KR100985196B1 - 비결핵항산성균의 감별 방법 및 이를 위한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비결핵항산성균의 감별 방법 및 이를 위한 키트에 대한 것으로, 미코박테리아의 hsp65 유전자 염기서열을 다정렬하고 분석함으로써, 균주 배양 없이 객담(sputum : 가래)으로부터 직접 비결핵항산성균군을 특징지을 수 있는 3 개의 signature 염기서열을 발견한 것이다. 그리고 이러한 염기서열을 이용하여 비결핵항산성균군에 특이적인 PCR 산물을 생산하는 프라이머 쌍들을 제조하였고, 이들 프라이머를 이용한 Nested PCR-Direct Sequencing(NPDS) 방법에 의해 종래보다 현저히 우수하게 비결핵항산성균군을 감별하였다.

비결핵항산성균, 객담, hsp65 유전자

Description

비결핵항산성균의 감별 방법 및 이를 위한 키트{Method and kit for identification of nontuberculous mycobacteria}

본 발명은 비결핵항산성균의 감별 방법 및 이를 위한 키트에 대한 것으로, 균주 배양 없이 객담(sputum : 가래)으로부터 직접 비결핵항산성균군을 특징지을 수 있는 signature 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

미코박테리움 속 균종은 병원성 정도에 따라 절대병원성균인 결핵균군과 기회감염성 균종인 비결핵항산성균으로 두 그룹으로 구분할 수 있다. 결핵균 군에 속하는 균으로는 인형결핵균인 M. tuberculosis 우형결핵균인 M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti 등이 있고, 이들을 제외한 M. avium과 M. intracellulare 등을 포함한 나머지 약 100여 가지의 미코박테리아균종이 비결핵항산성균 (Nontuberculous mycobacteria)에 포함된다. 병원성이 높은 결핵균 이외에도 비결핵항산성균종 역시 기본적으로 항결핵제에 내성을 가지고 있고, 면역이 저하된 환자에서 심각한 질환을 일으킬 수 있으며, 또한 각 균종의 종류에 따라 각기 다른 항생제 감수성 패턴을 가지고 있기 때문에 이들 균종의 정확한 임상치료를 위해서는 종 수준으로의 균 분류가 중요하다. 현재, 임상실험실에서 비결핵항산성균종의 종 수준으로의 동정은 주로 균주 배양 형태 및 색소형성여부 혹은 생화학적인 검사법에 주로 의존하고 있다.

그러나 이러한 방법은 숙달된 숙련가가 필요하며, 또한 각 실험실마다 재현성에 문제가 있는 실정이다. 그리고 결정적으로는 배양에 의존하여 실험을 수행하므로 느린 발육기간을 가지고 있는 미코박테리아의 생물학적 특성상 환자의 치료시기를 놓칠 수 있다. 따라서 이러한 기존의 생화학적 감별 방법의 단점을 보완하기 위하여 시계분자인 16S rRNA, rpoB , 및 hsp65 유전자 염기서열을 분석하거나, 혹은 이들 유전자를 표적으로 하는 PCR 후 제한효소 절단 분석방법 (PCR-RFLP)등을 이용하여 미코박테리움 속 균종을 동정한다. 그러나, 이러한 시계분자를 표적으로 하여 미코박테리움 속 균종을 동정하는 방법은 순수 배양된 배양 균주의 경우에는 정확한 결과를 나타내지만, 여러 호흡기 및 구강 정상상재균이 혼재되어 있는 객담의 경우에는 PCR을 수행하였을 때 표적으로 사용하고 있는 시계분자들의 염기서열이 모든 균종간에 서로 보존되어 상동성이 높기 때문에 동정에 어려움이 있다. 즉, 구강 및 호흡기 정상상재균의 DNA가 동정의 표적인 미코박테리아 균종의 DNA와 동시에 증폭되기 때문에 균 동정에 어려움이 있다.

한편, 미코박테리아 균종은 모든 세균 중에서 가장 느리게 자라는 균종 중에 하나 이기 때문에 (7일-1달), 배양 과정 없이 바로 객담에서 균종을 동정하는 방법이 환자의 치료시기를 실기하지 않기 위하여 반드시 필요하다.

현재, 미코박테리아 균종 중에서 병원성이 가장 높은 결핵균의 경우에는 시계분자 이외의 결핵균 특이적인 IS6110과 같은 결핵균 특이적인 유전자 분절을 표적으로 하여 객담에서 직접 이 균종을 검출하는 방법이 실제로 임상실험실에서 널리 사용되고 있다. 그러나, 비결핵항상성균종의 경우에는 100여 가지의 다양한 균종으로 구성되어 있기 때문에 이들 균종의 객담에서의 정확한 동정을 위해서는 모든 비결핵항산성 균종의 PCR 증폭을 가능하게 하는 시계분자를 표적으로 하여야 한다. 이유로, 객담에서 직접 시계분자를 표적으로 하여 비결핵항산성균종을 동정할 수 있는 방법의 개발이 환자의 치료 및 국민 보건역학적인 중요성을 감안하여 반드시 필요한 실정이다.

