RU2204608C2 - Способ выявления устойчивости микобактерий к рифампицину с возможной их идентификацией, способ гибридизации, зонд и композиция для его осуществления, набор праймеров (варианты) - Google Patents
Способ выявления устойчивости микобактерий к рифампицину с возможной их идентификацией, способ гибридизации, зонд и композиция для его осуществления, набор праймеров (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2204608C2 RU2204608C2 RU97100176/13A RU97100176A RU2204608C2 RU 2204608 C2 RU2204608 C2 RU 2204608C2 RU 97100176/13 A RU97100176/13 A RU 97100176/13A RU 97100176 A RU97100176 A RU 97100176A RU 2204608 C2 RU2204608 C2 RU 2204608C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- probes
- hybridization
- rifampicin
- probe
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 331
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 123
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 title claims abstract description 95
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 title claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 93
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 30
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 13
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 12
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 claims description 7
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 7
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 5
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 claims description 4
- 102220486708 Cytochrome b-245 chaperone 1_R44G_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 102220259718 rs34120878 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 14
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 abstract 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001549 tubercolostatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- ZWBTYMGEBZUQTK-PVLSIAFMSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,32-tetrahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-1'-(2-methylpropyl)-6,23-dioxospiro[8,33-dioxa-24,27,29-triazapentacyclo[23.6.1.14,7.05,31.026,30]tritriaconta-1(32),2,4,9,19,21,24,26,30-nonaene-28,4'-piperidine]-13-yl] acetate Chemical compound CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c4NC5(CCN(CC(C)C)CC5)N=c4c(=NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C ZWBTYMGEBZUQTK-PVLSIAFMSA-N 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 229960000885 rifabutin Drugs 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 10
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 101150005343 INHA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- FRFSUUWVTVDAJG-UHFFFAOYSA-N 3-fluoro-1h-quinolin-2-one Chemical class C1=CC=C2NC(=O)C(F)=CC2=C1 FRFSUUWVTVDAJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 4
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 4
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 4
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 108030002440 Catalase peroxidases Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 3
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 3
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000880156 Streptomyces cacaoi Subtilisin inhibitor-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29-pentahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-26-[(E)-(4-methylpiperazin-1-yl)iminomethyl]-6,23-dioxo-8,30-dioxa-24-azatetracyclo[23.3.1.14,7.05,28]triaconta-1(29),2,4,9,19,21,25,27-octaen-13-yl] acetate pyridine-4-carbohydrazide Chemical compound NNC(=O)c1ccncc1.CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c(O)c(\C=N\N4CCN(C)CC4)c(NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- -1 16S t-RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031998 Mycobacterium Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 1
- 241001502334 Mycobacterium avium complex bacterium Species 0.000 description 1
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 102200126591 c.125A>G Human genes 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 208000015355 drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229960005206 pyrazinamide Drugs 0.000 description 1
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N pyrazinecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Liquid Crystal Substances (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для диагностики заболеваний, вызванных микобактериями, а также лечения данных заболеваний с помощью антибиотиков. Способ выявления устойчивости микобактерий к рифампицину и его аналогам позволяет одновременно идентифицировать и виды микобактерий. Способ основан на исследовании ДНК микобактерий, гибридизации их с одним из зондов на основе гена rpoB (сведения о последовательностях нуклеотидов приведены в тексте описания) с последующим выявлением гибридов. Для осуществления способа созданы зонды и наборы праймеров. Сконструирована диагностическая композиция для выявления устойчивости микобактерий к рифампицину и диагностики туберкулеза и лепры. Использование изобретения позволяет унифицировать способ, осуществить раннюю диагностику заболеваний и ускорить распознавание устойчивости к туберкулостатическим средствам, что является существенным для лечения и оптимального контроля за вспышками эпидемии. 7 с. и 20 з.п.ф-лы, 11 ил., 6 табл.
Description
Изобретение относится к области устойчивых к лекарственным препаратам микобактерий.
Настоящее изобретение относится к зондам, праймерам, содержащим их способам и комплектам для выявления нуклеиновых кислот микобактериального происхождения в биологических образцах.
Распознавание большинства важных для клинической практики видов Myсоbacterium, в частности Mycobacterium tuberculosis, является утомительным и требующим много времени из-за процедур выращивания культур, которые могут отнимать до 6 недель. Быстрый диагноз инфекции Mycobaсterium очень важен, так как болезнь может быть опасной для жизни и в высокой степени контагиозной. Только недавно были разработаны некоторые способы, в каждом из которых используется тот или иной процесс амплификации, для выявления и идентификации видов Mycobaсterium, не требующие выращивания культуры (Claridge et al., 1993). Большая часть этих способов до сих пор находится на стадии испытаний, и их полезность для повседневного практического применения остается под вопросом. Более того, эти способы не решают проблему обнаружения устойчивости Myсоbacterium к лекарственным препаратам, которое до сих пор основывается на выращивании культуры.
Поскольку частота случаев туберкулеза с устойчивостью одновременно к ряду лекарственных препаратов постоянно увеличивается (Culliton, 1992), в настоящее время ясно, что раннее диагностирование М.tuberculosis и быстрое распознавание устойчивости к главным туберкулостатическим средствам является существенным для лечения и оптимального контроля за вспышками эпидемии. Антибиотиками, используемыми для лечения инфекций М.tuberculosis, в основном являются изониазид (isoniazid) и рифампицин, которые вводят либо по отдельности, либо в виде комбинации их обоих. Иногда используются пиразинамид (pyrazinanude), этамбутол (ethambutol) и стрептомицин; в будущем могут стать предпочтительными иные классы антибиотиков, подобные (фторо)хинолонам.
Так как у большинства микобактерий, устойчивых одновременно к ряду лекарственных препаратов, утрачена также восприимчивость к рифампицину, устойчивость к рифампицину рассматривается как потенциальный маркер для случаев туберкулеза, устойчивого одновременно к ряду лекарственных препаратов. По этой причине выявление устойчивости к рифампицину может быть особенно важным.
Для большинства штаммов М.tuberculosis, исследованных до сих пор, был выяснен механизм, ответственный за устойчивость к рифампицину (и аналогам, подобным рифабутину). Рифампицин (и аналоги) блокирует РНК-полимеразу путем взаимодействия с β-субъединицей этого энзима. Telenti et al. (1993a) обнаружили, что мутации в ограниченной области β-субъединицы РНК-полимеразы М.tuberculosis приводят к росту нечувствительности РНК-полимеразы к воздействию рифампицина. Эта область ограничивается участком из 23 кодонов в гене rроВ. Авторы описывают 17 изменений аминокислот, провоцирующих устойчивость к рифампицину (Telenti et al., 1993b). Эти изменения аминокислот вызываются точечными мутациями или делениями в 15 нуклеотидах или 8 аминокислотных кодонах соответственно, рассеянных на участке из 67 нуклеотидов или 23 аминокислотных кодонов.
Telenti et al. (1993а и b) описан метод PCR-SSCP для отбора подходящих мутаций, ответственных за устойчивость к рифампицину (SSCP обозначает полиморфизм однонитевой конформации). SSCP-анализ может выполняться либо путем использования радиоактивности, либо путем использования флуоресцентного маркера. В последнем случае требуется сложное и дорогостоящее оборудование (автоматизированное устройство для секвенирования ДНК). Описанный SSCP-подход имеет также иные ограничения в отношении к специфичности и чувствительности, которые могут затруднять его повседневное использование. Образец может непосредственно анализироваться с получением адекватного результата только в том случае, если микроскопически наблюдается значительная масса бактерий (микроскопический показатель: > 90 организмов/область), и могут наблюдаться артефакты на неочищенных образцах ДНК, связанные с разделением нитей, которые усложняют интерпретацию результатов.
Kapur et al. (1994) описывают 23 различных аллеля, связанные с устойчивостью к рифампицину. В дополнение к мутациям, описанным Telenti et al. (1993a), описаны некоторые новые мутантные аллели rроВ. Однако наиболее часто встречающимися аллелями остаются те же аллели, что описаны ранее.
Молекулярная основа для устойчивости к рифампицину в М.leprae описана Ноnоrе и Cole (1993). Здесь также устойчивость возникает в результате мутаций в гене rроВ, который кодирует бета-субъединицу РНК-полимеразы М.leprae. Анализировалось лишь ограниченное число устойчивых штаммов М.leprae (9), и в большей части их (8/9) устойчивость имела место вследствие мутации, оказывающей воздействие на остаток Ser-425.
У важных для клинической практики микобактерий, иных чем М.tuberculosis и М.leprae, часто проявляется врожденная устойчивость к рифампицину, которая является переменной. Это имеет место в случае М.aviuт и М.intracellulare патогенов человека, в отношении которых доступен лишь ограниченный выбор способов лечения. Guerrero et al. (1994) сравнивали последовательности гена rроВ различных изолятов М.avium и М.intracellulare с таковыми М. tuberculosis. Различия имеются на уровне нуклеотидов, однако обнаружена полная идентичность аминокислот с чувствительным к рифампицину М.tuberculosis. Эти данные предполагают, что для М.avium и М.intracellulare имеет место другой механизм устойчивости, возможно барьер проницаемости.
Специфичное обнаружение точечных мутаций или малых делений может быть изящно выполнено с использованием методик гибридизации, таких как проба на обратную гибридизацию. Однако сложность, наблюдаемая в соответствующей (относящейся к механизму устойчивости к лекарственным препаратам) части гена rроВ, не дает возможности прямой разработки зонда. Как будет в дальнейшем показано на примерах, одна из целей настоящего изобретения состояла в разработке специфического подхода, дающего возможность выявления большинства, если не всех, обнаруженных до сих пор мутаций быстрым и удобным способом без необходимости в сложном оборудовании.
Механизм устойчивости к изониазиду (INH) значительно более сложен, чем таковой для рифампицина. По крайней мере, два генных продукта вовлекаются в механизм устойчивости к изониазиду. Во-первых, имеется каталаза-пероксидаза, которая, как полагают, превращает изониазид в активированную молекулу. Таким образом, штаммы, которые не производят каталазу-пероксидазу вследствие дефектного или удаленного гена katG, уже не восприимчивы к изониазиду (Zhang et al. , 1992; Stoeckle et al., 1993). В этом контексте следует упомянуть, что связь между устойчивостью к изониазиду и потерей активности каталазы уже отмечалась в пятидесятые годы (Middlebrook, 1954а и b; Youatt, 1969).
Вторая молекула, вовлеченная в механизм устойчивости, является продуктом гена inhA, который, как полагают, играет роль в биосинтезе миколовой кислоты. Принимают, что активированная молекула изониазида взаимодействует либо непосредственно, либо опосредованно с этим продуктом и, вероятно, препятствует правильному биосинтезу миколовой кислоты. Эта гипотеза основана на недавнем наблюдении, что сверхэкспрессия гена inhA немутантного типа или изменение определенной аминокислоты (S94a) в гене inhA придает устойчивость к изониазиду (Banerjee et al., 1994).
Вкратце и в некоторой степени упрощенно мы можем утверждать, что в определенных штаммах М.tuberculosis устойчивость к изониазиду может быть опосредована
- потерей активности каталазы-пероксидазы;
- наличием определенных изменений аминокислот в белке inhA;
- уровнем экспрессии белка inhA природного типа.
- потерей активности каталазы-пероксидазы;
- наличием определенных изменений аминокислот в белке inhA;
- уровнем экспрессии белка inhA природного типа.
Также, иные механизмы могли бы участвовать в обеспечении устойчивости к изониазиду и связанным с ним лекарственным препаратам. Важность этих факторов в общем спектре механизмов устойчивости к изониазиду еще необходимо оценить. Эту проблему можно пытаться решить при помощи методик с использованием зондов ДНК, если надежные зонды ДНК могут быть выработаны из имеющихся в распоряжении ДНК-последовательностей типа katG (EMBL no X68081) и гена inhA (EMBL no U02492) М.tuberculosis. Эти зонд-тесты могли бы также применяться для выявления устойчивости к лекарственным образцам в биологических препаратах.
Для выявления устойчивости к стрептомицину и (фторо)хинолонам может применяться тот же подход, что и в случае рифампицина. Устойчивость к этим антибиотикам также вызывается точечными мутациями в ограниченной области одного или более генов. Точечные мутации в гене гиразы придают устойчивость к (фторо)хинолонам (EMBL no L27512). Устойчивость к стрептомицину коррелирует с мутациями либо в гене 16S рРНК, либо в гене рибосомного белка S12 (rpsL) (Finken et al., 1993; Douglas and Steyn, 1993; Nair et al., 1993).
Устойчивость вследствие изменений нуклеотидов в генах katG, rpoB и rpsL описывается в международной заявке WO 93/22454. Для каждого из различных генов в М.tuberculosis подробно описана только одна из многих возможных мутаций, а именно R461L для katG, S425L (эквивалентна мутации S531L, описанной Telenti et al. и в настоящем изобретении) для rpoB и K42R для rpsL.
Целью настоящего изобретения является разработка быстрого и надежного способа обнаружения, предназначенного для определения устойчивости к антибиотикам видов микобактерий, присутствующих в биологическом образце.
Более определенно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать быстрый и надежный метод определения устойчивости к рифампицину (и/или к рифабутину) вида М.tuberculosis, присутствующего в биологическом образце.
Целью настоящего изобретения является также разработка методов, дающих возможность обнаружения и идентификации видов Mycobaсterium в биологическом образце, непосредственно связанных с отслеживанием спектра устойчивости к антибиотикам.
Более определенно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать метод выявления присутствия вида Mycobaсtenum tuberculosis в биологическом образце, непосредственно связанный с выявлением устойчивости к рифампицину (и/или к рифабутину).
Более определенно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать метод выявления присутствия вида Mycobaсterium leprae в биологическом образце, непосредственно связанный с выявлением устойчивости к рифампицину (и/или к рифабутину).
Целью настоящего изобретения является также выбор определенных зондов, способных отличать последовательности немутантного типа от мутировавших последовательностей, придающих устойчивость к одному или более лекарственным препаратам.
Более определенно, целью настоящего изобретения является выбор определенных зондов, способных отличать последовательности немутантного типа от мутировавших последовательностей, придающих устойчивость к рифампицину (и/или к рифабутину).
Более определенно, целью настоящего изобретения является выбор определенного набора зондов, способных отличать последовательности немутантного типа от мутировавших последовательностей, придающих устойчивость к рифампицину (и/или к рифабутину), причем этот определенный набор зондов используется в одних и тех же условиях гибридизации и промывки.
Сверх того, целью настоящего изобретения является объединение набора выбранных зондов, способных отличать последовательности немутантного типа от мутировавших последовательностей, придающих устойчивость к рифампицину (и/или к рифабутину), с другим набором выбранных зондов, способных идентифицировать виды микобактерий, присутствующие в биологическом образце, в силу чего все зонды могли бы использоваться в одних и тех же условиях гибридизации и промывки.
Целью настоящего изобретения является также выбор праймеров, дающих возможность амплификации фрагмента(-ов) гена, определяющего(-их) представляющие интерес особенности устойчивости к антибиотикам.
Более конкретно, целью настоящего изобретения является выбор праймеров, дающих возможность амплификации фрагмента(-ов) гена, определяющего(-их) представляющие интерес особенности устойчивости к антибиотикам.
Более конкретно, целью настоящего изобретения является выбор праймеров, дающих возможность амплификации фрагмента гена rроВ, определяющего устойчивость к рифампицину (и аналогам).
