JP2003501023A

JP2003501023A - マイコバクテリア菌種同定用オリゴヌクレオティド

Info

Publication number: JP2003501023A
Application number: JP2001500749A
Authority: JP
Inventors: チョルミンキム; ヒキョンパク; ヒョンジョンザン
Original assignee: エスジェイハイテクコーポレーションリミテッド; チョルミンキム; ヒキョンパク
Priority date: 1999-05-29
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2003-01-14
Also published as: KR20010084908A; KR20010112907A; KR20010112900A; KR100343623B1; KR20010112905A; WO2000073436A1; KR20010113027A; KR100343618B1; KR100343607B1; KR100343610B1; KR20010084905A; KR100343606B1; KR100343608B1; KR100343609B1; CN1542141A; KR20010113029A; KR20010113025A; KR20010084907A; KR20010084906A; KR100343619B1

Abstract

(57)【要約】【課題】マイコバクテリア菌腫の同定及び鑑別診断に使用できるオリゴヌクレオティドプライマーまたはプローブを提供すること。【解決手段】非結核マイコバクテリアの一種であるマイコバクテリウムフォツイタム、マイコバクテリウムシェロナエ、マイコバクテリウムアブセシュス、マイコバクテリウムバッカエ、マイコバクテリウムフラヴェセンス、マイコバクテリウムアシアティカム、マイコバクテリウムポルシヌム、マイコバクテリウムアカプルセンシス及びマイコバクテリウムディエンホフェリのＩＴＳの塩基配列を明らかにし、これらＩＴＳ塩基配列を用いてマイコバクテリア属の同定が可能なオリゴヌクレオティドプライマーまたはプローブをデザインする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明はマイコバクテリア菌種の同定に使用できるオリゴヌクレオティドに係
り、さらに詳しくは非結核マイコバクテリアの一種であるマイコバクテリウム
フォツイタム（Mycobacterium fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ（
Mycobacterium chelonae）、マイコバクテリウムアブセシュス（Mycobacterium
abscessus）、マイコバクテリウムバッカエ（Mycobacterium vaccae）、マイ
コバクテリウムフラヴェセンス（Mycobacterium flavescens）、マイコバクテ
リウムアシアティカム（Mycobacterium asiaticum）、マイコバクテリウムポ
ルシヌム（Mycobacterium porcinum）、マイコバクテリウムアカプルセンシス
（Mycobacterium acapulcensis）及びマイコバクテリウムディエンホフェリ（M
ycobacterium diernhoferi）のＩＴＳ(Internal Transcribed Spacer region)の
塩基配列を明らかにし、これらＩＴＳ塩基配列を用いてマイコバクテリア属の同
定が可能なオリゴヌクレオティドプライマーまたはプローブを提供することに関
する。

【０００２】

【従来の技術】

結核は過去に比べて年々減少しているが今までも前世界的に毎年約８００万
名ほどの新たな患者が発生し、３００万名ほどの患者が死亡することと報告され
ている。さらに、開発途上国では抗結核剤の不足と不適切な治療により薬剤耐性
菌を有する慢性保菌者が増加しつつあり、先進国でも１９８０年代に入ってエイ
ズ(ＡＩＤＳ)患者の増加によって結核減少が鈍化し再び増える傾向を示している
。従って、このような趨勢ならば２０００年ごろには１２００万名の新たな患者
が発生することと予想されている(J．P．Natain、M．C．Raviglione、及びA．Ko
chi、Tubercle and Lung Disease、７３: ３１１-３２１、１９９２; Murray C
JL．及びLopez AD．The global burden of disease．Global burden of disease
and injury series．Vol．１．Cambridge、Mass: Harvard University Press、
１９９６、ｐ３４９-３５０; Global Tuberculosis Programme: Anti-tuberculo
sis drug resistance、WHO Report １９９７: World Health Organization．１
９９７)。

【０００３】１９５０年代に非結核マイコバクテリア(non-tuberculous mycobacteria、Ｎ
ＴＭ)も人間に疾病を起こす恐れがあるという事実が報告され、１９８０年以降
マイコバクテリウムアビウム複合体(M．avium complex、ＭＡＣ)がエイズ患者に
全身疾患を誘発させるということが知られてから、非結核マイコバクテリアに対
する関心が高まりつつある。非結核マイコバクテリアによる疾患は臨床的な所見
や一般の病理所見が結核に似ている。しかし、非結核マイコバクテリアは周辺の
生活環境に幅広く分布されており、臨床仮検物から分離されても病原性を判断し
難くて診断が難しいのみならず、殆んどの各種抗結核剤に薬剤耐性を示していて
治療し難く再発率も高いことと知られている。このように多様な薬剤に耐性を有
する非結核マイコバクテリア菌株が次第に増加しているが、これらによる疾病に
ついては結核菌による疾患と違う方法を使用すべきなので、これらに対する迅速
で正確な同定方法が求められている。一方、結核発病率と多剤耐性結核菌株の増
加により結核の効果的な治療及び管理のためにもＴＢ複合体とＮＴＭ菌株のさら
に迅速で正確な同定が求められている。

【０００４】マイコバクテリア感染に対する早期診断とマイコバクテリア菌種の確認のため
に色々の方法が研究及び開発されて来た。これらのうち現在利用されている同定
及び感染の診断方法は次の通りである。

【０００５】第１に、微生物学的方法である塗抹及び培養検査がある。しかし、この方法は
マイコバクテリアのように世代期間が長くて培養に長時間かかり、実験者に感染
危険が伴われる病原性微生物には適用し難い。

【０００６】第２に、重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ)法があるが
、この方法は敏感度と特異性が高くてマイコバクテリアのように分離培養に長時
間かかる病原菌の検出に極めて有用である。特に、少量のＤＮＡを増幅させ検出
するため、菌株の培養過程を経ず検体に存する少量の病原菌のみでも同定が可能
であるという長所がある。このようなＰＣＲによる検出は増幅させる標的ＤＮＡ
により色々の方法が紹介されているが、そのうち多数のコピー(copy)として存す
るＩＳ６１１０と１６ＳｒＲＮＡが主に用いられている(Bauer J、Andersen AB
、Kremer K、及びMiorner H、Usefulness of spoligotyping to discriminate I
S６１１０ low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cul
tured in Denmark、１９９９、J．Clin．Microbiol．３７: ２６０２-２６０６;
Troesch、A．、H．Nguyen、C．G．Miyada、S．Desvarenne、T．R．Gingeras、P
．M．Kaplan、P．Cros及びC．Mabilat．１９９９、Microbacterium species ide
ntification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe
arrays、J．Clin．Microbiol．３７: ４９-５５)。

