CN104164475B - 分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物的分子菌种鉴定领域，涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。其中，rpsA基因应用在分枝杆菌的菌种鉴定中，所述rpsA基因可通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌的rpsA基因。分枝杆菌的种属鉴定方法利用所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术。本发明对分枝杆菌的种属分类鉴定结果准确可靠、方法简单、鉴定速度快；通用引物对能鉴定绝大多数常见的非结核分枝杆菌临床分离株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及微生物的分子鉴定领域；尤其涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。
背景技术
结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1/3有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。而非结核分枝杆菌（Non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染在我国总体也呈上升趋势，1984/1985年第二次全国结核病流行病学调查(简称流调)NTM发病率为4.2%，1990年第三次流调为4.9%，2000年第四次流调则增至11.1%，而在2010年第五次流调中则上升为22.9%。然而这个比率远低于欧洲和美国的发病率（＞40%）。按照流行病学的理论，随着国家结核病防治规划效果的日益显现，NTM在结核病总体发病中所占的比率逐步提高。因此，预计我国未来NTM的发病率仍有上升空间，所以对NTM的研究也应该提高重视程度。
NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。而临床对于感染了结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的患者治疗方案完全不同：非结核分枝杆菌多数对常用的抗结核药物天然耐药（NTM耐多药率高达83.7%），但一些广谱的抗生素对治疗NTM感染有效，而这些广谱抗生素对结核分枝杆菌感染的抗菌作用很弱，甚至没有作用；常见的能够致病的NTM有30余种，针对不同种NTM治疗的药物选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在NTM感染，是何种NTM感染，对临床治疗具有重要意义。
目前临床上常用的鉴定NTM的方法分为两大类，一类是传统生化的方法，操作繁琐并且不够准确，所以已基本被弃用，仅有含对硝基苯甲酸（PNB）的选择性培养基法仍然广泛使用，用于初步区分结核分枝杆菌复合群（MTC）和NTM；另一类为分子生物学方法，以比较同源基因/序列的序列差异来鉴定NTM至种水平，该方法以操作简单、快速、能够鉴定分枝杆菌至种水平等优势成为目前最常用的方法，并且已经衍生出了各类商业试剂盒(如DNA芯片技术,线形探针杂交技术)应用于临床。目前最见的用于分枝杆菌菌种鉴定的同源基因/序列包括：16srRNA编码基因、16s-23s rRNA间区（ITS）、hsp60和rpoB基因。采用单一的基因或现有基因组合对NTM的鉴别依然仅能鉴定常见致病NTM中的一部分，少量NTM由于种间序列的高度同源性，现有的鉴定技术不能够区分。如鸟分枝杆菌复合群、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌，即使联合使用16s rRNA编码基因和ITS,也不能区分。现有的鉴别技术鉴定为同一种的分枝杆菌，有可能被新的标识鉴定为几种分枝杆菌或分为几个亚种，如经16s rRNA基因和ITS鉴定为脓肿分枝杆菌的菌群，在结合使用hsp60和rpoB基因后，进一步分为了脓肿分枝杆菌、M.massiliense和M.bolletii。目前对分枝杆菌菌种鉴定技术主要关注的是其鉴定NTM至种的能力，实际上通过更多的分子标识的使用，有可能将同一种NTM分为更多的亚型，更细致的分型不仅有助于流行病学研究，而且当与患者的病史结合时，还有可能建立不同亚型与患者发病的联系，由此了解宿主的免疫机制与发病机制，类似的研究在国际上还未被关注过。因此，发现更多的分子标识，提高分枝杆菌菌种鉴定技术的鉴别能力，对临床诊断和治疗具有重要的参考价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。
本发明第一方面提供了rpsA基因在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。
rpsA基因（作为一种新的分子标识）用于在分枝杆菌菌种鉴定中，通过一种通用引物对，包括正向引物和反向引物，扩增分枝杆菌（Mycobacterium）的rpsA基因，从而鉴定或区分不同的分枝杆菌。优选的，其中所述正向引物为5’-CCCTACATCGGCAAGGAG-3’(SEQ IDNo：1)，所述反向引物为5’–TGTCGATGACCTTGACCATC-3’（SEQ ID No：2）。其中，正向引物，位于结核分枝杆菌的rpsA基因的487-504位置，gene bank号为NC_000962.2；反向引物位于结核分枝杆菌的rpsA基因的1032-1051位置，gene bank号为NC_000962.2。
