KR102247643B1 - 결핵균 및 비결핵항산균을 검출하기 위한 2단계 진단방법 및 키트 - Google Patents

결핵균 및 비결핵항산균을 검출하기 위한 2단계 진단방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자의 결핵균 및 비결핵 항산균을 검출하기 위한 2단계로 구성되는 진단방법 및 그 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 환자의 검체(호흡기 검체, 림프절, 체액 등) 및 배양액에서 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵항산균(Non-tuberculosis Mycobacterium, NTM)을 신속하기 검출하고, 또한 다빈도 NTM의 균종을 동정하기 위한 2 단계로 구성된 멀티플렉스(Multiplex) 리얼타임(real-time) PCR 진단방법 및 그 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 2단계로 이루어지는 결핵균 및 비결핵항산균의 진단방법은 객담 등의 직접 검체에서 결핵균 및 비결핵항산균의 구별이 가능하고, 비결핵 항산균의 동정까지 가능하기 때문에 빠른 시간 내에 원인균을 정확히 동정함으로써 비결핵 항산균에 작용할 수 있는 올바른 약제를 처방할 수 있도록 유용한 정보를 제공하며, 액체배양의 사용이 점차 늘어남에 따라 결핵균과 빨리 자라는 비결핵 항산균과 섞여있는 경우 비결핵항산균으로 오진되는 것을 방지할 수 있을 것으로 판단되고, 향후에 결핵균 및 비결핵항산균에 의한 폐결핵 등의 정확한 감별 및 균종의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

결핵균 및 비결핵항산균을 검출하기 위한 2단계 진단방법 및 키트{A method for diagonising mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis mycobacterium in 2-step way and the kit thereof}
본 발명은 환자의 결핵균 및 비결핵 항산균을 검출하기 위한 2단계로 구성되는 진단방법 및 그 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 환자의 검체(호흡기 검체, 림프절, 체액 등) 및 배양액에서 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵항산균(Non-tuberculosis Mycobacterium, NTM)을 신속하기 검출하고, 또한 다빈도 NTM의 균종을 동정하기 위한 2 단계로 구성된 멀티플렉스(Multiplex) 리얼타임(real-time) PCR 진단방법 및 그 키트에 관한 것이다.
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)에 의한 감염으로 발병하며 전 세계의 공중보건을 크게 위협하는 질환 중의 하나이다. 다만, 사회경제적인 여건의 개선에 따라 발병률이 감소추세이고 결핵에 의한 사망 또한 줄어들고 있어서 2000년에는 23%에 달하던 사망률이 2017년에는 16%로 줄어든 바 있다.
이에 반해 결핵항산균(Non-tuberculosis Mycobacterium, NTM)에 의한 호홉기 감염의 비율이 높아지고 있고 면역력이 약화된 사람에게 기회감염의 형태로 빈번히 확인되고 있다.
NTM은 Mycobacterum 속의 항상균 중 MTB complex와 나병균(Mycobacterium leprae)을 제외한 균종을 일컬으며, 토양과 물에 흔하게 존재하지만 폐질환, 림프절염, 피부질환, 파종성 질환 등의 질병을 유발할 수 있고 그 중에서도 폐질환을 가장 흔히 유발한다. 미국, 유럽 등 선진국에서 특히 NTM의 감염의 보고가 빈번하고 우리나라 또한 사회경제적 여건의 개선에 따라서 MTB에 의한 폐결핵의 비율이 줄고 NTM에 의한 폐질환의 비율이 높아지고 있다.
폐질환의 원인균으로 분리되는 NTM 균종의 비율은 지역적으로 차이가 있으나 MAC(Mycobacterium avium complex)이 가장 흔한 균종인 것으로 보고되고 있고, 그 중에서도 Mycobacterium intracellulare가 비교적 많이 분리되는 경향이 있다. 이밖에도 Mycobacterium abscessus, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium xenopi 등도 흔하게 분리되는 것으로 보고되고 있다.
항산균 감염 폐질환이 의심되는 경우 적절한 약물치료 전략을 결정하기 위해 일단 MTB아 NTM을 구분하고, NTM이 확인되면 추후 정확한 균종을 동정한다. NTM 균종은 핵산 부합법(nucleic acid hybridization), 지방산 분석법(mycolic acid analysis), 중합효소 연쇄반응 제한효소 절단법(PCR restriction enzyme analysis), 중합효소 연쇄반응 기반 유전자 염기서열분석법(PCR-based sequencing analysis) 등의 신속 동정법을 이용하여 확인하는 것이 일반적이다. 이들 중 가장 빈번하게 이용되는 PCR 산물의 염기서열분석법은 16S rDNA, RNA polymerase beta-subunit rpoB gene 등의 유전자를 타겟으로 한다.
