高度保存
領域の一次配列をもとに４５−ｍｅｒオリゴヌクレオチ
ドプローブをデザインした。結核菌ＤＮＡのゲノムブロ
ットをこのオリゴヌクレオチドでプローブすることによ
って、ほとんどの場合に特異なバンドが検出された。Ｋ
ｐｎＩは強くハイブリッド形成する４．５Ｋｂのユニー
クなフラグメントを生成したので、この酵素をＰＵＣ１
９中の大きさで選択するライブラリーを作るのに用い
た。
９８９）およびバチルスｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８
８）のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素中の高度保存
領域の一次配列をもとに４５−ｍｅｒオリゴヌクレオチ
ドプローブをデザインした。結核菌ＤＮＡのゲノムブロ
ットをこのオリゴヌクレオチドでプローブすることによ
って、ほとんどの場合に特異なバンドが検出された。Ｋ
ｐｎＩは強くハイブリッド形成する４．５Ｋｂのユニー
クなフラグメントを生成したので、この酵素をＰＵＣ１
９中の大きさで選択するライブラリーを作るのに用い
た。
【００３０】そのオリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングすることによって、適当なクローン、ｐＹＺ５
６が得られた。挿入ＤＮＡの制限マップを図１に示した
が、これはｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわか
る。クロス−ハイブリダイゼーションによっても独立に
確認された。
ーニングすることによって、適当なクローン、ｐＹＺ５
６が得られた。挿入ＤＮＡの制限マップを図１に示した
が、これはｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわか
る。クロス−ハイブリダイゼーションによっても独立に
確認された。
【００３１】いくつかのサブクローニングの実験によっ
て大腸菌中の結核菌カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性
を発現する最小フラグメントは２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ
−ＫｐｎＩフラグメントであることがわかり、これは予
期したように、ＢａｍＨＩに対する開裂部位を含んでい
た。部分ＤＮＡ配列解析から、ｐＹＺ５６によって運ば
れるＫａｔ Ｇ遺伝子は大腸菌およびＢ．ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＰＩ酵素に極めて相同な
カタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることが
わかった。
て大腸菌中の結核菌カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性
を発現する最小フラグメントは２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ
−ＫｐｎＩフラグメントであることがわかり、これは予
期したように、ＢａｍＨＩに対する開裂部位を含んでい
た。部分ＤＮＡ配列解析から、ｐＹＺ５６によって運ば
れるＫａｔ Ｇ遺伝子は大腸菌およびＢ．ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＰＩ酵素に極めて相同な
カタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることが
わかった。
【００３２】
（図２；Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１
９８８）；（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９
８８）．同じ残基を＊で示した。ＨＰＩ活性は染色によ
り大腸菌、Ｍ．スメグマチスいずれについても検出され
た（以下を見よ）。
９８８）；（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９
８８）．同じ残基を＊で示した。ＨＰＩ活性は染色によ
り大腸菌、Ｍ．スメグマチスいずれについても検出され
た（以下を見よ）。
【００３３】ＩＮＨ−感受性中にカタラーゼーペルオキ
シダーゼが含まれる 結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子をクローン化したので、カタラ
ーゼ−陰性とイソニアジド抵抗性の相関関係の遺伝的基
礎をしらべることか緊急の関心事であった。一連の構成
をシャトルベクターｐＢＡＫ１４中に確立し、ＩＮＨ−
抵抗Ｍ．スメグマチス変異体ＢＨ１をトランスフォーム
するのに用いた。完全なＫａｔ Ｇ遺伝子を運んでいる
プラスミドのみがＨＰＩを産生してＩＮＨ−感受性を取
り戻した。これらのうちの最小のｐＢＡＫ１６は２．５
Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫＰｎＩフラグメントを運び、この
ことはＫａｔ Ｇの上流２Ｋｂ領域は含まれないこと、
そしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼだけでマイコバク
テリアがＩＮＨに感受性になるのに十分であることを示
している。
シダーゼが含まれる 結核菌Ｋａｔ Ｇ遺伝子をクローン化したので、カタラ
ーゼ−陰性とイソニアジド抵抗性の相関関係の遺伝的基
礎をしらべることか緊急の関心事であった。一連の構成
をシャトルベクターｐＢＡＫ１４中に確立し、ＩＮＨ−
抵抗Ｍ．スメグマチス変異体ＢＨ１をトランスフォーム
するのに用いた。完全なＫａｔ Ｇ遺伝子を運んでいる
プラスミドのみがＨＰＩを産生してＩＮＨ−感受性を取
り戻した。これらのうちの最小のｐＢＡＫ１６は２．５
Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫＰｎＩフラグメントを運び、この
ことはＫａｔ Ｇの上流２Ｋｂ領域は含まれないこと、
そしてカタラーゼ−ペルオキシダーゼだけでマイコバク
テリアがＩＮＨに感受性になるのに十分であることを示
している。
【００３４】無細胞抽出物を非変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で分離し、ペルオキシダーゼとカタラー
ゼ活性に関して染色を行なった。これらの条件下で、結
核菌酵素はペルオキシダーゼ活性の２つのバンドを示し
（レーン１）、これはカタラーゼ活性と同時移動した
（データは示さず；Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９
２）。
ゲル電気泳動法で分離し、ペルオキシダーゼとカタラー
ゼ活性に関して染色を行なった。これらの条件下で、結
核菌酵素はペルオキシダーゼ活性の２つのバンドを示し
（レーン１）、これはカタラーゼ活性と同時移動した
（データは示さず；Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９
２）。