本发明第二方面提供了一种通用引物对，所述通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌Mycobacterium的rpsA基因，其中所述正向引物如SEQ ID No：1所示，所述反向引物如SEQ ID No：2所示。该引物对扩增分枝杆菌（Mycobacterium）的rpsA基因，本发明还将引物对应用于检测分枝杆菌或鉴定分枝杆菌。
本发明第三方面提供了一种分枝杆菌的种属鉴定方法，该方法利用上述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。
优选的，所述方法包括如下步骤：a)以待测菌株的基因组DNA为模板，以正向引物和反向引物进行PCR扩增，对扩增所得DNA片段进行回收、纯化、测序，得rpsA基因序列；b)根据序列测定结果构建系统发育树，获得鉴定结果。
更优选的，上述方法的步骤b)为：将序列测定结果与GenBank数据库中所有的分枝杆菌的rpsA基因序列进行BLAST比对，构建系统发育树，获得鉴定结果。或者更优选的，步骤b)为：利用Clustal X软件对待测菌株的rpsA基因序列进行多序列重排；其间同时加入不同分枝杆菌菌种的标准菌株的rpsA基因序列，利用MEGA软件建立包含多种分枝杆菌标准株的系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。
更优选的，上述方法的步骤a)中PCR扩增的具体操作为：扩增反应体系25μl，正向引物浓度及反向引物浓度分别为20pmol，模板DNA50ng，Taq酶1U，脱氧核苷三磷酸终浓度250μM，MgCl2终浓度1.5mM；扩增反应条件为：95℃变性5分钟，之后循环30次（95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒），72℃延伸5分钟。
本发明第四方面还提供了一种分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术。所述试剂盒包含SEQ ID No：1所示的正向引物和SEQ ID No：2所示的反向引物。所述试剂盒还包括dNTPs、10×Buffer、Taq DNA聚合酶和超纯水。
本发明还提供了将上述通用引物对、扩增引物对、或试剂盒应用于制备鉴定分枝杆菌的产品中。
举例来说，本发明的鉴定分枝杆菌种属的方法，包括如下步骤：S10、使用上述引物分别扩增多种分枝杆菌标准株的rpsA基因；S20、对扩增后的分枝杆菌标准株的rpsA基因进行测序；S30、对待鉴定的临床分离株的rpsA基因用步骤S10中的引物进行扩增并测序；S40、对扩增后的rpsA基因进行多序列重排，根据临床分离株与标准株的序列相似度判断临床分离株所属菌种。其中扩增条件同前。
其中，优选的，步骤S30中使用CLUSTAL2.1软件对待鉴定临床分离株扩增后的rpsA基因进行多序列重排。
为了更简便的鉴定出待测菌株所属菌种，优选的，步骤S20与步骤S30之间还包括步骤S25：对扩增后的分枝杆菌标准株的rpsA基因测序后，建立包含多种分枝杆菌标准株的进化树；并且步骤S30中判断临床分离株所属菌种后，参照所述进化树进行进一步比对证实。
为了更简便快速的建立进化树，优选的，步骤S25中使用Mega5.05软件建立包含多种分枝杆菌标准株的进化树。
本发明的上述鉴定方法中，其中扩增了43种分枝杆菌标准株的rpsA基因片段，所述43种分枝杆菌标准株为：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)ATCC13950,龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)ATCC14472,偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)ATCC6481,戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)ATCC14470,金色分枝杆菌(Mycobacterium aurum)ATCC23366,新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)ATCC25795,海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)ATCC927,微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)ATCC43909,爱知分枝杆菌(Mycobacterium