KR100692484B1

KR100692484B1 - 결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에사용되는 뉴클레오타이드들

Info

Publication number: KR100692484B1
Application number: KR1020050104871A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 김현주; 박해준
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2007-03-13

Abstract

본 발명에서는 미코박테리아의 hsp65 유전자 염기서열을 다정렬하고 분석하여 결핵균군 및 비결핵항산성균군을 특징지을 수 있는 각각 8 개의 signature 염기서열을 6 개의 코돈 위치에서 발견하였다. 그리고 이러한 염기서열, 특히 240 번째 코돈의 3 개의 연속된 signature 염기서열들을 이용하여 각각 결핵균군 및 비결핵항산성균군 특이적인 PCR 산물을 생산하는 프라이머 쌍들을 제조하였고, 이들 프라이머를 이용하여 한 번의 PCR 반응만으로 결핵균군과 비결핵항산성균군을 감별할 수 있는 다중 프라이머 PCR 방법을 개발하였다. 또한, 비결핵항산성균인 경우에 Ava-II 및 Hae-III 제한효소 처리에 의한 PCR restriction fragment length polymorphism analysis (PRA)에 의하여 균 동정을 할 수 있는 미코박테리아 균 동정용 알고리즘을 구축하였다. 본 발명에서 소개된 방법 및 알고리듬을 실제 임상분리주에 적용하여 보았을 때 100%의 민감도를 보이면서 성공적으로 균 동정을 수행할 수 있었다. 따라서 본 발명은 향 후 임상적으로 문제가 되고 있는 미코박테리아 균종을 간편하고, 정확하게 동정하든 데에 상당한 기여를 할 수 있다.

Description

결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에 사용되는 뉴클레오타이드들{Method for differentiation or identification between Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous mycobacteria (NTM) and nucleotides for the method}

도 1은 결핵균 군 및 비결핵항산성균군에 특이적인 signature 염기서열을 보여주는 그림. 본 발명에서는 이러한 signature 염기를 결정하기 위하여 (A)에서 보여지는 것처럼 전의 특허에서 서술한 방법대로 미코박테리움 속 균종의 644 bp hsp65 유전자 분절을 증폭시킬 수 있는 HSPF3 및 HSPR4 프라이머를 이용하여 미코박테리아 표준균주 54 주의 604 bp 염기서열을 분석하였고 전체 미코박테리아 HSP65 단백 중에서 6 곳의 코돈의 위치에서 비결핵항산성균군을 구분할 수 있는 모두 8 개의 signature 염기서열을 발견할 수 있었다 (B).

도 2는 본 발명의 다중 프라이머 PCR 방법의 비결핵항산성균 및 결핵균군 특이적인 프라이머의 위치 및 염기서열을 나타내는 그림.

도 3은 다중 프라이머 PCR의 민감도 결정 사진. 사진에서 M: 50 bp ladder, 1: DNA 100 ng, 2: DNA 10 ng, 3: DNA 1 ng, 4: DNA 100 pg, 5: DNA 10 pg, 6: DNA 1 pg, 7: 음성 대조군. 결핵균 표군균주 M. tuberculosis (ATCC 27294)의 경우 1 pg의 DNA 희석배율에서도 결핵균군 특이적인 다중프라이머 PCR 산물인 195 bp의 증 폭산물을 생산함을 확인하였다. 비결핵항산성균인 M. avium (ATCC25291)인 경우 100 pg의 DNA 까지 희석배율에서 비결핵항산성균군 특이적인 증폭산물인 515 bp 증폭산물을 생산함을 확인하였다.

