KR20000075182A - 마이코박테리아 및 그 균종의 진단 방법 및 진단하기 위한 프로브 - Google Patents

마이코박테리아 및 그 균종의 진단 방법 및 진단하기 위한 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이코박테리아 및 그 균종을 진단하는 프로브 및 프라이머를 이용한 효소중합연쇄반응에 의한 진단방법을 제공하며, 본 발명에 의해 마이코박테리아 MOTT의 각 균종을 쉽고 용이하게 진단할 수 있다.

Description

마이코박테리아 및 그 균종의 진단 방법 및 진단하기 위한 프로브 {Method and probe for Genus- and Species-specific detection of Mycobacteria}
본 발명은 결핵균의 종류를 동정하는 프로브와 프라이머를 개발함으로써 결핵을 조기에 진단하는 방법뿐만 아니라 결핵균의 종류를 밝힘으로써 결핵의 원인균을 정확하게 동정할 수 있는 진단 방법에 관한 것이다.
1950년대 비결핵마이코박테리아(Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)가 인간에게 질병을 일으킬 수 있다는 사실이 보고되었고 1980년 이후 AIDS 환자에게서 M. avium complex가 전신질환을 유발한다고 알려진 다음부터 비결핵마이코박테리아에 대한 관심이 높아지고 있다. 비결핵마이코박테리아에 의한 질환은 임상적인 소견이나 일반적인 병리소견이 결핵과 유사하지만 비결핵마이코박테리아는 생활환경에 널리 분포하고 있어서 임상 가검물로부터 분리되어도 병원성 여부를 판단하기 어려워 진단이 쉽지 않다. 또한 대부분 각종 항결핵제에 약제 내성을 보이고 있어서 치료가 어려우며 재발율도 높은 것으로 알려져 있다. 여러 약제에 내성을 가진 균주가 점차 증가하고 있고 결핵균과 비결핵균은 치료가 달라지므로 이들에 대한 신속하고 정확한 동정방법이 요구되고 있다.
이러한 결핵발병율과 다제내성 결핵균주의 증가로 결핵의 효과적인 치료 및 관리를 위해 TB complex 뿐만 아니라 MOTT 균주의 보다 신속하고 정확한 결핵균의 동정방법이 요구되고 있다.
마이코박테리아 감염여부의 조기진단과 결핵균 종류의 확인은 치료에 있어 상당히 중요하므로 여러 가지 진단방법들이 연구되고 개발되어 왔다. 현재 이용되고 있는 동정 및 감염여부 진단방법들과 그 장단점은 아래와 같다.
첫째, 미생물학적 방법인 도말 및 배양검사가 있다. 이 방법은 마이코박테리아처럼 세대기간이 길어 배양시간이 오래 걸리고 실험자에게 감염 위험이 많이 수반되는 병원성 미생물인 경우에 적합하지 않다.
둘째, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법은 민감도와 특이도가 높으며 마이코박테리아처럼 분리 배양에 오랜 시간이 걸리는 병원균의 검출에 매우 유용하다. 특히 소량의 DNA를 증폭시켜 검출하므로 균주의 배양과정을 거치지 않고 검체에 존재하는 소량의 병원균만으로도 동정이 가능하다. 이러한 PCR에 의한 검출은 증폭시키는 표적 DNA에 따라 여러 가지 방법이 소개되고 있는데 그 중에서도 여러 copy로 존재하는 IS6110과 16S rRNA를 주로 사용하고 있다.
셋째, 마이코박테리아 균체 성분의 물리화학적 분석방법은 마이코박테리아의 균체 성분중 지방화합물을 gas chromatography와 mass spectrometry를 이용하여 검출하고 있다. 특이도가 높기는 하나 고가의 장비가 필요하다.
넷째, 혈청학적 방법에 의한 균체성분의 검출은 균항원에 대한 항체를 흡착시킨 혈구나 latex 입자를 이용한 응집반응과 효소를 항체에 결합시킨 효소결합면역 분석법등이 이용되고 있다. 그러나 이 기법은 매우 정교하여 세심한 주의를 요하므로 한정된 검사실에서만 가능하다.