이를 위하여, 본 발명에서는 미코박테리아의 hsp65 유전자의 604-bp 염기서열 절편을 분석하여, 객담에 혼재되어 있는 정상상재균(예를 들어, Rothia mucilaginosa spp.)을 배제할 수 있는 것으로 미코박테리아 균종 특이적인 hsp65 signature 염기서열을 발견하였다. 그리고, 이러한 염기서열의 일부를 이용하여, 정상상재균의 증폭을 제한하면서 모든 미코박테리아의 특이적인 증폭을 가능하게 하는 MspuF-MspuR 프라이머 쌍을 제조하였다. 그래서, 종래에 비결핵항산성균군에 특이적인 PCR 산물을 생산하는 프라이머 쌍으로 1차 PCR 증폭산물을 얻고, 이로부터 상기 MspuF-MspuR 프라이머 쌍으로 2차 PCR 증폭산물을 얻는 Nested PCR-Direct Sequencing(NPDS) 방법에 의하여, 객담으로부터 직접 비결핵항산성균군을 종래보다 현저히 우수하게 감별하고자 하는 것이다.

현재, 객담에서 직접 결핵균 및 비결핵항산성균을 감별하는 데에 주로 사용되는 방법은 결핵균 및 기타 비결핵항산성균을 종 수준에서 동정할 수 있는 probe-hybridization 방법 및 DNA chip등의 개발이 수행되고 있으나 이러한 방법은 고가의 장비 및 검사비용이 소요된다. 또한, 이러한 방법들은 모든 미코박테리아 균종에 보존되어 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하기 때문에, 결핵균과 비결핵항산성균종이 혼재되어 있는 경우에 있어서 객담에 다수로 존재하는 결핵균은 검출하기 용이하나, 소수로 존재하거나 혹은 검출하기 어려운 비결핵항산성균의 존재를 검출 하지 못하는 경우가 흔하다.

그러나, 본 발명에 따른 1차 PCR의 경우 비결핵항산성균종 특이적인 hsp65 DNA만 증폭이 가능한 프라이머 시스템을 사용하기 때문에, 심지어 결핵균이 존재하는 객담검체에서도 혼재되어 있는 비결핵항산성균종을 정확히 검출할 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점은 본 발명에서만 가지고 있는 특성으로서 향후 객담에서 직접 비결핵항상성균종의 동정뿐만 아니라, 결핵균 존재 검체에서도 동시 감염되어 있는 비결핵항상성균을 검출할 수 있도록 하여 환자의 치료를 위한 동정뿐만 아니라, 미코박테리움증 분자역학적 연구를 위하여 유용하게 사용될 수 있는 획기적인 방법일 것이다.

이에, 본 발명자들은 선 확보된 대한민국 등록특허 제10-692484호를 기초로 하여, 이 특허에서 구축된 비결핵항상성균 특이적인 프라이머 시스템을, 본 특허에서 개발된 Rothia spp를 배제하면서 동시에 미코박테리아 균종 특이적인 증폭을 가능하게 하는 프라이머 시스템과 연계하여 객담으로부터 직접 미코박테리아를 동정할 수 있게 하는 NPDS 시스템을 개발하는 것에 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시형태에 따른 비결핵항산성균의 감별 방법은, (S1) 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자를, 서열번호 1에 따른 염기서열을 가지는 전 방향 프라이머와 서열번호 2에 따른 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 증폭시켜서, PCR 증폭산물을 생산하는 단계; (S2) 상기 생산된 PCR 증폭산물의 5'말단부터 상기 HSP65 유전자의 423번째 염기, 424번째 염기 및 701번째 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 유전자 분절을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여, 해당 유전자 분절을 증폭하는 단계; (S3) 상기 증폭된 유전자 분절의 염기서열을 분석하는 단계; 및, (S4) 상기 423번째 염기, 424번째 염기 또는 701번째 염기를 비교하는 단계를 포함하고, 상기 비교에서 비결핵항산성균은 423번째 염기가 G 또는 C, 424번째 염기가 C 또는 701번째 염기가 C인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 실시형태에 따른 비결핵항산성균의 감별 키트는, 비결핵항산성균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍과 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 한다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 대한민국 등록특허 제10-692484호에 따른 MOTT3F-MOTT3R 프라이머를 이용한 시스템이 19개의 객담 검체에서 미코박테리아 균주를 전부 동정하지 못한 반면에, 본 발명에 따른 NPDS 방법은 높은 정확도로 미코박테리아 균주를 동정할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 NPDS 방법은 객담에서 직접 배양 없이 직접 미코박테리아를 종 수준으로의 동정하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 결핵균과 비결핵항상성균에 동시감염된 환자 유래의 객담에서도 비결핵항산성균종의 동정이 가능한 혁신적인 방법이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 비결핵항산성균의 감별 방법은, 먼저 (S1) 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자 중에서 비결핵항산성균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산한다. HSP65 유전자를 PCR로 증폭시키는 경우, 대한민국 등록특허 제10-692484호(상기 등록특허의 도 1 참조)에서와 같이 비결핵항산성균 특이적인 PCR 산물(NonTuberculous Mycobacteria:NTM)과 결핵균 특이적인 PCR 산물(Tuberculosis:TB)이 증폭되는데, 본 발명은 상기 비결핵항산성균 특이적인 PCR 산물을 이용하여 객담에서 직접 비결핵항산성균을 감별하고자 하는 것이다.