【０００７】第３は、マイコバクテリア菌体成分の物理化学的分析方法であって、マイコバ
クテリアの菌体成分のうち脂肪化合物をＨＰＬＣまたはＧＣ及び質量分析機器を
用いて検出する方法である。この方法は特異度は高いものの、高価な装備を必要
とする短所がある。

【０００８】第４は、血清学的方法による菌体成分の検出方法であって、菌抗原に対する抗
体を吸着させた血球やラテックス(latex)粒子を用いた凝集反応と酵素を抗体に
結合させた酵素結合免疫分析法などが用いられている。しかし、この技法は極め
て精巧で繊細な注意を要するため限定された検査室でのみ可能であり、現在の感
染とそれ以前の感染とを区別し難い短所がある。

【０００９】第５に、マイコバクテリアファージＬ５にルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子
を挿入しマイコバクテリアに感染させた後、培地内に添加されたルシフェリン(l
uciferin)で発光有無を調べてマイコバクテリアを検索できる方法がある(W．R．
Jacobs、R．G．Barletta、R．Udani、J．Chan、G．Kalkut、G．Sosne、T．Kiese
r、G．J．Sarkis、G．F．Hatful、及びB．R．Bloom．１９９３、Science ２６０
: ８１９-８２２)。

【００１０】第６に、オリゴヌクレオティドプローブのハイブリダイゼーション(hybridiza
tion)による同定方法がある(A．Troesch、H．Nguyen、C．G．Miyada、S．Desvar
enne、T．R．Gingeras、P．M．Kaplan、P．Cros及びC．Mabilat．１９９９．J．
Clin．Microbiol．３７: ４９-５５)。

【００１１】一方、人体に疾病を誘発する非結核マイコバクテリアとしては、前述したマイ
コバクテリウムアビウム複合体(ＭＡＣ)以外も、マイコバクテリウムフォツイ
タム（M．fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ複合体（M．chelonae c
omplex）、マイコバクテリウムテラエ（M．terrae）及びマイコバクテリウム
バッカエ（M．vaccae）などが知られている。このうち、マイコバクテリウムシ
ェロナエ複合体（M．chelonae complex）はマイコバクテリウムシェロナエ（M
．chelonae）とマイコバクテリウムアブセシュス（M．abscessus）とに分類され
、現在、この二つの菌株を区別できる方法は知られていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】

本発明は、前述したような従来のマイコバクテリア同定及び感染診断方法の
問題点を解決するために、マイコバクテリア菌株であるか否かを判別し、ＴＢ複
合体とＮＴＭを識別し、マイコバクテリア属(genus)の種(species)を、正確及び
効率よく同定するのに使用されるＰＣＲ用プライマーまたは同定用プローブを提
供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】

前述した目的を達成するため、本発明では配列番号１ないし配列番号９に記載
されたマイコバクテリウムフォツイタム（Mycobacterium fortuitum）、マイコ
バクテリウムシェロナエ（Mycobacterium chelonae）、マイコバクテリウム
アブセシュス（Mycobacterium abscessus）、マイコバクテリウムバッカエ（M
ycobacterium vaccae）、マイコバクテリウムフラヴェセンス（Mycobacterium
flavescens）、マイコバクテリウムアシアティカム（Mycobacterium asiatic
um）、マイコバクテリウムポルシヌム（Mycobacterium porcinum）、マイコバ
クテリウムアカプルセンシス（Mycobacterium acapulcensis）及びマイコバク
テリウムディエンホフェリ（Mycobacterium diernhoferi）遺伝子のＩＴＳ（In
ternal Transcribed Spacer region）のＤＮＡを提供する。

【００１４】また本発明ではＰＣＲ用プライマーまたはハイブリダイゼーション用プローブ
として、配列番号１０〜１４のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリア同定に
使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１５〜２３のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリアのうち
ＴＢ複合体(TB complex)と非結核マイコバクテリアの区別に使用されるオリゴヌ
クレオティド; 配列番号２４〜２７のうち一つの塩基配列を有する、ＭＡＣ(マイコバクテリ
ウムアビウム（Mycobacterium avium）及びマイコバクテリウムイントラセル
ラレ（Mycobacterium intracellulare）)同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号２８〜３８のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムフ
ォツイタム（Mycobacterium fortuitum）同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号３９〜４６のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムシ
ェロナエ（Mycobacterium chelonae）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号４７〜５２のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムア
ブセシュス（Mycobacterium abscessus）同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号５３〜６４のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムバ
ッカエ（Mycobacterium vaccae）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号６５〜７２のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムフ
ラヴェセンス（Mycobacterium flavescens）同定に使用されるオリゴヌクレオテ
ィド; 配列番号７３〜７７のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウムゴ
ドナエ（Mycobacterium gordonae）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号７８〜１００のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
テラエ（Mycobacterium terrae）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１０１〜１０８のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）同定に使用されるオリゴヌ
クレオティド; 配列番号１０９〜１１２のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
カンサシイ（Mycobacterium kansasii）同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号１１３〜１１６のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
シュルガイ（Mycobacterium szulgai）同定に使用されるオリゴヌクレオティド
; 配列番号１１７〜１１９のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
マリヌム（Mycobacterium marinum）及びマイコバクテリウムウルセランス（
Mycobacterium ulcerans）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１２０〜１２３のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ガストリ（Mycobacterium gastri）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１２４〜１３３のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
キセノピ（Mycobacterium xenopi）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１３４〜１４１のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ゲナヴェンス（Mycobacterium genavense）同定に使用されるオリゴヌクレオテ
ィド; 配列番号１４２〜１４６のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
マルモエンス（Mycobacterium malmoense）同定に使用されるオリゴヌクレオテ
ィド; 配列番号１４７〜１５３のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
シミアエ（Mycobacterium simiae）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１５４〜１６５のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）同定に使用されるオリゴヌクレ
オティド; 配列番号１６６〜１７２のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
シモイデイ（Mycobacterium shimoidei）同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号１７３〜１８０のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ハバナ（Mycobacterium habana）同定に使用されるオリゴヌクレオティド; 配列番号１８１〜１８９のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ファーシノゲン（Mycobacterium farcinogen）同定に使用されるオリゴヌクレ
オティド; 配列番号１９０〜１９３のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
アシアティカム（Mycobacterium asiaticum）同定に使用されるオリゴヌクレオ
ティド; 配列番号１９４〜２０５のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ポルシヌム（Mycobacterium porcinum）同定に使用されるオリゴヌクレオティ
ド; 配列番号２０６〜２１５のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
アカプルセンシス（Mycobacterium acapulcensis）同定に使用されるオリゴヌ
クレオティド; 配列番号２１６〜２２７のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
ディエンホフェリ（Mycobacterium diernhoferi）同定に使用されるオリゴヌク
レオティド; 配列番号２２８〜２４０のうち一つの塩基配列を有する、マイコバクテリウム
パラチューバークロシス（Mycobacterium paratuberculosis）同定に使用され
るオリゴヌクレオティド、配列番号２４１の塩基配列を有する、マイコバクテリア属(Mycobacteria sp)
同定に使用されるオリゴヌクレオティドを提供する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、更に詳細に説明する。