그러나 이러한 방법은 숙달된 숙련가가 필요하며, 또한 각 실험실마다 재현성에 문제가 있는 실정이다. 그리고 결정적으로는 배양에 의존하여 실험을 수행하므로 느린 발육기간을 가지고 있는 미코박테리아의 생물학적 특성상 환자의 치료시기를 놓칠 수 있다. 따라서 이러한 기존의 생화학적 감별 방법의 단점을 보완하기 위하여 시계분자인 16S rRNA, rpoB, 및 hsp65 유전자 염기서열을 분석하거나, 혹은 이들 유전자를 표적으로 하는 PCR 후 제한효소 절단 분석방법 (PCR-RFLP)등을 이용하여 미코박테리움 속 균종을 동정한다. 그러나, 이러한 시계분자를 표적으로 하여 미코박테리움 속 균종을 동정하는 방법은 순수 배양된 배양 균주의 경우에는 정확한 결과를 나타내지만, 여러 호흡기 및 구강 정상상재균이 혼재되어 있는 객담의 경우에는 PCR을 수행하였을 때 표적으로 사용하고 있는 시계분자들의 염기서열이 모든 균종간에 서로 보존되어 상동성이 높기 때문에 동정에 어려움이 있다. 즉, 구강 및 호흡기 정상상재균의 DNA가 동정의 표적인 미코박테리아 균종의 DNA와 동시에 증폭되기 때문에 균 동정에 어려움이 있다.
현재 결핵균 및 비결핵항산성균을 감별하는 데에 주로 사용되는 방법은 결핵균 및 기타 비결핵항산성균을 종 수준에서 동정할 수 있는 probe-hybridization 방법 및 DNA chip등의 개발이 수행되고 있으나 이러한 방법은 고가의 장비 및 검사비용이 소요된다. 또한, 이러한 단점을 극복하고자 PCR 반응만으로 두 군을 감별할 수 있는 multiplex PCR 방법들이 고안되어 개발되고 있으나, 이 방법들은 주로 하나의 유전자를 표적으로 하지 않고 여러 유전자를 표적으로 하는 방법이기 때문에 두 군의 균종들이 서로 혼재되어 있는 경우에는 적용하기 어렵다는 문제점이 있다.
결핵 및 NTM의 신속동정을 위해서 환자의 검체(호흡기 검체, 림프절, 체액 등)에서 핵산증폭법을 이용하여 직접 검출하는 방법이 최근 널리 사용되고는 있으나, 이는 결핵균 단독 또는 결핵균과 NTM 모두를 검출대상으로 하고 있고 균주의 동정을 위하여 많은 시간이 걸리고 실험이 복합하다는 문제점이 있다.
결핵균의 검출 타겟으로 널리 사용되고 있는 IS6110의 경우는 IS6110내에 균주의 copy수가 많아서 결핵균의 검출 민감도를 향상시킬 수는 있으나, BCG 백신의 주원료인 우결핵균(M. bovis)도 IS6110을 가지고 있어서 BCG 백신을 접종받은 환자가 결핵감염 환자로 오진단되는 문제점이 있다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 우결핵균은 가지고 있지 않은 유전자 Rv1514c를 타겟으로 하여 우결핵균에 의한 감염성을 배제하고 이후에 NTM에 특이적인 rpoB를 타겟으로 하는 염기서열을 이용하여 NTM만을 검출함으로써 환자의 NTM 감염여부를 진단하는 첫 번째 단계와, 상기 첫 번째 단계에서 양성으로 판별된 대상에 대하여 NTM의 다빈도 균종을 확인하는 두 번째 단계로 이루어지는 MTB 및 NTM을 진단하는 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
한국공개특허공보 10-2012-0000868 한국공개특허공보 10-2001-0084904
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술에서 MTM 및 NTM의 균종을 동정하기 위한 다양한 방법의 문제점인 장시간이 소요되고 진단 장비가 복잡해지며, 또한 우결핵균에도 동일한 균종이 존재하고 있어서 결핵감염의 오진단이 발생할 수 있다는 문제점을 해결하기 위해 개발된 것으로서, 결핵감염의 원인균종을 동정하기 위하여 우결핵균이 배제된 타겟유전자를 이용하여 NTM의 감염여부를 확인하고, NTM의 감염이 확인된 검체에 대해서 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 NTM의 균종을 특정하는 두 가지 단계로 이루어진 결핵균 및 비결핵상산균을 동정하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미국 Ntional Center for Biotechnology Information의 Genome database에 결핵균의 reference genome으로 등록된 M. Tuberculosis H32Rv의 유전자를 기준으로, M. tuberculosis complex에 속하는 균종은 모두 보유하나 우결핵균(M. tuberculosis variant bovis, 결핵예방을 위한 피내용 생백신의 원료)은 가지지 않는 유전자인 Rv1514c를 타겟으로 하여 결핵균의 감염을 판별하는 방법을 이용하였다.