도 4는 다중 프라이머 PCR에 의한 미코박테리아 표준 균주의 감별에 대한 사진. 사진에서 M: 100 bp ladder, 1: M. avium (ATCC25291), 2: M. tuberculosis (ATCC 27294), 3: M. bovis, 4: M. bovis BCG, 5: M. africanum, 6: M. microti, 7: M. kansasii type I, 8: M. szulgai, 9: M. fortuitum (ATCC6841), 10: M. chelonae

도 5는 다중 프라이머 PCR 및 제한효소 처리에 의한 미코박테리아 균종 동정용 알고리즘을 나타내는 그림. 미코박테리아 균종 DNA를 다중 프라이머 PCR을 수행하면 결핵균군인(M. africanum , M. bovis , M. bovis BCG, M. tuberculosis, M. microti) 경우 195 bp 증폭산물이 생산되고, 비결핵항산성균종인 경우 515 bp 증폭산물이 생산된다. 비결핵항산성균을 균종 수준으로 동정을 원할 경우, 먼저 515 bp 산물을 Ava II 제한효소를 처리하게 되면 국내에서 임상적으로 중요한 대부분의 균종 M. avium , M. intracellulare , M. abscessus , M. fortuitum , M. kansasii 등의 균종이 서로 감별이 가능하다. 만일 그 밖의 균종이 의심될 경우 다른 제한효소 Hae III를 처리할 경우 동정이 가능하게 된다.

도 6은 515-bp 다중 프라이머 PCR 산물의 Ava-II PRA에 의한 비결핵항산성균종의 동정하는 사진. 사진에서 M: 50 bp ladder, 1: M. avium (ATCC25291), 2: M. avium KIT41182, 3: M. intracellulare , 4: M. scrofulaceum, 5: M. kansasii, 6: M. szulgai, 7: M. fortitum 6841, 8: M. peregrinum, 9: M. abscessus, 10: M. chelonae . 모든 표준균주들이 도 5의 알고리즘에서 제시한 것과 같은 절편양상을 보이면서 감별됨을 2.5 % 아가로스 젤 상에서 확인할 수 있었다. M. avium은 국내에서 분리된 KIT41182와 외국에서 분리된 ATCC25291이 서로 다른 이동양상을 보임을 확인할 수 있었다.

도 7은 Ava-II PRA에 의한 M. avium complex 임상분리 균주의 감별 사진. 사진에서 M: 50 bp ladder, 1: M. avium (ATCC25291), 2: M. avium KIT41182, 3: M. intracellulare , 4: MAC clinical isolate 1, 5: MAC clinical isolate 2, 6: MAC clinical isolate 3, 7: MAC clinical isolate 4, 8: MAC clinical isolate 5, 9: MAC clinical isolate 6, 10: MAC clinical isolate 7, 11: MAC clinical isolate 8, 12: MAC clinical isolate 9, 13: MAC clinical isolate 10. MAC 임상분리 균주 들이 모두 M. intracellulare 표군균주 혹은 M. avium KIT41182와 같은 PRA 패턴을 보이면서 2.5% 아가로스 젤상에서 감별이 가능하였다.

도 8은 Hae-III PRA에 의한 비결핵항산성균 표군균주의 감별 사진. 사진에서 M: 50 bp ladder, 1: M. avium (ATCC25291), 2: M. intracellulare , 3: M. scrofulaceum, 4: M. kansasii type I, 5: M. kansasii type II, 6: M. szulgai, 7: M. gordonae, 8: M. marinum, 9: M. fortitum 6841, 10: M. fortitum 49403, 11: M. peregrinum, 12: M. abscessus ATCC 19977, 13: M. chelonae. 비결핵항산성균 표군균주들 모두 도 5의 알고리즘과 같은 PRA 패턴을 보이면서 서로 감별이 가능하였다.