【００１６】従来のＰＣＲ方法による同定法では目的とする一種または二種の菌株だけ同定
できたが、本発明ではほぼ全ての人体感染性マイコバクテリア菌株の同定が同時
に可能なようにするためマイコバクテリアのＩＴＳ塩基配列からプライマー及び
プローブをデザインした。ＩＴＳは標的ＤＮＡとして使用される１６ＳｒＲＮ
Ａより多形サイトが多く、かつ、保存領域を存し、遺伝型鑑別のための標的ＤＮ
Ａとして高い有用性を有する(Gurtler、V．、及びV．A．Stanisich、１９９６、
New approaches to typing and identification of bacteria using the １６Ｓ
-２３Ｓ rDNA spacer region．Microbiol．１４２: ３-１６)。

【００１７】本発明者は、非結核マイコバクテリアのうち今だ塩基配列が明らかになってい
ない、例えば、マイコバクテリウムフォツイタム（Mycobacterium fortuitum
）、マイコバクテリウムシェロナエ（Mycobacterium chelonae）、マイコバク
テリウムアブセシュス（Mycobacterium abscessus）、マイコバクテリウムバ
ッカエ（Mycobacterium vaccae）、マイコバクテリウムフラヴェセンス（Mycob
acterium flavescens）、マイコバクテリウムアシアティカム（Mycobacterium
asiaticum）、マイコバクテリウムポルシヌム（Mycobacterium porcinum）、マ
イコバクテリウムアカプルセンシス（Mycobacterium acapulcensis）及びマイ
コバクテリウムディエンホフェリ（Mycobacterium diernhoferi）遺伝子のＩ
ＴＳ塩基配列を明らかにした。これらのＤＮＡ配列を用いて、マイコバクテリア
の同定のためのプローブ又はプライマー用のオリゴヌクレオチドをデザインした
。更に、GenBankに公開されている他のマイコバクテリアの塩基配列情報を参照
し、マルチアラインメント(multi-alignment)とブラスト(blast)で分析して、マ
イコバクテリア同定のためのプローブまたはプライマー用のオリゴヌクレオチド
をデザインするために、多形(polymorphism)の独特の領域を選定した。オリゴヌ
クレオチドは、ＰＣＲ反応の属特異的及び種特異的プライマーで特異的なハイブ
リダイゼーション（hybridization）及び増幅を行って、マイコバクテリアの同
定が可能なことを確認した。

【００１８】すなわち、本発明のオリゴヌクレオティドプローブ(oligonucleotide probe)
は固形支持体に付着され、マイコバクテリアのＩＴＳに存する特異核酸配列にの
みハイブリダイゼーションし、それゆえ、特定のマイコバクテリアの菌種を敏感
に探知または同定することができる。また、上記プローブと同じ塩基配列のプラ
イマーもまたＰＣＲの増幅によって、特定のマイコバクテリアを同定することが
できる。これらマイコバクテリアＩＴＳ塩基配列から作製された本発明のプロー
ブまたはプライマーを用いれば、マイコバクテリアであるかを同定し、ＴＢ複合
体であるかＮＴＭであるかを区別し、マイコバクテリアの種（spicies）を迅速
かつ正確に区別することができる。

【００１９】

【実施例】

本発明の好ましい実施例を、添付した図を参照しながら、より具体的に説明す
る。但し、これらの実施例は、現時点で、最も実用的で好ましいと考えられる態
様を示したにすぎず、本発明の範囲は、これら実施例に限定されるわけではなく
、請求の範囲に記載された発明の趣旨の範囲内での様々な変更や均等物が包含さ
れる。

【００２０】実施例１マイコバクテリアの培養及びゲノムＤＮＡ分離マイコバクテリア標準菌株は、ＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultur
e、遺伝子銀行)とＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から、臨床菌株
は大韓結核協会、馬山結核病院及び釜山大学病院を通して入手したし、菌株の保
管及び培養は釜山大学病院臨床病理課臨床微生物専攻教授の管理下に行った。本
発明において使用されたマイコバクテリアと一般病原性細菌の種類は表８に示さ
れている。

【００２１】マイコバクテリアにおいてＤＮＡの抽出は次のような方法で施した:マイコバ
クテリアをオガワ(Ogawa)培地で培養した後ループを使用して一つのコロニーを
採取して遠心分離管に入れＤＮＡ簡易抽出剤(InstaGene matrix、Bio-Rad Co．)
２００μｌを加えて浮遊させた後５６℃で３０分間維持し、１０分間撹拌(vorte
x)した後１００℃で８分間熱処理した。再び１０分間撹拌した後１２、０００ｒ
ｐｍで３分間遠心分離して上澄液を新たなチューブに移して-２０℃で保管した
。分離された各菌種のＤＮＡ２μｌを次のＰＣＲ反応に使用した。