본 발명에서 제공하고자 하는 결핵균의 감염을 판별하기 위한 결핵균 및 비결핵항산균의 두 단계 동정방법은 환자의 객담샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 8로 이루어지는 MTB 및 NTM의 감염을 확인하는 첫 번째 단계와 상기 첫 번째 단계를 거쳐 NTM의 감염이 확인된 검체를 대상으로 하여 상기 NTM의 균종을 동정하는 단계인 두 번째 단계로 이루어지는데, 상기 두 번째 단계는 서열번호 9 내지 26의 유전자로 이루어지는 6종의 NTM 균종 및 이를 판별하기 위한 프로브의 혼합물을 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 상기 6종의 NTM 균을 동정하는 단계로 이루어지는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 첫 번째 단계는
서열번호 1 내지 3으로 이루어지는 Rv1514c 유전자의 프라이머 및 서열번호 4로 이루어지는 프로브를 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 환자의 MTB 균종을 확인하는 단계 및 상기 단계에서 음성으로 판별된 검체를 대상으로 하여, 서열번호 5 내지 7로 이루어지는 rpoB 유전자의 프라이머 및 서열번호 8로 이루어지는 프로브를 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 NTM의 감염을 확인하는 단계로 이루어지진다.
상기 두 번째 단계는
서열번호 9 및 10으로 이루어지는 M. abscessus 유전자의 프라미어 및 서열번호 11로 이루어지는 프로브, 서열번호 12 및 13으로 이루어지는 M. avium 유전자의 프라이머 및 서열번호 14로 이루어지는 프로브, 서열번호 15 및 16으로 이루어지는 M. kansasil 유전자의 프라이머 및 서열번호 17로 이루어지는 프로브, 서열번호 18 및 19로 이루어지는 M. massiliense 유전자의 프라이머 및 서열번호 20으로 이루어지는 프로브, 서열번호 21 및 22로 이루어지는 M. intracellulare 유전자의 프라이머 및 서열번호 23으로 이루어지는 프로브, 서열번호 24 및 25로 이루어지는 M. fortuitum 유전자의 프라미어 및 서열번호 26으로 이루어지는 프로브를 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 상기 NTM의 균종을 동정하는 단계이다.
또한, 본 발명은 결핵감염의 원인균을 동정하기 위한 키트로서 상기 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열을 모두 포함하여 이루어지는 키트와 상기 서열번호 9 내지 26으로 표시되는 염기서열을 모두 포함하여 이루어지는 키트를 제공한다.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 2단계로 이루어지는 결핵균 및 비결핵항산균의 진단방법은 객담 등의 직접 검체에서 결핵균 및 비결핵항산균의 구별이 가능하고, 비결핵 항산균의 동정까지 가능하기 때문에 빠른 시간 내에 원인균을 정확히 동정함으로써 비결핵 항산균에 작용할 수 있는 올바른 약제를 처방할 수 있도록 유용한 정보를 제공하며, 액체배양의 사용이 점차 늘어남에 따라 결핵균과 빨리 자라는 비결핵 항산균과 섞여있는 경우 비결핵항산균으로 오진되는 것을 방지할 수 있을 것으로 판단되고, 향후에 결핵균 및 비결핵항산균에 의한 폐결핵 등의 정확한 감별 및 균종의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 2단계로 이루어지는 MTB 및 NTM의 균종을 진단하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 결핵균 및 비결핵항산균을 진단하는 실험결과로서 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 나타내었다(도 2a는 internal control의 결과를 나타내고, 도 2b는 M. tuebrculosis의 결과를 나타내며, 도 2c는 NTM(rpoB)의 결과를 나타낸다).
도 3은 본 발명에서 제공하는 결핵균 및 비결핵항산균을 진단하는 실험결과로서 표 4에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 나타내었다(도 3a는 M. abscessus의 결과를 나타내고, 도 3b는 M. avium의 결과를 나타내며, 도 3c는 M. kansasii의 결과를 나타낸다).
도 4는 본 발명에서 제공하는 결핵균 및 비결핵항산균을 진단하는 실험결과로서 표 5에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 나타내었다(도 4a는 M. massiliense의 결과를 나타내고, 도 4b는 M. intracellulare의 결과를 나타내며, 도 4c는 M. fortuitumi의 결과를 나타낸다).