Другой целью настоящего изобретения является создание комплектов для обнаружения устойчивости микобактерий к антибиотикам, по возможности объединенного с идентификацией рассматриваемых видов микобактерий.
Все цели настоящего изобретения были удовлетворены при помощи следующих конкретных вариантов реализации.
Выбор предпочтительных зондов согласно настоящему изобретению основан на принципе линейного зондового анализа (LiPA), который представляет собой обратный гибридизационный анализ с использованием олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в виде параллельных линий на полоске твердофазной подложки (Stuyver et al., 1993; международная заявка WO 94/12670). Этот способ имеет особые преимущества, так как он является быстрым и простым по выполнению. Схема обратной гибридизации и, более конкретно, способ LiPA имеет много практических преимуществ по сравнению с другими ДНК-методиками или схемами гибридизации, в особенности в том случае, когда является необходимым или неизбежным использование сочетания зондов для получения требуемой информации.
Однако необходимо понимать, что любой другой тип теста на гибридизацию или схемы гибридизации, в котором используется любой из выбранных зондов, как описывается далее в изобретении, также охватывается настоящим изобретением.
Способ обратной гибридизации предполагает, что зонды иммобилизованы на твердофазной подложке и что ДНК-мишень помечена для того, чтобы дать возможность обнаружения образующихся гибридов.
Следующие определения служат для того, чтобы проиллюстрировать термины и выражения, используемые в описании настоящего изобретения.
Вещество-мишень в настоящих примерах может представлять собой либо ДНК, либо РНК, например, геномную ДНК, или информационную РНК, или их амплифицированные варианты. Эти молекулы называются также полинуклеиновыми кислотами.
Термин "зонд" обозначает однонитевые специфичные в отношении последовательности олигонуклеотиды, в которых имеется последовательность, комплементарная к последовательности-мишени, которую необходимо обнаружить.
Термин "комплементарный", как он используется в настоящем описании, обозначает, что последовательность однонитевого зонда в точности комплементарна к последовательности однонитевой мишени, причем мишень определена как последовательность, в которой локализована мутация, которую необходимо обнаружить. Так как в соответствии с настоящей заявкой требуется обнаружение ошибочных спариваний оснований, для гибридизации требуются очень строгие условия, допускающие, в принципе, только гибридизацию в точности комплементарных последовательностей. Однако возможны вариации в длине зондов (см. ниже) и следует отметить, что поскольку для гибридизационных свойств зонда является существенной его центральная часть, то допустимы возможные отклонения последовательности зонда по отношению к последовательности мишени в начальной (головной) и конечной (хвостовой) части зонда, если используются более длинные последовательности зонда. Однако эти вариации, которые могут быть поняты на основе общих знаний в данной области технологии, всегда следует оценивать экспериментально, для того чтобы проверить, приводят ли они к эквивалентным характеристикам гибридизации по сравнению с точно комплементарными зондами.
Предпочтительно зонды имеют длину приблизительно от 5 до 50 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно от 10 до 25 нуклеотидов. Нуклеотиды, как они используются в настоящем изобретении, могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами и модифицированными нуклеотидами, такими как инозин, содержащими модифицированные группы, которые существенно не изменяют их гибридизационные свойства. Последовательности зондов представлены во всем описании как однонитевые ДНК-олигонуклеотиды с окончанием от 5' до 3'. Для квалифицированного специалиста ясно, что любой из определенных ниже зондов может использоваться как таковой, либо в его комплементарной форме, либо в его РНК-форме (в которой Т замещено на U).
Зонды, согласно изобретению, могут быть получены клонированием рекомбинантных плазмид, содержащих вставки, включающие соответствующие последовательности нуклеотидов, в случае необходимости посредством отщепления последних от клонированных плазмид с использованием адекватных нуклеаз и их выделения, например, путем фракционирования в соответствии с молекулярной массой. Зонды, согласно настоящему изобретению, могут быть также синтезированы химически, например, стандартным фосфо-триэфирным методом.
Термин "твердофазная подложка" может относиться к любому субстрату, с которым может быть связан олигонуклеотидный зонд, при условии, что он сохраняет гибридизационные свойства, и при условии, что фоновый уровень гибридизации остается низким. Обычно твердофазный субстрат представляет собой титрационный микропланшет, мембрану (например, найлоновую или нитроцеллюлозную) или микросферу (бусинку). Перед нанесением на мембрану или фиксацией может быть удобным модифицировать зонд на основе нуклеиновой кислоты, чтобы облегчить фиксацию или улучшить эффективность гибридизации. Такие модификации могут заключаться в гомополимерном наращивании, связывающем с различными реакционноспособными группами, такими как алифатические группы, NН2-группы, SH-группы, карбоксильные группы, или связывающем с биотином, гаптенами или белками.
Термин "меченый" относится к использованию меченых нуклеиновых кислот. Мечение может быть проведено путем использования меченых нуклеотидов, включаемых в ходе полимеразной стадии амплификации, так как это описано Saiki et al. (1988) или Bej et al. (1990), или мечеными праймерами, или любым другим методом, известным квалифицированным специалистам. Метки могут иметь изотопную (32P, 35S и т.д.) или неизотопную (биотин, дигоксигенин и т.д.) природу.
Термин "праймер" относится к однонитевой олигонуклеотидной последовательности, которая способна выступать в качестве центра инициации синтеза продукта удлинения праймера, который является комплементарным к копируемой нити нуклеиновой кислоты. Длина и последовательность праймера должны быть такими, чтобы они давали возможность служить затравкой для синтеза продуктов удлинения. Предпочтительно праймер имеет длину около 5-50 нуклеотидов. Конкретная длина и последовательность будут зависеть от сложности требуемых ДНК- или РНК-мишеней, а также от условий использования праймеров, таких как температура и ионная сила.
Тот факт, что праймеры амплификации не должны в точности подходить к соответствующей шаблонной последовательности, чтобы гарантировать должную амплификацию, неоднократно подтвержден в литературе (Kwok et al., 1990).
Используемый метод амплификации может представлять собой либо полимеразную цепную реакцию (PCR; Saiki et al., 1988), лигазную цепную реакцию LCR; Landgren et al. , 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), амплификацию на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), систему амплификации на основе транскрипции (TAS; Kwoh et al. , 1989), амплификацию замещением нити (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992), либо амплификацией при посредстве Qβ-репликазы (Lizardi et al., 1988; Lomely et al. , 1989), или любым другим подходящим способом амплификации молекул нуклеиновых кислот, известным в технологии.
Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров или зондов, могут также включать аналоги нуклеотидов, такие как фосфоротиаты (Matsukura et al. , 1987), алкилфосфоротиаты (Miller et al., 1979), или пептидные нуклеиновые кислоты (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993), или могут содержать интеркаляционные агенты (Asseline et al., 1984).
Как и большинство других вариаций и модификаций, вводимых в исходные последовательности ДНК, согласно изобретению эти вариации требуют адаптации по отношению к условиям, в которых следует использовать нуклеотиды, чтобы получить требуемую специфичность и чувствительность. Однако конечные результаты гибридизации будут существенно теми же, что и результаты, полученные с немодифицированными олигонуклеотидами.
Введение этих модификаций может давать преимущества в смысле положительного влияния на свойства, такие как кинетика гибридизации, обратимость образования гибрида, биологическая стабильность олигонуклеотидных молекул и т.д.
"Образец" может быть любым биологическим материалом, взятым либо непосредственно из организма инфицированного человека (или животного), либо после культивирования (обогащения). Биологический материал может представлять собой, например, мокроты любого вида, продукты бронхиального лаважа, кровь, ткань кожи, биопсии, материал в виде культуры лимфоцитов крови, колонии, жидкие культуры, экскременты, фекальные образцы, мочу и т.п.
Зонды, согласно настоящему изобретению, конструируются для достижения оптимальных рабочих характеристик в одних и тех же условиях гибридизации, так что они могут использоваться в наборах для одновременной гибридизации; это значительно повышает полезность этих зондов и приводит к значительному выигрышу в затратах времени и труда. Очевидно, если предпочтительными являются другие условия гибридизации, все зонды следует адаптировать соответствующим образом путем добавления или удаления нуклеотидов на их краях. Следует понимать, что эти соответствующие адаптации должны давать существенно тот же результат, а именно тот, что соответственные зонды будут все же специфично гибридизироваться с определенными мишенями. Такие адаптации могут также быть необходимыми, если амплифицируемый материал является по своей природе РНК, а не ДНК, как в случае системы NASBA.
Для конструирования зондов с желательными свойствами могут применяться следующие полезные приемы, известные квалифицированным специалистам.
Поскольку на степень и специфичность реакций гибридизации, таких как реакции, описанные в данной заявке, оказывает влияние ряд факторов, управление одним или более из этих факторов будет определять точное значение чувствительности и специфичности определенного зонда независимо от того, является ли он полностью комплементарным к своей мишени или нет. Важность и эффект различных условий испытаний, объясняемых далее, известны квалифицированным специалистам.
Во-первых, стабильность гибрида нуклеиновых кислот [зонд:мишень] следует выбирать таким образом, чтобы она была совместима с условиями испытаний. Этого можно достичь посредством избегания длинных последовательностей, содержащих много пар AT, посредством завершения гибридов парами оснований G:C и посредством конструирования зонда с подходящим Тm. Начальный и конечный участки зонда следует выбирать таким образом, чтобы длина и % GC приводили к Тm приблизительно на 2-10oС выше, чем температура, при которой будет проводиться заключительное испытание. Имеет значение состав оснований зонда, поскольку пары оснований G-C имеют более высокую термическую стабильность по сравнению с парами оснований А-Т благодаря дополнительной водородной связи. Таким образом, гибридизация, включающая комплементарные нуклеиновые кислоты с более высоким содержанием G-C, будет стабильна при более высоких температурах.
При конструировании зонда следует также принять во внимание такие условия, при которых будет использоваться зонд, как ионная сила и температура инкубации. Известно, что гибридизация будет возрастать по мере того, как возрастает ионная сила реакционной среды, и что термическая стабильность гибридов будет повышаться при повышении ионной силы. С другой стороны, химические реагенты, такие как формамид, мочевина, ДМСО и спирты, которые разрушают водородные связи, будут повышать жесткость условий гибридизации. Дестабилизация водородных связей такими реагентами может сильно снизить Тm. В целом, оптимальная гибридизация для синтетических олигонуклеотидных зондов длиной около 10-50 оснований происходит при температуре приблизительно на 5oС ниже температуры плавления данного дуплекса. Инкубация при температурах ниже оптимальной может дать возможность гибридизации ошибочно спаренных оснований, и может, следовательно, привести к пониженной специфичности.
Желательно иметь зонды, которые гибридизуются только в очень жестких условиях. В условиях высокой жесткости будут образовываться только высококомплементарные гибриды нуклеиновых кислот; гибриды без достаточной степени комплементарности образовываться не будут. Соответственно, жесткость условий испытаний определяет количество необходимых комплементарностей между двумя нитями нуклеиновых кислот, образующих гибрид. Степень жесткости выбирают так, чтобы максимизировать различия в стабильности между гибридом, образованным с мишенью, и с нуклеиновой кислотой, не являющейся мишенью. В настоящем случае требуется обнаружить изменения в единственной паре оснований, что требует условий очень высокой степени жесткости.
Во-вторых, зонды следует располагать таким образом, чтобы минимизировать стабильность гибрида нуклеиновых кислот [зонд:не-мишень). Это может быть выполнено путем минимизации длины полной комплементарности к не являющимся мишенями организмам, посредством избегания содержащих много пар GC областей гомологии с последовательностями, не являющимся мишенями, и посредством позиционирования зонда так, чтобы охватить настолько много дестабилизирующих ошибочных спариваний, насколько это возможно. Является ли последовательность зонда пригодной для того, чтобы обнаруживать только конкретный вид организма, зависит, по большей части, от различия в термической стабильности между гибридами [зонд: мишень] и гибридами [зонд:не-мишень]. При конструировании зондов различия в этих значениях Тm должны быть настолько большими, насколько это возможно (например, по меньшей мере 2oС и предпочтительно 5oС).
Длина последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью, и, соответственно, длина последовательности зонда также могут быть важны. В некоторых случаях могут иметься некоторые последовательности из определенной области, различающиеся по расположению и длине, которые будут давать зонды с желательными гибридизационными свойствами. В других случаях одна последовательность может быть значительно лучше, чем другая, которая отличается лишь единственным основанием. Хотя и для нуклеиновых кислот, которые не полностью комплементарны, возможна гибридизация, обычно стабильность гибрида в первую очередь определяет наиболее длинный отрезок полностью комплементарной последовательности оснований. Хотя могут использоваться олигонуклеотидные зонды различной длины и состава входящих в них оснований, предпочтительные олигонуклеотидные зонды согласно настоящему изобретению имеют длину от около 5 до 50 (более определенно 10-25) оснований и имеют значительный фрагмент в последовательности, который является полностью комплементарным к последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью.
В-третьих, области в ДНК- и РНК-мишенях, о которых известно, что они образуют прочные внутренние структуры, тормозящие гибридизацию, являются менее предпочтительными. Подобно этому следует избегать зондов с большой самокомплементарностью. Как объяснялось выше, гибридизация представляет собой ассоциацию двух одиночных нитей комплементарных нуклеиновых кислот с образованием связанной водородной связью двойной нити. Подразумевается, что, если одна из двух нитей полностью или частично включается в гибрид, то она будет в меньшей степени способной принимать участие в образовании нового гибрида. Могут существовать интрамолекулярные и интермолекулярные гибриды, образуемые молекулами зонда одного типа, если он является в достаточной степени самокомплементарным. Следует избегать таких структур в процессе тщательного конструирования зонда. Путем конструирования зонда таким образом, чтобы существенная часть представляющей интерес последовательности была однонитевой, скорость и степень гибридизации могут быть значительно повышены. Имеются компьютерные программы для поиска этого типа взаимодействия. Однако в некоторых случаях может оказаться невозможным избежать этого типа взаимодействия.
Настоящее изобретение предусматривает в своей наиболее общей форме способ выявления спектра устойчивости к антибиотикам присутствующих в образце видов Mycobacterium, объединенного, возможно, с идентификацией содержащихся видов Mycobaсterium, включающий стадии
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части генов, присутствующих в указанном образце, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), по крайней мере, с одним из зондов на основе гена rроВ, как упомянуто в таблице 2, в подходящих условиях гибридизации и промывки;
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о спектре устойчивости Mycobacterium к антибиотикам и, возможно, о содержащихся видах Mycobacterium из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части генов, присутствующих в указанном образце, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), по крайней мере, с одним из зондов на основе гена rроВ, как упомянуто в таблице 2, в подходящих условиях гибридизации и промывки;
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о спектре устойчивости Mycobacterium к антибиотикам и, возможно, о содержащихся видах Mycobacterium из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
Под соответствующей частью генов понимают области в генах rpoB, katG, inhA, 16S т-РНК, rpsL и гиразы, в которых находятся мутации, вызывающие устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину и (фторо)хинолонам, как описано выше.
В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретения стадия (iii) выполняется с использованием набора зондов, тщательно сконструированных таким образом, что они дают желаемые результаты гибридизации при использовании в одних и тех же условиях гибридизации и промывки.