다섯째, 마이코박테리오파아지 L5에 luciforase 유전자를 삽입해 마이코박테리아에 감염시켜 배지내 첨가된 luciferin으로 발광여부를 보아 검색을 할 수 있는 방법이 있다.(W.R. JACOBS, R.G. BARLETTA, R. UDANI, J. CHAN, G. KALKUT, G. SOSNE, T. KIESER, G.J. SARKIS, G.F. HATFUL, B.R. BLOOM. 1993, Science 260: 819-822)
여섯째, 올리고뉴클레오타이 프로브의 혼성화(hybridization)에 의한 동정방법이 있다.(A. TROESCH, H. NGUYEN, C.G.MIYADA, S. DESVARENNE, T.R. GINGERAS, P.M. KAPLAN, P. CROS and C. MABILAT. J. Clin. Microbiol. 1999, 37: 49-55.)
본 발명은 마이코박테리아 균종들의 특이적인 염기서열에 반응하여 각 균종을 진단하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 효소중합연쇄반응(PCR)에 의하여 마이코 박테리아 및 그 균종을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 마이코박테리아 MOTT의 각 균종을 간단하고도 정확하게 진단할 수 있다. 기존의 PCR 방법에 의한 동정이나 kit들은 목적으로 하는 한종류의 균주나 두종류의 균주정도를 동정하는 방법이었으나 본 발명에의해 결핵을 유발시키는 마이코박테리아의 대부분의 균주의 동정이 가능하다.
도 1은 마이코박테리아의 ITS 및 ITS의 PCR 증폭에 이용되는 프라이머의 위치에 관한 개요도, 도 2는 16S와 23S를 일부 포함하는 서열번호 3과 4의 염기서열쌍을 이용하여 마이코박테리아의 ITS를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시한 후 전기영동한 사진, 도 3는 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum)과 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae)의 ITS를 벡터에 클로닝한 후 확인한 전기영동 사진, 도 4는 마이코박테리아의 속특이적인 염기서열인 서열번호 3과 6, 서열번호 4와 5의 프라이머쌍으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 시킨 후 전기영동한 사진, 도 5는 각 균종의 종 특이적인 염기서열을 가지고 특이적인 프라이머로 각 균종의 핵산시료와 중합효소 연쇄반응을 시킨후 전기영동한 사진이다.
본 발명은 마이코박테리아의 속 공통적인 염기서열 부위와 속 특이적인 염기서열 부위를 프로브나 프라이머로 고안하여 기존의 균 배양 및 생화학적 방법에 의한 균 동정법을 대치할 수 있는 간단하고 정확도가 높은 효율적인 방법을 제공한다. 이를 위하여 동정 프로브와 프라이머는 마이코박테리아의 ITS 염기서열에서 디자인 하였는데 ITS는 흔히 표적 DNA로 사용되는 16S rRNA보다 다형성 지역이 많고 동시에 보존적인 지역이 존재하므로 유전형 감별을 위한 표적 DNA로서 높은 유용성을 갖고 있는 염기서열이다. 본 발명에서는 아직 염기서열이 밝혀지지 않은 M. fortuitum과 M. chelonae의 염기서열을 밝히고 이 두 균주의 염기서열을 이용하여 균종의 구별이 가능한 프로브와 프라이머를 디자인하고 그외 균주는 현재까지 public domain(Genbank)에 공개되어 있는 염기서열 정보를 multialignment와 blast로 분석하여 이론적으로 동일한 부위의 다형성(polymorphism)으로 감별이 가능한 부위를 선택하여 프로브와 프라이머를 고안하여 균주 특이적인 혼성화 반응과 중합효소연쇄반응으로 동정하는 방법을 취하였다.
본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 결핵균의 배양 및 genomic DNA분리
마이코박테리아를 유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)와 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 표준균주를, 대한결핵협회와 결핵병원을 통해서 임상균주를 확보하였으며 균주의 보관과 배양은 부산대학병원 임상병리과 임상미생물 전공교수의 관리하에 수행하였다. 마이코박테리아 DNA 추출은 다음과 같은 방법으로 실행하였다. 마이코박테리아를 Ogawa 배지에서 배양시킨 후 1백금이를 따서 원심분리용 튜브에 넣고 InstaGene matrix(Bio-Rad Co.)를 200㎕를 가하여 부유시킨 후 56℃에서 30분간 유지하였고 10초 동안 vortex한 후 100℃에서 8분간 열처리한다. 다시 10초간 vortex한 후 12,000rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 분리된 DNA 2㎕를 PCR 반응에 사용하였다.