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점인 결핵균 및 비결핵항산균의 동정에 있어서 오진을 최소화하고 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기에 기재된 결핵균 및 비결핵항산균을 신속하게 정확하게 동정할 수 있는 진단키트를 제공하고자 하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어지는 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위하여 Rv1514c 및 rpoB 유전자를 멀티플렉스 리얼타임 PCR 법을 이용하여 증폭하기 위한 프라이머와 상기 유전자들을 확인하기 위한 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9 내지 26의 염기서열로 이루어지는 마이코박테리움속 비결핵항산균인 M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. kansasii, M. massiliense 등을 동정하기 위하여 상기 균을 멀티플렉스 리얼타임 PCR 법을 이용하여 증폭하기 위한 프라이머와 상기 유전자들을 확인하기 위한 프로브를 제공한다.
아래의 표 1은 본 발명에서 사용되는 상기 유전자들을 증폭 및 동정하기 위한 서열번호 1 내지 26으로 이루어지는 프라이머 및 프로브와 타겟균주를 나타낸다.
Target species 서열번호 Target gene Primer sequence (5'-3'/label)
M. tuberculosis 1 Rv1514c forward 1-1Rv1514c_F229-247 CAGGGCATCGCGCACGCAT
2 reverse 1-1Rv1514c_R320-302 TCCACGGCCTGGGCTACCA
3 reverse Rv1514c_R313-296 CCTGGGCTACCACGTCGG
4 probe Rv1514c-MTB-probe 5'FAM-CACTCCGCCGATCGTTTTTCC-3'TAMRA
Non-tuberculosis Mycobacterium 5 rpoB forward rpoB-NTM_F744-765 CGGCTTCTCCGAGATCATGATG
6 reverse rpoB-NTM_R891-870 GAAGAACAGGTTCTCCAGCAGG
7 reverse rpoB-NTM_R878-860 TCCAGYAGGGYCTGSGCS
8 probe rpoB-NTM-probe 5'HEX-TGCTSGACATCTACCGVAARC-3'TAMRA
M. abscessus 9 erm(41) forward erm41_MABS_F225-244 GGAAGATGTCCGGATAGCGG
10 reverse erm41_MABS_R324-305 TGCGCTGGTGACTTGGTAGG
11 probe erm41_MABS_probe 5'HEX-GACCTGCTCGCCTTCCGG-3'TAMRA
M. avium 12 hsp70 forward hsp70_MAVI-F501-520 CATCACCGCCAAACGGGAGT
13 reverse hsp70_MAVI-R605-586 CTGACCACCACCTCGTTGGA
14 probe ITS_MAVI_probe 5'TEXASRED-GTGCTCGTCTACGACCTCG-3'BHQ2
M. kansasii 15 ITS forward ITS_MKAN_F211-230 ATGGATGCGTTGCCCTACGG
16 reverse ITS_MKAN_R291-267 GCCCTTAGACACTTACAAACACAAA
17 probe ITS_MKAN_probe 5'CY5-GTGTTCTTTTGTGCAATTTTATTCT-3'BHQ2
M. massiliense 18 rpoB forward rpoB-MMAR_F CCCGAGTGGGCGCAGAAC
19 reverse rpoB-MMAR_R CGCGGGCACCGTCGAACA
20 probe rpoB_MMAR_probe 5'HEX-AGGACCTGCAGTCGGCTCC-3'TAMRA
M. intracellulare 21 NOR forward NOR_MINT_F25-45 CAACAGTCATCGTCACAGCCG
22 reverse NOR_MINT_R118-98 CCAGAATGCCCATCACCAGGA
23 probe NOR_MINT_probe 5'ROX-AAAGGCTGGGTCCAGGGTGT-3'TAMRA
M. fortuitum 24 rpoB forward 3-2rpoB_MFOR_F164-182 GGCTCGTCGGTGCGGATGA
25 reverse 3-2rpoB_MFOR_R267-248 CTCGATCGGGGAGAGCTCTT
26 probe rpoB_MFOR_probe 5'CY5-GATCGCGGCGAGACCGAC-3'BHQ2
본 발명이 제공하는 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 구체적인 내용은 다음과 같다.
본 발명은 환자의 객담 샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 프라이머 및 프로브를 첨가하여 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 산물을 형광분석하여 상기 샘플이 결핵균 또는 비결핵항산균에 의해 감염되었는지를 확인하는 단계로 이루어지는 첫 번째 단계와 상기 첫 번째 단계에서 비결핵항산균에 의해 감염되었다고 판별된 샘플에서 추출된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 내지 서열번호 26의 프라이머 및프로브를 첨가하여 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 산물을 형광분석하여 상기 비결핵항산균을 동정하는 단계로 이루어지는 두 번째 단계로 이루어진다.