미코박테리움 속 균종은 병원성 정도에 따라 절대병원성균인 결핵균군과 기회감염성 균종인 비결핵항산성균으로 두 그룹으로 구분할 수 있다. 결핵균 군에 속하는 균으로는 인형결핵균인 M. tuberculosis 우형결핵균인 M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti 등이 있고, 이들을 제외한 M. avium과 M. intracellulare 등을 포함한 나머지 미코박테리아균종이 비결핵항산성균 (Nontuberculous mycobacteria)에 포함된다. 미코박테리움 증의 정확한 임상치료를 위해서는 각기 다른 항생제 감수성 패턴을 가지고 있는 미코박테리아의 종 수준으로의 균 분류가 필요하지만, 국내처럼 결핵균 감염빈도 (93% 이상)가 상대적으로 높은 지역에서는 임상치료 및 병원성 강도가 현저하게 다른 결핵균과 비결핵항산성균 두 그룹을 감별하는 것이 1차적으로 중요하다고 할 수 있다. 현재, 임상실험실에서 두 그룹간의 감별은 주로 균주 배양 형태 및 Niacin, Catalase 시험 같은 몇 가지의 생화학적인 검사법에 의존하고 있다.

그러나 이러한 방법은 숙달된 숙련가가 필요하며, 또한 각 실험실마다 재현성에 문제가 있는 실정이다. 그리고 결정적으로는 배양에 의존하여 실험을 수행하므로 느린 발육기간을 가지고 있는 미코박테리아의 생물학적 특성상 환자의 치료시기를 놓칠 수 있다. 따라서 이러한 기존의 생화학적 감별 방법의 단점을 보완하기 위하여 결핵균 특이적인 IS6110 같은 표적 유전자나 16S rRNA, rpoB 유전자 염기서 열 중에서 결핵균 및 비결핵항산성균 특이적인 signature 염기서열을 이용하여 미코박테리움의 두 군을 감별하는 분자생물학적인 방법이 개발되어 사용되고 있으나, 표적유전자의 염기서열 보존성에 있어서의 문제점 혹은 염기서열 다양성에 있어서의 문제점 등으로 인한 문제점이 보고 되고 있다. 이런 이유로, 결핵균군과 비결핵항산성균군의 감별을 수월하게 할 새로운 표적 유전자의 확보가 필요한 실정이다.

따라서 본 발명에서는 미코박테리아의 열 충격 단백을 코딩하는 hsp65 유전자의 604-bp 염기서열 절편을 분석하여 결핵균군과 비결핵항산성균군의 감별을 용이하게 할 hsp65 signature 염기서열을 발견하였다. 그리고 이러한 염기서열의 일부를 이용하여 각 군의 특이적인 증폭을 가능하게 하는 프라이머를 제조하였고, 이들 프라이머들을 이용하여 결핵균과 비결핵항산성균을 용이하게 감별할 수 있는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 다중 프라이머 PCR 시스템을 개발하였다. 그리고 비결핵항산성균종인 경우 제한효소 처리에 의하여 균종 동정까지도 가능한 PCR restriction fragment length polymorphism analysis (PRA) 알고리즘 또한 구축하였다.

현재 결핵균 및 비결핵항산성균을 감별하는 데에 주로 사용되는 방법은 결핵균 및 기타 비결핵항산성균을 종 수준에서 동정할 수 있는 probe-hybridization 방법 및 DNA chip등의 개발이 수행되고 있으나 이러한 방법은 고가의 장비 및 검사비용이 소요된다. 또한, 이러한 단점을 극복하고자 PCR 반응만으로 두 군을 감별할 수 있는 multiplex PCR 방법들이 고안되어 개발되고 있으나, 이 방법들은 주로 하나의 유전자를 표적으로 하지 않고 여러 유전자를 표적으로 하는 방법이기 때문에 두 군의 균종들이 서로 혼재되어 있는 경우 혹은 객담같이 여러 정상상재총이 혼재되어 있는 경우 등에 적용하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 이러한 단점들을 극복하기 위해서는 하나의 유전자를 표적으로 하여 두 군을 감별하는 새로운 방법의 개발이 필요하다.