【００３５】大腸菌中にＫａｔ Ｇ遺伝子を導入する
と、同じ蛋白質の合成が行われるのに対して、ｐＹＺ５
６は僅かに大きい蛋白質を産生した。これは、フレーム
内の１ａｃ Ｚ：：Ｋａｔ Ｇ遺伝子融合の構成によ
る。Ｍ．スメグマチスの細胞抽出物についても活性染色
を実施した。ＢＨ１中の結核菌からのＫａｔ Ｇ遺伝子
の存在はカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導
き、これは結核菌または大腸菌中に作られる酵素、およ
びＭ．スメグマチスの未変性ＨＰＩと電気泳動的に同じ
移動度を示した。
と、同じ蛋白質の合成が行われるのに対して、ｐＹＺ５
６は僅かに大きい蛋白質を産生した。これは、フレーム
内の１ａｃ Ｚ：：Ｋａｔ Ｇ遺伝子融合の構成によ
る。Ｍ．スメグマチスの細胞抽出物についても活性染色
を実施した。ＢＨ１中の結核菌からのＫａｔ Ｇ遺伝子
の存在はカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導
き、これは結核菌または大腸菌中に作られる酵素、およ
びＭ．スメグマチスの未変性ＨＰＩと電気泳動的に同じ
移動度を示した。
【００３６】結核菌中のＩＮＨ一抵抗性の基礎
ＩＮＨ一抵抗株のサブセット、とくに最高薬物濃度に抵
抗性をもつものはモルモットに菌毒性が低く、またカタ
ラーゼ活性を欠くことがずっと以前から知られていた。
臨床的に分離したいくつかの結核菌からゲノムＤＮＡを
調製し、４．５Ｋｂ ＫＰｎＩフラグメントをプローブ
として用いることによってサウザーンブロッティングに
より解析した。高度の抵抗性をもつ２つの株、Ｂ１４５
３と２４の中で、カタラーゼ遺伝子がクロモソームから
欠失していた。これに対して株１２のような低い抵抗性
を示すものではそれがなお存在していたが発現はしてい
ない。さらに付加して行なった研究からＫａｔ Ｇの直
前の領域は転位し易いことがわかった（データは示さ
ず）。
抗性をもつものはモルモットに菌毒性が低く、またカタ
ラーゼ活性を欠くことがずっと以前から知られていた。
臨床的に分離したいくつかの結核菌からゲノムＤＮＡを
調製し、４．５Ｋｂ ＫＰｎＩフラグメントをプローブ
として用いることによってサウザーンブロッティングに
より解析した。高度の抵抗性をもつ２つの株、Ｂ１４５
３と２４の中で、カタラーゼ遺伝子がクロモソームから
欠失していた。これに対して株１２のような低い抵抗性
を示すものではそれがなお存在していたが発現はしてい
ない。さらに付加して行なった研究からＫａｔ Ｇの直
前の領域は転位し易いことがわかった（データは示さ
ず）。
【００３７】結核菌のＨＰＩは大腸菌をＩＮＨに対して
感受性にさせる 結核菌のＨＰＩ酵素が大腸菌にＩＮＨ感受性を付与でき
るかどうかを明らかにするために、一連のカタラーゼ変
異体をｐＹＺ５６でトランスフォームしてＭＩＣｓを定
量した。野生型株はＩＮＨ感受性でなかったが、内因性
カタラーゼ活性を欠如する一方でｐＹＺ５６を包含する
変異体は高濃度のＩＮＨ（５００μｇ／ｍｌ）の存在下
では増殖阻害を示した。一方、トランスフォームしない
株は非感受性であった。
感受性にさせる 結核菌のＨＰＩ酵素が大腸菌にＩＮＨ感受性を付与でき
るかどうかを明らかにするために、一連のカタラーゼ変
異体をｐＹＺ５６でトランスフォームしてＭＩＣｓを定
量した。野生型株はＩＮＨ感受性でなかったが、内因性
カタラーゼ活性を欠如する一方でｐＹＺ５６を包含する
変異体は高濃度のＩＮＨ（５００μｇ／ｍｌ）の存在下
では増殖阻害を示した。一方、トランスフォームしない
株は非感受性であった。
【００３８】本発明の目的のために、図５に示したプラ
スミド含有および制限エンドヌクレアーゼマップを、培
養コレクション受入Ｎｏ．Ｉ−１２０９として１９９２
年５月１８日に、フランス、パリー、パスツール研究所
のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍの
株中にｄｅｐｏｓｉｔした。このプラスミドは本発明の
核酸配列、すなわちフラグメント中にＢａｍＨＩ開裂部
位をもつプラスミドｐＹＺ５６の４．５ＫｂＫｐｎＩ−
ＫｐｎＩフラグメントを含んでいる。
スミド含有および制限エンドヌクレアーゼマップを、培
養コレクション受入Ｎｏ．Ｉ−１２０９として１９９２
年５月１８日に、フランス、パリー、パスツール研究所
のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍの
株中にｄｅｐｏｓｉｔした。このプラスミドは本発明の
核酸配列、すなわちフラグメント中にＢａｍＨＩ開裂部
位をもつプラスミドｐＹＺ５６の４．５ＫｂＫｐｎＩ−
ＫｐｎＩフラグメントを含んでいる。
【００３９】一般的には、本発明は試料中のイソニアジ
ド−抵抗性結核菌の存在を検出する方法を特徴としてお
り、イソニアジド−抵抗性結核菌ＤＮＡと選択的にハイ
ブリッド形成して検出可能な複合体を作れるようなＤＮ
ＡまたはＲＮＡを少なくとも１つ用意することも含んで
いる。検出はプローブが試料中に存在するイソニアジド
−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを作ってハイブリ
ッド複合体を形成し、試料中のイソニアジド−感受性結
核菌の存在の表示としてハイブリッド複合体を検出でき
るような条件下で行なわれる（ここで用いた“選択的ハ
イブリッド形成”はイソニアジド−抵抗性結核菌とはハ
イブリッドを作らずにイソニアジド−感受性結核菌とだ
けハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡプローブを
指している。）試料は結核菌細胞またはその細胞の一部
または結核菌核酸、とくにＤＮＡを豊富に含む細胞成分
から作ることができる。ハイブリダイゼーションは通常
のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することが
できる。本発明にとって決定的であるような特定のハイ
ブリダイゼーションの条件は何も見出されなかった。
ド−抵抗性結核菌の存在を検出する方法を特徴としてお
り、イソニアジド−抵抗性結核菌ＤＮＡと選択的にハイ
ブリッド形成して検出可能な複合体を作れるようなＤＮ
ＡまたはＲＮＡを少なくとも１つ用意することも含んで
いる。検出はプローブが試料中に存在するイソニアジド
−感受性結核菌ＤＮＡとハイブリッドを作ってハイブリ
ッド複合体を形成し、試料中のイソニアジド−感受性結
核菌の存在の表示としてハイブリッド複合体を検出でき
るような条件下で行なわれる（ここで用いた“選択的ハ
イブリッド形成”はイソニアジド−抵抗性結核菌とはハ
イブリッドを作らずにイソニアジド−感受性結核菌とだ
けハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡプローブを
指している。）試料は結核菌細胞またはその細胞の一部
または結核菌核酸、とくにＤＮＡを豊富に含む細胞成分
から作ることができる。ハイブリダイゼーションは通常
のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することが
できる。本発明にとって決定的であるような特定のハイ
