KR101261292B1 - 실시간 ｐｃｒ을 이용한 미코박테리움 속 균종의 동시 감별 방법 및 이를 위한 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 프라이머와 프로브를 이용한 다중 프로브 PCR 을 수행하여 미코박테리움 속 균종을 동시에 감별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석 방법에 의하여 임상적으로 문제되는 미코박테리움 속 균종을 간편하면서도 정확하게 감별, 동정하는 데에 크게 기여할 수 있다.

Description

실시간 ＰＣＲ을 이용한 미코박테리움 속 균종의 동시 감별 방법 및 이를 위한 키트{Method and kit for identification of Mycobacterium sp. using real-time PCR}
본 발명은 특정 프라이머와 프로브를 이용한 다중 프로브 PCR 을 수행하여 미코박테리움 속 균종을 동시에 감별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
미코박테리움 속 균종은 병원성 정도에 따라 절대병원성균인 결핵균군과 기회감염성 균종인 비결핵항산성균으로 두 그룹으로 구분할 수 있다. 결핵균 군에 속하는 균으로는 인형결핵균인 M. tuberculosis 우형결핵균인 M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti 등이 있고, 이들을 제외한 M. avium과 M.intracellulare 등을 포함한 나머지 약 100여 가지의 미코박테리아 균종이 비결핵항산성균(Nontuberculous mycobacteria)에 포함된다. 병원성이 높은 결핵균 이외에도 비결핵항산성균종 역시 기본적으로 항결핵제에 내성을 가지고 있고, 면역이 저하된 환자에서 심각한 질환을 일으킬 수 있으며, 또한 각 균종의 종류에 따라 각기 다른 항생제 감수성 패턴을 가지고 있기 때문에 이들 균종의 정확한 임상치료를 위해서는 종 수준으로의 균 분류가 중요하다. 현재, 임상실험실에서 비결핵항산성균종의 종 수준으로의 동정은 주로 균주 배양 형태 및 색소 형성여부 혹은 생화학적인 검사법에 주로 의존하고 있다.
그러나 이러한 방법은 숙달된 숙련가가 필요하며, 또한 각 실험실마다 재현성에 문제가 있는 실정이다. 그리고 결정적으로는 배양에 의존하여 실험을 수행하므로 느린 발육기간을 가지고 있는 미코박테리아의 생물학적 특성상 환자의 치료시기를 놓칠 수 있다. 따라서 이러한 기존의 생화학적 감별 방법의 단점을 보완하기 위하여 시계분자인 16S rRNA, rpoB, 및 hsp65 유전자 염기서열을 분석하거나, 혹은 이들 유전자를 표적으로 하는 PCR 후 제한효소 절단 분석방법 (PCR-RFLP)등을 이용하여 미코박테리움 속 균종을 동정한다. 그러나, 이러한 시계분자를 표적으로 하여 미코박테리움 속 균종을 동정하는 방법은 순수 배양된 배양 균주의 경우에는 정확한 결과를 나타내지만, 여러 호흡기 및 구강 정상상재균이 혼재되어 있는 객담의 경우에는 PCR을 수행하였을 때 표적으로 사용하고 있는 시계분자들의 염기서열이 모든 균종간에 서로 보존되어 상동성이 높기 때문에 동정에 어려움이 있다. 즉, 구강 및 호흡기 정상상재균의 DNA가 동정의 표적인 미코박테리아 균종의 DNA와 동시에 증폭되기 때문에 균 동정에 어려움이 있다.
한편, 미코박테리아 균종은 모든 세균 중에서 가장 느리게 자라는 균종 중에 하나이기 때문에 (7일-1달), 배양과정 없이 바로 객담에서 균종을 동정하는 방법이 환자의 치료시기를 실기하지 않기 위하여 반드시 필요하다.