Более конкретно, в настоящем изобретении предусматривается способ выявления устойчивости присутствующего в биологическом образце М.tuberculosis, к рифампицину (и/или к рифабутину), включающий стадии:
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rpoB, присутствующего в указанных полинуклеиновых кислотах, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), с выбранным набором зондов на основе rроВ немутантного типа в подходящих условиях гибридизации и промывки, причем указанный набор включает, по крайней мере, один из следующих зондов (см. таблицу 2):
S1 - (SEQ ID NO 1)
S11 - (SEQ ID NO 2)
S2 - (SEQ ID NO 3)
S3 - (SEQ ID NO 4)
S33 - (SEQ ID NO 5)
S4 - (SEQ ID NO 6)
S44 - (SEQ ID NO 7)
S444 - (SEQ ID NO 43)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S5 - (SEQ ID NO 9)
S55 - (SEQ ID NO 10)
S555 - (SEQ ID NO 39)
S5555 - (SEQ ID NO 40)
S55C - (SEQ ID NO 44)
S55M - (SEQ ID NO 45)
S6 - (SEQ ID NO 11)
S66 - (SEQ ID NO 12)
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о восприимчивости (чувствительность в соотношении с устойчивостью) присутствующего в образце М. tuberculosis к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rpoB, присутствующего в указанных полинуклеиновых кислотах, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), с выбранным набором зондов на основе rроВ немутантного типа в подходящих условиях гибридизации и промывки, причем указанный набор включает, по крайней мере, один из следующих зондов (см. таблицу 2):
S1 - (SEQ ID NO 1)
S11 - (SEQ ID NO 2)
S2 - (SEQ ID NO 3)
S3 - (SEQ ID NO 4)
S33 - (SEQ ID NO 5)
S4 - (SEQ ID NO 6)
S44 - (SEQ ID NO 7)
S444 - (SEQ ID NO 43)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S5 - (SEQ ID NO 9)
S55 - (SEQ ID NO 10)
S555 - (SEQ ID NO 39)
S5555 - (SEQ ID NO 40)
S55C - (SEQ ID NO 44)
S55M - (SEQ ID NO 45)
S6 - (SEQ ID NO 11)
S66 - (SEQ ID NO 12)
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о восприимчивости (чувствительность в соотношении с устойчивостью) присутствующего в образце М. tuberculosis к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
Термин "восприимчивость" относится к фенотипическому свойству штамма М. tuberculosis быть устойчивым либо чувствительным к лекарственному средству, как это определяется культуральными методами in vitro, более конкретно к рифампицину (и/или рифабутину). Устойчивость к рифампицину обнаруживается по отсутствию гибридизации, по крайней мере, с одним из S-зондов.
Стандартными условиями гибридизации и промывки являются, например, следующие: 3Х SSC (раствор хлорида и цитрата натрия), 20% деионизированный FA (формамид) при 50oС. Могут также применяться другие растворы (SSPE (хлорид, фосфат и этилендиаминтетраацетат натрия), ТМАС1 (хлорид тетраметиламмония) и т.д.) и температуры при условии, что сохраняется специфичность и чувствительность зондов. Если это необходимо, нужно провести легкую модификацию зондов в отношении длины или последовательности, чтобы сохранить специфичность и чувствительность, требуемые в данных обстоятельствах. При использовании зондов, согласно изобретению, изменение условий на 1,4Х SSC, 0,07% SDS (додецилсульфат натрия) при 62oС ведет к таким же результатам гибридизации, как результаты, полученные в стандартных условиях, без необходимости адаптировать последовательность или длину зондов.
Подходящие пары праймеров могут быть выбраны из списка пар праймеров, как описано ниже.
В более предпочтительном варианте реализации вышеупомянутые полинуклеиновые кислоты, полученные на стадии (i) или (ii), подвергают гибридизации с, по крайней мере, с двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, одиннадцатью, двенадцатью, тринадцатью, четырнадцатью, пятнадцатью, шестнадцатью или семнадцатью из вышеупомянутых S-зондов, предпочтительно с 5 или 6 S-зондами, которые, вместе взятые, покрывают область мутации гена rpoB.
Термин "область мутации" обозначает область в последовательности гена rpoB, где расположено большинство, если не все мутации, ответственные за устойчивость к рифампицину. Эта область мутации представлена на фиг.1.
В более предпочтительном варианте реализации изобретения полинуклеиновые кислоты, полученные на стадии (i) или (ii), подвергают гибридизации с выбранным набором зондов rроВ немутантного типа, причем указанный набор включает, по крайней мере, один, а предпочтительно все, из следующих зондов (см. таблицу 2):
S11 - (SEQ ID NO 2)
S2 - (SEQ ID NO 3)
S33 - (SEQ ID NO 5)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
В другом конкретном варианте реализации набор S-зондов, как описано выше, или, по крайней мере, один из них, может быть объединен с одним или более SIL-зондов, выявляющих молчащие мутации в гене rроВ. Предпочтительным SIL-зондом является зонд SIL-1 (SEQ ID NO 13, см. таблицу 2).
S11 - (SEQ ID NO 2)
S2 - (SEQ ID NO 3)
S33 - (SEQ ID NO 5)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
В другом конкретном варианте реализации набор S-зондов, как описано выше, или, по крайней мере, один из них, может быть объединен с одним или более SIL-зондов, выявляющих молчащие мутации в гене rроВ. Предпочтительным SIL-зондом является зонд SIL-1 (SEQ ID NO 13, см. таблицу 2).
В другом варианте реализации изобретения набор S-зондов и, возможно, SIL-зондов может объединяться с, по крайней мере, одним R-зондом, обнаруживающем специфичную мутацию, связанную с устойчивостью к рифампицину.
R-зонды выбирают из следующей группы зондов (см. таблицу 2):
R1 - (SEQ ID NO 46)
R2 - (SEQ ID NO 14)
R2B - (SEQ ID NO 47)
R2C - (SEQ ID NO 48)
R3 - (SEQ ID NO 49)
R4A - (SEQ ID NO 15)
R44A - (SEQ ID NO 16)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R4B - (SEQ ID NO 18)
R44B - (SEQ ID NO 19)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R4C - (SEQ ID NO 50)
R4D - (SEQ ID NO 51)
R4E - (SEQ ID NO 52)
R5 - (SEQ ID NO 21)
R55 - (SEQ ID NO 22)
R5B - (SEQ ID NO 53)
R5C - (SEQ ID NO 54)
Предпочтительно набор S-зондов и, возможно, SIL-зондов может объединяться с, по крайней мере, с двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более R-зондов.
R1 - (SEQ ID NO 46)
R2 - (SEQ ID NO 14)
R2B - (SEQ ID NO 47)
R2C - (SEQ ID NO 48)
R3 - (SEQ ID NO 49)
R4A - (SEQ ID NO 15)
R44A - (SEQ ID NO 16)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R4B - (SEQ ID NO 18)
R44B - (SEQ ID NO 19)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R4C - (SEQ ID NO 50)
R4D - (SEQ ID NO 51)
R4E - (SEQ ID NO 52)
R5 - (SEQ ID NO 21)
R55 - (SEQ ID NO 22)
R5B - (SEQ ID NO 53)
R5C - (SEQ ID NO 54)
Предпочтительно набор S-зондов и, возможно, SIL-зондов может объединяться с, по крайней мере, с двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более R-зондов.
Наиболее предпочтительно набор S-зондов и, возможно, SIL-зондов объединяют с, по крайней мере, одним R-зондом, из следующей ограниченной группы зондов:
R2 - (SEQ ID NO 14)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R55 - (SEQ ID NO 22)
В случае, когда S- и R-зонды объединяются, устойчивость к рифампицину обнаруживают по отсутствию гибридизации с одним из S-зондов и, возможно, по положительному сигналу гибридизации с соответствующим R-зондом.
R2 - (SEQ ID NO 14)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R55 - (SEQ ID NO 22)
В случае, когда S- и R-зонды объединяются, устойчивость к рифампицину обнаруживают по отсутствию гибридизации с одним из S-зондов и, возможно, по положительному сигналу гибридизации с соответствующим R-зондом.
Так как некоторые мутации могут встречаться более часто, чем другие, например, в определенных географических районах (см., например, таблицу 5) или в специфических обстоятельствах (например, в достаточно замкнутых сообществах), может быть целесообразным производить отбор только конкретных мутаций с использованием выбранных наборов S- и/или R-зондов. Это привело бы к более простому тесту, который удовлетворял бы требованиям в определенных обстоятельствах. Согласно Telenti et al. (1993а и b), большинство мутаций, описанных в его публикации, относительно редки (3% или менее); преобладающими мутациями являются S531L (51,6%), H526Y (12,5%), D516V (9,4%) и H526D (7,8%).
В конкретном варианте реализации изобретения используется выбранный набор из двух или трех S-зондов, при этом соответственные наборы зондов таковы:
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
или
S2 - (SEQ ID NO 3)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
Используя эти ограниченные наборы зондов, можно выявить большинство случаев устойчивости к рифампицину по отсутствию сигнала гибридизации с, по крайней мере, одним из этих зондов.
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
или
S2 - (SEQ ID NO 3)
S4444 - (SEQ ID NO 8)
S55 или S5555 - (SEQ ID NO 10 или 40)
Используя эти ограниченные наборы зондов, можно выявить большинство случаев устойчивости к рифампицину по отсутствию сигнала гибридизации с, по крайней мере, одним из этих зондов.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения используют, по крайней мере, один из R-зондов, возможно, объединенный с выбранным набором из двух или трех S-зондов, как описано выше, причем указанный R-зонд выбирают из следующего списка зондов:
R2 - (SEQ ID NO 14)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R55 - (SEQ ID NO 22)
В этом случае вывод о присутствии конкретной мутации, ответственной за устойчивый к рифампицину фенотип, может быть сделан на основе положительного сигнала гибридизации с одним из R-зондов и/или отсутствия гибридизации с соответствующим S-зондом.
R2 - (SEQ ID NO 14)
R444A - (SEQ ID NO 17)
R444B - (SEQ ID NO 20)
R55 - (SEQ ID NO 22)
В этом случае вывод о присутствии конкретной мутации, ответственной за устойчивый к рифампицину фенотип, может быть сделан на основе положительного сигнала гибридизации с одним из R-зондов и/или отсутствия гибридизации с соответствующим S-зондом.
В другом варианте реализации изобретения вышеупомянутые S-, SIL- или R-зонды могут объединяться с, по крайней мере, одним зондом, специфичным к видам М. tubercolosis, позволяющим проводить одновременную идентификацию Mycobaсterium tubercolosis и обнаружение устойчивости к рифампицину, причем указанный вид-специфичный зонд выбирается из следующей группы зондов (см. таблицу 2):
MT-POL-1 - (SEQ ID NO 23)
MT-POL-2 - (SEQ ID NO 24)
MT-POL-3 - (SEQ ID NO 25)
MT-POL-4 - (SEQ ID NO 26)
MT-POL-5 - (SEQ ID NO 27)
Более предпочтительно специфичный к видам М.tubercolosis зонд представляет собой
MT-POL-1 - (SEQ ID NO 23)
Еще в одном варианте реализации вышеупомянутые S-, SIL-, R- или MT-POL-зонды могут объединяться с, по крайней мере, одним зондом, специфичным к видам M.paratubercolosis, М.avium, М.scrophulaceum, М.Kansasii, М.intracellutare (и штаммы MAC) или M.leprae, причем указанные зонды являются, соответственно, MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), MA-POL-1 (SEQ ID NO
29), MS-POL-1 (SEQ ID NO 38), MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), MI-POL-1 (SEQ 10 NO 68), ML-POL-1 (SEQ ID NO 57) (см. таблицу 2В) или с любым вид-специфичным зондом, произведенным из последовательности соответствующей части гена rpoB M. paratubercolosis (SEQ ID NO 35), M.avium (SEQ ID NO 36), M.scrophulaceum (SEQ ID NO 37), M.kansasii (SEQ ID NO 56) или штаммов MAC (SEQ ID NO 69), как представлено, соответственно, на фиг.5, 6, 7, 8 и 11. Следует отметить, что последовательности, представленные на фиг.5-8 и 11, являются новыми. Последовательность фрагмента гена rpoB M.intracellulare и M.leprae уже описана в других работах (Guerrero et al., 1994; Honore and Cole, 1993).
MT-POL-1 - (SEQ ID NO 23)
MT-POL-2 - (SEQ ID NO 24)
MT-POL-3 - (SEQ ID NO 25)
MT-POL-4 - (SEQ ID NO 26)
MT-POL-5 - (SEQ ID NO 27)
Более предпочтительно специфичный к видам М.tubercolosis зонд представляет собой
MT-POL-1 - (SEQ ID NO 23)
Еще в одном варианте реализации вышеупомянутые S-, SIL-, R- или MT-POL-зонды могут объединяться с, по крайней мере, одним зондом, специфичным к видам M.paratubercolosis, М.avium, М.scrophulaceum, М.Kansasii, М.intracellutare (и штаммы MAC) или M.leprae, причем указанные зонды являются, соответственно, MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), MA-POL-1 (SEQ ID NO
29), MS-POL-1 (SEQ ID NO 38), MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), MI-POL-1 (SEQ 10 NO 68), ML-POL-1 (SEQ ID NO 57) (см. таблицу 2В) или с любым вид-специфичным зондом, произведенным из последовательности соответствующей части гена rpoB M. paratubercolosis (SEQ ID NO 35), M.avium (SEQ ID NO 36), M.scrophulaceum (SEQ ID NO 37), M.kansasii (SEQ ID NO 56) или штаммов MAC (SEQ ID NO 69), как представлено, соответственно, на фиг.5, 6, 7, 8 и 11. Следует отметить, что последовательности, представленные на фиг.5-8 и 11, являются новыми. Последовательность фрагмента гена rpoB M.intracellulare и M.leprae уже описана в других работах (Guerrero et al., 1994; Honore and Cole, 1993).
Термин "штаммы MAC" обозначает штаммы "комплекса M.avium, известные квалифицированным специалистам в области таксономии микобактерий. Эта довольно разнородная группа штаммов MAC может, однако, содержать штаммы, которые генотипически весьма похожи на M.intracellulare. Это также имеет место в случае изолята ITG 926, последовательность гена rpoB которого показана на фиг. 11. Последовательность MI-POL-1, полученная из SEQ ID NO 69, и опубликованная последовательность rpoB M.intracellulare являются, таким образом, специфичными совместно для M.intracellulare и некоторых штаммов MAC.
Следует подчеркнуть, что все вышеупомянутые зонды, включая вид-специфичные зонды, содержатся в последовательности rpoB и, более определенно, в последовательности амплифицированного фрагмента rроВ. Более того, как иллюстрируется далее в примерах, зонды, описанные выше как "предпочтительные", сконструированы таким образом, что все они могут использоваться одновременно, в одних и тех же условиях гибридизации и промывки. Эти два критерия подразумевают, что достаточно единственной стадии амплификации и гибридизации для одновременного обнаружения устойчивости к рифампицину и идентификации имеющихся микобактериальных видов.
В предпочтительном варианте реализации и в качестве примера раскрывается метод обнаружения М. tubercolosis и его устойчивости к рифампицину, включающий стадии
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rроВ, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), со следующим набором зондов в подходящих условиях гибридизации и промывки:
MT-POL-1
S11
S2
S33
S4444
S55 или S5555
R2
R444A
R444B
R55
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о присутствии в образце М.tuberculosis и его восприимчивости к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rроВ, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii), со следующим набором зондов в подходящих условиях гибридизации и промывки:
MT-POL-1
S11
S2
S33
S4444
S55 или S5555
R2
R444A
R444B
R55
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о присутствии в образце М.tuberculosis и его восприимчивости к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
Для того, чтобы выявить микобактериальные организмы и/или их рисунки устойчивости при помощи выбранного набора олигонуклеотидных зондов, может использоваться любой известный в технологии метод гибридизации (стандартный дот-блоттинг, саузернблоттинг, метод сэндвича и т.д.).