ブリダイゼーションの条件は何も見出されなかった。
【００４０】より詳しくいえば、結核菌からのＤＮＡの
配列はサウザーンブロッティングとハイブリダイゼーシ
ョンによって解析できる。本発明で用いる方法について
はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｓｅｃ
ｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に述べられてい
る。ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル上で分離でき
てその場所で変性される。ついでフラグメントはゲルか
ら水不溶性固体、すなわちニトロセルロースフィルタ
ー、ナイロン膜、または活性化セルロース紙のような多
孔性の支持体に移され、そこで固定されるが、それには
たとえばＡｍｅｒｓｈａｍで発売しているＨｙｂｏｎｄ
ＴＭ膜が用いられる。プローブとの非特異的ハイブリダ
イゼーションを減らすためにプレハイブリダイゼーショ
ンしてのち、固体支持体を本発明の核酸プローブとハイ
ブリッド形成させる。非結合と弱く結合したプローブを
取除くために固体支持体を洗滌し、生成したハイブリッ
ド二重複合分子をしらべる。代わりの便利なやり方はゲ
ル中で変性したＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリ
ッド形成させることである。
配列はサウザーンブロッティングとハイブリダイゼーシ
ョンによって解析できる。本発明で用いる方法について
はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｓｅｃ
ｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に述べられてい
る。ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル上で分離でき
てその場所で変性される。ついでフラグメントはゲルか
ら水不溶性固体、すなわちニトロセルロースフィルタ
ー、ナイロン膜、または活性化セルロース紙のような多
孔性の支持体に移され、そこで固定されるが、それには
たとえばＡｍｅｒｓｈａｍで発売しているＨｙｂｏｎｄ
ＴＭ膜が用いられる。プローブとの非特異的ハイブリダ
イゼーションを減らすためにプレハイブリダイゼーショ
ンしてのち、固体支持体を本発明の核酸プローブとハイ
ブリッド形成させる。非結合と弱く結合したプローブを
取除くために固体支持体を洗滌し、生成したハイブリッ
ド二重複合分子をしらべる。代わりの便利なやり方はゲ
ル中で変性したＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリ
ッド形成させることである。
【００４１】ハイブリダイゼーション溶液中に存在する
標識プローブの量は標識の性質、フィルターに当然結合
しうる標識プローブの量およびハイブリダイゼーション
の厳密さに依存して大きく変化する。一般的には、固定
化したＤＮＡへのプローブの結合の速度を促進させるた
めに化学量論的量を大きく超える過量が用いられる。
標識プローブの量は標識の性質、フィルターに当然結合
しうる標識プローブの量およびハイブリダイゼーション
の厳密さに依存して大きく変化する。一般的には、固定
化したＤＮＡへのプローブの結合の速度を促進させるた
めに化学量論的量を大きく超える過量が用いられる。
【００４２】種々の段階の厳密さをもつハイブリダイゼ
ーションを用いることができる。条件が厳密であればあ
るほど、二重複合体形成のためのポリヌクレオチドとプ
ローブ間のハイブリダイゼーションにとって要求される
相補性はより大きくなる。ハイブリダイゼーションの厳
しさは温度、プローブの濃度、プローブの長さ、イオン
強度、時間その他もろもろによって調節できる。都合よ
く、ハイブリダイゼーションの厳密さは反応溶液の極性
を変えることによって変えられる。用いるべき温度は経
験的に使用するか、またはこの目的のために開発され
た、よく知られた公式から決められる。
ーションを用いることができる。条件が厳密であればあ
るほど、二重複合体形成のためのポリヌクレオチドとプ
ローブ間のハイブリダイゼーションにとって要求される
相補性はより大きくなる。ハイブリダイゼーションの厳
しさは温度、プローブの濃度、プローブの長さ、イオン
強度、時間その他もろもろによって調節できる。都合よ
く、ハイブリダイゼーションの厳密さは反応溶液の極性
を変えることによって変えられる。用いるべき温度は経
験的に使用するか、またはこの目的のために開発され
た、よく知られた公式から決められる。
【００４３】ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルから
固体支持体へ移されるサウザーンハイブリダイゼーショ
ンと異なり、本発明の方法は乾燥アガロースゲル中での
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても
実施することができる。この方法では、アガロースゲル
を乾燥させ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用
いてハイブリダイゼーションをその位置で行なわせる。
この方法は検出の速度と感度が望まれるときに推奨され
る。この方法は結核菌のゲノムまたはクローン化ＤＮＡ
を含むアガロースゲル上で実施することができる。
固体支持体へ移されるサウザーンハイブリダイゼーショ
ンと異なり、本発明の方法は乾燥アガロースゲル中での
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても
実施することができる。この方法では、アガロースゲル
を乾燥させ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用
いてハイブリダイゼーションをその位置で行なわせる。
この方法は検出の速度と感度が望まれるときに推奨され
る。この方法は結核菌のゲノムまたはクローン化ＤＮＡ
を含むアガロースゲル上で実施することができる。
【００４４】さらに、本発明の方法は結核菌ＤＮＡをポ
リアクリルアミドゲルからエレクトロブロッティングに
よってナイロンフィルターへ移すことによって実施する
ことができる。時間が最も重要なときはエレクトロブロ
ッティングが望ましいかもしれない、というのはエレク
トロブロッティングはＤＮＡをアガロースゲルから移す
ために開発された毛細管ブロッティングよりも必まって
早いからである。この方法はＵＶ−クロスリンキングと
組み合わせて実施することができる。テストすべき試料
を含むポリアクリルアミドゲルが、適当に調製されたナ
イロンフィルターと接触して置かれる。ついでこれらを
エレクトロブロッティング装置の中にサンドイッチ状に
入れ、ついで電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター
上へ移す。緩衝液で洗滌後、フィルターをプレハイブリ
ダイゼーションのために用意し、ついでハイブリッド形
成またはＵＶ−クロスリンキングを行なわせる。
リアクリルアミドゲルからエレクトロブロッティングに