본 발명에서 개발된 hsp65 signature 염기서열을 이용하는 다중 프라이머 방법은 다른 multiplex 방법과 달리 단일 유전자 즉 hsp65 유전자만을 표적으로 사용하기 때문에 각 각의 유전자를 표적으로 하는 PCR 반응 간의 민감도와 특이도의 차이와 같은 여러 유전자를 사용하여 발생할 수 있는 문제점들을 극복할 수 있다. 또한 비결핵항산성균의 경우에도 여러 PCR 산물이 생산하는 multiplex PCR에 비하여 한 개의 PCR 산물만이 생산되기 때문에, 후에 이 산물의 제한효소 절편 양상의 다형성 등을 분석함에 의하여 비결핵항산성군 균종 간의 동정을 할 수도 있다는 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 선 확보된 대한민국 특허 제 0435587호, 특허 제 0486820호를 기초로 하여 이 특허에서 분석된 미코박테리움 속 균종의 hsp65 유전자 염기서열을 다정렬 후 분석함으로써 결핵균군 및 비결핵항산성균군에 특이적인 염기서열을 발견하고 이들 염기서열을 미코박테리움 속 균종 동정에 응용하고자 하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미코박테리움 균속의 전체 1623bp 로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자를 기준으로 5'말단에서 228번째 염기가 C, 243번째 염기가 C, 543번째 염기가 C, 600번째 염기가 C 또는 T, 705번째 염기가 G 또는 718번째부터 720번째까지의 염기가 CAG 염기를 포함하는 DNA 단편을 제공한다. 바람직하게는 상기의 DNA단편은 비결핵항산성균에 특이적이다.

또 본 발명은 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자를 기준으로 5'말단에서 228번째 염기가 A, 243번째 염기가 T, 543번째 염기가 T, 600번째 염기가 G, 705번째 염기가 C 또는 718번째부터 720번째까지의 염기가 GGA 염기를 포함하는 DNA 단편을 제공한다. 바람직하게는 상기의 DNA단편은 결핵균에 특이적이다.

또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 DNA 단편을 포함하는 비결핵항산성균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하기 위한 프라이머 쌍을 제공하며 상기 프라이머 쌍을 이용한 비결핵항산성균군을 감별하는 방법 또한 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재된 DNA 단편을 포함하는 결핵균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하기 위한 프라이머 쌍을 제공하고, 상기 프라이머 쌍을 이용한 결핵균을 감별하는 방법 또한 제공한다.

또 본 발명의 상기 방법은 서열번호3 및 서열번호4에 기재된 프라이머쌍을 더욱 포함하는 결핵균 및 비결핵항산성균군을 감별하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 상기의 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 515bp의 PCR 반응 산물을 얻고, 이 반응 산물을 제한효소로 처리하는 것을 포함하는 비결핵항산성균주 감별방법을 제공한다. 상기 제한효소는 Ava-II 또는 Hae-III인 것이 바람직하다.

또 본 발명은 상기 제한효소 처리 후, 제한효소 절단 단편 분석에 의하여 비결핵항산성균주를 감별하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 상기 Ava-II 제한효소 처리시 단편의 크기는 515bp; 또는 465bp; 또는 420bp; 또는 417bp 및 98bp; 또는 411bp; 또는 411bp 및 95bp; 또는 393bp 및 72bp; 또는 357bp; 또는 267bp 및 126bp; 또는 231bp 및 198bp; 또는 222 bp 및 198bp; 또는 222bp 및 126bp; 또는 213bp 및 198bp; 또는 213bp 및 126bp인 것이 바람직하고,