이를 위하여, 본 발명에서는 HSP65 유전자로부터 비결핵항산성균에 특이적인 PCR 산물을 얻기 위하여, 상기 등록특허 제10-692484호에 기재된 것으로 서열번호 1에 따른 염기서열을 가지는 전 방향 프라이머(MOTT3F)와 서열번호 2에 따른 염기서열을 가지는 역방향 프라이머(MOTT3R)를 사용하는 것이 적합하다. 본 명세서에서도 상기 MOTT3F-MOTT3R 프라이머의 염기서열을 서열번호 1, 2로 표시하였으며, 아래의 실시예에서도 이것들을 사용하여 비결핵항산성균 특이적인 PCR 산물을 증폭시켰다.

다음으로, 본 발명은 (S2) 상기 생산된 PCR 증폭산물의 5'말단부터 상기 HSP65 유전자의 423번째 염기, 424번째 염기 및 701번째 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 유전자 분절을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여, 해당 유전자 분절을 증폭하는 단계를 거친다. 본 발명은 객담에서 미코박테리아 균종의 hsp65 유전자 증폭을 방해하는 구강 정상 상재균 Rothia spp.의 hsp65 유전자 증폭을 선택적으로 제한할 수 있는 프라이머를 제조하기 위하여, 상기 Rothia spp.와 다르고 모든 미코박테리아에 공통적인 미코박테리아 균종 특이적인 hsp65 signature 염기서열을 결정하였고, 상기 결정된 염기서열이 바로 상기 HSP65 유전자의 423번째 염기, 424번째 염기 또는 701번째 염기였다.

즉, 본 발명은 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자를 기준으로 5' 말단에서 423번째 염기가 G 혹은 C, (G+C = S), 424번째 염기가 C, 701번째 염기가 C를 포함하는 DNA 단편을 제공하는 것이 특징이고, 상기 DNA단편은 Rothia spp에 대하여 미코박테리아균에 특이적인 것이 바람직하다.

본 발명은 상기한 3개의 signature 염기서열을 이용하여, 미코박테리아의 특이적인 증폭을 가능하게 하는 것으로 서열번호 3에 따른 염기서열을 가지는 정방향 프라이머(MspuF)와 서열번호 4에 따른 염기서열을 가지는 역방향 프라이머(MspuR)를 새롭게 제조하였고, 이들을 이용하여 객담에서 직접 비결핵항산성균을 용이하게 감별할 수 있는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 NPDS 시스템을 개발하였다.

다시 말해서, 본 발명은 먼저 비결핵항산성균군에 특이적인 PCR 산물을 생산하는 프라이머 쌍으로 1차 PCR 증폭산물을 얻고, 이로부터 상기 MspuF-MspuR 프라이머 쌍으로 2차 PCR 증폭산물을 얻는 Nested PCR-Direct Sequencing(NPDS) 방법에 의하여, 객담으로부터 직접 비결핵항산성균군을 종래보다 현저히 우수하게 감별하고자 하는 것이다.

다음으로, 본 발명은 (S3) 상기 증폭된 유전자 분절의 염기서열을 분석하고, (S4) 상기 423번째 염기, 424번째 염기 또는 701번째 염기를 비교하는 단계를 포함하며, 상기 비교에서 423번째 염기가 G 또는 C, 424번째 염기가 C 또는 701번째 염기가 C인 경우 비결핵항산성균인 것으로 결정하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같은 본 발명은 hsp65 유전자 염기서열을 표적으로 하고, 균주의 배양 없이 직접 객담에서 비결핵항산성 균종을 동정할 수 있는 nested PCR 시스템을 제공하는 것이다. 종래의 비결핵항산성 균종 검출방법(등록특허 제10-692484호에 따 른 이중 PCR 방법)은 배양 균주에서 균 동정하는 데에는 탁월한 장점을 보이지만, 이 방법을 직접 객담에 적용하는 경우, 비결핵항산성균 특이적인 프라이머가 객담에 존재하는 정상상재균 특히 Rothia sp.의 DNA를 함께 증폭시키기 때문에 비결핵항상성 균종을 동정하는 데에는 심각한 문제점이 있다. 이를 극복하기 위하여, 본 발명에서는 객담 DNA에서 Rothia sp.의 증폭을 배제할 수 있는 새로운 nested PCR 프라이머를 발명한 것이다.