よってナイロンフィルターへ移すことによって実施する
ことができる。時間が最も重要なときはエレクトロブロ
ッティングが望ましいかもしれない、というのはエレク
トロブロッティングはＤＮＡをアガロースゲルから移す
ために開発された毛細管ブロッティングよりも必まって
早いからである。この方法はＵＶ−クロスリンキングと
組み合わせて実施することができる。テストすべき試料
を含むポリアクリルアミドゲルが、適当に調製されたナ
イロンフィルターと接触して置かれる。ついでこれらを
エレクトロブロッティング装置の中にサンドイッチ状に
入れ、ついで電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター
上へ移す。緩衝液で洗滌後、フィルターをプレハイブリ
ダイゼーションのために用意し、ついでハイブリッド形
成またはＵＶ−クロスリンキングを行なわせる。
【００４５】本発明の方法は、イソニアジドに抵抗性の
結核菌を検出するための、本発明による核酸プローブを
用いて実施することができる。プローブは通常の方法を
用いて検出することができる。
結核菌を検出するための、本発明による核酸プローブを
用いて実施することができる。プローブは通常の方法を
用いて検出することができる。
【００４６】本発明のヌクレオチドは結核菌の生物学的
試料中のヌクレオチド配列の検出のためのプローブとし
て用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは原
子または無機遊離基、もっとも普通には放射性核種で標
識することができるが、おそらく重金属でも標識でき
る。放射性標識の中には３２Ｐ，３Ｈ，１４Ｃまたは類
似のものが含まれる。適当なシグナルを提供し十分な半
減期をもつ放射性標識はどんなものでも用いることがで
きる。その他の標識の中には、標識抗体、蛍光物質、化
学ルミネッセンス体、酵素、抗体など標識リガンドや類
似体に対する特異結合ペアメンバーとして働らきうるよ
うなものが含まれる。標識の選択がどのようになされる
かはハイブリダイゼーションの速度とＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの標識の結合に対する標識の効果によって決められ
る。標識が、ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡま
たはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供するこ
とが必要である。
試料中のヌクレオチド配列の検出のためのプローブとし
て用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは原
子または無機遊離基、もっとも普通には放射性核種で標
識することができるが、おそらく重金属でも標識でき
る。放射性標識の中には３２Ｐ，３Ｈ，１４Ｃまたは類
似のものが含まれる。適当なシグナルを提供し十分な半
減期をもつ放射性標識はどんなものでも用いることがで
きる。その他の標識の中には、標識抗体、蛍光物質、化
学ルミネッセンス体、酵素、抗体など標識リガンドや類
似体に対する特異結合ペアメンバーとして働らきうるよ
うなものが含まれる。標識の選択がどのようになされる
かはハイブリダイゼーションの速度とＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの標識の結合に対する標識の効果によって決められ
る。標識が、ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡま
たはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供するこ
とが必要である。
【００４７】本発明の望ましい態様中では、プローブは
たとえばニック−トランスレーションによって標識中に
取みされ得るような、例えば３２Ｐや１２５Ｉなどの放
射性アイソトープで標識される。他の望ましい態様にお
いては、アビヂンがヒオチンに結合しているとき、ハイ
ブリッドＤＮＡ複合体の検出を可能にさせるような化学
物質、たとえば蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と結
合体を作っているアビヂンと反応するところのビオチン
でプローブを標識する。この蛍光団の存在によって、ハ
イブリッドＤＮＡ複合体を蛍光測定法によって検出する
ことが可能となる；ビオチンに結合する化学物質が電子
密度の高い化合物であれば電子顕微鏡によってハイブリ
ッドＤＮＡ複合体の検出が可能である；抗体の場合は免
疫学的に検出できる；あるいはカタラーゼ／基質対の一
つは酵素学的に検出することができる。細菌をプローブ
と接触させる前に、結核菌を破壊してＤＮＡを溶出さ
せ、ついでそれを変性させてニトロセルロース膜のよう
な、適当な固体のＤＮＡ支持体上に固定させる。
たとえばニック−トランスレーションによって標識中に
取みされ得るような、例えば３２Ｐや１２５Ｉなどの放
射性アイソトープで標識される。他の望ましい態様にお
いては、アビヂンがヒオチンに結合しているとき、ハイ
ブリッドＤＮＡ複合体の検出を可能にさせるような化学
物質、たとえば蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と結
合体を作っているアビヂンと反応するところのビオチン
でプローブを標識する。この蛍光団の存在によって、ハ
イブリッドＤＮＡ複合体を蛍光測定法によって検出する
ことが可能となる；ビオチンに結合する化学物質が電子
密度の高い化合物であれば電子顕微鏡によってハイブリ
ッドＤＮＡ複合体の検出が可能である；抗体の場合は免
疫学的に検出できる；あるいはカタラーゼ／基質対の一
つは酵素学的に検出することができる。細菌をプローブ
と接触させる前に、結核菌を破壊してＤＮＡを溶出さ
せ、ついでそれを変性させてニトロセルロース膜のよう
な、適当な固体のＤＮＡ支持体上に固定させる。
【００４８】プローブの標識を必要としないその他の検
出法はいわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション法
である。このアッセイでは、１本鎖ベクター中に含まれ
る非標識プローブがイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡ
とハイブリッドを形成し、標識した、プローブを含まな
い１本鎖ベクターが、ハイブリッド複合体全体を標識し
つつ、プローブを含むベクターとハイブリッド形成す
る。
出法はいわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション法
である。このアッセイでは、１本鎖ベクター中に含まれ
る非標識プローブがイソニアジド−感受性結核菌ＤＮＡ
とハイブリッドを形成し、標識した、プローブを含まな
い１本鎖ベクターが、ハイブリッド複合体全体を標識し
つつ、プローブを含むベクターとハイブリッド形成す
る。
【００４９】本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配