Однако для того чтобы получить результаты быстрым и удобным способом в том случае, если используется множество зондов, наиболее удобной может быть схема обратной гибридизации.
В предпочтительном варианте реализации выбранный набор зондов иммобилизуют на твердофазной подложке. В другом предпочтительном варианте реализации выбранный набор зондов иммобилизуют на мембранной полоске в линейной форме. Указанные зонды могут быть иммобилизованы индивидуально или в виде смесей в определенных местоположениях на твердофазной подложке.
Конкретным и весьма удобным для пользователя вариантом реализации вышеуказанного предпочтительного способа является метод LiPA, в котором вышеупомянутый набор зондов иммобилизуют в виде параллельных линий на мембране, как описано далее в примерах.
Вышеупомянутые R-зонды обнаруживают мутации, которые уже были описаны в имеющихся источниках, относящихся к соответствующей области технологии (Telenti et al., 1993a и 1993b). Однако как показывается далее в примерах, в настоящем изобретении раскрыты четыре новых мутации, связанные с устойчивостью М.tuberculosis к рифампицину, еще не описанные другими авторами. Новые мутации, как и мутации, уже описанные в имеющихся источниках, относящихся к соответствующей области технологии, можно определить, используя S-зонды, согласно настоящему изобретению. Замечательная идея использования набора S-зондов, охватывающих полностью всю область мутаций в гене rроВ, позволяет обнаруживать большинство, если не все мутации, в гене rроВ, ответственные за устойчивость к рифампицину, даже те мутации, которые до сих пор еще не были описаны.
Четыре новых мутации rроВ (D516G, Н526С, Н526Т и R529Q) помечены в таблице 1 звездочками. В качестве примера на фиг.2 представлена последовательность rроВ-мутантной аллели Н526С (SEQ 10 NO 34).
Изобретение предусматривает также любые зонды или наборы праймеров, сконструированные для того, чтобы специфически обнаруживать или амплифицировать в особенности эти мутации гена rроВ, и любой метод или комплекты оборудования, включающие указанные наборы праймеров или зонды.
В другом варианте реализации изобретение предусматривает также способ обнаружения устойчивости к рифампицину (и/или рифабутину) М.leprae, присутствующего в биологическом образце, включающий стадии
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rроВ, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii) с выбранным набором зондов rроВ немутантного типа в подходящих условиях гибридизации и промывки, причем указанный набор включает, по крайней мере, один из следующих зондов (см. таблицу 2):
ML-S1 (SEQ ID NO 58)
ML-S2 (SEQ ID NO 59)
ML-S3 (SEQ ID NO 60)
ML-S4 (SEQ ID NO 61)
ML-S5 (SEQ ID NO 62)
MT-S6 (SEQ ID NO 63)
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о восприимчивости (чувствительность в соотношении с устойчивостью) присутствующего в образце М.leprae к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
(i) если необходимо, высвобождение, выделение или концентрирование полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) если необходимо, амплифицирование соответствующей части гена rроВ, по крайней мере, с одной парой подходящих праймеров;
(iii) гибридизация полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii) с выбранным набором зондов rроВ немутантного типа в подходящих условиях гибридизации и промывки, причем указанный набор включает, по крайней мере, один из следующих зондов (см. таблицу 2):
ML-S1 (SEQ ID NO 58)
ML-S2 (SEQ ID NO 59)
ML-S3 (SEQ ID NO 60)
ML-S4 (SEQ ID NO 61)
ML-S5 (SEQ ID NO 62)
MT-S6 (SEQ ID NO 63)
(iv) обнаружение гибридов, образовавшихся на стадии (iii);
(v) составление заключения о восприимчивости (чувствительность в соотношении с устойчивостью) присутствующего в образце М.leprae к рифампицину из дифференциального сигнала (сигналов) гибридизации, полученного на стадии (iv).
Устойчивость к рифампицину определяют по отсутствию гибридизации с, по крайней мере, одним из ML-S-зондов.
В другом варианте реализации изобретения вышеупомянутые ML-S-зонды могут объединяться со специфичным к виду М.leprae зондом ML-POL-1, давая возможность одновременной идентификации М.leprae и выявления устойчивости к рифампицину, причем указанный вид-специфичный зонд представлен последовательностью SEQ ID NO 57.
Следует отметить, что вышеупомянутые зонды ML-S и зонд ML-POL-1 все содержатся в одном и том же амплифицированном фрагменте гена rpoB M.leprae и сконструированы таким образом, что все они могут использоваться в одних и тех же условиях гибридизации и промывки.
Кроме того, изобретением предусматривается любой из зондов, описанных выше, а также композиции, содержащие, по крайней мере, один из этих зондов.
Изобретение предусматривает также набор праймеров, дающих возможность амплификации области мутаций гена rpoB M. tuberculosis. Наборы праймеров могут выбираться из следующей группы наборов (см. таблицу 2):
Р1 и Р5 (SEQ ID NO 30 и 33)
Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 и 32)
Р7 и Р8 (SEQ ID NO 41 и 42)
Р2 и Р6, в сочетании с (Р1 и Р5), или (Р3 и Р4), или (Р7 и Р8).
Р1 и Р5 (SEQ ID NO 30 и 33)
Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 и 32)
Р7 и Р8 (SEQ ID NO 41 и 42)
Р2 и Р6, в сочетании с (Р1 и Р5), или (Р3 и Р4), или (Р7 и Р8).
Наиболее предпочтительным набором праймеров является следующий:
Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 или 32)
Изобретение предусматривает также набор праймеров, дающих возможность амплификации области мутаций гена rроВ в микобактериях в целом, т.е., по крайней мере, в М.tuberculosis, M.avium, M.paratuberculosis, М.intracellulare, M. leprae, M. scrofulaceum. Эти общие праймеры могут использоваться, например, в образцах, в которых предполагается присутствие иных, чем М.tuberculosis, микобактерий и где желательно иметь более общий метод обнаружения. Набор праймеров состоит из 5'-праймера, выбираемого из следующего набора:
MGRPO-1 (SEQ ID NO 64)
MGRPO-2 (SEQ ID NO 65)
и 3'-праймера, выбираемого из следующего набора:
MGRPO-3 (SEQ ID NO 66)
MGRPO-4 (SEQ ID NO 67)
Последовательность этих праймеров показана в таблице 2В.
Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 или 32)
Изобретение предусматривает также набор праймеров, дающих возможность амплификации области мутаций гена rроВ в микобактериях в целом, т.е., по крайней мере, в М.tuberculosis, M.avium, M.paratuberculosis, М.intracellulare, M. leprae, M. scrofulaceum. Эти общие праймеры могут использоваться, например, в образцах, в которых предполагается присутствие иных, чем М.tuberculosis, микобактерий и где желательно иметь более общий метод обнаружения. Набор праймеров состоит из 5'-праймера, выбираемого из следующего набора:
MGRPO-1 (SEQ ID NO 64)
MGRPO-2 (SEQ ID NO 65)
и 3'-праймера, выбираемого из следующего набора:
MGRPO-3 (SEQ ID NO 66)
MGRPO-4 (SEQ ID NO 67)
Последовательность этих праймеров показана в таблице 2В.
Праймеры могут быть помечены меткой выбора (например, биотином). Могут использоваться различные системы амплификации мишеней на основе праймеров, и предпочтительно PCR-амплификация, как представлено в примерах. Может использоваться PCR (цепная полимеразная реакция) в один круг или гнездная PCR.
Изобретением предусматривается также комплект, предназначенный для того, чтобы сделать заключение о спектре устойчивости к антибиотикам присутствующих в биологическом образце микобактерий, возможно в сочетании с одновременной идентификацией соответствующих видов микобактерий, включающий следующие компоненты:
(i) средства, если они нужны, для высвобождения, выделения или концентрирования полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) по крайней мере, один из вышеупомянутых наборов праймеров, если он нужен;
(iii) по крайней мере, один из зондов, определенных выше, возможно зафиксированных на твердофазной подложке;
(iv) буфер гибридизации или компоненты, необходимые для получения указанного буфера;
(v) промывочный раствор или компоненты, необходимые для получения указанного раствора;
(vi) средства, если они нужны для обнаружения гибридов, образующихся в результате предшествовавшей гибридизации.
(i) средства, если они нужны, для высвобождения, выделения или концентрирования полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце;
(ii) по крайней мере, один из вышеупомянутых наборов праймеров, если он нужен;
(iii) по крайней мере, один из зондов, определенных выше, возможно зафиксированных на твердофазной подложке;
(iv) буфер гибридизации или компоненты, необходимые для получения указанного буфера;
(v) промывочный раствор или компоненты, необходимые для получения указанного раствора;
(vi) средства, если они нужны для обнаружения гибридов, образующихся в результате предшествовавшей гибридизации.
Термин "буфер гибридизации" обозначает буфер, дающий возможность происходить реакции гибридизации между зондами и полинуклеиновыми кислотами, присутствующими в образце, или амплифицированными продуктами в условиях подходящей степени жесткости.
Термин "промывочный раствор" обозначает раствор, дающий возможность промывать гибриды, образующиеся в условиях подходящей степени жесткости.
Более конкретно, изобретение предусматривает описанный выше комплект для одновременного обнаружения М. tuberculosis и его устойчивости к рифампицину.
В другом конкретном случае изобретение предусматривает описанный выше комплект для одновременного обнаружения М.leprae и его устойчивости к рифампицину.
ПОДПИСИ И ОБОЗНАЧЕНИЯ К ТАБЛИЦАМ
В таблице 1 суммированы изменения нуклеотидов и аминокислот (описанные Telenti et al. (1993а и b), Kapur et al., 1994 и в настоящем изобретении) во фрагменте гена rроВ устойчивых к рифампицину изолятов М. tuberculosis. Нумерация кодонов является такой же, как на фиг.1. Новые мутации, описанные в настоящем изобретении, помечены звездочкой (*).
В таблице 1 суммированы изменения нуклеотидов и аминокислот (описанные Telenti et al. (1993а и b), Kapur et al., 1994 и в настоящем изобретении) во фрагменте гена rроВ устойчивых к рифампицину изолятов М. tuberculosis. Нумерация кодонов является такой же, как на фиг.1. Новые мутации, описанные в настоящем изобретении, помечены звездочкой (*).
Список обозначений аминокислот:
Arg - аргинин,
Asp - аспарагиновая кислота,
Asn - аспарагин,
Суs - цистеин,
Gln - глутамин,
Glu - глутаминовая кислота,
His - гистидин,
Ley - лейцин,
Lys - лизин,
Met - метионин,
Phe - фенилаланин,
Pro - пролин,
Ser - серии,
Thr - треонин,
Trp - триптофан,
Туr - тирозин,
Val - валин.
Arg - аргинин,
Asp - аспарагиновая кислота,
Asn - аспарагин,
Суs - цистеин,
Gln - глутамин,
Glu - глутаминовая кислота,
His - гистидин,
Ley - лейцин,
Lys - лизин,
Met - метионин,
Phe - фенилаланин,
Pro - пролин,
Ser - серии,
Thr - треонин,
Trp - триптофан,
Туr - тирозин,
Val - валин.
В таблице 2 перечисляются последовательности праймеров и зондов, выбираемых из гена rроВ.
2А: М. tuberculosis
2В: другие виды микобактерий
В таблице 3 показаны результаты гибридизации с зондом MT-POL-1, полученные с ДНК из различных микобактериальных и немикобактериальных видов.
2В: другие виды микобактерий
В таблице 3 показаны результаты гибридизации с зондом MT-POL-1, полученные с ДНК из различных микобактериальных и немикобактериальных видов.
В таблице 4 показаны некоторые репрезентативные результаты, полученные методом LiPA для некоторых изолятов М.tuberculosis, которые были секвенированы, и интерпретация различных рисунков LiPA.
В таблице 5 показана встречаемость различных мутаций rроВ в М.tuberculosis в различных географических районах.
Сокращения:
Бел. - Бельгия,
Бнгл. - Бангладеш,
Бен. - Бенин,
Бур-Фа - Буркина Фасо,
Бур. - Бурунди,
Кан. - Канада,
Кол. - Колумбия,
Ег. - Египет,
Гв. - Гвинея,
Гон. - Гондурас,
Пак. - Пакистан,
Руа. - Руанда,
Тун. - Тунис.
Бел. - Бельгия,
Бнгл. - Бангладеш,
Бен. - Бенин,
Бур-Фа - Буркина Фасо,
Бур. - Бурунди,
Кан. - Канада,
Кол. - Колумбия,
Ег. - Египет,
Гв. - Гвинея,
Гон. - Гондурас,
Пак. - Пакистан,
Руа. - Руанда,
Тун. - Тунис.
В таблице 6 дано сравнение результатов LiPA с определением устойчивости к рифампицину в культуре М.tuberculosis.
Чувств. = чувствительный,
Уст. = устойчивый.
Уст. = устойчивый.
ПОДПИСИ И ОБОЗНАЧЕНИЯ К РИСУНКАМ
На фиг. 1 представлена последовательность нуклеотидов и последовательность аминокислот области мутаций, соответственно, гена rроВ и β-субъединицы РНК-полимеразы штамма Mycobacterium tuberculosis (ITG 9081) немутантного типа (т. е. , неустойчивого). Нумерация кодонов (аминокислот) соответствует таковой у Telenti et al. (1993a). Нуклеотиды или аминокислоты, входящие в число изменений, которые вызывают устойчивость, подчеркнуты. Наблюдаемые мутации заключены в рамку. Горизонтальные полосы указывают положения некоторых из олигонуклеотидных зондов (указано по одному зонду из каждой группы).
На фиг. 1 представлена последовательность нуклеотидов и последовательность аминокислот области мутаций, соответственно, гена rроВ и β-субъединицы РНК-полимеразы штамма Mycobacterium tuberculosis (ITG 9081) немутантного типа (т. е. , неустойчивого). Нумерация кодонов (аминокислот) соответствует таковой у Telenti et al. (1993a). Нуклеотиды или аминокислоты, входящие в число изменений, которые вызывают устойчивость, подчеркнуты. Наблюдаемые мутации заключены в рамку. Горизонтальные полосы указывают положения некоторых из олигонуклеотидных зондов (указано по одному зонду из каждой группы).
На фиг. 2 показана частичная нуклеотидная последовательность вновь описанного мутантного аллеля rроВ штамма М.tuberculosis ITG 9003 (SEQ ID NO 34).
На фиг.3 показаны результаты, полученные на полосках LiPA с зондами S44 и S4444, нанесенными в различных концентрациях на мембранную полоску. В качестве материала-мишени использовали штаммы М.tuberculosis ITG 8872 и ITG 9081.
На фиг.4 дано сравнение характеристики зондов S44 и S4444 в форме линейного зондового анализа. Зонды на полосках А и В являются идентичными, за исключением зондов S44 и S4444. Гибридизацию выполняли с использованием амплифицированного материала, происходящего из штамма М.tuberculosis ITG 8872.
На фиг. 5 показана частичная нуклеотидная последовательность предполагаемого гена rроВ штамма M.paratuberculosis 316F (SEQ ID NO 35).