현재 결핵균 및 비결핵항산성균을 감별하는 데에 주로 사용되는 방법은 결핵균 및 기타 비결핵항산성균을 종 수준에서 동정할 수 있는 probe-hybridization 방법 및 DNA chip등의 개발이 수행되고 있으나 이러한 방법은 고가의 장비 및 검사비용이 소요된다. 또한, 이러한 단점을 극복하고자 PCR 반응만으로 두 군을 감별할 수 있는 multiplex PCR 방법들이 고안되어 개발되고 있으나, 이 방법들은 주로 하나의 유전자를 표적으로 하지 않고 여러 유전자를 표적으로 하는 방법이기 때문에 두 군의 균종들이 서로 혼재되어 있는 경우 혹은 객담같이 여러 정상상재총이 혼재되어 있는 경우 등에 적용하지 못하는 문제점이 있다.
따라서 이러한 단점들을 극복하기 위해서는 본 발명자는 등록특허 제692,484호에는 열충격단백질 65(hsp 65) 유전만을 표적으로 사용하여 두 군을 감별하는 새로운 방법의 개발한 바 있다.
한편 최근 실시간 PCR(real-time PCR) 방법은 많은 질병의 진단에 적용되고 있으며, 향상된 민감도와 낮은 오염 위험을 가지며, 적용이 용이하고 신속한 진단이 가능한 장점이 있다. 미코박테리아의 검출과 감별에 상기 실시간 PCR 방법을 적용하는 것이 연구되고 있으나, 1차 시료의 직접적인 실시간 PCR에의 적용은 일반적으로 M. tuberculosis 에 한정되며, M. tuberculosis 뿐만 아니라 여러 비결핵항산성균을 동시에 감별할 수 있는 방법은 아직 개발되지 아니한 실정이다.
이에 본 발명자들은, 실시간 PCR(real-time PCR) 방법에 의하여 여러 결핵균과 비결핵항산균을 동시에 감별할 수 있는 방법을 개발하고자 연구, 노력한 결과 특정 프라이머와 프로브를 제작하고, 이를 이용한 다중 프로브 PCR 을 수행하여 미코박테리움 속 균종의 감별에 응용할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 미코박테리움 속 균종 특이적인 증폭을 가능하게 하는 프라이머와 다중 프로브를 제작하여 미코박테리움 속 여러 결핵균과 비결핵항산균을 동시에 감별할 수 있는 시스템을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
본 발명은,
환자의 객담 샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4 내지 서열번호 13 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 프로브를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물의 Tm 값을 확인하여 미코박테리움 속 균종을 판독하는 단계
를 포함하는 미코박테리움 속 균종의 동시 검출 방법을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열을 가지는 미코박테리움 속 균의 동시 검출용 프라이머 세트를 또다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머; 및
서열번호 4 내지 서열번호 13 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 프로브
를 포함하는 미코박테리움 속 균종의 감별용 키트를 또다른 특징으로 한다.
본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석 방법에 의하여 실제 임상분리주에 적용한 경우, 성공적으로 균주의 감별을 수행할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 임상적으로 문제되는 미코박테리움 속 균종을 간편하면서도 정확하게 감별, 동정하는 데에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석에 의하여 측정된 CH. 610에서의 용융 피크이다.
도 2는 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석에 의하여 측정된 CH. 640에서의 용융 피크이다.
도 3은 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석에 의하여 측정된 CH. 670에서의 용융 피크이다.
도 4는 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석에 의하여 측정된 CH. 705에서의 용융 피크이다.
본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 환자의 객담 샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4 내지 서열번호 13 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 프로브를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 Tm 값을 확인하여 미코박테리움 속 균종을 판독하는 단계를 포함하는 미코박테리움 속 균종의 동시 검출 방법을 제공한다.
상기 PCR 산물의 Tm 값은 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)을 통하여 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 방법에 의하여 검출될 수 있는 미코박테리움 속 균종으로는 M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. kansasii, M. massiliense 또는 M. tuberculosis 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열을 가지는 미코박테리움 속 균의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 미코박테리움 속 균주의 전체 1623bp로 구성된 열충격단백질 65(hsp 65) 유전자 중 698번째 ~ 991번째 서열까지의 304 bp의 증폭산물을 생성한다.