aichiense)ATCC27280,耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)ATCC19420,副偶发分枝杆菌(Mycobacteriumparafortuitum)ATCC19686,枝母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)ATCC15483,鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)ATCC25291,草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)ATCC11758,瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)ATCC19981,胃分枝杆菌(Mycobacteriumgastri)ATCC15754,次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)ATCC23292，蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)ATCC19250,脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)ATCC19977,非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)ATCC25420,卡介苗分枝杆菌(Bacilli Calmette Guerin,BCG)ATCC35735,结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis H37Ra)ATCC25177,牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)ATCC19210,玛尔摩分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)ATCC29571,转黄分枝杆菌(Mycobacteriumflavescens)ATCC14474,迪尔诺弗枝杆菌(Mycobacterium diernhoferi)ATCC19340，亚洲分枝杆菌(Mycobacterium asiaticum)ATCC25276，斯塞格分枝杆菌(Mycobacteriumszulgai)ATCC25799,塞内加尔分枝杆菌(Mycobacterium senegalense)ATCC35796，耐高温分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)ATCC19527，楚布分枝杆菌(Mycobacteriumchubuense)ATCC27278，杜氏分枝杆菌(Mycobacterium duvalii)ATCC43910，嘎地分枝杆菌(Mycobacterium gadium)ATCC27726，奥布分枝杆菌(Mycobacterium obuense)ATCC27023，罗得西亚分枝杆菌(Mycobacterium rhodesiae)ATCC27024,泥炭藓分枝杆菌(Mycobacterium sphagni)ATCC33027,托凯分枝杆菌(Mycobacterium tokaiense)ATCC27282,猪分枝杆菌(Mycobacterium porcinum)ATCC33776,南非分枝杆菌(Mycobacterium austroafricanum)ATCC33464,地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)ATCC15755,龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)ATCC35752。上述标准株均能通过国内外商业渠道购买获得，如可在美国标准生物品保藏中心(American type culturecollection,ATCC)购买。
通过本发明的分枝杆菌的鉴定方法能准确区分表型分型和16S rDNA基因分型不能明确鉴定的菌株，包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌等。脓肿分枝杆菌和M.massiliense的16srRNA编码基因、16s-23srRNA间区（ITS）、hsp65和rpoB基因序列几乎完全相同，而其rpsA基因相似度98.7%，能用于区分这两种分枝杆菌；某些分枝杆菌（如M.celatum和M.terrae）的16s rRNA编码基因为多拷贝，但rpsA基因为单拷贝，能避免由于靶基因多拷贝而难以判定菌种鉴定结果。
胞内分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度97.9%-100%，鸟分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度96.7%-100%，脓肿分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度97.9%-100%，堪萨斯分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度95.1%-100%，戈登分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度97.9%-100%，偶然分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度97.9%-100%，结核分枝杆菌待测菌株与标准株序列相似度99.8%-100%。因此rpsA基因可用于分枝杆菌的菌种鉴定，以与标准株序列相似度大于97%为界，能鉴定绝大多数常见的非结核分枝杆菌待测菌株。