상기 Hae-III 제한효소 처리시 단편의 크기는 337bp; 또는 286bp; 또는 286bp 및 100bp; 또는 250bp 및 146bp; 또는 245bp 및 128bp; 또는 245 bp 및 92bp; 또는 192bp; 또는 192bp 및 181bp; 또는 192bp, 145bp 및 129bp; 또는 192bp, 145bp 및 95bp; 또는 192bp, 145bp 및 78bp; 또는 192bp 및 145bp; 또는 192 bp 및 123bp; 또는 192bp 및 122bp; 또는 192bp 및 119bp; 또는 192bp, 114bp 및 97bp; 또는 192bp, 112bp 및 83bp; 또는 192bp 및 112bp; 또는 192bp, 111bp 및 87bp; 또는 192bp, 103bp 및 101bp; 또는 192bp, 103bp 및 78bp; 또는 192bp 및 103bp; 또는 192bp, 94bp 및 78bp; 또는 192bp, 87bp 및 83bp; 또는 192bp 및 87bp; 또는 192bp 및 81bp; 또는 192bp 및 78bp; 또는 168bp, 106bp 및 86bp; 또는 114bp, 103bp 및 97bp; 또는 106bp, 103bp 및 86bp인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 결핵균 및 비결핵항산성균군 감별 키트를 제공한다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예1] 결핵균군 및 비결핵항산균 특이적인 hsp65 signature 염기서열

결핵균 혹은 비결핵항산성균 특이적인 signature 염기서열을 분석하기 위하여, 이미 확보된 특허 제 0486820호에서 분석된 하기 표 1에 나타난 54 주의 표준 균주들 각 각의 604-bp hsp65 유전자 염기서열을 다정렬한 후 결핵균군에 속하는 5 주 ( 2: M. africanum, 6: M. bovis, 7: M. bovis BCG, 12: M. microti, 45: M. tuberculosis)의 염기서열과 49 주의 비결핵항산성균 의 염기서열을 서로 비교하였다.

그 결과 도 1에서 보이는 것처럼 결핵균의 전체 HSP65 단백을 기준으로 할 때 모두 6 곳의 코돈에서 결핵균군 및 비결핵항산성균군을 서로 감별할 수 있는 총 8 개의 signature 염기를 발견할 수 있었다. 첫 번째는, HSP65 단백의 76 번째 아미노산의 3번째 염기인, 즉 전체 1623 개의 결핵균 hsp65 유전자 분절을 기준으로 할 때 (GenBank No. M15467) 228 번째 염기이다. 이 부위의 염기가 결핵균군에 속하는 5개의 균주가 A(adenosine)인 반면에 49 주의 비결핵항산성균은 C (cytosine)이다. 두 번째는, 81 번째 아미노산의 3 번째 염기이다, 즉 전체 hsp65 유전자 염기서열 중 243 번째 염기이다. 이 부위의 염기가 결핵균군에 속하는 5 개의 균주가 T (thymidine)인 반면에 나머지 비결핵항산성균은 C(cytosine)이다. 세 번째는 181 번째 아미노산의 3 번째 염기이다. 즉 전체 hsp65 유전자 염기서열 중 543 번째 염기이다. 이 부위의 염기가 결핵균군에 속하는 5 개의 균주는 T인 반면에 비결핵항산성균은 C이다. 네 번째는 200 번째 아미노산의 3 번째 염기이다. 즉 전체 hsp65 유전자 염기서열 중 600 번째 염기이다. 결핵균군에 속하는 5 개의 균주는 G인 반면에 비결핵항산성균은 C 혹은 T이다. 다섯 번째는 235 번째 아미노산의 3번째 염기이다. 즉 전체 hsp65 유전자 염기서열 중 705 번째 염기이다. 결핵균군에 속하는 5개의 균주는 C인 반면에 비결핵항산성균은 G이다. 여섯 번째부터 여덟번째 까지 모두 3개의 signature 염기들은 240번째 아미노산에 집중되어 있다. 즉 이 아미노산의 모든 염기가 결핵균군과 비결핵항산성균이 다르다. 결핵균군 5 개의 균주는 이 부위의 염기가 G(glycine)을 코딩하는 GGA인 반면에, 나머지 49주의 비결핵항산성균은 모두 Q(glutamine)을 코딩하는 CAG이다. 본 발명에서 발견된 하나의 아미노산을 구성하는 세 개의 염기가 결핵균군과 비결핵항산성균이 모두 다른 경우 (즉 각 군을 구분하는 세 개의 signature 염기가 집중되어 있는 경우) 아직까지 보고 된 바 없다. 본 발명에서 발견된 결핵균군 및 비결핵항산성균군에 특이적인 signature 염기서열은 향 후 이들 균종을 감별할 여러 분자생물학적인 방법 즉 결핵균만을 검출할 수 있는 특이적인 프라이머의 개발 및 이를 이용한 중합효소의 방법, 혹은 결핵균종과 비결핵항산성균을 한 번의 PCR 반응만으로 감별할 수 있는 다중 PCR 방법 등의 개발, 혹은 probe-hybridization 방법의 개발, DNA-chip의 개발 등에 효과적으로 응용될 수 있을 것임은 주지의 사실이다.