列決定法から導かれた。ヌクレオチドの塩基配列は５′
−−−−→３′の方向に書かれている。示した文字のそ
れぞれは以下のヌクレオチドについての通常の命名法に
よっている。 Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ｃ サイトシン
列決定法から導かれた。ヌクレオチドの塩基配列は５′
−−−−→３′の方向に書かれている。示した文字のそ
れぞれは以下のヌクレオチドについての通常の命名法に
よっている。 Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ｃ サイトシン
【００５０】本発明のヌクレオチドは、通常の化学合成
法を用いてヌクレオシド間を３′−−−→５′リン酸結
合生成によって作ることができる。たとえば、よく知ら
れたホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびホ
スファイトトリエステル法、ならびにこれらの方法の既
知修飾法を用いることができる。デオキシリボヌクレオ
チドは、ホスホラミダイトアプローチを基礎としたよう
な、自動合成マシンで調製することができる。オリゴ−
およびポリリボヌクレオチドも通常の方法を用い、ＲＮ
Ａリガーゼの助けをかりて得ることができる。
法を用いてヌクレオシド間を３′−−−→５′リン酸結
合生成によって作ることができる。たとえば、よく知ら
れたホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびホ
スファイトトリエステル法、ならびにこれらの方法の既
知修飾法を用いることができる。デオキシリボヌクレオ
チドは、ホスホラミダイトアプローチを基礎としたよう
な、自動合成マシンで調製することができる。オリゴ−
およびポリリボヌクレオチドも通常の方法を用い、ＲＮ
Ａリガーゼの助けをかりて得ることができる。
【００５１】本発明のヌクレオチドは純粋状態にある。
たとえば、これらのヌクレオチドはヒト血液由来の蛋白
質、ヒト血清蛋白質、ウィルス蛋白質、これらの蛋白質
をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト
組織成分を含んでいない。さらに、言えることはこれら
のヌクレオチドは他の核酸、外来蛋白質や脂質、それに
細菌やウィルスのような外来微生物を含まない。
たとえば、これらのヌクレオチドはヒト血液由来の蛋白
質、ヒト血清蛋白質、ウィルス蛋白質、これらの蛋白質
をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト
組織成分を含んでいない。さらに、言えることはこれら
のヌクレオチドは他の核酸、外来蛋白質や脂質、それに
細菌やウィルスのような外来微生物を含まない。
【００５２】もちろん本発明は、本発明のヌクレオチド
配列の変異体または、本発明のプローブと同じ選択的ハ
イブリダイゼーションの性質を示す血清型変異体も含ん
でいる。本発明のヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）として知られているＤＮＡ増幅プロセス
で用いることができる。たとえばＳ．Ｋｗｏｋ ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１６９０−１６９４
（１９８７）参照。ＰＣＲは迅速の故に好都合である。
配列の変異体または、本発明のプローブと同じ選択的ハ
イブリダイゼーションの性質を示す血清型変異体も含ん
でいる。本発明のヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）として知られているＤＮＡ増幅プロセス
で用いることができる。たとえばＳ．Ｋｗｏｋ ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１６９０−１６９４
（１９８７）参照。ＰＣＲは迅速の故に好都合である。
【００５３】増幅しようとするＤＮＡのプラスとマイナ
スストランドに相補的である部分から１０−３００塩基
対だけ離れて位置する、既知配列のＤＮＡプライマー対
は、オリゴヌクレオチド合成のためのよく知られた方法
によって調製することができる。各プライマーの一方の
端を伸ばすことができ、プライマーがＰＢＭＣ ＤＮＡ
にアニーリングするときに制限エンドヌクレアーゼ部位
をつくるように修飾される。ＰＣＲ反応混合物が含み得
るものは、ＰＢＭＣ ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４
つのデオキシリボヌクレオシドトリリン酸、ＭｇＣ
ｌ２、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常の緩衝液である。
ＤＮＡは何回にもわたるサイクルで増幅される。一般的
には、サイクル回数を多くすることによって検出感度を
増すことが可能であり、各サイクルは温度を上げて短時
間ＰＢＭＣ ＤＮＡを変性させ、反応液を冷却し、つい
でＤＮＡポリメラーゼで重合させることから成ってい
る。
スストランドに相補的である部分から１０−３００塩基
対だけ離れて位置する、既知配列のＤＮＡプライマー対
は、オリゴヌクレオチド合成のためのよく知られた方法
によって調製することができる。各プライマーの一方の
端を伸ばすことができ、プライマーがＰＢＭＣ ＤＮＡ
にアニーリングするときに制限エンドヌクレアーゼ部位
をつくるように修飾される。ＰＣＲ反応混合物が含み得
るものは、ＰＢＭＣ ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４
つのデオキシリボヌクレオシドトリリン酸、ＭｇＣ
ｌ２、ＤＮＡポリメラーゼおよび通常の緩衝液である。
ＤＮＡは何回にもわたるサイクルで増幅される。一般的
には、サイクル回数を多くすることによって検出感度を
増すことが可能であり、各サイクルは温度を上げて短時
間ＰＢＭＣ ＤＮＡを変性させ、反応液を冷却し、つい
でＤＮＡポリメラーゼで重合させることから成ってい
る。
【００５４】増幅した配列はオリゴマー制限（ＯＲ）と
呼ばれている方法を用いて検出できる。Ｒ．Ｋ．Ｓａｉ
ｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３：１００８−１０１２（１９８５）およびＳＳＣＰ
ＰＮＡＳ １９８５，Ｖｏｌ．８６，ｐ．２７６６−２
７７０を参照。たとえば、増幅後、ＰＣＲ反応混合物の
一部を分離してとり、３２Ｐ標識アデノシントリリン酸
末端−標識プローブのような、末端を標識したヌクレオ
チドプローブとハイブリダイズさせる。ＯＲ中では、末
端標識オリゴヌクレオチドプローブは溶液中で増幅配列
領域にハイブリド形成し、そのプロセスで特異なエンド
ヌクレアーゼ部位を再構成する。こうして、標識プロー
ブと増幅Ｋａｔ Ｇ配列のハイブリダイゼーションによ
って、選択的制限酵素切断に感受性の２本鎖ＤＮＡ形を
生ずる。エンドヌクレアーゼで制限的に切断後、生成し
た試料をポリアクリルアミドゲル上で分析し、診断的に
標識したフラグメントを有するゲルの１部のオートラジ
オグラムが得られる。オートラジオグラム中の診断的フ