附图说明
图1为本发明利用rpsA基因对不同非结核分枝杆菌标准株构建的系统发育树；
图2为本发明利用rpsA基因对待测菌株110以及不同种的分枝杆菌标准株进行多序列重排的结果；
图3为本发明利用rpsA基因对待测菌株110以及不同种的分枝杆菌标准株构建的系统发育树；
图4为本发明利用rpsA基因对待测菌株213以及不同种的分枝杆菌标准株进行多序列重排的结果；
图5为本发明利用rpsA基因对待测菌株213以及不同种的分枝杆菌标准株构建的系统发育树。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。
本发明的分枝杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：
S10、分别扩增多种分枝杆菌标准株的rpsA基因，所用的引物序列为：正向引物：5’CCCTACATCGGCAAGGAG3’，位于结核分枝杆菌的rpsA基因的487–504位置，gene bank号为NC_000962.2；反向引物：5’TGTCGATGACCTTGACCATC3’，位于结核分枝杆菌的rpsA基因的1032–1051位置，gene bank号为NC_000962.2；
S20、对扩增后的分枝杆菌标准株的rpsA基因进行测序；
S30、对待鉴定的临床分离株的rpsA基因用步骤S10中的引物进行扩增并测序；
S40、对扩增后的rpsA基因进行多序列重排，根据临床分离株与标准株的序列相似度判断临床分离株所属菌种。
优选的，为了建立足够丰富的标准株的rpsA基因序列库，步骤S10中扩增43种分枝杆菌标准株，所述43种分枝杆菌标准株为：胞内分枝杆菌ATCC13950,龟分枝杆菌ATCC14472,偶发分枝杆菌ATCC6481,戈登分枝杆菌ATCC14470,金色分枝杆菌ATCC23366,新金色分枝杆菌ATCC25795,海分枝杆菌ATCC927,微黄分枝杆菌ATCC43909,爱知分枝杆菌ATCC27280,耻垢分枝杆菌ATCC19420,副偶发分枝杆菌ATCC19686,母牛分枝杆菌ATCC15483,鸟分枝杆菌ATCC25291,草分枝杆菌ATCC11758,瘰疬分枝杆菌ATCC19981,胃分枝杆菌ATCC15754,次要分枝杆菌ATCC23292,蟾分枝杆菌ATCC19250,脓肿分枝杆菌ATCC19977,非洲分枝杆菌ATCC25420,卡介苗分枝杆菌ATCC35735,结核分枝杆菌H37RaATCC25177,牛分枝杆菌ATCC19210,玛尔摩分枝杆菌ATCC29571,转黄分枝杆菌ATCC14474,迪尔诺弗枝杆菌ATCC19340,亚洲分枝杆菌ATCC25276,斯塞格分枝杆菌ATCC25799,塞内加尔分枝杆菌ATCC35796,耐高温分枝杆菌ATCC19527,楚布分枝杆菌ATCC27278,杜氏分枝杆菌ATCC43910,嘎地分枝杆菌ATCC27726,奥布分枝杆菌ATCC27023,罗得西亚分枝杆菌ATCC27024,泥炭藓分枝杆菌ATCC33027,托凯分枝杆菌ATCC27282,猪分枝杆菌ATCC33776,南非分枝杆菌ATCC33464,地分枝杆菌ATCC15755,龟分枝杆菌ATCC35752。
优选的，步骤S30中使用CLUSTAL2.1软件对待鉴定临床分离株扩增后的rpsA基因进行多序列重排。
为了更简便的鉴定出临床分离株所属菌种，优选在步骤S20与步骤S30之间还包括步骤S25：对扩增后的分枝杆菌标准株的rpsA基因测序后，建立包含多种分枝杆菌标准株的进化树；并且步骤S30中判断临床分离株所属菌种后，参照所述进化树进行一步比对证实。
为了更简便快速的建立进行化，步骤S25中优选使用Mega5.05软件建立包含多种分枝杆菌标准株的进化树。
以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
实施例1
1、扩增临床分离株110并测序，序列如下：
ATCGAGGCCAAGATCATCGAGCTGGACAAGAACCGCAACAACGTGGTGCTGAGCCGCCGCGCCTGGCTGGAGCAGACCCAGTCCGAGGTGCGCAGCGAGTTCCTCAACCAGCTGCAGAAGGGTGCCATCCGCAAGGGTGTCGTCTCCTCGATCGTCAACTTCGGCGCCTTCGTCGATCTCGGCGGTGTCGACGGCCTGGTCCACGTGTCCGAGCTGTCCTGGAAGCACATCGATCACCCGTCCGAGGTGGTTCAGGTGGGCGACGAGGTCACCGTCGAGGTGCTCGACGTCGACATGGATCGCGAGCGGGTTTCGCTGTCGCTCAAGGCGACTCAGGAAGACCCGTGGCGCCACTTCGCCCGCACCCACGCGATCGGTCAGATCGTGCCGGGCAAGGTCACCAAGCTGGTGCCGTTCGGTGCGTTCGTCCGCGTCGAGGAGGGCATCGAGGGTCTGGTGCACATCTCGGAGCTGTCCGAGCGCCACGTCGAGGTCCCGGACCAGGTGGTCCAGGTCGGCGACGACGC（SEQ ID NO：3）