실시예 2. 마이코박테리아의 ITS를 증폭시키는 프라이머 제조
마이코박테리아에 있어서 ITS부근의 염기서열의 배열은 제 1도와 같다. 따라서 ITS를 증폭시키기 위해서 마이코박테리아의 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 지역중의 일부 염기서열을 선정하여 프라이머로 제작하였다. 프라이머 디자인은 이미 공개되어 있는 마이코박테리아의 16S와 23S rRNA의 염기서열을 multialignment와 blast search로 컴퓨터 분석하여 선정하였다. 선정된 프라이머는 서열번호 3, 4의 염기서열을 가지며, 이를 사용하여 16S rRNA와 23S rRNA 일부와 함께 ITS부위가 약 500 bp 크기로 선택적으로 증폭되도록 하였다. 위의 프라이머로 증폭시킨 결과는 제2도와 같다. ITS 증폭 프라이머를 포함하여 실험에 사용한 모든 프라이머는 BioBasic(캐나다)에 의뢰하여 Perkin-Elmer DNA synthesizer로 50 nmol 농도로 제작하여 사용하였다.
실시예 3 PCR 반응 및 산물의 확인
PCR 반응물의 조성은 다음과 같다. 500 mM KCl, 100 mM Tris HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphates(dATP, dGTP , dTTP and dCTP) 1.5 mM MgCl2, 1 pmol primer, 1U Taq DNA polymerase(Bio Basic Inc.) 이 혼합액을 94℃에서 5분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 1.5% 아가로우즈 젤(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다. Genbank의 자료를 통해서 미리 예견하였던 바와 같이 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 프라이머로 증폭시킨 ITS의 크기가 약 500 bp로 나타났으나 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 아그리(M. agri), 마이코박테리움 모리카엔스(M. morikaense)와 마이코박테리움 갈리나룸(M. gallinarum)등은 다른 균주에 비하여 ITS의 크기가 50bp정도 크게 나났다. 따라서 균주의 종류에 따른 ITS의 크기는 270∼350bp 정도임을 알 수 있다.
실시예 4. M. fortuitum과 M. chelonae ITS의 클로닝(cloning)
PCR 반응의 확인이 끝난 후 ITS 염기서열이 공개되어 있지 않은 M. fortuitum과 M. chelonae의 ITS의 반응물은 PCR purification kit(QIAGEN)로 정제한 후 cloning에 사용하였다. 정제된 ITS의 PCR 산물은 pGEM-T vector(Promega Co. Madison, WI)에 cloning 하였다. Heat-shock을 이용한 유전형질 도입방법으로 숙주인 E. coli JM 109내로 유도시켜 형질전환체들을 준비한 X-gal/IPTG/Amp+/LB 한천 배지에 도말하여 37℃ 배양기에 16-18시간 배양하였다. 배양 후 흰색의 균락만을 골라내어 LB(Amp+) 액체배지에 키워 플라스미드를 분리, 정제하였다. 플라스미드 DNA는 QIAprep kit로 분리하고 제한효소로 잘라 삽입된 DNA 절편을 확인하였다(제3도).
실시예 5. DNA 서열분석
DNA는 200μmol 농도로 정량하여 반응에 사용하였다. DNA auto sequencer(Perkin Elmer, ABI prim 377 sequencer)로 universal primer M13을 사용하여 dye terminator법으로 염기서열을 결정하였다.
실시예 6. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선정과 합성
실시예 5를 통해서 확보된 M. fortuitum과 M. chelonae의 ITS지역의 염기서열과 Genbank로부터 확보된 다른 마이코박테리아 ITS 염기서열을 multialignment와 blast로 분석하여 마이코박테리아의 ITS의 보존적인 염기서열에 해당되는 것은 마이코박테리아 동정 프라이머로, 다형성이 높은 염기서열에 해당하는 것은 균주 특이 프라이머로 선정하여 디자인하였다.