본 발명에 의해서 검출될 수 있는 비결핵항산균인 마이코박테리움속 균종으로는 M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. kansasii, M. massiliense 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 프로브를 가지는 결핵균 및 비결핵항산균을 판별하기 위한 동시검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 서열번호 9 내지 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 프라미어 및 프로브를 가지는 비결핵항산균을 동정하기 위한 동시검출용 키트를 제공한다.
상기 프로브는 5‘말단 및 3’말단에 각각 형광물질이 표지되어 있고, 각 형광물질은 특별히 제한되지는 않으며, 상기 형광물질로 사용될 수 있는 표지수단으로서는 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해서 보다 더 잘 이해될 수 있으나, 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 단순한 예시에 불과하며 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 의해서 제한되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게는 널리 알려진 것이다.
실시예
1. 실험재료 및 실험방법
실험균주
본 발명에는 마이코박테리아(Mycobacterium) 표준 균주와 직접검체를 이용하였다. 표준균주의 경우, National Culture Collection for Pathogens (NCCP) 24주의 마이코박테리아(Mycobacterium) 표준 균주를 이용하였으며, 표준 균주들은 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa 배지) 배지에서 배양한 균주들이었다. 직접검체로는 환자의 검체(호흡기 검체, 림프절, 체액 등) 를 이용하였다.
사용된 표준균주는 다음과 같다:
Mycobacterium gordonae ATCC 14470, Mycobacterium lentiflavum NCCP 15725, Mycobacterium malmoense NCCP 15727, Mycobacterium marinum NCCP 15667, Mycobacterium szulgai ATCC 35799, Mycobacterium bolletii CIP 108541, Mycobacterium chelonae AN 090043, Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, Mycobacterium obuense ATCC 27023, Mycobacterium phlei ATCC 354, Mycobacterium septicum AN 121098, Mycobacterium colombiense NCCP 15818, Mycobacterium immunogenum CIP 106684, Mycobacterium abscessus ATCC 19977, Mycobacterium massiliense CIP 108297, Mycobacterium terrae ATCC 15755, Mycobacterium intracellulare ATCC 13950, Mycobacterium chimaera CIP 107892T, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 25291, Mycobacterium xenopi NCCP 15718, Mycobacterium mucogenicum ATCC 49650, Mycobacterium aubagnense CIP 108543
균주 배양 및 DNA 추출 방법은 다음과 같다:
3% Ogawa (Union lab,Seoul, Korea) 고체배지 및 BD Mycobacteria Growth Indicator Tube (BD BBL, USA)에 접종하여, 6-8주 동안 37°에서 배양한 균주의 배양액 또는 세균 집락 현탁액에 동량의 4% NaOH를 넣어 진탕하고, 그 중 1 mL를 미량튜브에 넣어 원심분리하였다. 침전물을 phosphate buffered saline으로 2회 세척하고, 원심분리하여 수확한 침전물에 DNA extraction buffer (Kogen biotech, Seoul)를 100 μL 첨가하여 20분간 끓였다. 13,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층 액을 *?*80°에서 냉동보관하며 사용하였다. 직접검체의 경우, 동량의 4% NaOH를 넣어 진탕하고, 10분 동안 방치하여 객담을 액화시켰다. 그 중 1 mL를 미량튜브에 넣어 원심분리하였다. 침전물을 phosphate buffered saline으로 2회 세척하고, 원심분리하여 수확한 침전물에 DNA extraction buffer (Kogen biotech, Seoul)를 100 μL 첨가하여 20분간 끓였다. 13,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층 액을 *?*80°에서 냉동보관하며 사용하였다.
멀티플렉스 리얼타임 중합연쇄반응은 다음과 같이 진행하였다:
본 연구에서 사용한 프라이머는 표 1에 기술하였다. 총 20 μL의 반응액에 추출된 2 μL의 총 DNA, 각 2 μL의 전측 후측 프라이머와 프로브, 증류수 HS premix (Genetbio, Daejon, Korea)가 함유되도록 하여, Gentier96 (TIANLONG Science and Technology CO., LTD., Xi’China)를 사용하여 멀티플렉스 리얼타임 중합연쇄반응을 실시하였다. 50°에서 3분간 Uracil-DNA-glycosylase 반응 후 97°에서 2분간 전-분리 하고, 97°분리 10초, 61°결합 및 연장단계 30초를 1 싸이클로 하여 45 싸이클을 수행하였다. 각각의 프라이머-프로브 믹스에는 해당 비결핵 마이코박테리아와 내부정도관리(internal control, ICART)의 대상유전자를 검출하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 프로브가 있었다.