즉, 본 발명은 종래의 비결핵항산성 균종 검출방법(등록특허 제10-692484호)에 따라 비결핵항산성균종 특이적인 PCR 증폭을 가능하게 하는 프라이머 시스템과 본 특허에서 발명된 PCR 프라이머 시스템을 연계하여, 객담에서 직접 비결핵항산성 균종을 동정할 수 있는 nested PCR-direct sequencing (NPDS) 방법을 발명한 것이다.

실제로, 본 발명에서 소개된 NPDS 방법을 상기 등록특허 제10-692484호에 의해 결핵균 DNA가 검출되지 않는 19 개의 항산성 염색 양성 객담에 적용한 경우, 상기 등록특허는 모든 검체에서 주로 Rothia spp,의 간섭 증폭에 의하여 비결핵항상성균 동정에 실패한 반면에(정확도 0%), 본 발명에 따른 NPDS 방법은 19 개의 검체 중 16개에서(84.2%) 정확히 비결핵항산성균을 동정할 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 NPDS방법을 결핵균 DNA가 검출된 36 개의 항산성 염색 양성 객담에 적용하였을 때에도 25 개의 검체에서 비결핵항성균을 동정할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명은 배양없이 객담에서 직접 비결핵항상성균을 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 결핵균 과 비결핵항상성균의 동시감염된 환자 유래 객담에서도 비결핵항산성균종의 동정을 가능하게 하는 현저히 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실험예 1: 등록특허 제10-692484호에 따라 비결핵항산성균을 감별할 수 있는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 프라이머 PCR 시스템의 객담 검체의 적용

본 발명에 따른 실시예를 설명하기에 앞서서, 등록특허 제10-692484호에 따라 비결핵항산성균을 감별할 수 있는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 프라이머 PCR 시스템을 객담 검체에 적용해 보았다.

515-bp의 hsp65 유전자 분절을 증폭시키는 등록특허 제10-692484호의 발명과 같이, 배양 균주에 적용하였을 때에 비결핵항산성균의 감별에 유용한 MOTT3F-MOTT3R PCR 시스템(즉, PCR 증폭 후 직접 염기서열 분석 방법 시스템)을, 항산성 염색 양성이고 결핵균 특이적이며 IS6110 PCR 음성인(즉, 비결핵항산성균주의 감염이 추정되는) 19개의 객담 검체에 적용하여 보았다. 515-bp의 hsp65 유전자 분절 중에서도, 가장 정확한 염기서열만을 깨끗하게 분석할 수 있도록, 233~654번째 염기서열인 422-bp의 hsp65 유전자 분절을 이용하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 19개 중에서 3 개의 검체에서는 PCR 증폭산물을 생산하지 않았고, 나머지 16개 객담에서는 모두 증폭산물을 생산하였으나, 이 산물을 직접염기서열 분석 방법으로 염기서열 분석 후 Blast 상동성 검색을 수행한 결과, 모두 구강 정상상재 세균의 일종인 Rothia mucilaginosa와 높은 상동성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(98%). 즉, 모든 검체에서 예상했던 비결핵항산성 균주를 동정할 수 없었다(민감도 0%). 이에 따라, 배양과정 없이 직접 객담에서 비결핵항산성 균주를 동정하기 위해서는 기존 PCR의 민감도를 개선하고, 또한 객담에 존재하는 Rothia spp.의 hsp65 유전자 분절의 증폭을 배제할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요함을 확인할 수 있다.

[표 1: 종래(등록특허 제10-692484호)의 PCR 방법(PCR)과 본 특허에 따른 nested PCR 방법(Nested-PCR) 및 객담 배양 균주 동정 방법(Culture result)에 따라, 비결핵항산성균종 감염이 추정되는 환자 객담를 대상으로 한 미코박테리아 균 동정 결과의 비교 분석]

실시예 1 : Rothia spp . 대한 미코박테리아 특이적인 hsp65 signature 염기서열

Rothia spp.에 대하여 미코박테리아 균주 특이적인 signature 염기서열을 분석하기 위하여, 이미 확보된 특허 제 0486820호에서 분석된 54 주의 미코박테리아 표준 균주들 각각의 604-bp hsp65 유전자 염기서열을 다정렬한 후, Genbank 데이터베이스에서 Rothia mucilaginosa ATCC95296의 hsp65 유전자 염기서열을 확보하여 이들 염기서열을 서로 비교 분석하였다.