【００２２】実施例２マイコバクテリアのＩＴＳ増幅用プライマーの作製マイコバクテリアのＩＴＳ及びＩＴＳのＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの
位置は図１に示した通りである。マイコバクテリアのＩＴＳを増幅させるための
プライマーはマイコバクテリアの１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡの保存的な
地域のうち一部塩基配列を選定して作製した。すなわち、公知のマイコバクテリ
アの１６Ｓと２３ＳｒＲＮＡの塩基配列をマルチアラインメント(multialignme
nt)とブラスト検索(blast search)でコンピュータ分析してプライマーをデザイ
ンしたが、選定されたプライマーは１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ一部と
共にＩＴＳ部位が約５００ｂｐサイズに選択的に増幅されるよう創案されたもの
で、配列番号２４２(ＩＴＳＦ)及び２４３(ＩＴＳＲ)の塩基配列を有する。ＩＴ
Ｓ増幅プライマーを含んで実験に使用した全てのプライマーはバイオベーシック
(BioBasic、カナダ)に依頼してPerkin-Elmer-ＤＮＡ合成器(Perkin-Elmer ＤＮ
Ａ synthesizer)で５０ｎｍｏｌ濃度に作製して使用した。

【００２３】実施例３ＰＣＲ反応及び産物の確認実施例１において得た各菌種のＤＮＡ２μｌずつをＰＣＲ反応に使用した。
反応物の組成は次の通りである:５００ mM KCl、１００ mM Tris HCl(pH９．０)
、１% Triton X-１００、０．２ mM dNTP(dATP、dGTP、dTTP及びdCTP)、１．５
mMMgCl₂、１pmolプライマー、１U Taq ＤＮＡポリマラーゼ(Bio Basic Inc．)。
この混合液を９４℃で５分間反応させ十分変成させた後９４℃で１分間変性（de
naturation）、６０℃で１分間アニーリング（annealing）、７２℃で１分間延
長（elongation）という工程で３０回反応させた。試料は、延長（elongation）
を完全にするために、更に、７２℃で１０分間インキュベートした。反応が終わ
った後１．５％アガロスゲル(agarose gel)に電気泳動してＰＣＲ産物を確認し
た。GenBankの資料を通して予見した通り、１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡ
の保存的なプライマーで増幅させたＩＴＳのサイズは約５００ｂｐに現れた。

【００２４】図２はマイコバクテリアの１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡの一部を含む
ＩＴＳ増幅用プライマーペアを用いて多種のマイコバクテリア菌株についてＰＣ
Ｒを施した後電気泳動した写真である。ここでＭは分子量標識で１００ｂｐ間隔
を有しており、Ｃは対照群（control group）、レーン(lane)１はマイコバクテ
リウムフォツイタム（M．fortuitum）、レーン２はマイコバクテリウムシェ
ロナエ（M．chelonae）、レーン３はマイコバクテリウムイントラセルラレ（M．
intracellularae）、レーン４はマイコバクテリウムアビウム（M．avium）、レ
ーン５はマイコバクテリウムチュバークロシス（M．tuberculosis）、レーン
６はマイコバクテリウムアグリ（M．agri）、レーン７はマイコバクテリウム
カンサシイ（M．kansasii）、レーン８はマイコバクテリウムゴドナエ（M．gor
donae）、そしてレーン９はマイコバクテリウムチューバークロシス（M． tube
rculosis） H３７Rvを示すもので、対照群であるＣを除けばレーン１〜９のマイ
コバクテリアではＩＴＳ増幅が起こったことが分かる。

【００２５】実施例４マイコバクテリアＩＴＳのＤＮＡ配列分析ＰＣＲ反応の確認が終わった後、ＩＴＳ塩基配列が公開されていないマイコバ
クテリウムフォツイタム（M．fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ
（M．chelonae）、マイコバクテリウムアブセシュス（M．abscessus）、マイコ
バクテリウムバッカエ（M．vaccae）、マイコバクテリウムフラヴェセンス（
M．flavescens）、マイコバクテリウムアシアティカム（M．asiaticum）、マイ
コバクテリウムポルシヌム（M．porcinum）、マイコバクテリウムアカプル
センシス（M．acapulcensis）及びマイコバクテリウムディエンホフェリ（M．
diernhoferi）の反応物をＰＣＲで増幅させた後ＰＣＲ反応物そのままＤＮＡ配
列分析に使用した。

【００２６】ＤＮＡは２００μｍｏｌ濃度に定量して反応に使用した。ＤＮＡ自動配列分析
器(auto sequencer、Perkin-Elmer、ABI prim ３７７ sequencer)で万能プライ
マー(universal primer)Ｍ１３を使用いてダイターミネータ(dye terminator)法
で塩基配列を決定した。

【００２７】配列番号１ないし９はそれぞれマイコバクテリウムフォツイタム（Mycobact
erium fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ（Mycobacterium chelona
e）、マイコバクテリウムアブセシュス（Mycobacterium abscessus）、マイコ
バクテリウムバッカエ（Mycobacterium vaccae）、マイコバクテリウムフラ
ヴェセンス（Mycobacterium flavescens）、マイコバクテリウムアシアティカ
ム（Mycobacterium asiaticum）、マイコバクテリウムポルシヌム（Mycobacte
rium porcinum）、マイコバクテリウムアカプルセンシス（Mycobacterium acap
ulcensis）及びマイコバクテリウムディエンホフェリ（Mycobacterium diernho
feri）のＩＴＳ塩基配列を示す。

【００２８】実施例５オリゴヌクレオティドプライマーのデザインと合成実施例４で得られたマイコバクテリウムフォツイタム（M．fortuitum）、マ
イコバクテリウムシェロナエ（M．chelonae）、マイコバクテリウムアブセ
シュス（M．abscessus）、マイコバクテリウムバッカエ（M．vaccae）、マイ
コバクテリウムフラヴェセンス（M．flavescens）、マイコバクテリウムアシ
アティカム（M．asiaticum）、マイコバクテリウムポルシヌム（M．porcinum
）、マイコバクテリウムアカプルセンシス（M．acapulcensis）及びマイコバク
テリウムディエンホフェリ（M．diernhoferi）のＩＴＳ塩基配列のうちそれぞ
れ２０ｂｐサイズのプライマーをデザインした後、GenBankから確保された他の
マイコバクテリアのＩＴＳ塩基配列をマルチアラインメント(multi-alignment)
とブラスト(blast)で分析して比較した。

【００２９】結果に基づき、マイコバクテリアＩＴＳの保存的な塩基配列に該当するものは
マイコバクテリア同定用プライマーまたはプローブとして、多形性の高い塩基配
列部分に該当するものは菌株特異的プライマーまたはプローブとしてデザインし
た。デザインしたプライマーまたはプローブのＩＴＳ内における位置及びその配
列番号は表１ないし７の通りである。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【表２】