На фиг. 6 показана частичная нуклеотидная последовательность предполагаемого гена rроВ штамма М.avium ITG 5887 (SEQ ID NO 36).
На фиг. 7 показана частичная нуклеотидная последовательность предполагаемого гена rроВ штамма M.scrofulaceum ITG 4979 (SEQ ID NO 37).
На фиг. 8 показана частичная нуклеотидная последовательность предполагаемого гена rроВ штамма M.kansasii ITG 4987 (SEQ ID NO 56).
На фиг. 9 показаны некоторые мутации rроВ в M.tuberculosis и соответствующие им фиг. LiPA. Система обозначений мутаций соответствует таковой в таблице 1.
Система обозначений рисунков LiPA следующая:
wt = положительная гибридизация со всеми S-зондами и отрицательная гибридизация со всеми R-зондами;
ΔS1-5 = отсутствие гибридизации с соответственным S-зондом;
R2, 4А, 4, 5В = положительная гибридизация с соответственными R-зондами и отсутствие гибридизации с соответствующим S-зондом;
С = положительная контрольная линия: должна быть положительной при правильном проведении теста;
Mtb = зонд MT-POL.
wt = положительная гибридизация со всеми S-зондами и отрицательная гибридизация со всеми R-зондами;
ΔS1-5 = отсутствие гибридизации с соответственным S-зондом;
R2, 4А, 4, 5В = положительная гибридизация с соответственными R-зондами и отсутствие гибридизации с соответствующим S-зондом;
С = положительная контрольная линия: должна быть положительной при правильном проведении теста;
Mtb = зонд MT-POL.
Из каждой группы упомянут только один зонд, однако он представляет всю группу: например, S5 представляет S5, S55, S555, S5555, S55C, S55M.
На фиг.10 показана частота различных мутаций, встречающихся в устойчивых к рифампицину штаммах, анализировавшихся методом LiPA. Система обозначений соответствует таковой на фиг.9.
"Mix" обозначает, что в образце присутствовала смесь штаммов.
"Double" обозначает присутствие двух мутаций в одном штамме.
На фиг. 11 показана частичная нуклеотидная последовательность предполагаемого гена rроВ штамма штамма MAC ITG 926 (SEQ ID NO 69).
Пример 1: Амплификация фрагмента гена rpoB M.tuberculosis
После экстракции нуклеиновой кислоты из микобактериальных изолятов (либо культивированных, либо присутствующих в ткани или жидкой среде тела) использовали 2 мкл продукта, чтобы амплифицировать соответствующую часть гена rpoB путем использования одного или более сочетаний 5'-праймеров (PI (SEQ ID NO 30), Р2, Р3 (SEQ ID NO 31) и Р7 (SEQ ID NO 41)) и 3'-праймеров (Р4 (SEQ ID NO 32), P5 (SEQ ID NO 33), P6 и P8 (SEO ID NO 42)).
После экстракции нуклеиновой кислоты из микобактериальных изолятов (либо культивированных, либо присутствующих в ткани или жидкой среде тела) использовали 2 мкл продукта, чтобы амплифицировать соответствующую часть гена rpoB путем использования одного или более сочетаний 5'-праймеров (PI (SEQ ID NO 30), Р2, Р3 (SEQ ID NO 31) и Р7 (SEQ ID NO 41)) и 3'-праймеров (Р4 (SEQ ID NO 32), P5 (SEQ ID NO 33), P6 и P8 (SEO ID NO 42)).
Последовательность этих праймеров дана в таблице 2.
P1, Р3, Р4, P5, Р7 и P8 являются новыми последовательностями праймеров, описанными в настоящем изобретении. Р2 и P6 были описаны ранее (Telenti et al., 1993а).
Эти праймеры могут быть помечены меткой выбора (например, биотином). Могут использоваться различные системы амплификации мишеней на основе праймеров. Условия, использовавшиеся для амплификации с применением PCR, описаны ниже. Амплификация в один круг с праймерами Р1 и P5 включала 35 циклов 45 с/94oС, 45 с/58oС, 45 с/72oС. Если предпочтительной являлась гнездная PCR, то во втором круге использовали праймеры Р3 и Р4 и выполняли 25 циклов (45 с/94oС, 60 с/68oС), исходя из 1 мкл продукта первого круга.
Если Р3 и Р4 использовались в амплификации PCR в один круг, то использовался следующий порядок проведения циклов: 30 циклов по 1 мин/95oС, 1 мин/55oС, 1 мин/72oС. Такой же порядок проведения циклов использовали для наборов праймеров Р2/Р6.
PCR обычно выполняли в общем объеме 50 мкл, содержащем 50 мМ КСl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 2,2 мМ MgCl2, no 200 мкл дезоксинуклеозидтрифосфата, 0,01% желатина и 1 U Taq полимеразы.
Концентрации праймеров изменялись между 10 и 25 пмоль/реакция.
Так как набор праймеров Р3/Р4 давал гораздо более сильные сигналы после гибридизации, чем набор праймеров Р2/Р6, первый набор праймеров использовали для всех дальнейших экспериментов по гибридизации. Набор праймеров Р2/Р6 использовали для секвенирования. Гнездную PCR с использованием Р2 и Р6 в качестве внешних праймеров и Р3 и Р4 в качестве внутренних (биотинилированных) праймеров использовали только для прямого обнаружения в клинических образцах (мокротах и биопсиях).
Длина амплифицированных продуктов, контролировавшаяся при помощи гель-электрофореза с агарозой, имела следующие значения:
набор праймеров Р1/Р5: 379 пар оснований;
набор праймеров Р3/Р4: 257 пар оснований;
набор праймеров Р2/Р6: 411 пар оснований;
набор праймеров Р7/Р8: 339 пар оснований.
набор праймеров Р1/Р5: 379 пар оснований;
набор праймеров Р3/Р4: 257 пар оснований;
набор праймеров Р2/Р6: 411 пар оснований;
набор праймеров Р7/Р8: 339 пар оснований.
Пример 2: Секвенирование фрагментов гена rpoB M.tuberculosis
ДНК, экстрагированные из микобактериальных изолятов, о которых известно, что они являются устойчивыми или чувствительными к рифампицину, амплифицировали с использованием праймеров Р2/Р6 (из которых Р6 был биотинилирован на конце 5'). Прямое секвенирование однонитевого продукта PCR выполняли с использованием покрытых стрептавидином бусинок и комплекта Taq Dye Deoxy Terminator/Cycle Sequencing на ДНК-секвенаторе ABI373A (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Праймеры, использовавшиеся для секвенирования, были теми же, что использовались для амплификации (Р2 или Р6).
ДНК, экстрагированные из микобактериальных изолятов, о которых известно, что они являются устойчивыми или чувствительными к рифампицину, амплифицировали с использованием праймеров Р2/Р6 (из которых Р6 был биотинилирован на конце 5'). Прямое секвенирование однонитевого продукта PCR выполняли с использованием покрытых стрептавидином бусинок и комплекта Taq Dye Deoxy Terminator/Cycle Sequencing на ДНК-секвенаторе ABI373A (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Праймеры, использовавшиеся для секвенирования, были теми же, что использовались для амплификации (Р2 или Р6).
Как и ожидалось, все чувствительные (= чувствительные в культуре и чувствительные по рисунку LiPA) секвенировавшиеся штаммы (7) давали последовательность дикого типа (без мутаций). В большинстве устойчивых штаммов мутации могут быть идентифицированы. Большинство мутаций было описано ранее (Telenti et а1., 1993а и 1993b, Kapur et al., 1994). Однако 4 новые мутации описаны в настоящем изобретении: D516G, Н526С, Н526Т и R529Q (см. также таблицу 1 (*)). Полная последовательность амплифицированного фрагмента rpoB мутантного аллеля Н526С (изолят ITG 9003) показана на фиг.2 (SEQ ID NO 34) в качестве образца.
Несколько штаммов (3/180, см. таблицу 6) были устойчивы к рифампицину в культуре, однако давали картину LiPA немутантного типа. После секвенирования у всех этих изолятов проявлялась последовательность гена немутантного типа, подтверждая результаты гибридизации. Таким образом, возможно, что для этих изолятов применим иной молекулярный механизм устойчивости к рифампицину.
Пример 3: Разработка полоски для линейного зондового анализа (LiPA-полоски)
Принцип и порядок выполнения линейного зондового анализа были такими, как описано ранее (Stuyver et al., 1993), за несколькими исключениями. Вместо внедрения биотинилированного дУТФ использовали биотинилированные праймеры и проводили гибридизацию и обязательную промывку при 50oС в 3•SSC/20% деионизированного формамида.
Принцип и порядок выполнения линейного зондового анализа были такими, как описано ранее (Stuyver et al., 1993), за несколькими исключениями. Вместо внедрения биотинилированного дУТФ использовали биотинилированные праймеры и проводили гибридизацию и обязательную промывку при 50oС в 3•SSC/20% деионизированного формамида.
Мутации в гене rроВ, приводящие к устойчивости к рифампицину, локализованы главным образом в малой области гена, охватывающей 67 нуклеотидов (23 аминокислотных кодона). По крайней мере, 17 нуклеотидов, равномерно распределенных в этой области, связаны с мутациями, ведущими, по крайней мере, к 28 различным изменениям аминокислот. Такая сложность в изменениях нуклеотидов ставит задачи обнаружения всех этих изменений за одну стадию гибридизации. В принципе, на каждый мутировавший сайт был бы необходим один зонд немутантного типа, а на каждое изменение нуклеотида - один мутантный зонд, специфично обнаруживающий эту конкретную мутацию. Следовательно, тест на гибридизацию включал бы, по крайней мере, около 35 специфичных к последовательности олигонуклеотидных зондов, которые сделали бы этот тест сложным в изготовлении и использовании, и, следовательно, менее притягательным коммерчески.
Поэтому был разработан особый метод, в котором используются тщательно отобранные (S-) зонды немутантного типа, охватывающие, каждый из них, более чем один полиморфный сайт и полностью перекрывающие всю исследуемую область (см. фиг.1). При таком подходе набор из, по крайней мере, 10 зондов немутантного типа может быть сведен к общему числу зондов пять или шесть. Эти зонды экспериментально тщательно настроены таким образом, чтобы наличие каждой вызывающей устойчивость мутации в rроВ мутантном районе приводило к четко обнаруживаемому снижению стабильности гибрида между мишенью и, по крайней мере, одним из этих зондов в одних и тех же условиях гибридизации и промывки.
Так как при помощи этого сочетания зондов могут быть обнаружены все описанные до сих пор соответствующие мутации, можно контролировать устойчивость изолятов Mycobaсkerium tuberculosis к рифампицину. Этот набор зондов способен также обнаружить присутствие неописанных мутаций, например, мутацию TGC в положении 526 в штамме ITG 9003.
Хотя при строгом подходе добавление мутантных (R-) зондов к выбранной панели зондов немутантного типа является малоупотребительным, для научных целей может быть информативным выявление того, какая именно точечная мутация имеет место. Поэтому были сконструированы 4 мутантных зонда (R2, R4A, R4B, R5), которые соответствуют наиболее часто встречающимся мутациям и и которые, взятые совместно, способны положительно определять более чем 70% всех случаев устойчивости (см. фиг.10). К этому набору из 4 зондов могут быть добавлены дополнительные мутантные зонды (например, R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C), для того, чтобы положительно идентифицировать наиболее важные в клинической практике случаи устойчивости. Добавление этих зондов приводит также к повышению надежности испытания, так как появление мутантного зонда должно неизбежно приводить к исчезновению зонда немутантного типа, если только речь не идет о смешанных инфекциях. В некоторых случаях в клинической практике может быть важным отличать разные мутации, которые, возможно, присутствуют. Этот случай может, например, иметь место в аминокислотном положении 516. Если присутствующая в этом положении нормальная (немутантного типа) аминокислота (аспарагиновая кислота) заменяется валином или тирозином, это вызывает высокий уровень устойчивости или промежуточный уровень устойчивости к рифампицину; однако неопубликованные данные, по-видимому, указывают на то, что чувствительность к рифабутину сохраняется на том же уровне. Следовательно, при инфекции, вызываемой штаммами с этой мутацией, рифабутин может все еще быть эффективным, тогда как рифампицин - уже нет. То же может быть справедливым для колена 511, но, согласно нашим сведениям, эти положения являются единственными сайтами мутаций, для которых влияние рифампицина и рифабутина может быть различным; обычно штаммы, устойчивые к рифампицину, являются также устойчивыми к рифабутину.
Для того чтобы разработать LiPA-полоску для обнаружения мутаций, порождающих устойчивость к рифампицину (и/или рифабутину) у М.tuberculosis, олигонуклеотидные зонды общим числом 36 были синтезированы и испытаны в тесте на обратную гибридизацию. Последовательность этих зондов перечислена в таблице 2А (мутантные зонды и зонды немутантного типа). Первый набор тестировавшихся зондов был следующий: S1, S2, S3, S4, S5, R2, R4A, R4B и R5. В условиях, используемых для обратной гибридизации, большинство зондов не действовали так, как ожидалось теоретически, и оказалось необходимым ввести модификации, ведущие к синтезу и оценке следующих дополнительных зондов: S11, S33, S44, S4444, S5555, R44A, R444A, R44B, R444B, R55. Из общей панели зондов для дальнейшего использования выбирали зонды, у которых в одних и тех же экспериментальных условиях проявлялись самые оптимальные свойства в том, что касается специфичности и чувствительности.
Предпочтительными зондами с последовательностями немутантного типа (S-зонды), которые совместно перекрывают полную область rроВ, представляющую интерес, являются следующие: S11, S2, S33, S4444 и S55 или S5555 (см. таблицу 2).
Предпочтительными мутантными зондами (R-зонды) являются R2, R444A, R444B и R55 (см. таблицу 2). В некоторых случаях устойчивости отсутствие сигнала гибридизации с S-зондами может сопровождаться положительным сигналом гибридизации с соответствующим R-зондом.
В качестве примера на фиг.9 показаны некоторые из мутаций rроВ и соответствующий им рисунок LiPA.
Хотя зонды из одной и той же группы (например, зонды S4, S44, S444 и S4444) лишь слегка отличаются друг от друга, их гибридизационные характеристики могут значительно различаться. В качестве примера это иллюстрируется в эксперименте, в котором рабочие характеристики зондов S44 и S4444 сравниваются с использованием продуктов PCR, происходящих из двух штаммов М.tuberculosis (ITG 8872 и ITG 9081), демонстрирующих оба штамма, последовательность немутантного типа в области мишени зондов S44 и S4444. Различие между обоими зондами
Зонд S44 выбирали на теоретической основе, исходя из известной последовательности гена (Telenti et al., 1993а). Этот зонд теоретически мог бы быть наилучшим зондом для дискриминации несоответствий в кодоне САС (подчеркнут), так как этот кодон находится в центральной части зонда. Однако в противоположность общим правилам, рабочие характеристики зонда S4444 оказались значительно лучше (как описано в следующем эксперименте).
Зонд S44 выбирали на теоретической основе, исходя из известной последовательности гена (Telenti et al., 1993а). Этот зонд теоретически мог бы быть наилучшим зондом для дискриминации несоответствий в кодоне САС (подчеркнут), так как этот кодон находится в центральной части зонда. Однако в противоположность общим правилам, рабочие характеристики зонда S4444 оказались значительно лучше (как описано в следующем эксперименте).