ラグメント（たとえば長さ１０−１５塩基）が見られた
ときはＰＢＭＣｓ中にＫａｔ Ｇ配列が存在することを
示している。
呼ばれている方法を用いて検出できる。Ｒ．Ｋ．Ｓａｉ
ｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３：１００８−１０１２（１９８５）およびＳＳＣＰ
ＰＮＡＳ １９８５，Ｖｏｌ．８６，ｐ．２７６６−２
７７０を参照。たとえば、増幅後、ＰＣＲ反応混合物の
一部を分離してとり、３２Ｐ標識アデノシントリリン酸
末端−標識プローブのような、末端を標識したヌクレオ
チドプローブとハイブリダイズさせる。ＯＲ中では、末
端標識オリゴヌクレオチドプローブは溶液中で増幅配列
領域にハイブリド形成し、そのプロセスで特異なエンド
ヌクレアーゼ部位を再構成する。こうして、標識プロー
ブと増幅Ｋａｔ Ｇ配列のハイブリダイゼーションによ
って、選択的制限酵素切断に感受性の２本鎖ＤＮＡ形を
生ずる。エンドヌクレアーゼで制限的に切断後、生成し
た試料をポリアクリルアミドゲル上で分析し、診断的に
標識したフラグメントを有するゲルの１部のオートラジ
オグラムが得られる。オートラジオグラム中の診断的フ
ラグメント（たとえば長さ１０−１５塩基）が見られた
ときはＰＢＭＣｓ中にＫａｔ Ｇ配列が存在することを
示している。
【００５５】もとのテンプレートとしてクロモソームＤ
ＮＡの代りにＲＮＡを用いることによって検出感度を上
げる可能性があるので、本発明ではここで述べたＤＮＡ
配列に相補的なＲＮＡ配列を用いることを企てた。ＲＮ
Ａは逆転写酵素によって相補的なＤＮＡに変換でき、そ
のあとＤＮＡ増幅させる。
ＮＡの代りにＲＮＡを用いることによって検出感度を上
げる可能性があるので、本発明ではここで述べたＤＮＡ
配列に相補的なＲＮＡ配列を用いることを企てた。ＲＮ
Ａは逆転写酵素によって相補的なＤＮＡに変換でき、そ
のあとＤＮＡ増幅させる。
【００５６】実験法 細菌株とプラスミド
本発明で用いた細菌株とプラスミドの概略を表１に示
す。
す。
【００５７】
【表１】
【００５８】結核菌Ｈ３７ＲＶゲノムライブラリーがシ
ャトルコスミドｐＹＵＢ１８（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８８）中に構成され、Ｄｒ．Ｗ．Ｒ．Ｊａ
ｃｏｂｓの厚意により提供を受けた。使用したその他の
シャトルベクターはｐＹＵＢ１２（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８８）とｐＢＡＫ１４（Ｚｈａｎｇｅ
ｔ ａｌ．，１９９１）である。
ャトルコスミドｐＹＵＢ１８（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８８）中に構成され、Ｄｒ．Ｗ．Ｒ．Ｊａ
ｃｏｂｓの厚意により提供を受けた。使用したその他の
シャトルベクターはｐＹＵＢ１２（Ｓｎａｐｐｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８８）とｐＢＡＫ１４（Ｚｈａｎｇｅ
ｔ ａｌ．，１９９１）である。
【００５９】微生物学的方法と酵素学
用いた抗生物質、増殖条件、酵素学およびＭＩＣ定量は
Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）中で見ることが
できる。
Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）中で見ることが
できる。
【００６０】核酸に関する方法
サブクローニング、サウザーンブロッティング、ＤＮＡ
配列決定、オリゴヌクレオチド生合成等に用いたのは標
準プロトコールである（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９；Ｅｉｇｌｍｅｅｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１）。
配列決定、オリゴヌクレオチド生合成等に用いたのは標
準プロトコールである（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９；Ｅｉｇｌｍｅｅｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１）。
【００６１】活性染色
大腸菌とマイコバクテリアの無細胞抽出物の調製は最近
記載されている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。未変性蛋白試
料はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）が記載しているような
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で調製した：但し以
下の点はＬａｅｍｍｌｉと異なる。すなわち、すべての
緩衝液からＳＤＳを取除き、試料を煮沸せず、そしてβ
−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に含めなかっ
た。５０−１００μｇの蛋白質試料を７．５％のポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動してのち、そのゲルをゆ
るく攪拌しながら３ｍＭ Ｈ２Ｏ２中に２０分間浸して
カタラーゼ活性を検出した。等量の２％塩化第二鉄と２
％第二鉄シアン化カリウムを加えると、光照射によって
カタラーゼ活性を示す鮮明なバンドが現われる。ペルオ
キシダーゼ活性は、０．２−０．５ｍｇ／ｍｌジアミノ
ベンヂジンと１．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含む溶液中にゲル
を３０−１２０分間浸したのち褐色バンドとして検出さ
れる。
記載されている（Ｈｅｙｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。未変性蛋白試
料はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）が記載しているような
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で調製した：但し以
下の点はＬａｅｍｍｌｉと異なる。すなわち、すべての
緩衝液からＳＤＳを取除き、試料を煮沸せず、そしてβ
−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に含めなかっ
た。５０−１００μｇの蛋白質試料を７．５％のポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動してのち、そのゲルをゆ
るく攪拌しながら３ｍＭ Ｈ２Ｏ２中に２０分間浸して
カタラーゼ活性を検出した。等量の２％塩化第二鉄と２
％第二鉄シアン化カリウムを加えると、光照射によって
カタラーゼ活性を示す鮮明なバンドが現われる。ペルオ
キシダーゼ活性は、０．２−０．５ｍｇ／ｍｌジアミノ
ベンヂジンと１．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含む溶液中にゲル