<본 발명에서 사용한 미코박테리아 표준 균주>

[실시예 2]

결핵균군 및 비결핵항산성균을 감별할 수 있는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 다중 프라이머 PCR 시스탬 개발.

1. 결핵균군 및 비결핵항산성균군 특이 hsp65 프라이머 쌍 제조

본 발명에서 목적으로 하는, 즉 한 번의 PCR 반응만으로 결핵균군과 비결핵항산성균군을 서로 감별할 수 있는 다중 프라이머 PCR을 개발하기 위해서는 우선 결핵균 및 비결핵항산성균 각자의 군에 특이적이면서 서로 다른 크기의 증폭산물을 생산하는 hsp65 프라이머 쌍을 제조해야 한다. 그러기 위하여 본 연구에서는 각 군에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하는 프라이머쌍을 제조하기 위해 상기한 각 군에 특이적인 signature 염기가 각 프라이머의 3 말단에 오도록 프라이머들을 설계하였다 (도 2).

비결핵항산성균 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하는 전방향 및 후방향 프라이머는 도 2 에 보여주는 것처럼 515-bp 의 hsp65 유전자 증폭산물 (전체 1623 bp hsp65 유전자 염기 중에서 223부터 737 염기 부위를 증폭)을 생산하도록 설계되었다. 비결핵항산성균군에 특이적인 전 방향 (forward) 프라이머 (MOTT3F: 5'GAR GTY GCC AAG AAG ACB GAC-3' R은 A또는G, Y는 C또는T, B는 G또는T또는C를 의미)(서열번호1)를 제조하기 위하여 81 번째 아미노산의 3번째 염기 위치에 존재하는 비결핵항산성균군 특이적인 signature 염기(C)를 이용하였다. 후 방향 (reverse) 프라이머 (MOTT3R: 5'AGC AGC GGC TTG CCV SMC TG-3' V는 G또는A또는C, S는 G또는C, M은 A또는C)(서열번호2)를 제조하기 위하여 240 번째 아미노산에 위치하는 3 개의 비결핵항산성균군에 특이적인 signature 염기들을(CTG) 사용하였다(도 2).

결핵균 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하는 전 방향, 후 방향 프라이머는 195 bp의 hsp65 유전자 (전체 1623 bp hsp65 유전자 염기 중에서 701부터 895 염기 부위를 증폭)를 증폭하도록 설계되었다. 결핵균군군에 특이적인 전 방향 (forward) 프라이머 (2TBF: 5'TGC TCG AGA AGG TCA TCG GA-3')(서열번호3)를 제조하기 위하여 240 번째 아미노산에 위치하는 3 개의 결핵균군에 특이적인 signature 염기들을(GGA) 사용하였다 (도 2). 후 방향 프라이머는 2TBR: 5'TCA CCT GAC CAC CGG TGA GA-3')(서열번호4) 기존의 GenBank 데이터베이스에 전체 1623 bp hsp65 유전자 염기서열이 분석된 M. tuberculosis (GenBank No. M15467) 및 M. avium (GenBank No. AF281650) 2 주를 분석하여 전체 염기서열 중 876 번째의 결핵균 특이적인 염기 (A) 가 프라이머의 3'끝에 오도록 설계하였다.