Оба зонда наносили на нитроцеллюлозные полоски в различных количествах (2,4, 1,2 и 0,6 пмоль/полоска). После фиксации и блокирования полосок зонды подвергали гибридизации биотинилированными фрагментами PCR (из штаммов ITG 8872 и ITG 9081), как описано ранее. Результаты на фиг.3.
В использовавшихся условиях гибридизации (3•SSC, 20% деионизированный формамид, 50oС) сигналы, полученные с зондам S44, очень слабы. С другой стороны, зонд S4444 производит очень сильные и надежные сигналы. Следовательно, зонд S4444 более предпочтителен, чем S44, для использования в LiPA-полоске. Этот яркий эффект не может быть приписан только различию в длине обоих зондов, но, по-видимому, местоположение также имеет значение. Скорее всего, вторичная структура области мишени зондов сильно влияет на гибридизационные свойства.
На фиг. 4 показаны результаты другого эксперимента, в котором рабочие характеристики обоих зондов сравнивают в окружении других зондов. Обе полоски А и В идентично обрабатывали с использованием амплифицированного продукта, происходящего из штамма ITG 8872. Обе полоски являлись почти идентичными, за исключением того, что полоска А содержала зонд S44 (0,6 пмоль), а полоска В - зонд S4444 (0,1 пмоль), различен порядок зондов, нанесенных на полоску. На полоске А зонд S44 дает негативный результат, в то время как на полоске В зонд S4444 дает явно положительный результат, хотя в обоих случаях имеется полное соответствие между мишенью и зондом, и в обоих случаях следовало бы ожидать положительного результата.
Эти результаты ясно показывают, что устройство зонда, особенно в фиксированных условиях схемы обратной гибридизации (одни и те же условия для каждого зонда) не является непосредственно очевидным, и зонды следует тщательно оценивать перед тем, как их можно будет использовать в схеме обратной гибридизации.
В целом, мы можем констатировать, что подходящие зонды не всегда могут быть просто произведены на теоретической основе из известной последовательности гена.
Присутствие молчащих мутаций, хотя и не обнаруженное среди изолятов, тестировавшихся в настоящем изобретении, может привести к рисунку устойчивости на полоске (пропуск одного зонда немутантного типа), хотя штамм является чувствительным. До настоящего времени было описано только одно молчащее замещение (в кодоне 528: CGC-->CGT; Telenti et al., 1993a). Эта мутация привела бы к дестабилизации гибрида с зондом S4444. Однако путем добавления к полоске зонда, специфичного к молчащей мутации (зонд SIL-1, таблица 2), эта молчащая мутация может быть выделена из мутаций, вызывающих устойчивость, и возможность неверной интерпретации наблюдаемых рисунков будет предотвращена. Более того, SIL-зонды могут наноситься на полоску в то же местоположение, что и соответствующие S-зонды (смешанные зонды). При таком подходе не будет наблюдаться отсутствие сигналов гибридизации в результате молчащей мутации.
Для того чтобы обнаружить мутации со вставкой, сообщающие устойчивость к рифампицину, 514insF и 514insFM (см. фиг.1) были сконструированы два новых типа зондов, S6 и S66, последовательность которых представлена в таблице 2. Гибридизация с нуклеиновыми кислотами, происходящими из штаммов, содержащих эти мутации со вставкой, приводит к отсутствию сигнала гибридизации с S6 и S66 (см. также таблицу 1).
Для того, чтобы положительно идентифицировать больше мутаций, чем можно обнаружить при помощи набора зондов R2, R4A, R4B и R5, был сконструирован ряд дополнительных R-зондов, которые могут быть добавлены на LiPA-полоску, при использовании одних и тех же условий гибридизации и промывки. Совместно с описанными выше R-зондами дополнительные R-зонды (R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C) дают возможность положительной идентификации мутаций, наиболее часто встречающихся в коллекции штаммов, испытывавшихся в настоящей заявке.
Пример 4: Зонд, специфичный к комплексу М.tuberculosis
Для того чтобы получить возможность одновременного обнаружения мутаций, вызывающих устойчивость к рифампицину, прямо объединенного с обнаружением патогенного in casu M.tuberculosis, было разработано испытание с линейным зондом.
Для того чтобы получить возможность одновременного обнаружения мутаций, вызывающих устойчивость к рифампицину, прямо объединенного с обнаружением патогенного in casu M.tuberculosis, было разработано испытание с линейным зондом.
Так как является крайне выгодным иметь возможность одновременного обнаружения присутствия М.tuberculosis и присутствия либо отсутствия гена или мутации, вызывающих устойчивость к лекарственным препаратам, цель состояла в том, чтобы разработать зонд к М.tuberculosis, содержащийся в том же фрагменте PCR, что и, по крайней мере, один из имеющих отношение к устойчивости маркеров, которые будут идентифицироваться. Поэтому были подвергнуты секвенированию гены rроВ изолятов, не являющихся М.tuberculosis. Эти организмы представляли собой М. paratubercolosis 316F, М.avium ITG 5887, M.scrofulaceum ITC 4979 и М.kansasii ITG 4987. Последовательности соответствующих фрагментов гена rроВ показаны на фиг. с 5 по 8, соответственно. Кроме того, последовательности фрагментов гена rроВ М.leprae и М.intracellulare известны из литературы (Honore and Cole, 1993; Guerrero et al., 1994). Сравнение этих последовательностей с последовательностью гена rроВ М.tuberculosis позволяет провести очерчивание конкретной области (вне области, ответственной за устойчивость) во фрагменте гена rроВ, для которой представляется осуществимым получение из нее зондов, которые потенциально специфичны к М.tuberculosis. Олигонуклеотидный зонд (далее обозначаемый как MT-POL-1), произведенный из этой области со следующей последовательностью:
GCA CGT GGA GGG GAT САС АСС (SEQ ID NO 23)
оценивали далее в отношении его чувствительности и специфичности путем гибридизации на LiPA-полосках. Условия амплификации и гибридизации были такими же, как описано выше. Результаты суммированы в таблице 3. В дополнение к четырем штаммам М.tuberculosis, перечисленным в таблице 3, было протестировано еще 521 клинических изолятов М.tuberculosis: все изоляты дали положительный сигнал гибридизации. Очевидно, с зондом гибридизуются также штаммы М.bovis, однако для данной цели не является важным в клиническом отношении отличать М. tuberculosis от M.bovis. Фактически, во всей заявке термин "" можно заменить на термин "комплекс М.tuberculosis", относящийся к собственно М.tuberculosis, M.bovis, М.africanum и M.microti, без влияния на значимость результатов.
GCA CGT GGA GGG GAT САС АСС (SEQ ID NO 23)
оценивали далее в отношении его чувствительности и специфичности путем гибридизации на LiPA-полосках. Условия амплификации и гибридизации были такими же, как описано выше. Результаты суммированы в таблице 3. В дополнение к четырем штаммам М.tuberculosis, перечисленным в таблице 3, было протестировано еще 521 клинических изолятов М.tuberculosis: все изоляты дали положительный сигнал гибридизации. Очевидно, с зондом гибридизуются также штаммы М.bovis, однако для данной цели не является важным в клиническом отношении отличать М. tuberculosis от M.bovis. Фактически, во всей заявке термин "" можно заменить на термин "комплекс М.tuberculosis", относящийся к собственно М.tuberculosis, M.bovis, М.africanum и M.microti, без влияния на значимость результатов.
Хотя, используя наборы праймеров, описанные в примере 1, можно получить продукт PCR с ДНК некоторых других видов Mycobacterium и даже некоторых не связанных генетически микроорганизмов, которые также могут присутствовать в дыхательном тракте, ни для одной из этих бактерий не проявляется гибридизация с выбранным зондом МТ-POL-l. В заключение мы можем констатировать, что выбранный зонд является высоко специфичным к штаммам комплекса М.tuberculosis и на 100% чувствительным к М.tuberculosis. Для специфичного обнаружения штаммов комплекса М.tuberculosis также могут быть полезны другие зонды из этой области, такие как: KT-POL-2, MT-POL-3, MT-POL-4 и MT-POL-5 (см. таблицу 2).
Подобным же образом, следующие зонды могут использоваться для того, чтобы отличить штаммы М.avium, M.paratubercolosis, М.scrofulaceum, M.kansasii, М. intracellulare и M. leprae друг от друга и от других микобактерий: MA-POL-1, MP-POL-1, MS-POL-1, MK-POL-1, MI-POL-1 и ML-POL-1, соответственно (см. таблицу 2В).
Пример 5: Оценочные испытания LiPA-полосок для М.tuberculosis
Были приготовлены LiPA-полоски, несущие следующие зонды (в дополнение к линии положительного контроля): MT-POL-1, S11, S2, S33, S4444, S5555, R2, R444A, R444B, R55.
Были приготовлены LiPA-полоски, несущие следующие зонды (в дополнение к линии положительного контроля): MT-POL-1, S11, S2, S33, S4444, S5555, R2, R444A, R444B, R55.
Эти полоски гибридизовали с продуктами PCR из штаммов М.tubercolosis, для которых была определена соответствующая последовательность гена rроВ. Некоторые репрезентативные результаты суммированы в таблице 4.
Результаты гибридизации полностью коррелируют с результатами секвенирования, показывая, что используемые зонды могут осуществлять дискриминацию на уровне единичного несоответствия. Каждая отбираемая мутация может быть обнаружена либо по отсутствию одного из зондов немутантного типа (S-зондов), либо по отсутствию зонда немутантного типа совместно с присутствием соответствующего мутантного зонда (R-зонда). В последнем случае из результатов гибридизации можно определить, какая именно мутация имеет место. Однако знать, какая именно мутация имеет место, не является необходимым для того, чтобы определить, имеют ли дело с устойчивым к рифампицину штаммом или нет, так как каждая отбираемая мутация вызывает такую устойчивость. Чувствительные штаммы, т.е. штаммы без мутаций в соответствующей части гена rроВ, дают положительные реакции на все S-зонды, в то время как все R-зонды дают отрицательные значения (= wt-рисунок).
Пример 6: Прямое определение штаммов М.tuberculosis и устойчивости к рифампицину в клинических образцах
Анализу подвергались шестьдесят восемь клинических образцов различного географического происхождения (13 и 35 образцов мокроты из Бельгии и Руанды соответственно, и 20 биопсий из лимфоузлов из Бурунди), все дающие положительные результаты на М. tubercolosis в культуре и сохранявшиеся при -20oС. Приготовление образцов для амплификации основывалось на методике Boom et al. (1990), модифицированной De Beenhouwer et al. (представлено на рассмотрение). Метод гнездной PCR для соответствующей области гена rроВ реализовывали при помощи биотинилированных внутренних праймеров (Р3 и Р4). После цикла термической обработки амплифицированный продукт подвергали инкубации с LiPA-полосками. Устойчивость к рифампицину определяли по Левенштайну-Дженсену
с использованием метода пропорций Canetti et al. (1963). Для устойчивых штаммов определяли MIC (минимальную тормозящую концентрацию) на агаре 7Н10 (Heifets, 1988). По данным микроскопии 20 образцов (29,4%) были отрицательными, 15 (22,1%) в слабой степени положительными (1+ или менее согласно шкале American Thoracic Society) и 33 (48,5%) в сильной степени положительными (≥+2) при окрашивании по методу Циля-Нельсена.
Анализу подвергались шестьдесят восемь клинических образцов различного географического происхождения (13 и 35 образцов мокроты из Бельгии и Руанды соответственно, и 20 биопсий из лимфоузлов из Бурунди), все дающие положительные результаты на М. tubercolosis в культуре и сохранявшиеся при -20oС. Приготовление образцов для амплификации основывалось на методике Boom et al. (1990), модифицированной De Beenhouwer et al. (представлено на рассмотрение). Метод гнездной PCR для соответствующей области гена rроВ реализовывали при помощи биотинилированных внутренних праймеров (Р3 и Р4). После цикла термической обработки амплифицированный продукт подвергали инкубации с LiPA-полосками. Устойчивость к рифампицину определяли по Левенштайну-Дженсену
Анализ методом LiPA обнаружил чувствительность к рифампицину в 49 образцах (положительны только зонды на М.tubercolosis и зонды немутантного типа) и устойчивость в 19 образцах (зонд на М. 11:22 tubercolosis положителен, один из зондов немутантного типа пропущен и, наконец, один из мутантных зондов положителен). Тестирование на восприимчивость к рифампицину in vitro подтвердило эти результаты, за тремя исключениями. Для всех чувствительных штаммов наблюдался рисунок чувствительного зонда, показывая, что возможные молчащие мутации в этой серии не были обнаружены. При помощи стандартных методик было найдено, что все штаммы, у которых проявляется картина устойчивости, являются устойчивыми. Для трех образцов (от трех устойчивых одновременно к ряду лекарственных препаратов пациентов из Руанды) в результате PCR-LiPA был получен рисунок чувствительности, хотя у культуры имела место устойчивость (MIC ≥ 2 мкг/мл на 7Н10). Секвенирование области rроВ этих штаммов подтвердило наличие последовательности гена немутантного типа, что, возможно, предполагает в этих случаях другой механизм устойчивости к рифампицину или мутацию в другой части гена rроВ.
Интересно также отметить, что система с гнездной PCR давала положительные результаты для всех тестировавшихся образцов, положительных в культуре, включая 20 образцов, отрицательных по Цилю-Нельсену. В другом эксперименте (данные не представлены), охватывавшем 17 отрицательных по мазкам образцов мокроты из отрицательных в культуре случаев клинического подозрения на туберкулез, при применении системы LiPA вообще не было получено сигналов, показывая, что, скорее всего, инфекции были вызваны не M.tubercolosis.
В последующем эксперименте тестировали при помощи LiPA большую коллекцию клинических образцов различного географического происхождения. Результаты показаны в таблице 5. Из 137 найденных устойчивых штаммов абсолютное большинство можно было отнести к одной из мутаций, представляемых R-зондами (R2, R4A, R4B, R5). Интересно, что некоторые мутации, по-видимому, более часто встречаются в некоторых странах по сравнению с другими (например, в Тунисе и Египте: R4B (=H526D), в
Руанде: R5 (S531L). Это может в итоге вести к различным схемам тестов в различных странах.
Руанде: R5 (S531L). Это может в итоге вести к различным схемам тестов в различных странах.
Из общего числа 213 устойчивых к рифампицину штаммов, анализировавшихся при помощи LiPA в настоящей заявке, 151 (71%) может быть отнесен к мутациям S531L, H526D, D516V или H526Y и, таким образом, их можно было обнаружить по положительному отклику с зондами R5, R4B, R2 и R4A соответственно (см. фиг. 10).
Из общего числа 180 штаммов, анализировавшихся как в культуре, так и при помощи LiPA, правильная идентификация (чувствительный/устойчивый) была сделана для 164 (91,1%) штаммов (см. таблицу 6). Для трех устойчивых штаммов результаты LiPA и секвенирования показали наличие фрагмента гена rроВ немутантного типа, что говорит о том, что механизм устойчивости к рифампицину не мог быть приписан мутациям в исследованной части гена rроВ.