그 결과, 도 1에서 보이는 것처럼 결핵균의 전체 HSP65 단백을 기준으로 할 때 모두 3 곳의 염기서열에서 Rothia mucilaginosa ATCC95296와 구분할 수 있는 미코박 테리아 특이적인 signature 염기서열을 확인할 수 있었다. 첫 번째는, 전체 1623 개의 결핵균 hsp65 유전자 분절을 기준으로 할 때 (GenBank No. M15467) 5' 말단에서 423번째 염기이다. 이 부위의 염기서열은 미코박테리아 균주인 경우 G 혹은 C, (G+C = S),인 반면에 Rothia mucilaginosa ATCC95296 (Genbank No. AY123718)주는 A이다. 두 번째는 424번째 부위 염기이다. 이 부위의 염기가 미코박테리아 균주인 경우 C 이지만, Rothia mucilaginosa ATCC95296의 경우는 G이다. 마지막 세 번 째 염기는 701번째 부위 염기이다. 이 부위의 염기가 미코박테리아인 경우 C이지만 Rothia mucilaginosa ATCC95296의 염기는 A이다.

본 발명에서 확인된 Rothia spp.와 구별되는 미코박테리아 특이적인 hsp65 유전자 signature 염기서열은 향 후, 객담에서 Rothia spp.를 배제하여 미코박테리아 균종 특이적인 hsp65 유전자 분절을 증폭하는데 이용될 수 있을 것이므로, 궁극적으로는 객담에서 미코박테리아아 균종 동정에 효과적으로 이용될 수 있는 직접염기서열 분석방법, 다중 PCR 방법 등의 개발, 혹은 probe-hybridization 방법의 개발, DNA-chip의 개발 등에 효과적으로 응용될 수 있을 것임은 주지의 사실이다.

실시예 2 : 항산성 염색 양성 객담 검체에서 미코박테리아 균종의 동정을 가능하게 하는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 nested PCR direct sequencing ( NPDS ) 방법 개발

1. 객담 검체에서 Rothia spp . 의 hsp65 유전자 분절의 증폭을 배제할 수 있는 마이코박테리아 특이 hsp65 프라이머 쌍 제조

본 발명에서 목적으로 하는, 즉 객담에서 구강 및 호흡기 상재세균의 hsp65 유전자 분절의 증폭을 배제하고 미코박테리아균종의 hsp65 유전자 분절의 증폭을 가능하게 하는 nested PCR을 개발하기 위해서는 우선 미코박테리아 균 특이적인 프라이머 쌍을 제조해야 한다. 이를 위하여, 본 특허에서는 도 1에 도시된 바와 같이, 미코박테리아 균종 특이적인 정방향 프라이머(MspuF)로써는, 연속적인 두 개의 미코박테리아 균종 특이적인 signature 염기(S, C : 423과 424 번째 염기)가, 3' 말단에 오도록 프라이머를 설계하였다(도 1에서 402~424번째 염기). 또한, 역방향 프라이머인 경우 701 번째 염기에 위치한 미코박테리아 signature 염기가 3' 끝에서 두번 째 위치에 오도록 설계하여(도 1에서 700~722번째 염기) Rothia spp,의 hsp65 분절이 증폭되지 않도록 하였다.

즉, 본 발명은 비결핵항산성균군에 특이적인 PCR 산물로부터 정상상재균의 증폭을 제한하면서 모든 미코박테리아의 특이적인 증폭을 가능하게 하는 프라이머 쌍으로써, 비결핵항산성균군에 특이적인 PCR 산물을 생산하는 정방향(forward) 프라이머(MspuF: 5'-CAA GGA GGT SGA GAC CAA GGA SC -3' S는 G또는C를 의미)(서열번호 3)와, 역방향 (reverse) 프라이머(MspuR: 5'-YTG CTG GAG AAG GTC ATY CAG G C -3' Y는 C또는T를 의미)(서열번호 4)를 제조하였다.

2. Nested PCR 방법 개발

1) 미코박테리아 표준균주

본 발명에 따른 Nested PCR 방법이 객담에서 미코박테리아 균종 감별을 가능하게 하는지를 확인하기 위해서, 실험예 1의 종래의 PCR 방법으로 객담에서 직접 미코박테리아 균종 감별에 실패하여 결핵균이 검출되지 않은 19개의 항산성 염색 양성 검체를 사용하였다.