を３０−１２０分間浸したのち褐色バンドとして検出さ
れる。
【００６２】高度の毒性化合物をつくるための最も適当
な方法は、結核菌ＨＰＩ酵素てペルオキシダーゼ作用的
にＩＮＨを活性化することである（Ｙｏｕａｔｔ，１９
６９；Ｇａｙａｔｈｒｉ−Ｄｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，１
９７５）。ｋａｔ Ｇ遺伝子が分離されて特性が明らか
になったので、同じようにして活性化され得るＩＮＨの
新しい誘導体を作ることも可能なはずである。
な方法は、結核菌ＨＰＩ酵素てペルオキシダーゼ作用的
にＩＮＨを活性化することである（Ｙｏｕａｔｔ，１９
６９；Ｇａｙａｔｈｒｉ−Ｄｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，１
９７５）。ｋａｔ Ｇ遺伝子が分離されて特性が明らか
になったので、同じようにして活性化され得るＩＮＨの
新しい誘導体を作ることも可能なはずである。
【００６３】引 用 文 献
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【図１】ｐＹＺ５６中に存在する挿入体の制限マップを
示す。
示す。
【図２】結核菌カタラーゼ／ペルオキシダーゼポリペプ
チドの部分配列およびＨＰＩ酵素との比較を示す
チドの部分配列およびＨＰＩ酵素との比較を示す
【図３】組換え結核菌ペルオキシダーゼ／カタラーゼの
発現を示す。
発現を示す。
【図４】ＩＮＨ−抵抗株におけるカタラーゼ遺伝子の欠
失を示す。
失を示す。
【図５】各種の制限酵素地図を示す。
【図６Ａ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌から
の抽出物を示す。
の抽出物を示す。
【図６Ｂ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌から
の抽出物を示す。
の抽出物を示す。
【図６Ｃ】結核菌Ｈ３７ＲＶからの抽出物と大腸菌から
の抽出物を示す。
の抽出物を示す。
【図７】コロニー数を示すグラフである。
【図８】サザーンブロット分析の結果を示す。
フロントページの続き
(72)発明者 イング ザング
イギリス国ロンドン，デュケイン ロー
ド，オドリスコール ハウス 137 エ
イ
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/09
C12Q 1/04
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (26)
- 【請求項１】 イソニアジドに抵抗性の結核菌の存在を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するプロセスで、以下のステッ
プから成る： （Ａ） 結核菌の核酸を固体支持体上に沈着固定して、
プローブにその核酸が近づけるようにする； （Ｂ） ステップ（Ａ）からの問題の固定化核酸をハイ
ブリダイズできる条件下でプローブと接触させる； （Ｃ） ステップ（Ｂ）からの問題のフィルターを洗滌
して、ハイブリド形成していないプローブを除去し；つ
いで （Ｄ） ステップ（Ｃ）から得た問題の洗滌フィルター
上でハイブリッド形成したすべてのプローブを検出す
る； ここで問題のプローブは、プラスミドｐＹＺ５６の２．
５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントでその中に
ＢａｍＨＩ開裂部位を含有する核酸配列を含んでいる。 - 【請求項２】 請求項第１項記載のプロセスで、そこで
プローブは放射性、酵素的、蛍光およびリン光標識から
選択された標識を有する。 - 【請求項３】 イソニアジドに抵抗性の結核菌細胞の存
在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するプロセスで、そのプロ
セスは以下のステップから成る： （Ａ） 細胞の核酸を固体支持体上に沈着固定して、プ
ローブにその核酸が近づけるようにする； （Ｂ） ステップ（Ａ）からの問題の固定化核酸をハイ
ブリダイズできる条件下でプローブと接触させる； （Ｃ） ステップ（Ｂ）からの問題のフィルターを洗滌
して、ハイブリッド形成していないプローブを除去し；
ついで （Ｄ） ステップ（Ｃ）から得た問題の洗滌フィルター
上でハイブリッド形成したすべてのプローブを検出す
る； ここで問題のプローブは、つぎの構造のポリペプチドを
コードする核酸配列を含んでいる：ＡＰＬＮＳＷＰＤＮ
ＡＳＬＤＫＡＲＲＬＬＷＰＳＫＫＫＹＧＫＫＬ−ＳＷＡ
ＤＬＩＶ． - 【請求項４】 請求項第３項記載のプロセスで、そこで
プローブは放射性、酵素的、蛍光およびリン光標識から
選択された標識を有する。 - 【請求項５】 細菌含有試料中でイソニアジド抵抗性結
核菌の存在を検出する方法で、つぎのプロセスから成る （Ａ） イソニアジド抵抗性結核菌の含有が疑われる試
料を用意する； （Ｂ） 問題の試料中の細菌を溶解してそれらのＤＮＡ
を溶出させる； （Ｃ） 問題の溶出ＤＮＡを変性させ； （Ｄ） イソニアジド類に抵抗性の結核菌からのＤＮＡ
に安定的にハイブリッド形成することのできるプローブ
を用意する。そこで問題のプローブはプラスミドｐＹＺ
５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント
を含み、そのフラグメントはＢａｍＨＩ開裂部位を含有
する； （Ｅ） 問題のプローブが、問題の試料中に存在するイ
ソニアジド抵抗性結核菌のＤＮＡとハイブリッドＤＮＡ
複合体を作りうる条件下で、問題のＤＮＡプローブと問
題の試料中の溶出ＤＮＡとを接触させる；そして （Ｆ） 問題の試料中にイソニアジド抵抗性結核菌が存
在することの表示であるハイブリッドＤＮＡ複合体を検
出する。 - 【請求項６】 請求項第５項記載の方法で、そこでは問
題のプローブは標識されている。 - 【請求項７】 請求項第６項記載の方法で、そこでは問
題のラベルは検出可能かまたは選択的にインディケータ
ーに結合して検出可能な複合体を作る。 - 【請求項８】 請求項第７項記載の方法で、そこでは問
題のプローブは放射性アイソトープで標識されている。 - 【請求項９】 請求項第７項記載の方法で、そこでは問
題の標識は非アイソトープマーカーであり、そのインデ
ィケーターは、アビヂンがハイブリッドＤＮＡ複合体上
でマーカーに結合しているときに検出可能な化学物質が
結合したアビヂンである。 - 【請求項１０】 請求項第９項記載の方法で、そこで問
題の化学物質は蛍光団であり、これによって問題のハイ
ブリッドＤＮＡ複合体を蛍光測定法により検出できる。 - 【請求項１１】 請求項第９項記載の方法で、そこで問
題の化学物質は電子密度の大きな化合物であり、これに
よって問題のハイブリッドＤＮＡ複合体を電子顕微鏡に
よって検出できる。 - 【請求項１２】 請求項第９項記載の方法で、そこで問
題の化学物質は抗体であり、これによって問題のハイブ
リッドＤＮＡ複合体を免疫的に検出できる。 - 【請求項１３】 請求項第９項記載の方法で、そこで問
題の化学物質は触媒／基質対の一つであり、これによっ
て問題のハイブリッドＤＮＡ複合体を酵素学的に検出で