서열번호 1은 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex)의 hsp 65 유전자에서 698번째 ~ 720번째 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머이다.
또한 서열번호 2는 비결핵항산성균(Nontuberculous Mycobacteria)의 hsp 65 유전자에서 697번째 ~ 720번째 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머로서, 상기 서열번호 2의 염기서열중 Y는 C 또는 T를 의미한다.
또한 서열번호 3은 미코박테리움 속 전체 균주의 hsp 65 유전자에서 970번째 ~ 991번째 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머이다.
각 프라이머 서열과 특징을 하기 표 1에 정리하였다.
이름 프라이머 특이성 서열 (5'→3') T m (℃)
HSP-TBC-F M. tuberculosis complex CGCTGCTCGAGAAGGTCATCGGA
(서열번호 1)		 68.3
HSP-NTM-F Non-tuberculosis mycobacteria CCGYTGCTGGAGAAGGTCATYCAG
(서열번호 2)		 66.3 - 69.7
HSP-MYC-R Mycobacteria CGATGATGGTGGTCTCGTCCTTGGT
(서열번호 3)		 68.6
상기 프라이머와 하기 서열번호 4 내지 서열번호 13 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 프로브를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하고, PCR 산물의 Tm 값(용융점)을 확인하여 미코박테리움 속 균을 판독할 수 있다. 상기 프로브 중 프로브 센서(sensor)가 표적 염기서열을 검출하며, 각 프로브의 서열 및 타겟 균주를 하기 표 2에 정리하였다.
프로브 서열 (5'→3') 타겟 균주
MTC GGCGACCGACGCAAGGCGATGCT(서열번호 4) M. tuberculosis
complex
AGGATATGGCCATTCTCACCGGT(서열번호 5)
KAN TGATCAGCGAGGAGGTCGGCCTCACCCTG(서열번호 6) M. kansasii type I-VI
GCCGACCTGAGCCTGCT(서열번호 7)
INT GTCATCAGCGAAGAGGTCGGCCTGTCGCT(서열번호 8) M. intracellulare
GAGCGCCGATGTCGCCCTGCT(서열번호 9) M. fortuitum , M. peregrinum
AVI AGCGCCGACATCTCGCTGCTCGGTAA(서열번호 10) M. avium
M. avium subsp . hominissuis
ABS CCGCTGCTGATCATCGCCGAGGACGTC(서열번호 11) M. abscessus
GGGTGAGGCTCTGTCCAC(서열번호 12)
MAS GGGCGAGGCTCTCTCCACTC(서열번호 13) M. massiliense
상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되고, 각 형광물질은 특별히 제한되지 아니하나, 5' 말단에 표지되는 형광물질로는 Fluorescein이 사용될 수 있으며, 3' 말단에 표지되는 형광물질로는 LightCycler dye가 사용될 수 있다.
상기 PCR 산물의 Tm 값은 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)을 통하여 확인할 수 있으며, 이를 통하여 다양한 미코박테리움 속 균을 한 번의 PCR 과정을 통하여 검출할 수 있게 된다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으나, 하기의 실시예는 본 발명의 예시하기 위함이며, 특허청구범위에 의한 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 : DNA의 추출
본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 방법이 미코박테리움 균주의 감별을 가능하게 하는지 확인하기 위하여 미코박테리움 표준균주로는 하기 표 3의 9주의 균주를 사용하였다.