【００３２】

【表３】

【００３３】

【表４】

【００３４】

【表５】

【００３５】

【表６】

【００３６】

【表７】

【００３７】実施例６マイコバクテリア同定用プライマーを使用したＰＣＲの結果マイコバクテリアに存する保存的な塩基配列からデザインされた、属特異的な
プライマー(genus-specific primer)はマイコバクテリア同定用のに使用した。
約２７０-３５０ｂｐサイズのＩＴＳ塩基配列から製作されたプライマーのうち
ＩＴＳＦ(配列番号２４２)とＭＹＣ２(配列番号１１)のプライマーペアはＰＣＲ
の進行に使用した。その結果、マイコバクテリア菌株について、約３５０ｂｐの
増幅されたヌクレオチドが取得されたが、他の病原性細菌である黄色ブドウ球菌
(Staphylococcus aureus)、エンテロコッカスヘシュウム(Enterococcus faecium
)、そしてセラチアマルセセンス(Serratia marcescens)などでは増幅されなかっ
た。従って、これらプライマーがマイコバクテリア同定用として使用可能なこと
が分かる。

【００３８】図３はマイコバクテリアであるかを確認するプライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹ
Ｃ２)を用いて多種のマイコバクテリア菌株についてＰＣＲを施した後電気泳動
した写真である。ここで、Ｍは分子量標識で１００ｂｐ間隔を有しており、Ｃは
ネガティブ対照群（negative control）、レーン１はマイコバクテリウムアブ
セシュス（M．abscessus） ATCC １９９７７、レーン２はマイコバクテリウム
アグリ（M．agri） ATCC ２７４０６、レーン３はマイコバクテリウムアシア
ティカム（M．asiaticum） ATCC ２５２７６、レーン４はマイコバクテリウム
アウストラフリカヌム（M．austroafricanum） ATCC ３３４６４、レーン５はマ
イコバクテリウムアビウム（M．avium） ATCC ２５２９１、レーン６はマイコ
バクテリウムボビス（M．bovis） ATCC １９２１０、レーン７はマイコバクテ
リウムシェロナエ（M．chelonae）ATCC ３５７５２、レーン８はマイコバクテ
リウムフラヴェセンス（M．flavescens）ATCC １４４７４、レーン９はマイコ
バクテリウムフォツイタム（M．fortuitum） ATCC ６８４１、レーン１０は
マイコバクテリウムゴドナエ（M．gordonae） ATCC １４４７０、レーン１１は
マイコバクテリウムイントラセルラエ（M．intracellularae） ATCC １３９５
０、レーン１２はマイコバクテリウムカンサシイ（M．kansasii） ATCC １２
４７８、レーン１３はマイコバクテリウムフェレイ（M．phlei） ATCC ３５４
、レーン１４はマイコバクテリウムスクロファセウム（M．scrofulaceum） AT
CC １９９８１、レーン１５はマイコバクテリウムスメグマティス（M．smegma
tis） ATCC ２１７０１、レーン１６はマイコバクテリウムシュルガイ（M．sz
ulgai） ATCC ３５７９９、レーン１７はマイコバクテリウムテラエ（M．terr
ae） ATCC １５７５５、レーン１８はマイコバクテリウムトリヴィアエ（M．t
riviale） ATCC ２３２９２、レーン１９はマイコバクテリウムチュバークロ
シス（M．tuberculosis） H３７Rv、そしてレーン２０はマイコバクテリウム
バッカエ（M．vaccae）ATCC １５４８３を示したもので、対照群であるＣを除き
レーン１〜２０のマイコバクテリア全てにおいてＩＴＳ増幅を確認することがで
きる。

【００３９】表８はマイコバクテリアであるかを確認するプライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹ
Ｃ２)を使用したＰＣＲの結果を示す。この表で、＋は増幅が起こったことを示
し、−は増幅が起こらなかったことを示す。マイコバクテリア以外の菌株では増
幅が起こらなかったことが分かる。

【００４０】

【表８】

【００４１】実施例７ＴＢ複合体用プライマーを使用したＰＣＲの結果先の実施例で製造したオリゴヌクレオティドを使用して各菌株特異的な同定が
可能なのかに対する実験をＰＣＲにおける増幅で確認した。先ず、ＴＢ複合体(T
B complex)同定のために、マイコバクテリアであるかを確認するプライマーペア
(ＩＴＳＦとＭＹＣ２)とＴＢ複合体を同定するプライマーペア(ＭＴＢ２とＭＹ
Ｃ２; 配列番号１６と１１)でマルチプレクスＰＣＲ(multiplex ＰＣＲ)を実施
した。図４はこのようにマイコバクテリアであるかを確認し、かつ同時にマイコ
バクテリアの中からＴＢ複合体(complex)であるか非結核マイコバクテリア(ＮＴ
Ｍ)であるかを同定するマルチプレクスＰＣＲを説明する概要図である。

【００４２】図５はマイコバクテリアであるかを確認するプライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹ
Ｃ２)とマイコバクテリアのうちＴＢ複合体(complex)同定用プライマーペア(Ｍ
ＴＢ２とＭＹＣ２)でマルチプレクスＰＣＲを施した後電気泳動した写真である
。ここで、Ｍは分子量標識で１００ｂｐ間隔を有しており、Ｃはネガティブ対照
群、レーン１と２はＴＢ複合体であるマイコバクテリウムチュバークロシス（
M．tuberculosis）H３７Rvとマイコバクテリウムボビス（M．bovis）を示し、
レーン３〜１０はそれぞれマイコバクテリウムアビウム（M．avium）、マイコ
バクテリウムイントラセルラエ（M．intracellularae）、マイコバクテリウム
フォツイタム（M．fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ（M．chelo
nae）、マイコバクテリウムゴドナエ（M．gordonae）、マイコバクテリウム
シュルガイ（M．szulgai）、マイコバクテリウムテラエ（M．terrae）及びマ
イコバクテリウムスクロフラセウム（M．scrofulaceum） ATCC １９９８１を
示す。ＴＢ複合体であるレーン１と２ではマイコバクテリア確認用プライマーと
ＴＢ複合体用プライマーにより２つのバンドが形成され、二重増幅が起こること
が分かり、ＮＴＭ菌種の残りのレーンでは、一つのバンドのみ形成され、単一増
幅が起こったことが確認できた。