きる。 - 【請求項１４】 請求項第５項記載の方法で、そこでは
問題のＤＮＡを問題のプローブに接触させる前に、問題
の試料から細菌を分離し、ＤＮＡ結合支持体上に問題の
ＤＮＡを固定する。 - 【請求項１５】 請求項第１４項記載の方法で、そこで
問題の支持体はニトロセルロース膜である。 - 【請求項１６】 イソニアジド抵抗性結核菌の検出のた
めのキットで、そこでキットは以下のものを含む： （Ａ） プラスミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｖ−ＫｐｎＩフラグメントでこの中にＢａｍＨＩ開裂部
位を含む核酸配列を包含するプローブを含む容器一式
で、さらに （Ｂ） 核酸の対照調製体を含む容器一式。 - 【請求項１７】 請求項第１６項記載のキットで、そこ
でプローブは放射性、酵素的、蛍光およびリン光標識か
らなる群から選択した標識を有する。 - 【請求項１８】 イソニアジド抵抗性結核菌を検出する
ための核酸プローブで、そこでは問題のプローブはプラ
スミドｐＹＺ５６の２．５Ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ
フラグメントから成り、このフラグメントはＢａｍＨＩ
開裂部位を含んでいる。 - 【請求項１９】 請求項第１８項記載のプローブで、こ
れはヒト血清蛋白質、ウィルス蛋白質、細菌蛋白質およ
び問題の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含まな
いＤＮＡである。 - 【請求項２０】 請求項第１８項記載のプローブで、そ
れはヒト組織を含まない。 - 【請求項２１】 請求項第１８項記載のプローブで、そ
のプローブには放射性核種が結合している。 - 【請求項２２】 請求項第１８項記載のプローブが相補
的塩基配列を有するヌクレオチド配列に必ず水素結合し
ているようなものから成るハイブリッド二重複合分子。 - 【請求項２３】 請求項第２２項記載のハイブリッド二
重複合分子で、そこで問題のプローブは一つのＤＮＡ配
列である。 - 【請求項２４】 請求項第２２項記載のハイブリッド二
重複合分子で、そこで放射性核種ラベルが問題のヌクレ
オチド二重複合体に結合している。 - 【請求項２５】 一群のヌクレオチド配列の中からイソ
ニアジド抵抗性結核菌のヌクレオチド配列を選択するプ
ロセスで、請求項第１８項記載のプローブに対して問題
のヌクレオチド配列のうちのどれがハイブリッド形成す
るかを決めるステップから成る。 - 【請求項２６】 請求項第９項記載の方法で、そこでラ
ベルはビオチン、インディケーターはアビヂンである。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87594092A | 1992-04-30 | 1992-04-30 | |
| US875940 | 1992-04-30 | ||
| US07/929,206 US5633131A (en) | 1992-04-30 | 1992-08-14 | Rapid detection of isoniazid resistance in mycobacterium tuberculosis probes for selecting nucleic acid encoding isoniazid resistance, and methods and kits |
| US929206 | 1992-08-14 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002374077A Division JP2003225097A (ja) | 1992-04-30 | 2002-12-25 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759595A JPH0759595A (ja) | 1995-03-07 |
| JP3408564B2 true JP3408564B2 (ja) | 2003-05-19 |
Family
ID=27128386
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31259692A Expired - Fee Related JP3408564B2 (ja) | 1992-04-30 | 1992-10-09 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
| JP2002374077A Withdrawn JP2003225097A (ja) | 1992-04-30 | 2002-12-25 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
| JP2005369286A Withdrawn JP2006149390A (ja) | 1992-04-30 | 2005-12-22 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002374077A Withdrawn JP2003225097A (ja) | 1992-04-30 | 2002-12-25 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
| JP2005369286A Withdrawn JP2006149390A (ja) | 1992-04-30 | 2005-12-22 | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (3) | JP3408564B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9620075D0 (en) * | 1996-09-26 | 1996-11-13 | Dynal As | Method |
| CN115920965B (zh) * | 2022-10-14 | 2024-05-28 | 东北林业大学 | 一种制备纳米金复合双金属有机骨架纳米酶的方法及其过氧化物酶活性的应用 |
-
1992
- 1992-10-09 JP JP31259692A patent/JP3408564B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-12-25 JP JP2002374077A patent/JP2003225097A/ja not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-12-22 JP JP2005369286A patent/JP2006149390A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003225097A (ja) | 2003-08-12 |
| JPH0759595A (ja) | 1995-03-07 |
| JP2006149390A (ja) | 2006-06-15 |
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