중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 구성 및 농도는 아래의 표2와 같다.
성분 부피
(μl)		 농도
2x HS prime Multiplex PCR Master Mix 10 1x
프라이머-프로브 혼합물 프라이머(20 pmole/μl)-프로브(5 pmole/
μl)		 8 5 μM-0.3 μM
샘플 DNA 템플레이트 2 -
Total 20 microL
멀티플렉스 리얼타임 중합연쇄반응 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 Gentier96 (TIANLONG Science and Technology CO., LTD., Xi’China)에서 측정한다. 상기 멀티플렉스 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실-시간 모니터 상에서 FAM이 발색되는 경우 녹색채널(510 ±5 nm), HEX가 발색되는 경우 노랑채널(555 ±5 nm), ROX 또는 Texas Red가 발색하는 경우 주황채널(610 ±5 nm), Cy5가 발색되는 경우 빨강채널(660 ±10nm) 에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널(green channel), 노랑채널 (yellow channel), 주황채널(orange channel) 및 빨강채널(red channel)에서 형광을 관찰하였다.
Ct(cycle threshold)값은 표준화된 리포터 시그날이 처음으로 검출된 사이클이라고 할 수 있다. 중합연쇄효소반응 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승 하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)로 증가하는 중합연쇄효소반응 생산물과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출할 수 있게 된 시점, 즉 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 해당 유전자의 수(균의 양)의 로그값에 반비례한다. 그러므로, 특정 샘플에서 보여지는 Ct 값은 반응에서 반응물이 충분히 축적된 중합연쇄효소반응 수를 반영하므로 타겟산물의 정량적인 측정을 가능하게 한다. 결론적으로 애초에 반응물에 넣은 타겟의 수가 많을수록, 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타나게 되어 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값을 가지게 된다.
2. 실험결과
각 튜브에서 각 채널의 역치 값을 기기의 초기설정값으로 하여 Ct 값을 확인하였다. Ct 값이 ≤45에서 피크(peak)가 관찰되면 양성으로 판독하였다. 각 튜브에서의 사용된 프라이머와 프로브 및 형광물질은 아래의 표 3 내지 5와 같다.
Tube 1
primer/probe M. tuberculosis (Rv1514c)
1-1Rv1514c_F229-247 CAGGGCATCGCGCACGCAT
1-1Rv1514c_R320-302 TCCACGGCCTGGGCTACCA
Rv1514c_R313-296 CCTGGGCTACCACGTCGG
Probe (FAM) CACTCCGCCGATCGTTTTTCC
NTM ( rpoB )
rpoB-NTM_F744-765 CGGCTTCTCCGAGATCATGATG
rpoB-NTM_R891-870 GAAGAACAGGTTCTCCAGCAGG
rpoB-NTM_R878-860 TCCAGYAGGGYCTGSGCS
Probe (HEX) TGCTSGACATCTACCGVAARC
Internal control
ICART82_F GAGTAGGGAGTCAAGGCGAG
ICART82_R GTTGGGACTCTCCCAAGTGG
Probe (Cy5) CTCCCCATGCACACCCCAG
상기 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 도 2에 나타내었다.
Tube 2
primer/probe M. abscessus ( erm(41) )
erm41_MABS_F225-244 GGAAGATGTCCGGATAGCGG
erm41_MABS_R324-305 TGCGCTGGTGACTTGGTAGG
Probe (HEX) GACCTGCTCGCCTTCCGG
M. avium ( hsp70 )
hsp70_MAVI-F501-520 CATCACCGCCAAACGGGAGT
hsp70_MAVI-R605-586 CTGACCACCACCTCGTTGGA
Probe (TEXAS RED) GTGCTCGTCTACGACCTCG
M. kansasii (ITS)
ITS_MKAN_F211-230 ATGGATGCGTTGCCCTACGG
ITS_MKAN_R291-267 GCCCTTAGACACTTACAAACACAAA
Probe GTGTTCTTTTGTGCAATTTTATTCT
Internal control
ICART82_F GAGTAGGGAGTCAAGGCGAG
ICART82_R GTTGGGACTCTCCCAAGTGG
Probe (FAM) CTCCCCATGCACACCCCAG
상기 표 4에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 도 3에 나타내었다.