2) DNA 추출

Bead beater phenol (BB/P) 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 간단하게 설명하면 객담을, TEN buffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM: pH 8.0)에 부유시킨 후에 직경 0.1 mm 초자구 (diameter 0.1 mm; Biospec Products, Bartlesville, Okla., U.S.A.) 100 ㎕ (packing volume)와 phenol: chloroform: isopropylalcohol (50:49:1) 용액 100 ㎕를 함께 부유시켜 mini beater로 1 분간 진탕하여 객담을 파쇄하였다. 객담 파쇄액은 12000 rpm으로 5 분간 원심분리하고 상청액 (100 ㎕)을 새로운 tube에 옮긴 후, 60 ㎕의 isopropylalcohol을 섞고, 다시 15,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척한 후 TE (pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer 60 ㎕로 DNA를 회수하였다.

3) Nested PCR

Nested PCR의 제1 PCR은 등록특허 제10-692484호에서 개발된 비결핵항산성균주 특이적인 515-bp hsp65 유전자 분절을 증폭시키는 전방향 프라이머 MOTT3F(MOTT3F: 5'GAR GTY GCC AAG AAG ACB GAC-3' R은 A또는G, Y는 C또는T, B는 G또는T또는C를 의미, 서열번호 1)와 후방향 프라이머 MOTT3R(MOTT3R: 5'AGC AGC GGC TTG CCV SMC TG-3' V는 G또는A또는C, S는 G또는C, M은 A또는C, 서열번호 2)을 사용하였다. 두 번째 PCR은 본 발명에서 새롭게 개발한 MspuF-MspuR 프라이머를 이용하였다.

PCR 반응은 2 U의 Taq polymerase, 10 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂을 포함하는 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)을 이용하였다. 조건은 첫 번째 PCR인 경우 비결핵항산성균군 특이적인 프라이머 set인 MOTT3F-MOTT3R을 각각 10 pmol 넣고, 객담 DNA 20 ng을 넣고, 증류수를 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 첨가하여 혼합물을 만들었다. PCR은 first denature 95℃로 5분, 30 cycle로 denaturation 95℃ 1분 annealing 62℃ 45초 extension 72℃ 1분, final extension 72℃ 5분으로 수행하였다(Model 9600 thermocycler, Perkin-Elmer cetus). 두 번째 PCR은 상기 첫 번째 PCR에 의해 525-bp로 증폭된 산물을 주형 DNA로 하여 2 ㎕를 사용하고, 프라이머로는 MspuF-MspuR을 사용한 것을 제외하고는 첫 번째 PCR 조건과 같이 하였다. 그리고, 만들어진 제2 PCR 증폭산물을 1 % 아가로스 젤에 전기영동 하여 확인하였다. 19개의 객담 D NA를 대상으로 nested PCR을 수행한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 모든 검체에서 321-bp의 미코박테리아 특이적인 hsp65 유전자 분절 증폭산물을 생산함을 확인할 수 있었다.

4) 중합효소 연쇄반응 산물의 정제

1% 겔에 전기영동 후, 반응산물 부위의 겔을 자른 다음 새로운 튜브에 옮겨 DNA을 추출하였다. DNA 추출 및 정제는 Qiaex(Qiagen, Germany) 시스템을 이용하였다. Gel solubilizing solution QX1 500 ㎕을 겔을 포함한 튜브에 첨가한 후 50 ℃에 15분간 방치하여 겔을 완전히 녹였다. 그 후 겔 비드를 10 ㎕을 첨가하여 완전히 섞은 후에 50 ℃에 15분간 방치하였다. 그 사이 1분 간격으로 튜브를 10초씩 vortex를 수행하여 비드가 골고루 퍼지도록 하였다. 이 후 QX1으로 1번, QF로 2번 세척한 후 45 ℃에서 10분간 말린 후 TE 버퍼 20 ㎕로 DNA을 회수하였다.

5) hsp65 분절의 자동염기서열 분석

자동 염기서열 분석은 겔 용출 산물을 주형 DNA로 사용하였다. 주형 DNA 60 ng, 프라이머 1.2 pmol, BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(PE Appied Biosystems) 2 ㎕을 섞고, 증류수를 첨가하여 총 부피 10 ㎕로 제조하였다. 반응은 Perkin Elmer Cetus 9600을 사용하여, 95 ℃ 10 초, 60 ℃ 10 초, 60 ℃ 4 분으로 25 사이클로 실시하였다. 반응이 끝난 샘플은 에탄올 침전방법으로 DNA를 정제하였다. 즉, 증류수 180 ㎕, 3M 소듐 아세테이트 10 ㎕을 첨가하여 총 200 ㎕로 만든 후, 이 혼합물에 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 잘 섞은 다음 15000 rpm 으로 20분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 그 후 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가한 후 15000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 DNA를 세척하였다. 그 후 DNA를 Deionized Formimide(PE Appied Biosystems)로 회수하였다. 이렇게 정제된 DNA를 95 ℃로 5분간 반응하여 단일가닥 DNA로 만든 후, ABI 3100 시스템을 이용하여 2시간 30분 동안 전기 영동하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 방법은 역방향 프라이머 MspuR 을 사용하여 염기서열을 분석하였고, 전체 321-bp 중에서 265-bp의 염기서열 (408 번째 염기에서 672 번째 염기)을 결정하였다.