【００４３】実施例８ＮＴＭ菌種同定用プライマーを使用したＰＣＲの結果非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)の各菌種(species)を同定するために各菌株
の多形サイト(polymorphic site)の塩基配列から作製された種特異的なプライマ
ー(species-specific primer)を持ってＰＣＲ反応を実施した。

【００４４】すなわち、マイコバクテリウムチュバークロシス（M．tuberculosis） H３
７Rvとマイコバクテリウムボビス（M．bovis）に特異的な配列番号１６と２１
、マイコバクテリウムアビウム（M．avium）及びマイコバクテリウムイントラ
セルラエ（M．intracellularae）に特異的な配列２４と２７、マイコバクテリウ
ムフォツイタム（M．fortuitum）に特異的な配列２９と３７、マイコバクテリ
ウムシェロナエ（M．chelonae）に特異的な配列４１と４４、マイコバクテリ
ウムアブセシュス（M．abscessus）に特異的な配列４８と４９、マイコバクテ
リウムバッカエ（M．vaccae）に特異的な配列５５と６３、マイコバクテリウム
フラヴェセンス（M．flavescens）に特異的な配列６６と７２、マイコバクテリ
ウムゴドナエ（M．gordonae）に特異的な配列７３と７５、マイコバクテリウム
テラエ（M．terrae）に特異的な配列８８と９６、マイコバクテリウムスク
ロフラセウム（M．scrofulaceum）に特異的な配列１０２と１０３、マイコバク
テリウムカンサシイ（M．kansasii）に特異的な配列１０９と１１０、マイコ
バクテリウムシュルガイ（M．szulgai）に特異的な配列１１３と１１４、マイ
コバクテリウムマリヌム（M．marinum）及びマイコバクテリウムウルセラン
ス（M．ulcerans）に特異的な配列１１７と１１９、マイコバクテリウムガスト
リ（M．gastri）に特異的な配列１２０と１２３、マイコバクテリウムキセノ
ピ（M．xenopi）に特異的な配列１２８と１３２、マイコバクテリウムジェナ
ベンス（M．genavense）に特異的な配列１３５と１４１、マイコバクテリウム
マルモエンス（M．malmoense）に特異的な配列１４３と１４５、マイコバクテリ
ウムシミアエ（M．simiae）に特異的な配列１４７と１４９、そしてマイコバ
クテリウムスメグマティス（M．smegmatis）に特異的な配列１５４と１５９の
塩基配列をそれぞれ選択して、一番目塩基配列のセンスストランド(sense stran
d)を有するプライマーと二番目塩基配列のアンチセンスストランド(antisense s
trand)を有するプライマーペアで各マイコバクテリアの菌種とＰＣＲ反応させた
後電気泳動して結果を確かめた。

【００４５】図６は非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)各菌株の多形サイトの塩基配列から作
製された種特異的なプライマーペアを用いてそれぞれのマイコバクテリア菌株に
ついてＰＣＲを施した後電気泳動した写真である。ここで、Ｍは分子量標識で１
００ｂｐ間隔を有しており、Ｃはネガティブ対照群（negative control）、レー
ン１と２はＴＢ複合体であるマイコバクテリウムチュバークロシス（M．tuber
culosis） H３７Rvとマイコバクテリウムボビス（M．bovis） ATCC １９２１０
、レーン３と４はマイコバクテリウムアビウム（M．avium） ATCC ２５２９１
とマイコバクテリウムイントラセルラエ（M．intracellularae）ATCC １３９
５０、レーン５はマイコバクテリウムフォツイタム（M．fortuitum） ATCC ６
８４１、レーン６はマイコバクテリウムシェロナエ（M．chelonae） ATCC ３５
７５２、レーン７はマイコバクテリウムアブセシュス（M．abscessus） ATCC
１９９７７、レーン８はマイコバクテリウムバッカエ（M．vaccae） ATCC １
５４８３、レーン９はマイコバクテリウムフラヴェセンス（M．flavescens） A
TCC １４４７４、レーン１０はマイコバクテリウムゴドナエ（M．gordonae） A
TCC １４４７０、レーン１１はマイコバクテリウムテラエ（M．terrae） ATCC
１５７５５、レーン１２はマイコバクテリウムスクロファセウム（M．scroful
aceum） ATCC １９９８１、レーン１３はマイコバクテリウムカンサシイ（M．
kansasii） ATCC １２４７８、レーン１４はマイコバクテリウムシュルガイ（
M．szulgai） ATCC ３５７９９、レーン１５はマイコバクテリウムマリヌム（M
．marinum） ATCC ９２７、レーン１６はマイコバクテリウムウルセランス（M
．ulcerans） ATCC １９４２３、レーン１７はマイコバクテリウムガストリ（
M．gastri） ATCC １５７５４、レーン１８はマイコバクテリウムキセノピ（M
．xenopi） ATCC １９２５０、レーン１９はマイコバクテリウムジェナベンス
（M．genavense） ATCC １２３３、レーン２０はマイコバクテリウムマルモエ
ンス（M．malmoense） ATCC ２９５７１、レーン２１はマイコバクテリウムシ
ミアエ（M．simiae） ATCC ２５２７５、レーン２２はマイコバクテリウムス
メグマティス（M．smegmatis） ATCC ２１７０１に、レーン１〜２２の各マイコ
バクテリア菌株が種特異的に増幅されたことが分かる。