디자인한 프라이머의 ITS내에서 위치 및 그 염기서열은 표 1과 같다
동정 균주 프로브 이름 ITS내 위치 서열 번호
마이코박테리아 MYC1MYC2MYC3MYC4 균종에 따라 다름 5678
TB COMPLEX MTB1MTB2MTB3MTB4MTB5MTB6MTB7MTB8MTB9 166-18565-8420-3941-6060-7981-100125-144139-158203-222 91011121314151617
M. Avium - M. intracellularae(MAC) MAC1MAC2MAC3MAC4 241-260142-16192-111117-136 18192021
M. fortuitum FOR1FOR2FOR3FOR4FOR5FOR6FOR7FOR8FOR9FOR10 41-6045-6465-8479-9890-109110-129115-134136-155158-177248-267 22232425262728293031
M. chelonae CHE1CHE2CHE3CHE4CHE5CHE6CHE7CHE8 41-6045-6459-7879-98110-129133-152172-191247-266 3233343536373839
동정균주 프로브 이름 ITS내 위치 서열번호
M. gordonae GOR1GOR2GOR3GOR4GOR5 84-103249-268216-235201-220223-242 4041424344
M. terrae TER1TER2TER3TER4TER5 178-197237-25624-4370-8989-108 4546474849
M. scrofluceum SCO1SCO2SCO3 118-137131-150210-229 505152
M. kansasii KAN1KAN2 35-50238-257 5354
M. szulgai SZU1SZU2 124-143209-228 5556
M.marinum과 M. ulcerans MAR-ULC1MAR-ULC2 85-104128-147 5758
M. gastri GAS1GAS2 85-104145-164 5960
M. xenopi XEN1 190-209 61
M. genavense GEN2 85-104 62
M. malmoense MAL1MAL2 203-22229-48 6364
M. shimoidei SHI1 89-108 65
M. habana HAB1 86-105 66
M. farcinogen FAR1FAR2 122-141111-130 6768
M. simiae SIM1SIM2SIM3 83-102129-148208-227 697071
M. sp SP1 225-244 72
실시예 7. 마이코박테리아 진단 프라이머에 의한 중합효소 반응결과
서열번호 3과 6의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍과 서열번호 4와 5의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 제작하여 PCR반응을 시킨 결과 마이코박테리아 균주에 대하여 약 350 bp와 200 bp의 크기로 증폭되었으나, 다른 장내미생물인 Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium과 Serratia marcescens은 증폭되지 않은 결과를 나타내어 위의 프로브와 프라이머로 마이코박테리아 진단이 가능함을 알 수 있다. 제4도는 실시예 7에 의한 PCR반응결과를 전기영동한 사진이다..
실시예8. TB complex와 MOTT 균주의 진단 프라이머에 의한 중합효소 반응결과
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 프로브를 프라이머로 제작하여 각 균주를 특이적으로 동정이 가능한지에 대한 실험을 PCR의 증폭여부로 확인하였다.TB complex 동정을 위해서 서열번호 3의 과 10의 염기서열을 선택, MOTT균주중 MAC의 동정을 위해서 서열번호 21과 18의 염기서열을 선택, M. fortuitum의 동정을 위해서는 서열번호 31과 23의 염기서열을 선택, M. chelonae의 동정을 위해서는 서열번호 34와 37의 염기서열을 선택, M. gordonae의 동정을 위해서는 서열번호 40과 42의 염기서열을 선택, M. terra의 동정을 위해서는 서열번호 47과46의 염기서열을 선택, M. scrofulaceum의 동정을 위해서는 서열번호 51과 52의 염기서열을 선택하여 첫번째 염기서열의 센스 스트랜드(sense strand)를 가진 프라이머와 두번째 염기서열의 안티센스 스트랜드(antisense strand)를 가진 프라이머를 제작하여 마이코박테리아의 균종과 중합반응시켜 전기영동한 결과 도 7과 같이 효소중합연쇄반응이 일어났음을 확인할 수 있어, 각각의 프라이머쌍에 의한 PCR반응으로 마이코박테리아의 각 균종이 진단가능함을 알 수 있다.