2、使用CLUSTAL2.1软件对临床分离株110的rpsA基因进行多序列重排，并比对与标准株的相似度（与偶然分枝杆菌标准株相似度100%），初步鉴定为偶然分枝杆菌（图2）。
3、进化树进一步证实为偶然分枝杆菌（图3）。
实施例2
1、扩增临床分离株213并测序，序列如下：
ATCGAGGCCAAGATCATCGAGCTGGACACAGACCGCAACAACGTGGTGCTGTCGCGCCGGGCGTGGCTGGAGCAGACGCAGTCCGAGGTGCGCAGCGAGTTCCTCAACCAGCTGCAGAAGGGCGCCATCCGCAAGGGTGTCGTCTCCTCCATCGTCAACTTCGGTGCGTTCGTCGACCTCGGCGGCGTCGACGGTCTGGTGCACGTCTCCGAGCTGAGCTGGAAGCACATCGACCACCCGTCCGAGGTGGTCCAGGTCGGCGACGAGGTCACCGTCGAGGTGCTCGATGTCGACATGGACCGCGAGCGGGTTTCGTTGTCGCTCAAGGCGACTCAGGAAGACCCGTGGCGCCACTTCGCCCGCACCCACGCCATCGGCCAGATCGTGCCCGGCAAGGTCACCAAGCTGGTTCCGTTCGGCGCGTTCGTCCGCGTCGAGGAGGGCATCGAGGGCCTGGTGCACATTTCGGAGCTGGCCGAGCGCCACGTCGAGGTCCCCGACCAGGTGGTTGCCGTCGGCGACGACGC（SEQ ID NO：4）。
2、使用CLUSTAL2.1软件对临床分离株213的rpsA基因进行多序列重排，并比对与标准株的相似度（与胞内分枝杆菌标准株相似度98.3%），初步鉴定为胞内分枝杆菌（图4）。
3、进化树进一步证实为胞内分枝杆菌（图5）。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.rpsA基因在制备分枝杆菌菌种的分类鉴定试剂盒中的应用，其中所述分枝杆菌菌种包括非结核分枝杆菌菌种，所述rpsA基因为所述分枝杆菌菌种的rpsA基因。
2.权利要求1所述的应用，其中所述rpsA基因通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。
3.权利要求2所述的应用，其中所述正向引物如SEQ ID No：1所示，所述反向引物如SEQID No：2所示。
4.通用引物对，其特征在于所述通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌Mycobacterium的rpsA基因，其中所述正向引物如SEQ ID No：1所示，所述反向引物如SEQ ID No：2所示。
5.一种制备分枝杆菌的分类鉴定试剂盒的方法，该方法利用权利要求4所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。
6.权利要求5所述方法，该方法包括如下步骤：
a)以待测菌株的基因组DNA为模板，以正向引物和反向引物进行PCR扩增，对扩增所得DNA片段进行回收、纯化、测序，得rpsA基因序列；
b)根据序列测定结果构建系统发育树，获得鉴定结果。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，
所述步骤b)为：将序列测定结果与GenBank数据库中所有的分枝杆菌的rpsA基因序列进行BLAST比对，构建系统发育树，获得鉴定结果；或者，
所述步骤b)为：利用Clustal X软件对待测菌株的rpsA基因序列进行多序列重排；其间同时加入不同分枝杆菌菌种的标准菌株的rpsA基因序列，利用MEGA软件建立包含多种分枝杆菌标准株的系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，
步骤a)中PCR扩增的具体操作为：扩增反应体系25μl，正向引物浓度及反向引物浓度分别为20pmol，模板DNA 50ng，Taq酶1U，脱氧核苷三磷酸终浓度250μM，MgCl2终浓度1.5mM；扩增反应条件为：95℃变性5分钟，之后以95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒为一循环，循环30次，72℃延伸5分钟。
9.一种分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，其特征在于应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术；
其中，所述分枝杆菌菌种包括非结核分枝杆菌菌种，所述rpsA基因为所述分枝杆菌菌种的rpsA基因。
10.按照权利要求9所述的分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，其特征在于包含SEQ ID No：1所示的正向引物和SEQ ID No：2所示的反向引物，还包括dNTPs、10×Buffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。
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