2.다중 프라이머 PCR 방법 개발

1) 미코박테리아 표준균주

다중 프라이머 PCR 방법이 결핵균군과 비결핵항산성균군과의 감별을 가능하게 하는지를 확인하기 위하여 미코박테리아 표준균주로는 표 1에서 보여주는 54 주의 표준균주를 사용하였다.

2) DNA 추출

Bead beater phenol (BB/P) 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 간단하게 설명하면 균의 집락을 따내, TEN buffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM: pH 8.0)에 부유시킨 후에 직경 0.1 mm 초자구 (diameter 0.1 mm; Biospec Products, Bartlesville, Okla., U.S.A.) 100 ㎕ (packing volume)와 phenol: chloroform: isopropylalcohol (50:49:1) 용액 100 ㎕를 함께 부유시켜 mini beater로 1 분간 진탕하여 균체를 파쇄 하였다. 균 파쇄 액은 12000 rpm으로 5 분간 원심분리하고 상청액 (100 ㎕)을 새로운 tube에 옮긴 후, 60 ㎕의 isopropylalcohol을 섞고, 다시 15,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척한 후 TE (pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer 60 ㎕로 DNA를 회수하였다.

3) 다중 프라이머 PCR

위에서 제조된 각 군에 특이적인 프라이머 쌍들을 서로 조합하여 한번의 PCR 만으로 서로 다른 크기의 증폭산물을 생산함으로서 (결핵균군: 195 bp, 비결핵한산성균군: 515 bp) 결핵균군과 비결핵항산성균군을 서로 감별할 수 있는 다중 프라이머 PCR 법을 개발 하였다. PCR 반응은 2 U의 Taq polymerase, 10 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂을 포함하는 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)을 이용하였다. 조건은 결핵균군 특이적인 프라이머 set인 2TBF-2TBR을 각각 10 pmol, 비결핵항산성균군 특이적인 프라이머 set인 MOTT3F-MOTT3R을 각각 20 pmol 넣고, 주형 DNA 50 ng을 넣고, 증류수를 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 첨가하여 혼합물을 만들었다. PCR은 first denature 95℃로 5분, 30 cycle로 denaturation 95℃ 1분 annealing 62℃ 45초 extension 72℃ 1분, final extension 72℃ 5분으로 수행하였다 (Model 9600 thermocycler, Perkin-Elmer cetus). 증폭산물은 2.5 % 아가로스 젤에 전기영동 하여 확인하였다.

4) 다중 프라이머 PCR의 미코박테리움 민감도 분석

개발된 다중 프라이머 PCR 방법의 민감도를 측정하기 위해서 결핵균 표군균주 M. tuberculosis (ATCC 27294)와 비결핵항산성균에 속하는 M. avium (ATCC25291)의 DNA의 희석배수에 대하여 다중 프라이머 PCR을 수행하였다. 그 결과 도 3에서 보이는 것처럼 결핵균인 경우 1 pg 까지의 희석배율에서, M. avium인 경우 100 pg의 희석배율에서 다중프라이머 증폭산물을 생산함을 확인하였다.

5) 다중 프라이머 PCR의 54 주 표준균주에의 적용

다중 프라이머 PCR을 54 주 표준균주 DNA에 적용하였을 경우 결핵균군에 속하는 5주 (M. tuberculosis, M. bovis , M. bovis BCG, M. africanum , M. microti)는 모두 결핵균군에 특이적인 195-bp의 hsp65 유전자 분절을 생산하였고(도 4), 비결핵항산성균 49 주는 비결핵항산성균에 특이적인 515 bp 유전자 분절을 생산함을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 개발된 다중 프라이머 PCR 방법은 배양된 균주인 경우에는 결핵균군과 비결핵항산성균군, 두 군 사이를 100%의 민감도와 특이도로 감별할 수 있음을 보여준다.