이상과 같이 본 발명에서는 마이코박테리아의 검출 및 동정을 위해 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 프라이머를 이용하여 혼성화반응 (hybridization) 및 효소중합연쇄반응을 수행하므로서 동정결과를 빨리 얻을 수 있고, 결핵감염의 여부뿐만 아니라 균의 종류까지 동시에 동정하여 TB complex와 MOTT의 구별이 가능하여 이에 대한 결과에 따라 올바른 치료 방법을 선택할 수 있으며 동시감염도 효과적으로 진단할 수 있다.

Claims (31)

  1. 서열번호 18-21의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 MAC의 특정염기서열에 혼성화하여 MAC(M. avium, M. intracellulare)를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  2. 서열번호 18-21의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와, 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 MAC(M. avium, M. intracellulare)를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  3. 서열번호 22-31의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. fortuitum의 특정염기서열에 혼성화하여 M. fortuitum를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  4. 서열번호 22-31의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. fortuitum를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  5. 서열번호 32-39의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. chelonae의 특정염기서열에 혼성화하여 M. chelonae를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  6. 서열번호 32-39의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. chelonae를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  7. 서열번호 40-44의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. gordonae의 특정염기서열에 혼성화하여 M. gordonae를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  8. 서열번호 40-44의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 이 두 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. gordonae를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  9. 서열번호 45-49의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. terrae의 특정염기서열에 혼성화하여 M. terrae를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  10. 서열번호 40-44의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와, 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. terrae를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  11. 서열번호 50-52의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. scrofluceum의 특정염기서열에 혼성화하여 M. scroflucem를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  12. 서열번호 50-52의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. scroflucem를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  13. 서열번호 53-54의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. kansasii의 특정염기서열에 혼성화하여 M. kansasii를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  14. 서열번호 53-54의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. kansasii를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  15. 서열번호 55-56의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. szulgai의 특정염기서열에 혼성화하여 M. szulgai를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  16. 서열번호 55-56의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. szulgai를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  17. 서열번호 57-58의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. marinum과 M. ulcerans의 특정염기서열에 혼성화하여 M. marinum과 M. ulcerans를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  18. 서열번호 57-58의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. marinum과 M. ulcerans를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  19. 서열번호 59-60의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. gastri의 특정염기서열에 혼성화하여 M. gastri를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  20. 서열번호 59-60의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. gastri를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  21. 서열번호 61의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. xenopi의 특정염기서열에 혼성화하여 M. xenopi를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  22. 서열번호 62의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. genavense의 특정염기서열에 혼성화하여 M. genavense를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  23. 서열번호 63-64의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. malmoense의 특정염기서열에 혼성화하여 M. malmoense를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  24. 서열번호 63-64의 염기서열 그룹 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. malmoense를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  25. 서열번호 65의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. shimoidei의 특정염기서열에 혼성화하여 M. shimoidei를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  26. 서열번호 66의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. habana의 특정염기서열에 혼성화하여 M. habana를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  27. 서열번호 67-68의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. farcinogen의 특정염기서열에 혼성화하여 M. farcinogen를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  28. 서열번호 67-68의 염기서열 그룹 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. farcinogen를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  29. 서열번호 69-71의 염기서열 그룹 중 선택된 하나의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. simiae의 특정염기서열에 혼성화하여 M. simiae를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  30. 서열번호 69-71의 염기서열 그룹 중 1쌍을 선택하여 그 중 하나의 염기서열의 센스스트랜드(sence strand)를 가진 프라이머와 나머지 염기서열의 안티센스스트랜드 (antisense strand)를 가진 또 하나의 프라이머를 사용하여 효소중합반응(PCR)을 수행하고 일정한 크기로 증폭되었는지 여부를 확인하여 MOTT균종 중 M. simiae를 진단함을 특징으로 하는 마이코박테리아 진단방법.
  31. 서열번호 72의 염기서열을 가지며, 마이코박테리아 MOTT균종 중 M. sp의 특정염기서열에 혼성화하여 M. sp를 진단함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
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