Tube 3
primer/probe M. massiliense ( rpoB )
rpoB-MMAR_F CCCGAGTGGGCGCAGAAC
rpoB-MMAR_R CGCGGGCACCGTCGAACA
Probe (HEX) AGGACCTGCAGTCGGCTCC
M. intracellulare (NOR)
NOR_MINT_F25-45 CAACAGTCATCGTCACAGCCG
NOR_MINT_R118-98 CCAGAATGCCCATCACCAGGA
Probe (ROX) AAAGGCTGGGTCCAGGGTGT
M. fortuitum (rpoB)
3-2rpoB_MFOR_F164-182 GGCTCGTCGGTGCGGATGA
3-2rpoB_MFOR_R267-248 CTCGATCGGGGAGAGCTCTT
Probe (Cy5) GATCGCGGCGAGACCGAC
Internal control
ICART82_F GAGTAGGGAGTCAAGGCGAG
ICART82_R GTTGGGACTCTCCCAAGTGG
Probe (FAM) CTCCCCATGCACACCCCAG
상기 표 5에 기재된 프라이머 및 프로브를 이용한 실험결과를 도 4에 나타내었다.
각 튜브에서 각 채널의 역치(threshold) 값을 기기의 초기설정값으로 하여 Ct 값을 확인하였다. Ct 값이 <45에서 피크(peak)가 관찰되면 양성으로 판독하였다. 표준균주에 대해 실시한 실험으로 확보한 Ct 값은 아래의 표 6과 같다.
Tube 1 Tube 2 Tube 3
Sample ID Dye Gene Ct Dye Gene Ct Dye Gene Ct
M. tuberculosis FAM TB 25.730 FAM ICART 31.020 FAM ICART 32.949
HEX NTM - HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.168 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
M.bovis FAM TB - FAM ICART 30.754 FAM ICART 32.660
HEX NTM - HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.426 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
M.abscessus FAM TB - FAM ICART 30.941 FAM ICART 32.902
HEX NTM 32.754 HEX ABS 31.809 HEX MAR -
Cy5 ICART 27.48 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
M.massiliense FAM TB - FAM ICART 31.145 FAM ICART 33.605
HEX NTM 27.934 HEX ABS - HEX MAR 28.066
Cy5 ICART 27.387 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
M.intracellulare FAM TB - FAM ICART 31.176 FAM ICART 33.215
HEX NTM 24.285 HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.074 Texas Red AVI - ROX INT 24.363
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
M. fortuitum FAM TB - FAM ICART 30.621 FAM ICART 32.723
HEX NTM 31.035 HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 29.129 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR 29.848
M. kansasii FAM TB - FAM ICART 31.465 FAM ICART 32.980
HEX NTM 32.34 HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.699 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN 28.551 Cy5 FOR -
M. avium FAM TB - FAM ICART 31.168 FAM ICART 32.973
HEX NTM 29.582 HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.246 Texas Red AVI 27.887 ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
Negative FAM TB - FAM ICART 30.691 FAM ICART 32.605
HEX NTM - HEX ABS - HEX MAR -
Cy5 ICART 27.543 Texas Red AVI - ROX INT -
Cy5 KAN - Cy5 FOR -
Positive FAM TB 26.480 FAM ICART 30.363 FAM ICART 39.535
HEX NTM 31.090 HEX ABS 30.332 HEX MAR 28.488
Cy5 ICART 27.418 Texas Red AVI 30.973 ROX INT 27.301
Cy5 KAN 30.480 Cy5 FOR 27.918
본 발명은 산업상 이용가능하다.
<110> Bio Park Diagnostics Co., LTD. <120> A method for diagonising mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis mycobacterium in 2-step way and the kit thereof <130> 19-FP-007 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> M. tuberculosis <400> 1 cagggcatcg cgcacgcat 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> M. tuberculosis <400> 2 tccacggcct gggctacca 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> M. tuberculosis <400> 3 cctgggctac cacgtcgg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> M. tuberculosis <400> 4 cactccgccg atcgtttttc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Non-tuberculosis Mycobacterium <400> 5 cggcttctcc gagatcatga tg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Non-tuberculosis Mycobacterium <400> 6 gaagaacagg ttctccagca gg 22 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Non-tuberculosis Mycobacterium <400> 7 tccagyaggg yctgsgcs 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Non-tuberculosis Mycobacterium <400> 8 tgctsgacat ctaccgvaar c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> M. abscessus <400> 9 ggaagatgtc cggatagcgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> M. abscessus <400> 10 tgcgctggtg acttggtagg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> M. abscessus <400> 11 gacctgctcg ccttccgg 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> M. avium <400> 12 catcaccgcc aaacgggagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> M. avium <400> 13 ctgaccacca cctcgttgga 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> M. avium <400> 14 gtgctcgtct acgacctcg 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> M. kansasii <400> 15 atggatgcgt tgccctacgg 20 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> M. kansasii <400> 16 gcccttagac acttacaaac acaaa 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> M. kansasii <400> 17 gtgttctttt gtgcaatttt attct 25 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> M. massiliense <400> 18 cccgagtggg cgcagaac 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> M. massiliense <400> 19 cgcgggcacc gtcgaaca 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> M. massiliense <400> 20 aggacctgca gtcggctcc 19 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> M. intracellulare <400> 21 caacagtcat cgtcacagcc g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> M. intracellulare <400> 22 ccagaatgcc catcaccagg a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> M. intracellulare <400> 23 aaaggctggg tccagggtgt 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> M. fortuitum <400> 24 ggctcgtcgg tgcggatga 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> M. fortuitum <400> 25 ctcgatcggg gagagctctt 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> M. fortuitum <400> 26 gatcgcggcg agaccgac 18

Claims (10)

  1. 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 두 단계로 이루어진 검출방법에 관한 것으로서, 상기 검출방법은
    환자의 객담샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 타겟 유전자를 증폭한 후에 표지수단을 이용하여 결핵균 및 비결핵항산균의 감염을 확인하는 첫 번째 단계; 및
    상기 첫 번째 단계를 거쳐 비결핵항산균의 감염이 확인된 검체를 대상으로 하여 타겟 유전자를 증폭한 후에 표지수단을 이용하여 상기 비결핵항산균의 균종을 동정하는 단계인 두 번째 단계로 이루어지며,
    상기 첫 번째 단계의 타겟 유전자는 Rv1514c 및 rpoB 유전자이고, 상기 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 각각의 염기서열로 이루어지는 프라이머 또는 프로브를 모두 첨가하여 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 상기 유전자를 증폭하는 것이고,
    상기 두 번째 단계의 타겟 유전자는 erm(41), hsp70, ITS, rpoB, NOR 유전자이고, 상기 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 9 내지 서열번호 26의 각각의 염기서열로 이루어지는 프라이머 또는 프로브를 모두 첨가하여 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 상기 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 검출방법
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 비결핵항산균은 M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. kansasii 및 M. massiliense 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 검출방법
  5. 제1항에 있어서, 상기표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 검출방법
  6. 결핵균 및 비결핵항산균을 동정하기 위한 키트에 관한 것으로서, 상기 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 26의 각각의 염기서열로 이루어지는 프라이머 또는 프로브를 모두 첨가하여 멀티플렉스 리얼타임 PCR법을 이용하여 유전자를 증폭하는 것이고
    상기 서열번호 4 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프로브에는 표지수단이 결합되어 있고, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 비결핵항산균은 M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. kansasii 및 M. massiliense 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서 상기 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 23 또는 서열번호 26의 염기서열 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 프로브에는 표지수단이 결합되어 있고, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010084904A (ko) 1999-05-29 2001-09-07 김철민 마이코박테리아 균종 동정용 올리고뉴클레오티드
US6291190B1 (en) * 1998-08-25 2001-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Molecular differences between species of the M. tuberculosis complex
KR20030030266A (ko) * 2001-10-09 2003-04-18 주식회사 에스제이하이테크 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트
KR20120000868A (ko) 2010-06-28 2012-01-04 서울대학교산학협력단 실시간 ｐｃｒ을 이용한 미코박테리움 속 균종의 동시 감별 방법 및 이를 위한 키트
KR20130095454A (ko) * 2012-02-20 2013-08-28 엠앤디 (주) 결핵균 및 비결핵 항산균의 구별방법 및 조성물
KR101802417B1 (ko) * 2016-07-13 2017-11-30 주식회사 큐라티스 결핵균 및 비결핵균 동시 진단용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6291190B1 (en) * 1998-08-25 2001-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Molecular differences between species of the M. tuberculosis complex
KR20010084904A (ko) 1999-05-29 2001-09-07 김철민 마이코박테리아 균종 동정용 올리고뉴클레오티드
KR20030030266A (ko) * 2001-10-09 2003-04-18 주식회사 에스제이하이테크 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트
KR20120000868A (ko) 2010-06-28 2012-01-04 서울대학교산학협력단 실시간 ｐｃｒ을 이용한 미코박테리움 속 균종의 동시 감별 방법 및 이를 위한 키트
KR20130095454A (ko) * 2012-02-20 2013-08-28 엠앤디 (주) 결핵균 및 비결핵 항산균의 구별방법 및 조성물
KR101802417B1 (ko) * 2016-07-13 2017-11-30 주식회사 큐라티스 결핵균 및 비결핵균 동시 진단용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK ACCESSION NO. CP019610 *
GENBANK ACCESSION NO. CP028731 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230065656A (ko) 2021-11-05 2023-05-12 연세대학교 산학협력단 마이코박테리움 아비움 복합체 감염증의 중증도 예측용 대사체 마커

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