증폭된 중합효소 연쇄반응 산물을 전기에서 상술한 대로 정제한 후 클로닝 과정 없이 직접 자동염기서열분석 방법으로 결핵균의 전체 hsp65 염기서열 순서를 기준으로 408번째 염기에서 672 코돈의 첫 번째 염기까지 265-bp의 염기서열을 분석하였다(도 1 참조). 그 결과, 어떤 모호한 결과(표적유전자가 genome 상에 여러 개 존재하고, 그들 사이의 염기서열이 다르면 다른 부위의 염기서열은 직접 염기서열 분석 상에서 염기서열이 겹쳐 나오기 때문에 정확한 염기서열을 결정할 수 없다) 없이 19 개의 객담 모두 265-bp의 염기를 성공적으로 결정할 수 있었다.

(6) 19개의 객담으로부터 증폭된 265-bp hsp65 유전자 비교염기서열 분석에 의한 미코박테리아 균종 동정

등록특허 제10-692484호에서 완성된 미코박테리아 표준균주 54 주의 hsp65 604-bp 염기서열 데이터베이스 중에서, 가장 정확한 염기서열만 깨끗하게 분석되어 본 특허에 따라 염기서열 분석에 이용한 결핵균 기준 408 번째 염기에서 672 번째 염기까지 265 bp 크기의 염기서열을 균 동정에 적용하여, 상기 표 1에서 보여지는 것처럼 항산성 염색 양성 19개의 객담 대상으로 hsp65 유전자 비교염기서열 분석 방법에 의해 균 동정을 실시하였다. 분석된 321-bp 유전자 염기서열을 DNASTAR 소프트웨어의 MegAlign 프로그램을 사용하여 다정렬 한 후, 계통도를 분석하여 균동정을 수행하였다.

그 결과, 19 주 모두 미코박테리아 균종에 속함을 확인할 수 있었다(상기 표 1 참조). 총 19개의 객담중에서 9개의 객담은[329-77, 329-19, 329-22, 89-3, 95, 69, 46, 52, 120-2]는 서로 94～ 98%의 염기서열 상동성을 보이면서 그룹 M. avium 으로 동정되었다. 8 개의 객담은 [329-54, 329-66, 329-78, 329-60-2, 329-6, 329-35, 329-85, 329-99] M. intracellulare로 동정되었고 나머지 2주(329-39, 329-118)는 M. abscessus로 동정되었다(도 3 참조). 객담으로부터 직접 NPDS방법을 시행하여 얻은 결과를 은 객담을 대상으로 1-2달 배양 후 얻어진 배양 균주를 대상으로 MOTT3F-MOTT3R 프라이머 시스템을 이용하여 증폭된 산물을 MOTT3R 프아미어를 이용하여 자동염기서열 분석방법으로 분석된 동정결과와 비교하였을 때, 19 검체 중에서 3 개를 (329-69, 329-46 과 329-118) 제외한 16개의 검체의 결과가 일치하였다 (84.2%).

실험예 1에서 MOTT3F-MOTT3R 프라이머를 이용한 시스템이 19개의 객담 검체에서 미코박테리아 균주를 전부 동정하지 못한 반면에, 본 특허에서 개발한 NPDS 방법은 높은 정확도로 미코박테리아 균주를 동정할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 NPDS 방법은 객담에서 직접 배양없이 직접 미코박테리아를 종 수준으로의 동정하는 데 유용하게 사용될 수 있는 것이다.

(7) NPDS 에 의한 결핵균 DNA 존재 ( IS6110 PCR 양성) 항산성 도말 양성 객담으로부터 혼합 감염된 비결핵항산성균주 동정

본 발명에서 개발된 NPDS 시스템이 결핵균이 감염된 환자의 객담에서 배양없이 직접 비결핵항산성균의 동시감염시 감염된 균종의 동정을 가능하게 하는지를 확인하기 위하여, 총 36 개의 결핵균 특이 유전 절편인 IS6110 PCR 수행시 증폭산물을 생산하는 즉 결핵균이 감염되어 있는 환자 유래 객담을 대상으로 하여 본 특허의 NPDS 방법을 적용하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 36개의 객담 중 총 25개의 객담에서 결핵균과 혼합감염된 비결핵항상성균주를 동정할 수 있었다. 25 개의 균주 중에서 신속 발육균이 18 개의 환자 객담에서, 완속 발육균이 7 개의 환자 객담에서 동정되었다. 신속 발육균으로서는 M. abscessus가 10 명의 환자 유래 객담으로부터 가잔 높은 빈도로 동정되었고, M. peregrinum이 4명의 환자로부터, M. chelonae, M. wolinsky, M. foutuitum, M. smegmatis가 각 각 1명의 환자로부터 동정되었다. 완속발육균으로서는 M. intracellulare 3명의 환자로부터 M. avium 3명의 환자로부터, M. gordonae가 1명의 환자로부터 동정되었다.