Тринадцать из 180 анализировавшихся штаммов были устойчивыми согласно LiPA, но, по-видимому, чувствительными в культуре. Однако после рекультивирования 2 из этих 13 штаммов в синтетической среде 7Н11 вместо традиционной среды Левенштайна-Дженсена оказалось, что они так или иначе устойчивы к рифампицину. Эти до сих пор не публиковавшиеся данные показывают, что стандартная среда Левенштайна-Дженсена не рекомендуется для определения восприимчивости микобактерий к антибиотикам (возможно, вследствие присутствия следов антибиотиков, найденных в имеющихся в продаже яйцах, используемых для приготовления среды Левенштайна-Дженсена). Таким образом, ожидается, что процент штаммов с противоречивыми свойствами, которые устойчивы согласно LiPA, но чувствительны в культуре (в данном случае 13/180 = 7,2%) будет много ниже (и, возможно, составит 0%) в том случае, если культивирование производится на синтетической среде, подобной 7Н11.
Интересно, что большинство устойчивых к рифампицину изолятов, исследованных в настоящей заявке, было, к тому же, устойчиво к изониазиду, и, таким образом, одновременно устойчиво к ряду лекарственных препаратов (определение устойчивости к ряду лекарственных препаратов = устойчивость, по крайней мере, к изониазиду и рифампицину). Таким образом, устойчивость к рифампицину можно рассматривать как потенциальный маркер устойчивости одновременно к ряду лекарственных препаратов, и, следовательно, описанный выше тест LiPA может быть важным средством контроля случаев устойчивого к ряду лекарственных препаратов туберкулеза.
В итоге, описанный выше метод дает возможность корректной идентификации М. tubercolosis и одновременного обнаружения устойчивости к рифампицину непосредственно в клинических образцах без предварительного культивирования. Он дает возможность легко обнаруживать устойчивость к рифампицину непосредственно в клинических образцах в течение менее чем 24 часов.
Пример 7: Обнаружение устойчивости к рифампицину в M.leprae
Описанный выше способ обнаружения может также применяться для обнаружения присутствия М.leprae в биологических образцах, объединенного с выявлением его устойчивости к рифампицину. Последовательность гена rроВ М.1eprae была описана ранее Ноnоrе и Cole (1993). Они идентифицировали лишь ограниченное число мутаций, ответственных за устойчивость М.leprae к рифампицину. Резонно было бы ожидать, что, подобно М.tubercolosis, ряд других мутаций может вызывать устойчивость М.leprae к. рифампицину, и что большая часть из этих мутаций будет локализована в весьма ограниченной области гена rроВ, соответствующей "области мутаций", описанной ранее в настоящей заявке.
Описанный выше способ обнаружения может также применяться для обнаружения присутствия М.leprae в биологических образцах, объединенного с выявлением его устойчивости к рифампицину. Последовательность гена rроВ М.1eprae была описана ранее Ноnоrе и Cole (1993). Они идентифицировали лишь ограниченное число мутаций, ответственных за устойчивость М.leprae к рифампицину. Резонно было бы ожидать, что, подобно М.tubercolosis, ряд других мутаций может вызывать устойчивость М.leprae к. рифампицину, и что большая часть из этих мутаций будет локализована в весьма ограниченной области гена rроВ, соответствующей "области мутаций", описанной ранее в настоящей заявке.
Поэтому выбирали набор зондов немутантного типа, перекрывающий предполагаемую область мутаций в гене rроВ М.leprae (см. таблицу 2В):
ML-S1 (SEQ ID NO 58)
ML-S2 (SEQ ID NO 59)
ML-S3 (SEQ ID NO 60)
ML-S4 (SEQ ID NO 61)
ML-S5 (SEQ ID NO 62)
ML-S6 (SEQ ID NO 63).
ML-S1 (SEQ ID NO 58)
ML-S2 (SEQ ID NO 59)
ML-S3 (SEQ ID NO 60)
ML-S4 (SEQ ID NO 61)
ML-S5 (SEQ ID NO 62)
ML-S6 (SEQ ID NO 63).
Устойчивость к рифампицину устанавливали по отсутствию гибридизации с, по крайней мере, одним из этих ML-зондов. Этот набор ML-зондов будет определять вызывающие устойчивость к рифампицину мутации в этой области, даже если последовательность этих мутаций еще не определена.
Вышеупомянутые ML-S-зонды тщательно сконструированы таким образом, что все они могут использоваться в одних и тех же условиях гибридизации и промывки. То же самое распространяется на видоспецифичные зонды ML-POL-1, с которыми могут объединяться ML-S-зонды, чтобы получить возможность одновременного обнаружения М.leprae и его устойчивости к рифампицину.
Все зонды, упомянутые в данном примере, содержатся в одном и том же фрагменте гена rpoB M.leprae, который может быть получен при помощи PCR с использованием набора праймеров, выбранных из MGRPO-1 или MGRPO-2 (5'-праймеры) и MGRPO-3 или MGRPO-4 (3'-праймеры).
Claims (27)
1. Способ выявления устойчивости к рифампицину и его аналогам, присутствующим в образце видов Mycobacterium, с возможностью одновременной идентификации этих видов Mycobacterium, включающий стадии: (i) высвобождения, выделения или концентрирования полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце; (ii) если необходимо, амплификации соответствующей части гена rроВ, присутствующего в указанном образце, по крайней мере с одной парой подходящих праймеров, как описано в пп. 22-24; (iii) гибридизации полинуклеиновых кислот согласно стадии (i) или (ii) по крайней мере с одним из зондов на основе гена rроВ, как определено в таблице 2, в подходящих условиях гибридизации и промывки; (iv) обнаружения гибридов, образовавшихся на стадии (iii); (v) составления заключения о чувствительности Mycobacterium к рифампицину и его аналогам и при необходимости о содержащихся в образце видах Mycobacterium по характеру полученного на стадии (iv) дифференциального сигнала гибридизации.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выявления устойчивости присутствующего в биологическом образце М. tuberculosis к рифампицину и его аналогам амплификацию проводят по крайней мере с одной парой подходящих праймеров по пп. 22 и 23, а гибридизацию проводят по крайней мере с одним из следующих зондов на основе rроВ дикого типа или S-зондов, определенных в таблице 2: Sl (SEQ ID NO 1); S11 (SEQ ID NO 2); S2 (SEQ ID NO 3); S3 (SEQ ID NO 4); S33 (SEQ ID NO 5); S44 (SEQ ID NO 7); S4444 (SEQ ID NO 8); S5 (SEQ ID NO 9); S55 (SEQ ID NO 10); S555 (SEQ ID NO 39); S5555 (SEQ ID NO 40); S55C (SEQ ID NO 44); S55M (SEQ ID NO 45); S6 (SEQ ID NO 11) и/или S66 (SEQ ID NO 12).
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, включающим по крайней мере 5 или 6 S-зондов по п. 2, причем указанные зонды, взятые совместно, покрывают область мутации гена rроВ.
4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, включающим по крайней мере один, а предпочтительно все из следующих S-зондов, определенных в таблице 2: S11 (SEQ ID NO 2); S2 (SEQ ID NO 3); S33 (SEQ ID NO 5); S4444 (SEQ ID NO 8) и/или S55 или S5555 (SEQ ID NO 10 или 40).
5. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов по любому из пп. 2-4, дополнительно включает по крайней мере один зонд с молчащей мутацией в гене rроВ, определенный в таблице 2, такой, как: SIL-1 (SEQ ID NO 13).
6. Способ по любому из пп. 2-5, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов по любому из пп. 2-5, причем указанный набор дополнительно включает по крайней мере один зонд с мутацией в гене rроВ или R-зонд и выбран из списка R-зондов, определенных в таблице 2: Rl (SEQ ID NO 46); R2 (SEQ ID NO 14); R2B (SEQ ID NO 47); R2C (SEQ ID NO 48); R3 (SEQ ID NO 49); R4A (SEQ ID NO 15); R44A (SEQ ID NO 16); R444A (SEQ ID NO 17); R4B (SEQ ID NO 18); R44B (SEQ ID NO 19); R444B (SEQ ID NO 20); R4C (SEQ ID NO 50); R4D (SEQ ID NO 51); R4E (SEQ ID NO 52); R5 (SEQ ID NO 21); R55 (SEQ ID NO 22); R5B (SEQ ID NO 53) и/или R5C (SEQ ID NO 54).
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, причем указанный набор включает по крайней мере один из следующих R-зондов, определенных в таблице 2: R2 (SEQ ID NO 14); R444A (SEQ ID NO 17); R444B (SEQ ID NO 20) и/или R55 (SEQ ID NO 22).
8. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, причем указанный набор включает по крайней мере следующие S-зонды, определенные в таблице 2: S4444 (SEQ ID NO 8) и S55 или S5555 (SEQ ID NO 10 или 40).
9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, причем указанный набор включает по крайней мере следующие S-зонды, определенные в таблице 2: S2 (SEQ ID NO 3); S4444 (SEQ ID NO 8) и S55 или S5555 (SEQ ID NO 10 или 40).
10. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что гибридизацию осуществляют с набором зондов, причем указанный набор дополнительно включает по крайней мере один R-зонд, выбранный из следующего списка R-зондов, определенных в таблице 2: R2 (SEQ ID NO 14); R444A (SEQ ID NO 17); R444B (SEQ ID NO 20) и/или R55 (SEQ ID NO 22).
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что для одновременного выявления устойчивости к рифампицину и его аналогам и идентификации присутствующего в образце Mycobacterium tuberculosis набор зондов дополнительно включает по крайней мере один зонд, специфичный к Mycobacterium tuberculosis, причем указанный зонд предпочтительно содержится в амплифицированном фрагменте гена rроВ и предпочтительно выбран из группы зондов, определенных в таблице 2: MT-POL-1 (SEQ ID NO 23); MT-POL-2 (SEQ ID NO 24); MT-POL-3 (SEQ ID NO 25); MT-POL-4 (SEQ ID NO 26) и/или MT-POL-5 (SEQ ID NO 27).
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что набор зондов включает зонд, определенный в таблице 2: MT-POL-1 (SEQ ID NO 23).
13. Способ по любому из пп. 1, 11 и 12, отличающийся тем, что для одновременного выявления устойчивости к рифампицину и идентификации М. tuberculosis и микобактерий, иных, чем М. tuberculosis, гибридизацию проводят с набором зондов, дополнительно включающим по крайней мере один из следующих видоспецифичных зондов, определенных в табл. 2: MP-POL-1 (SEQ ID NO 28); MA-POL-1 (SEQ ID NO 29); MS-POL-1 (SEQ ID NO 38); MK-POL-1 (SEQ ID NO 55); MI-POL-1 (SEQ ID NO 68) и/или ML-POL-1 (SEQ ID NO-57); и/или любой специфичный к М. Paratuberculosis зонд, производный от последовательности соответствующей части гена rроВ М. paratuberculosis (SEQ ID NO 35), и/или любой специфичный к М. avium зонд, производный от последовательности соответствующей части гена rроВ М. avium (SEQ ID NO 36), и/или любой специфичный к М. scrofulaceum зонд, производный от последовательности соответствующей части гена rроВ М. scrofulaceum (SEQ ID NO 37), и/или любой специфичный к М. kansasii зонд, производный от последовательности соответствующей части гена rроВ М. kansasii (SEQ ID NO 56), и/или любой специфичный к штамму MAC зонд, производный от последовательности соответствующей части гена rроВ штамма MAC (SEQ ID NO 69).
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанная гибридизация осуществляется со следующим набором зондов, определенных в таблице 2: MT-POL-1 (SEQ ID NO 23); S11 (SEQ ID NO 2); S2 (SEQ ID NO 3); S33 (SEQ ID NO 5); S4444 (SEQ ID NO 8); S55 или S5555 (SEQ ID NO 10 или 40); R2 (SEQ ID NO 14); R444A (SEQ ID NO 17); 3 R444B (SEQ ID NO 20) и R55 (SEQ ID NO 22).
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что для выявления присутствующего в образце Mycobacterium tuberculosis, устойчивого к рифампицину и его аналогам, используют зонд или набор праймеров, сконструированных для того, чтобы специфически обнаруживать или амплифицировать следующие новые мутации гена rроВ: D516G, представляющая собой мутацию в кодоне 516 гена rроВ, приводящую к замене аминокислоты D на G, Н526С, представляющая собой мутацию в кодоне 526 гена rроВ, приводящую к замене аминокислоты Н на С; Н 526Т, представляющая собой мутацию в кодоне 526 гена rроВ, приводящую к замене аминокислоты Н на Т, и R529Q, представляющая собой мутацию в кодоне 529 гена rроВ, приводящую к замене аминокислоты R на Q, как определено в таблице 1.
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выявления устойчивости присутствующего в биологическом образце М. leprae к рифампицину и его аналогам амплификацию проводят по крайней мере с одной парой подходящих праймеров по п. 24, а гибридизацию проводят по крайней мере с одним из зондов, определенных в таблице 2: ML-S1(SEQ ID NO 58); ML-S2 (SEQ ID NO 59); ML-S3 (SEQ ID NO 60); ML-S4 (SEQ ID NO 61); ML-S5 (SEQ ID NO 62) или MT-S6 (SEQ ID NO 63).
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что для одновременного выявления устойчивости к рифампицину и идентификации М. leprae гибридизацию проводят с набором зондов, включающим зонд, определенный в таблице 2: ML-POL-1 (SEQ ID NO 57).
18. Зонд для выявления устойчивости Mycobacterium к рифампицину и его аналогам с возможностью одновременной идентификации видов Mycobacterium, выбранный из группы зондов, охарактеризованных в таблице 2.
19. Способ обратнофазовой гибридизации для выявления устойчивости Mycobacterium к рифампицину и его аналогам с возможностью одновременной идентификации видов Mycobacterium, включающий использование любого из зондов по п. 18, причем указанные олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на твердофазной подложке.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на мембранной полоске.
21. Композиция для диагностики заболеваний, вызванных микобактериями, включая выявление их устойчивости к рифампицину, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество любого из зондов по п. 18 и подходящий гибридизационный буфер.
22. Набор праймеров для амплификации фрагмента гена rроВ в М. tuberculosis, выбранный из следующих пар праймеров, определенных в таблице 2: P1 и Р5 (SEQ ID NO 30 и 33); Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 и 32); Р7 и Р8 (SEQ ID NO 41 и 42) или Р2 и Р6 в комбинации с (Р1 и Р5), или (Р3 и Р4), или (Р7 и Р8).
23. Набор праймеров по п. 22, отличающийся тем, что он включает пару праймеров, определенных в таблице 2: Р3 и Р4 (SEQ ID NO 31 и 32).
24. Набор праймеров для амплификации фрагмента гена rроВ в микобактериях иных, чем М. tuberculosis, состоящий из 5'-праймера, выбираемого из MGRPO-1 (SEQ ID NO 64) или MGRPO-2 (SEQ ID NO 65), и 3'-праймера, выбираемого из MGRPO-3 (SEQ ID NO 66) или MGRPO-4 (SEQ ID NO 67).
25. Набор, предназначенный для выявления устойчивости к рифампицину и его аналогам, присутствующих в биологическом образце микобактерий, с возможностью одновременной идентификации видов микобактерий, характеризующийся тем, что включает следующие компоненты: (i) при необходимости средства для высвобождения, выделения или концентрирования полинуклеиновых кислот, присутствующих в образце; (ii) при необходимости по крайней мере один из наборов праймеров по любому из пп. 22-24; (iii) по крайней мере один из зондов, определенных в п. 18, возможно, зафиксированных на твердофазной подложке; (iv) буфер гибридизации или компоненты, необходимые для получения указанного буфера; (v) промывочный раствор или компоненты, необходимые для получения указанного раствора;
(vi) при необходимости средства для обнаружения гибридов, образующихся в результате предшествовавшей гибридизации.