균종 균주
M. tuberculosis ATCC 27294
M. kansasii ATCC 12478
M. intracellulare ATCC 13950
M. intracellulare SNUMC 05-1390
M. fortuitum ATCC 6841
M. avium ATCC 25291
M. avium SMC 4006
M. abscessus ATCC　19977
M. massiliense KCTC 19086
Bead beater phenol (BB/P) 방법을 이용하여 상기 균주 및 환자 샘플 객담의 DNA를 추출하였다. 간단하게 설명하면 상기 균주의 집락 또는 객담을, TEN buffer(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM: pH 8.0)에 부유시킨 후에 직경 0.1 mm 초자구 (diameter 0.1 mm; Biospec Products, Bartlesville, Okla., U.S.A.) 100 ㎕ (packing volume)와 phenol: chloroform: isopropylalcohol (50:49:1) 용액 100 ㎕를 함께 부유시켜 mini beater로 1 분간 진탕하여 균체 또는 객담을 파쇄하였다.
균체 또는 객담 파쇄액은 12000 rpm으로 5 분간 원심분리하고 상층액(100 ㎕)을 새로운 tube에 옮긴 후, 60 ㎕의 isopropylalcohol을 섞고, 다시 15,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척한 후 TE(pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer 60 ㎕로 DNA를 회수하였다.
실시예 2 : 실시간 PCR 분석 키트 제작
hsp 65 DNA 의 증폭을 위하여 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머를 제작하였다.
그리고 서열번호 4 내지 서열번호 13의 프로브를 제작하되, 상기 프로브 앵커(anchor)는 3' 말단을 형광염료(fluorescein, TIM MOLBIOL Inc., Berlin, Germany)로 표지하고, 프로브 센서(sensor)는 5' 말단을 형광염료(LC Red610, LC Red640, LC Red670 또는 LC Red705, TIM MOLBIOL Inc., Berlin, Germany)로 표지하며, 3' 말단에 인산기(phosphate)를 부가하고, 상기 프로브 중에서 프로브 센서가 표적 염기서열을 검출할 수 있도록 설계하였다.
각 프로브의 검출 채널과 프로그램에 의하여 계산된 Tm 값, 및 검출 채널에서 나타나는 Tm 값을 하기 표 4에 나타내었다.
프로브 서열 (5'→3') T m
(℃)a 		타겟 균주 검출 채널(nm)/
T m (℃)
MTC GGCGACCGACGCAAGGCGATGCT 73.6 M. tuberculosis
complex		 610/67.2
LC Red610c-AGGATATGGCCATTCTCACCGGT- PHd 67.2
KAN TGATCAGCGAGGAGGTCGGCCTCACCCTG- FL 75.3 M. kansasii
type I-VI		 640/65.1 66.7
LC Red640e-GCCGACCTGAGCCTGCT- PH 65.2
INT GTCATCAGCGAAGAGGTCGGCCTGTCGCT- FL 74.8 M. intracellulare 640/72.9
LC Red640-GAGCGCCGATGTCGCCCTGCT- PH 72.9 M. fortuitum and M. peregrinum 640/61.4
AVI LC Red670f-AGCGCCGACATCTCGCTGCTCGGTAA- PH 73.7 M. avium 670/73.7
M. avium subsp . hominissuis 670/67.2
ABS CCGCTGCTGATCATCGCCGAGGACGTC- FL 73.6 M. abscessus 705/63
LC Red705g-GGGTGAGGCTCTGTCCAC- PH 63
MAS LC Red705-GGGCGAGGCTCTCTCCACTC- PH 67 M. massiliense 705/67
a) LC PDS software V 2.0 에 의하여 계산됨
b) Fluorescein
c) LightCycler dye Red610
d) Phosphate
e) LightCycler dye Red640
f) LightCycler dye Red670
g) LightCycler dye Red705
실시예 3 : 실시간 PCR 분석 키트를 이용한 미코박테리움 균의 검출
상기 실시예 2에서 제작한 실시간 PCR 분석키트에 포함된 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR 증폭방법을 다음과 같이 수행하였다: 마스터믹스(Taq buffer(LC Faststart DNA Master HP kit(Roche Diagnostics)): 1.0 ㎕, 50 mM MgCl2: 0.4 ㎕(3 mM), HSP-TBC-F 프라이머(서열번호 1) : 0.15 ㎕(0.3 μM), HSP-NTM-F 프라이머(서열번호 2) :　0.2 ㎕(0.4 μM), HSP-MYC-R 프라이머(서열번호 3) 0.5 ㎕ (1.0 μM), 프로브(서열번호 4 ~ 13) 각각 0.4 ㎕(0.2 μM), 증류수: 0 또는 1.75 ㎕, 및 상기 실시예 1에서 얻은 균체 DNA : 3.75 ㎕ 또는 객담 샘플 DNA: 2.0 ㎕)를 실시간 PCR 기기(LightCycler 2.0 system)의 캐필러리에 10 ㎕씩 분주하였다. 그런 다음, 상기 캐필러리를 실시간 PCR 기기의 캐로셀(carousel)에 삽입하고, 실시간 PCR 기기용 프로그램(LightCycler software 4.05)을 이용하여, 증폭 사이클(95℃에서 10분간 1회 denaturation 및, 95℃에서 10초, 65℃에서 20초 및 72℃에서 20초의 45사이클)로 실시간 PCR을 수행하면서 각 사이클마다 형광값을 측정하였다.