【００４６】また、図７は非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)各菌株の多形サイトの塩基配列
から作製された種特異的なプライマーペアを用いて多種のマイコバクテリア菌株
についてＰＣＲを施した後電気泳動した写真である。ここで、ＴＢ複合体(compl
ex)に特異的な第１段のプライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹＣ２)ではレーン１と２
のマイコバクテリウムチュバークロシス（M．tuberculosis） H３７Rvとマイ
コバクテリウムボビス（M．bovis）が増幅され、マイコバクテリウムアビウム
(M．avium)とマイコバクテリウムイントラセルラエ（M．intracellularae）に
特異的な第２段のプライマーペア(ＭＡＣ１とＭＡＣ４)ではレーン３と４のマイ
コバクテリウムアビウム(M．avium)とマイコバクテリウムイントラセルラエ（
M．intracellularae）が増幅され、マイコバクテリウムフォツイタム（M．for
tuitum）に特異的な第３段のプライマーペア(ＦＯＲ２とＦＯＲ１０)ではレーン
５のマイコバクテリウムフォツイタム（M．fortuitum）が増幅され、マイコバ
クテリウムシェロナエ（M．chelonae）に特異的な第４段のプライマーペア(Ｃ
ＨＥ３とＣＨＥ６)ではレーン６のマイコバクテリウムシェロナエ（M．chelon
ae）が増幅され、マイコバクテリウムゴドナエ（M．gordonae）に特異的な第
５段のプライマーペア(ＧＯＲ１とＧＯＲ２)ではレーン７のマイコバクテリウム
ゴドナエ（M．gordonae）が増幅され、マイコバクテリウムシュルガイ（M．
szulgai）に特異的な第６段のプライマーペア(ＳＺＵ１とＳＺＵ２)ではレーン
８のマイコバクテリウムシュルガイ（M．szulgai）が増幅され、そしてマイコ
バクテリウムスクロフラセウム（M．scrofulaceum）に特異的な第７段のプラ
イマーペア(ＳＣＯ１とＳＣＯ２)ではレーン１０のマイコバクテリウムスクロ
フラセウム（M．scrofulaceum）のみが増幅され他の菌種では増幅が起こらない
ことが分かる。レーン９はマイコバクテリウムテラエ（M．terrae）に、これら
種特異的なプライマーペアいずれにも増幅が起らなかった。

【００４７】従って、それぞれの種特異的なプライマーペアによるＰＣＲ反応でマイコバク
テリアの各菌種を特異的に同定できることが分かる。

【００４８】

【発明の効果】

以上述べた通り、非結核マイコバクテリアの一種であるマイコバクテリウム
フォツイタム（Mycobacterium fortuitum）、マイコバクテリウムシェロナエ（
Mycobacterium chelonae）、マイコバクテリウムアブセシュス（Mycobacterium
abscessus）、マイコバクテリウムバッカエ（Mycobacterium vaccae）、マイ
コバクテリウムフラヴェセンス（Mycobacterium flavescens）、マイコバクテ
リウムアシアティカム（Mycobacterium asiaticum）、マイコバクテリウム
ポルシヌム（Mycobacterium porcinum）、マイコバクテリウムアカプルセンシ
ス（Mycobacterium acapulcensis）、及びマイコバクテリウムディエンホフェ
リ（Mycobacterium diernhoferi）のＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer reg
ion）の塩基配列を分析し、これを用いてマイコバクテリア属の同定及びそれぞ
れのマイコバクテリウム菌種の同定が可能なオリゴヌクレオティドプローブまた
はプライマーをデザインすることができる。このように得られたＰＣＲ用プライ
マーまたはハイブリダイゼーション反応用プローブによれば、これら菌種の同定
結果を迅速で効果的に得られ、ＴＢ複合体とＮＴＭ菌種の区別が可能なのでその
結果により適した治療方法を選択でき、同時感染も効率よく診断できる。

【００４９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】マイコバクテリアＩＴＳ及びＩＴＳの重合酵素連鎖反応(ＰＣＲ)増幅に用いら
れるプライマーに関する概要図。

【図２】マイコバクテリアの１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ一部を含むＩＴＳ増
幅用プライマーペアを用いて多種のマイコバクテリア菌株についてＰＣＲを施し
た後電気泳動した写真。

【図３】マイコバクテリアであるかを確認するプライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹＣ２)を
用いて多種のマイコバクテリア菌株についてＰＣＲを施した後電気泳動した写真
。

【図４】マイコバクテリアであるかを確認し、かつマイコバクテリアのうちＴＢ複合体
(complex)であるか非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)であるかを同定するマルチ
プレクスＰＣＲ(multiplex ＰＣＲ)を説明する概要図。

【図５】マイコバクテリア確認用プライマーペア(ＩＴＳＦとＭＹＣ２)とマイコバクテ
リアのうちＴＢ複合体(complex)同定用プライマーペア(ＭＴＢ２とＭＹＣ２)で
マルチプレクスＰＣＲ(multiplex ＰＣＲ)を施した後電気泳動した写真。

【図６】非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)各菌株の多形サイトの塩基配列から作製され
た種特異的なプライマーペアを用いてそれぞれのマイコバクテリア菌株について
ＰＣＲを施した後電気泳動した写真。