따라서, 본 특허에서 개발된 NPDS 방법은 객담에서 직접 비결핵항상성균종의 동정뿐만 아니라, 결핵균 존재 검체에서도 동시 감염되어 있는 비결핵항상성균을 검출할 수 있는 획기적인 방법임을 알 수 있다.

[표 2. 결핵균 DNA (IS6110 PCR 양성)가 검출된 항산성 양성 객담 검체로부터 NPDS에 의한 비결핵항상성균종 동정 결과]

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 소개된 NPDS 방법은 객담에서 배양없이 직접 비결핵항산성균종을 동정할 있을 뿐만 아니라 결핵균 감염되어 있는 환자 유래 객담에서 동시 혼합감염되어 있는 비결핵항산성균주동 종정할 수 있는 획기적인 방법으로서, 향후 미코박테리움 증 환자의 진단에 효과적으로 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명에 따라 객담에서 비결핵항산성균종만을 증폭시키기 위한 nested PCR에 사용한 프라이머 위치 및 염기서열을 나타내는 모식도이고,

도 2는 본 발명에 따른 nested PCR 방법을 객담 검체에 적용한 사진으로, (A)는 등록특허 제692484호에서 개발된 비결핵항산성균종 특이적인 프라이머 set인 MOTT3F-MOTT3R을 객담 검체에 적용한 결과이고, 몇 개의 객담검체에서 비결핵항산성균 특이적인 PCR 산물인 515-bp 증폭산물을 생산함을 확인할 수 있으며, 사진에서 M: 100 bp ladder, 1-15: 객담 검체로부터의 DNA임. (B) 는 MOTT3F-MOTT3R에 의하여 증폭된 PCR 산물을 대상으로 본 특허에서 개발된 MspuF-MspuR 프라이머 set을 이용한 nested PCR 방법을 적용한 사진이고, 331-bp의 비결핵항산성균 특이적인 증폭산물을 생산함을 확인할 수 있었으며, 사진에서 M: 100 bp ladder, 1-5: 객담검체의 MOTT3F-MOTT3R PCR 산물, 6: 음성 대조군임.

도 3은 본 발명에 따라 객담에서 nested PCR 방법에 의하여 증폭된 321 bp 산물을 직접 염기서열로 265-bp 표적 DNA를 분석한 후 표준균주 미코박테리아 hsp65 유전자 염기서열로 구성된 데이터베이스에 적용하여 계통수를 구축하여 균 동정을 실시한 예시도로써, 사진에서 329-67, 329-89-3은 M. avium, 329-35, 329-38은 M. intracellulare로 329-103-1, 329-92로 M. abscessus로 동정되었음을 확인 가능함.

<110> Seoul National University Academic Corporation Foundation <120> Method and kit for identification of nontuberculous mycobacteria <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of 1st PCR <400> 1 gargtygcca agaagacbga c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of 1st PCR <400> 2 agcagcggct tgccvsmctg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Nested PCR <400> 3 caaggaggts gagaccaagg asc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Nested PCR <400> 4 ytgctggaga aggtcatyca ggc 23

Claims (2)

1. (S1) 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자를, 서열번호 1에 따른 염기서열을 가지는 전 방향 프라이머와 서열번호 2에 따른 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 증폭시켜서, PCR 증폭산물을 생산하는 단계;

   (S2) 상기 생산된 PCR 증폭산물의 5'말단부터 상기 HSP65 유전자의 423번째 염기, 424번째 염기 및 701번째 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 유전자 분절을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여, 해당 유전자 분절을 증폭하는 단계;

   (S3) 상기 증폭된 유전자 분절의 염기서열을 분석하는 단계; 및,

   (S4) 상기 423번째 염기, 424번째 염기 또는 701번째 염기를 비교하는 단계를 포함하고,

   상기 비교에서 비결핵항산성균은 423번째 염기가 G 또는 C, 424번째 염기가 C 또는 701번째 염기가 C인 비결핵항산성균의 감별 방법,
2. 비결핵항산성균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍과,

   서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍을 포함하는 비결핵항산성균의 감별 키트.

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