(vi) при необходимости средства для обнаружения гибридов, образующихся в результате предшествовавшей гибридизации.
26. Набор по п. 25, отличающийся тем, что для идентификации М. tuberculosis с одновременным определением его устойчивости к рифампицину он включает праймеры по п. 22 или 23 и зонды, выбранные из группы зондов по п. 18.
27. Набор по п. 25, отличающийся тем, что для идентификации М. leprae с одновременным определением его устойчивости к рифампицину он включает праймеры по п. 24 и зонды, выбранные из группы зондов по п. 18.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94870093 | 1994-06-09 | ||
| EP94870093.5 | 1994-06-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97100176A RU97100176A (ru) | 1999-05-20 |
| RU2204608C2 true RU2204608C2 (ru) | 2003-05-20 |
Family
ID=8218646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97100176/13A RU2204608C2 (ru) | 1994-06-09 | 1995-06-09 | Способ выявления устойчивости микобактерий к рифампицину с возможной их идентификацией, способ гибридизации, зонд и композиция для его осуществления, набор праймеров (варианты) |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6329138B1 (ru) |
| EP (1) | EP0771360B1 (ru) |
| JP (1) | JP4558105B2 (ru) |
| AT (1) | ATE261496T1 (ru) |
| AU (1) | AU703947B2 (ru) |
| BR (1) | BR9507960B8 (ru) |
| CA (1) | CA2192364C (ru) |
| CZ (1) | CZ298020B6 (ru) |
| DE (1) | DE69532675T2 (ru) |
| DK (1) | DK0771360T3 (ru) |
| ES (1) | ES2217280T3 (ru) |
| PT (1) | PT771360E (ru) |
| RU (1) | RU2204608C2 (ru) |
| WO (1) | WO1995033851A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2715591C1 (ru) * | 2016-08-04 | 2020-03-02 | Оптифарм.Ко., Лтд | Диагностический способ и набор для одновременного обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения рифампициновой устойчивости туберкулезной микобактерии на основе аналитической платформы quantamatrix |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995033851A2 (en) | 1994-06-09 | 1995-12-14 | Innogenetics N.V. | Method for the detection of the antibiotic resistance spectrum of mycobacterium species |
| EP0975421B1 (en) | 1997-04-15 | 2014-06-18 | Basf Se | Preparation of low-dust stabilisers |
| DE19734940A1 (de) * | 1997-08-12 | 1999-02-18 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül-Satz für Salmonella-Nachweis, Nucleinsäuren, Kit und Verwendung |
| US7108968B2 (en) * | 1998-04-03 | 2006-09-19 | Affymetrix, Inc. | Mycobacterial rpoB sequences |
| WO2000036142A1 (en) * | 1998-12-11 | 2000-06-22 | Visible Genetics Inc. | METHOD AND KIT FOR THE CHARACTERIZATION OF ANTIBIOTIC-RESISTANCE MUTATIONS IN $i(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS) |
| EP1076099A3 (en) * | 1999-08-03 | 2003-03-05 | Nisshinbo Industries, Inc. | Kit for diagnosis of tubercle bacilli |
| KR100363615B1 (ko) * | 1999-10-27 | 2002-12-06 | 주식회사 제니스라이프사이언스 | ｒｐｏＢ 유전자 단편 및 이를 이용한 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 동정방법 |
| EP1307587A2 (en) | 2000-03-03 | 2003-05-07 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | MULTIPLEX HYBRIDIZATION SYSTEM FOR IDENTIFICATION OF PATHOGENIC i MYCOBACTERIUM /i AND METHOD OF USE |
| KR100451108B1 (ko) * | 2000-05-30 | 2004-10-06 | 주식회사 바이오메드랩 | 마이코박테리아 균동정 및 약제내성 탐지를 위한 유전자진단키트 및 그 키트의 제조방법 |
| WO2002000165A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Bakulesh Mafatlal, Khamar | Agent for reversal of drug resistance in mycobacterium tuberculosis |
| US6902894B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-06-07 | Genetel Pharmaceuticals Ltd. | Mutation detection on RNA polmerase beta subunit gene having rifampin resistance |
| US7094542B2 (en) | 2001-09-18 | 2006-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Detection of rpoB sequences of Mycobacterium tuberculosis |
| ATE414175T1 (de) * | 2001-09-18 | 2008-11-15 | Gen Probe Inc | Detektion von rpob sequenzen von mycobacterium tuberculosis |
| KR100454585B1 (ko) * | 2001-10-09 | 2004-11-02 | 주식회사 에스제이하이테크 | 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트 |
| FI115637B (fi) * | 2003-12-19 | 2005-06-15 | Mobidiag Oy | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos |
| GB0403039D0 (en) * | 2004-02-11 | 2004-03-17 | Health Prot Agency | TB resistance assay |
| US7445895B2 (en) * | 2004-04-28 | 2008-11-04 | Asiagen Corporation | Methods, kits and assay system for detecting drug-resistant Mycobacterium tuberculosis |
| ITRM20050068A1 (it) * | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine. |
| US7914982B2 (en) * | 2005-02-17 | 2011-03-29 | Trovagene, Inc. | Methods for detecting pathogen specific nucleic acids in urine |
| ITRM20050067A1 (it) * | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici virali o di origine virale nelle urine. |
| RU2376387C2 (ru) * | 2005-12-26 | 2009-12-20 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций в днк микобактерий, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, на биологических микрочипах, набор праймеров, биочип и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе |
| US9234247B2 (en) | 2006-03-13 | 2016-01-12 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for detection of mutant gene |
| CA2696403C (en) * | 2007-08-22 | 2018-01-02 | Xenomics, Inc. | Methods of using mirna for detection of in vivo cell death |
| US7946758B2 (en) * | 2008-01-31 | 2011-05-24 | WIMM Labs | Modular movement that is fully functional standalone and interchangeable in other portable devices |
| JP2009189283A (ja) * | 2008-02-13 | 2009-08-27 | Nipro Corp | 結核菌および非結核性抗酸菌検出試薬 |
| KR100990756B1 (ko) | 2008-05-22 | 2010-10-29 | 엠앤디 (주) | 결핵균 약제 내성 진단용 프로브 및 그 키트 |
| KR101001368B1 (ko) * | 2008-05-22 | 2010-12-14 | 엠앤디 (주) | 나균 리팜핀 내성 진단용 프로브 및 그 키트 |
| US10273525B2 (en) | 2010-11-10 | 2019-04-30 | Brandeis University | Compositions, methods, and kits for detecting and identifying mycobacteria |
| TWI614345B (zh) | 2012-06-22 | 2018-02-11 | Taichung Veterans General Hospital | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
| RU2552214C2 (ru) * | 2013-04-03 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт химический биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ПИРАЗИНАМИНУ ИЗОЛЯТОВ Mycobacterium tuberculosis |
| KR101472993B1 (ko) * | 2013-08-20 | 2014-12-18 | 한국생명공학연구원 | 마이크로박테리움 속 hy-17 균주로부터 생산되는 신규한 알카리 내성 글리코시드 하이드로레이즈 패밀리 10 자일라나제 |
| EP4446739A2 (en) * | 2014-10-10 | 2024-10-16 | Rutgers, The State University of New Jersey | Polymerase chain reaction primers and probes for mycobacterium tuberculosis |
| WO2016203267A2 (en) * | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Cambridge Enterprise Limited | Diagnosis and treatment of infectious disease |
| RU2659958C2 (ru) * | 2016-10-17 | 2018-07-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России) | Способ оценки лекарственной чувствительности Mycobacnerium tuberculosis на основе результатов определения иммунологических показателей крови у больного туберкулезом легких человека |
| EP3877550A4 (en) * | 2018-11-09 | 2022-08-10 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | RAPID PCR METHODOLOGY |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775361A (en) * | 1986-04-10 | 1988-10-04 | The General Hospital Corporation | Controlled removal of human stratum corneum by pulsed laser to enhance percutaneous transport |
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US5749847A (en) * | 1988-01-21 | 1998-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of nucleotides into organisms by electroporation |
| EP0398960B1 (en) * | 1988-01-21 | 1995-12-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Transport of molecules across tissue using electroporation |
| US5713845A (en) * | 1991-10-29 | 1998-02-03 | Thermolase Corporation | Laser assisted drug delivery |
| US5423803A (en) * | 1991-10-29 | 1995-06-13 | Thermotrex Corporation | Skin surface peeling process using laser |
| US5246436A (en) * | 1991-12-18 | 1993-09-21 | Alcon Surgical, Inc. | Midinfrared laser tissue ablater |
| US5165418B1 (en) * | 1992-03-02 | 1999-12-14 | Nikola I Tankovich | Blood sampling device and method using a laser |
| US5633131A (en) * | 1992-04-30 | 1997-05-27 | Institut Pasteur | Rapid detection of isoniazid resistance in mycobacterium tuberculosis probes for selecting nucleic acid encoding isoniazid resistance, and methods and kits |
| US5851763A (en) | 1992-09-17 | 1998-12-22 | Institut Pasteur | Rapid detection of antibiotic resistance in mycobacterium tuberculosis |
| ES2131578T5 (es) | 1992-04-30 | 2010-03-31 | Institut Pasteur | Deteccion rapida de resistencia a antibioticos en mycobacterium tuber culosis. |
| US5464386A (en) * | 1992-08-17 | 1995-11-07 | Genetronics, Inc. | Transdermal drug delivery by electroincorporation of vesicles |
| US5462520A (en) * | 1992-08-17 | 1995-10-31 | Genetronics, Inc. | Transsurface drug delivery by electrofusion of microbubbles to the tissue surface |
| US5643252A (en) * | 1992-10-28 | 1997-07-01 | Venisect, Inc. | Laser perforator |
| US5462743A (en) * | 1992-10-30 | 1995-10-31 | Medipro Sciences Limited | Substance transfer system for topical application |
| US5458140A (en) * | 1993-11-15 | 1995-10-17 | Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) | Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers |
| US5556612A (en) * | 1994-03-15 | 1996-09-17 | The General Hospital Corporation | Methods for phototherapeutic treatment of proliferative skin diseases |
| US5505726A (en) * | 1994-03-21 | 1996-04-09 | Dusa Pharmaceuticals, Inc. | Article of manufacture for the photodynamic therapy of dermal lesion |
| US5643723A (en) | 1994-05-26 | 1997-07-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens |
| WO1995033851A2 (en) * | 1994-06-09 | 1995-12-14 | Innogenetics N.V. | Method for the detection of the antibiotic resistance spectrum of mycobacterium species |
| US5554153A (en) * | 1994-08-29 | 1996-09-10 | Cell Robotics, Inc. | Laser skin perforator |
-
1995
- 1995-06-09 WO PCT/EP1995/002230 patent/WO1995033851A2/en active IP Right Grant
- 1995-06-09 BR BRPI9507960-2B8A patent/BR9507960B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-06-09 DE DE69532675T patent/DE69532675T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 EP EP95923283A patent/EP0771360B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 JP JP50037496A patent/JP4558105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 AU AU27896/95A patent/AU703947B2/en not_active Expired
- 1995-06-09 ES ES95923283T patent/ES2217280T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 RU RU97100176/13A patent/RU2204608C2/ru active
- 1995-06-09 AT AT95923283T patent/ATE261496T1/de active
- 1995-06-09 PT PT95923283T patent/PT771360E/pt unknown
- 1995-06-09 US US08/750,088 patent/US6329138B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 CA CA002192364A patent/CA2192364C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 DK DK95923283T patent/DK0771360T3/da active
- 1995-06-09 CZ CZ0361296A patent/CZ298020B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-28 US US09/722,319 patent/US6632607B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-01-10 US US10/339,604 patent/US7252936B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-06-27 US US11/819,472 patent/US20090068651A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. М.О. БИРГЕРА. - М.: Медицина, 1982, с.271-276. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2715591C1 (ru) * | 2016-08-04 | 2020-03-02 | Оптифарм.Ко., Лтд | Диагностический способ и набор для одновременного обнаружения и идентификации туберкулезной микобактерии и нетуберкулезных микобактерий и определения рифампициновой устойчивости туберкулезной микобактерии на основе аналитической платформы quantamatrix |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0771360A1 (en) | 1997-05-07 |
| US6632607B1 (en) | 2003-10-14 |
| AU2789695A (en) | 1996-01-04 |
| DK0771360T3 (da) | 2004-07-12 |
| WO1995033851A3 (en) | 1996-02-08 |
| DE69532675D1 (de) | 2004-04-15 |
| CA2192364C (en) | 2009-01-20 |
| JP4558105B2 (ja) | 2010-10-06 |
| BR9507960B1 (pt) | 2010-08-10 |
| PT771360E (pt) | 2004-07-30 |
| CZ361296A3 (en) | 1997-07-16 |
| US7252936B2 (en) | 2007-08-07 |
| ES2217280T3 (es) | 2004-11-01 |
| EP0771360B1 (en) | 2004-03-10 |
| CZ298020B6 (cs) | 2007-05-23 |
| US20090068651A1 (en) | 2009-03-12 |
| AU703947B2 (en) | 1999-04-01 |
| BR9507960B8 (pt) | 2014-09-30 |
| DE69532675T2 (de) | 2005-02-24 |
| WO1995033851A2 (en) | 1995-12-14 |
| JPH10500857A (ja) | 1998-01-27 |
| BR9507960A (pt) | 1997-09-02 |
| US6329138B1 (en) | 2001-12-11 |
| ATE261496T1 (de) | 2004-03-15 |
| CA2192364A1 (en) | 1995-12-14 |
| US20030152982A1 (en) | 2003-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2204608C2 (ru) | Способ выявления устойчивости микобактерий к рифампицину с возможной их идентификацией, способ гибридизации, зонд и композиция для его осуществления, набор праймеров (варианты) | |
| US8628926B2 (en) | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith | |
| JP5049016B2 (ja) | Ｔｂ耐性アッセイ | |
| CA2134103C (en) | Rapid detection of antibiotic resistance in mycobacterium tuberculosis | |
| JP2008263994A (ja) | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 | |
| US5500341A (en) | Species-specific detection of Mycobacterium kansasii | |
| KR100388548B1 (ko) | 알이피 13 이 12 반복서열의 피시알 증폭을 이용한결핵균의 검출방법 | |
| US5518884A (en) | Nucleic acid sequences specific for mycbacterium kansasii | |
| EP1049809B1 (en) | EF-Tu mRNA AS A MARKER FOR VIABILITY OF BACTERIA | |
| US20020187467A1 (en) | Mycobacterial rpob sequences | |
| US20050058985A1 (en) | Method and kit for identifying vancomycin-resistant enterococcus | |
| JP3408564B2 (ja) | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 | |
| US7074568B2 (en) | Molecular diagnosis of atypical mycobacterial infections | |
| Jannes et al. | Relationship between Pyrazinamide | |
| KR20000075178A (ko) | 마이코박테리움 포튜이튬의 내부전사지역의 염기서열 | |
| KR20000075179A (ko) | 마이코박테리움 첼로네의 내부전사지역의 염기서열 | |
| KR20000075180A (ko) | 마이코박테리아의 진단도구 및 진단방법 | |
| KR20000075181A (ko) | 마이코박테리아균종의 진단프로브 및 진단방법 | |
| KR20000075182A (ko) | 마이코박테리아 및 그 균종의 진단 방법 및 진단하기 위한 프로브 |