그런 다음, 융해곡선(melting curve) 분석을 수행하기 위하여, 57℃에서 90℃까지 초당 0.1℃(0.1℃/s) 씩 올리면서 형광량을 측정하였다. 사이클 중에 생성된 증폭산물에 결합한 프로브에 의해 발생된 증폭신호를 검출하여 성공적인 증폭산물 생성을 모니터링하였다. 그런 다음, 증폭사이클이 종료되면, 곧바로 이어진 융해곡선 분석을 시행하여, 검체 DNA의 표적부위에 결합한 프로브의 Tm 값을 상기 프로그램을 이용하여 측정하였다. 실험은 3회 반복되었으며 그 평균값을 측정하였다.
검체 내에서 미코박테리움 속 균주의 상기 실시간 PCR을 수행하여 나타난 Tm 값을 하기 표 5에 나타내었으며, 상기 실시간 PCR을 수행하여 각 채널별로 나타난 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.
균종 균주 T m (℃) 측정된 T m (℃)
CH. 610 CH. 640 CH. 670 CH. 705
M. tuberculosis ATCC 27294 67.2 66.9 ± 0.02 - - 57.8 ± 0.10
M. kansasii ATCC 12478 65.1-
66.7		 - 67.0 ± 0.01 - 57.4 ± 0.18
M. intracellulare ATCC 13950 72.9 61.5 ± 0.02 73.0 ± 0.02 - 58.2 ± 0.31
M. intracellulare SNUMC 05-1390 70.7 61.6 ± 0.02 70.0 ± 0.06 - 58.4 ± 0.18
M. fortuitum ATCC 6841 61.4 - 60.6 ± 0.06 - -
M. avium ATCC 25291 73.7 60.9 ± 0.00 - 74.0 ± 0.05 60.4 ± 0.03
M. avium SMC 4006 67.2 60.7 ± 0.05 - 70.5 ± 0.03 60.0 ± 0.07
M. abscessus ATCC　19977 63.0 - - - 68.3 ± 0.37
M. massiliense KCTC 19086 67.1 - - - 71.0 ± 0.07
상기 7종의 미코박테리움 속 균종으로부터의 PCR 산물은 명확하게 분리되었으며, 이론적으로 계산된 Tm 값과 유사한 특이적 Tm 값을 가지는 것을 확인할 수 있었다. M. tuberculosis 의 경우에는 CH. 610에서 다들 균종에 비하여 5℃ 이상 높은 Tm 값을 나타내었으며, M. avium 은 CH. 670에서 다른 균종에 비하여 5℃ 이상 높은 Tm 값을 나타내어 구분될 수 있었다. 또한, M. abscessus 와 M. massiliense도 CH. 705에서 Tm 값이 2℃ 이상의 차이를 나타내므로 분리가 가능하였다. 더욱이, M. avium 과 M. intracellulare 의 경우 동종의 균주간에도 분리가 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 4 : 미코박테리움 임상분리주의 동정
본 발명에서 개발된 다중 프로브 실시간 PCR 에 의한 미코박테리아 임상분리주의 동정에 있어서의 유용성을 평가하기 위하여, 이미 알려진 RNA 중합효소 β 서브유닛 유전자(rpoB)를 표적으로 하는 PRA 분석(PCR restriction fragment length polymorphism analysis)에 의하여 결핵균을 탐지하는 방법과 비교하였다. 즉, 먼저 두가지 방법에 의하여 총 133 주의 임상분리주를 대상으로 하여 감별을 수행하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
rpoB PRA 다중 프로브 실시간 PCR
균종 동정 수 균종 동정 수
M. abscessus 33 M. abscessus 16
M. massiliense 17
M. avium 18 M. avium 18
M. fortuitum 7 M. fortuitum 7
M. intracellulare 26 M. intracellulare 26
M. kansasii 25 M. kansasii 25
M. tuberculosis 24 M. tuberculosis 24
Total 133 Total 133
상기 표 6에서 보는 바와 같이 rpoB PRA 분석에 의해서는 분리되지 아니하였던 M. abscessus 과 M. massiliense 가 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석에 의하여 분리될 수 있음을 확인할 수 있었다. 상기 두 균주는 항생물질의 민감성 패턴, 역학적 구성, 임상 결과 등에 있어 차이가 있으므로 그 분리가 중요한 것으로 인식되어 왔으나, 두 균주간에 높은 서열 보전성에 기인하여 종전에는 그 분리가 어려웠다. 따라서 본 발명의 분석에 의하여 이러한 어려움을 해결할 수 있음을 확인하였다.
그리고, 상기 결과를 기존의 생화학적인 방법으로 동정된 결과와 서로 비교한 결과, 100% 일치하는 결과를 보였다.