【図７】非結核マイコバクテリア(ＮＴＭ)各菌株の多形サイトの塩基配列から作製され
た種特異的なプライマーペアを用いて多種のマイコバクテリア菌株についてＰＣ
Ｒを施した後電気泳動した写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号１９９９／１９６３３ (32)優先日平成11年５月29日(1999．5．29) (33)優先権主張国韓国（ＫＲ） (31)優先権主張番号１９９９／１９６３４ (32)優先日平成11年５月29日(1999．5．29) (33)優先権主張国韓国（ＫＲ） (31)優先権主張番号１９９９／１９６３５ (32)優先日平成11年５月29日(1999．5．29) (33)優先権主張国韓国（ＫＲ） (31)優先権主張番号２０００／１８１８９ (32)優先日平成12年４月７日(2000．4．7) (33)優先権主張国韓国（ＫＲ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人Ｒｏｏｍ 1202，ＳａＨａｋＹｅｏｎＧｕｍＢ／Ｄ， 849−２，Ｂｅｏｍｃｈｅｏｎ−１ｄｏｎｇ，Ｐｕｓａｎｊｉｎ −ｋｕ，ＰｕｓａｎＭｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ 614−020，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ (71)出願人キムチョルミンＫＩＭ，ＣｈｅｏｌＭｉｎ大韓民国 613−012 プサンメトロポリタンスヨン−クナムチョン−２ドング 148 サミクビチアパート＃211− 811 ＃211−811，Ｓａｍｉｃｋ−ｂｅａｃｈＡｐｔ．，148，Ｎａｍｃｈｅｏｎ− ２ｄｏｎｇ，Ｓｏｏｙｏｕｎｇ−ｋｕ，ＰｕｓａｎＭｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ 613−012，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ (71)出願人パクヒキョンＰＡＲＫ，ＨｅｅＫｙｕｎｇ大韓民国 136−022 ソウルソンブク− クソンブク−２ドング 60−１ 60−１，Ｓｕｎｇｂｕｋ−２ｄｏｎｇ，Ｓｕｎｇｂｕｋ−ｋｕ，Ｓｅｏｕｌ 136−022，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ (72)発明者キムチョルミン大韓民国 613−012 プサンメトロポリタンスヨン−クナムチョン−２ドング 148 サミクビチアパート＃211− 811 (72)発明者パクヒキョン大韓民国 136−022 ソウルソンブク− クソンブク−２ドング 60−１ (72)発明者ザンヒョンジョン大韓民国 612−030 プサンメトロポリタンヘウンデ−クジョヤ−ドングデオンアパート＃102−801 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 AA20 CA01 HA14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に記載されたマイコバクテリウムフォツイタム（M
ycobacterium fortuitum）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項２】配列番号２に記載されたマイコバクテリウムシェロナエ（M
ycobacterium chelonae）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項３】配列番号３に記載されたマイコバクテリウムアブセシュス（
Mycobacterium abscessus）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項４】配列番号４に記載されたマイコバクテリウムバッカエ（Myc
obacterium vaccae）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項５】配列番号５に記載されたマイコバクテリウムフラヴェセンス
(Mycobacterium flavescens)遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項６】配列番号６に記載されたマイコバクテリウムアシアティカム
(Mycobacterium asiaticum)遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項７】配列番号７に記載されたマイコバクテリウムポルシナム（My
cobacterium porcinum）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項８】配列番号８に記載されたマイコバクテリウムアカプルセン
シス（Mycobacterium acapulcensis）遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項９】配列番号９に記載されたマイコバクテリウムディエンホフェ
リ(Mycobacterium diernhoferi)遺伝子のＩＴＳのＤＮＡ。
【請求項１０】配列番号１０〜１４のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリア同定に使用されるオリゴヌクレオティド。
【請求項１１】配列番号１５〜２３のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムのうちＴＢ複合体と非結核マイコバクテリアの区別に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項１２】配列番号２４〜２７のうち一つの塩基配列を有する、ＭＡＣ
(マイコバクテリウムアビウム（Mycobacterium avium）及びマイコバクテリ
ウムイントラセルラレ（Mycobacterium intracellulare）)同定に使用されるオ
リゴヌクレオティド。
【請求項１３】配列番号２８〜３８のうち一つの塩基配列を有する、マイコ
バクテリウムフォツイタム（Mycobacterium fortuitum）同定に使用されるオ
リゴヌクレオティド。
【請求項１４】配列番号３９〜４６のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムシェロナエ（Mycobacterium chelonae）同定に使用されるオリ
ゴヌクレオティド。
【請求項１５】配列番号４７〜５２のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムアブセシュス（Mycobacterium abscessus）同定に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項１６】配列番号５３〜６４のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムバッカエ（Mycobacterium vaccae）同定に使用されるオリゴヌ
クレオティド。
【請求項１７】配列番号６５〜７２のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムフラヴェセンス（Mycobacterium flavescens）同定に使用され
るオリゴヌクレオティド。
【請求項１８】配列番号７３〜７７のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムゴドナエ（Mycobacterium gordonae）同定に使用されるオリゴ
ヌクレオティド。
【請求項１９】配列番号７８〜１００のうち一つの塩基配列を有する、マイ
コバクテリウムテラエ（Mycobacterium terrae）同定に使用されるオリゴヌク
レオティド。
【請求項２０】配列番号１０１〜１０８のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムスクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum)同定に使
用されるオリゴヌクレオティド。
【請求項２１】配列番号１０９〜１１２のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムカンサシイ（Mycobacterium kansasii）同定に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項２２】配列番号１１３〜１１６のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムシュルガイ（Mycobacterium szulgai）同定に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項２３】配列番号１１７〜１１９のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムマリヌム（Mycobacterium marinum）及びマイコバクテリ
ウムウルセランス（Mycobacterium ulcerans）同定に使用されるオリゴヌクレ
オティド。
【請求項２４】配列番号１２０〜１２３のうち一つの塩基配列を有する、マ
イコバクテリウムガストリ(Mycobacterium gastri)同定に使用されるオリゴヌ
クレオティド。
【請求項２５】配列番号１２４〜１３３のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムキセノピ（Mycobacterium xenopi）同定に使用されるオリ
ゴヌクレオティド。
【請求項２６】配列番号１３４〜１４１のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムゲナヴェンセ（Mycobacterium genavense）同定に使用され
るオリゴヌクレオティド。
【請求項２７】配列番号１４２〜１４６のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムマルモエンセ（Mycobacterium malmoense）同定に使用され
るオリゴヌクレオティド。
【請求項２８】配列番号１４７〜１５３のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムシミアエ（Mycobacterium simiae）同定に使用されるオリ
ゴヌクレオティド。
【請求項２９】配列番号１５４〜１６５のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムスメグマティス（Mycobacterium smegmatis）同定に使用
されるオリゴヌクレオティド。
【請求項３０】配列番号１６６〜１７２のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムシモイデイ（Mycobacterium shimoidei）同定に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項３１】配列番号１７３〜１８０のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムハバナ（Mycobacterium habana）同定に使用されるオリゴ
ヌクレオティド。
【請求項３２】配列番号１８１〜１８９のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムファーシノゲン（Mycobacterium farcinogen）同定に使用
されるオリゴヌクレオティド。
【請求項３３】配列番号１９０〜１９３のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムアジアティカム（Mycobacterium asiaticum）同定に使用さ
れるオリゴヌクレオティド。
【請求項３４】配列番号１９４〜２０５のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムポルシヌム（Mycobacterium porcinum）同定に使用される
オリゴヌクレオティド。
【請求項３５】配列番号２０６〜２１５のうち一つの塩基配列を有する、マ
イコバクテリウムアカプルセンシス（Mycobacterium acapulcensis）同定に使
用されるオリゴヌクレオティド。
【請求項３６】配列番号２１６〜２２７のうち一つの塩基配列を有する、マ
イコバクテリウムディエンホフェリ（Mycobacterium diernhoferi）同定に使
用されるオリゴヌクレオティド。
【請求項３７】配列番号２２８〜２４０のうち一つの塩基配列を有する、
マイコバクテリウムパラチュバークロシス（Mycobacterium paratuberculosis
）同定に使用されるオリゴヌクレオティド。
【請求項３８】配列番号２４１の塩基配列を有する、マイコバクテリア属(
Mycobacteria sp)同定に使用されるオリゴヌクレオティド。