이상의 결과는 본 발명의 다중 프로브 실시간 PCR 분석 방법이 미코박테리움 균종 동정에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Method and kit for identification of Mycobacterium sp. using real-time PCR <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP-TBC-F primer <400> 1 cgctgctcga gaaggtcatc gga 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP-NTM-F primer <400> 2 ccgytgctgg agaaggtcat ycag 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP-MYC-R primer <400> 3 cgatgatggt ggtctcgtcc ttggt 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTC probe anchor <400> 4 ggcgaccgac gcaaggcgat gct 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTC probe sensor <400> 5 aggatatggc cattctcacc ggt 23 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN probe anchor <400> 6 tgatcagcga ggaggtcggc ctcaccctg 29 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN probe sensor <400> 7 gccgacctga gcctgct 17 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INT probe anchor <400> 8 gtcatcagcg aagaggtcgg cctgtcgct 29 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INT probe sensor <400> 9 gagcgccgat gtcgccctgc t 21 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AVI probe sensor <400> 10 agcgccgaca tctcgctgct cggtaa 26 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABS probe anchor <400> 11 ccgctgctga tcatcgccga ggacgtc 27 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABS probe sensor <400> 12 gggtgaggct ctgtccac 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS probe sensor <400> 13 gggcgaggct ctctccactc 20

Claims (6)

  1. 환자의 객담 샘플에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머들 및 서열번호 4 내지 서열번호 13의 프로브들을 첨가하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 Tm 값을 확인하여 Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium massiliense 및 Mycobacterium tuberculosis을 감별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미코박테리움 속 균종의 동시 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 PCR 산물의 Tm 값은 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)을 통하여 Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium massiliense 및 Mycobacterium tuberculosis을 감별하는 것을 특징으로 하는 미코박테리움 속 균종의 동시 검출 방법.
  3. 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열을 가지는 미코박테리움 속 균종의 동시 검출용 프라이머 세트.
  4. 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머들; 및 서열번호 4 내지 서열번호 13의 프로브들을 포함하는 것을 특징으로 하는 미코박테리움 속 균종의 감별용 키트.
  5. 삭제
  6. 삭제
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