[실시예 3] 미코박테리아 균 동정을 위한 Ava-II, Hae-III PRA 방법 개발

다른 다중 프라이머 방법과 비교하여 볼 때, 본 발명의 다중 프라이머 PCR 법의 가장 큰 장점은 비결핵항산성균종의 경우 종에 상관없이 모두 일률적으로 515 bp, 단 한 개만의 증폭산물을 생산하기 때문에 이 증폭산물을 제한 효소 처리에 의하여 종 수준으로 감별할 수 있다는 것이다. 본 발명에서는 515-bp 비결핵항산성균종의 다중 프라이머 PCR 산물을 Ava-II 또는 Hae-III 제한 효소를 처리하여 종 수준으로 감별할 수 있는 알고리즘을 완성하였다.

1. 제한효소의 선별

본 발명에서는 비결핵항산성균주의 동정에 이용될 수 있는 가장 적절한 제한효소를 선별하기 위하여 표군균주 비결핵항산성균주 49 주의 염기서열을 DNASTAR (Windows, version 3.12e)의 MapDraw 프로그람을 이용하여 분석하였다. 그 결과 가장 효율적으로 균종을 동정할 수 있는 2 개의 제한효소, AvaII 와 HaeIII를 선별하였고 49 균종을 감별할 수 있는 알고리즘을 완성하였다(도 5). 본 알고리즘에서는 절단 양상의 복잡성을 피하고자 72 bp 미만의 절편은 포함시키지 않았다.

2. Ava II PRA에 의한 비결핵항산성 표준균주의 감별

도 5에서 보여주는 알고리즘에 따라 비결핵항산성균주를 동정할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 다중 프라이머 PCR에 의하여 증폭된 비결핵항산성균 표준균주의 515 bp 산물을 Ava II 제한효소를 처리하여 2.5 % 아가로스 젤상에서 절편의 다형성을 분석하여 보았다.

방법은 일단 증폭된 비결핵항산성균의 515 bp의 PCR 산물 10 ㎕에 Ava II 제한효소 2 U, 제한효소 완충용액과 증류수를 첨가하여 최종 부피를 20 ㎕로 하여 37 ℃에서 2 시간 처리한다. 제한효소 처리 후 혼합물을 2.5 % 아가로스 젤에 50 bp DNA size marker와 함께 전기영동 한 후 절편의 전기영동 다형성을 분석하여 균을 동정한다. 전기영동 할 때 표준균주 M. avium (ATCC25291)의 Ava-II 처리 시료를 internal control로서 함께 전기영동하여 이 표준균주의 72 bp 절편을 기준으로 하여 그 이하의 절편은 배제한 후 각 균주의 전기영동 다형성을 분석한다.

도 6에서 보여지는 것처럼 모든 표준균주가 전기영동 상에서 도 5의 알고리듬에서 보여주는 절편의 다형성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 국내의 폐질환 환자에서 높은 빈도로 분리되는 비결핵항산성균종인 M. avium , M. intracellulare , M. abscessus , M. fortuitum , M. kansasii 등은 Ava -II PRA에 의하여 서로 감별이 가능함을 도 6에서 보여준다.

3. Ava II PRA에 의한 M. avium complex (MAC)의 균 종 수준으로의 감별

MAC는 비결핵항산성균 중에서 임상적으로 가장 흔히 분리되고 있는 균으로서 대표적으로 M. avium와 M. intracellulare으로 구성되어 있다. 현재, 이 균종은 서로 공통적인 생화학적 특성을 가지고 있으므로 이 두 균종을 분리하는 것이 기존의 생화학적 방법으로는 불가능하다. 따라서, 본 발명의 Ava-II PRA 방법이 MAC의 두 균종을 분리 감별할 수 있는 지를 살펴보기 위하여 35 주의 MAC 임상분리 주를 대상으로 하여 실험을 수행한 후 그 결과를 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과와 비교하여 보았다. Ava-II PRA를 수행한 결과, MAC 35 주 중에서 27 주는 M. intracellulare 표군균주 ATCC 13950과 같은 PRA 패턴 (213, 126, 72 bp)을 보였고, 8 주는 M. avium 표준 균주 중에서 KIT41182와 같은 패턴 (222, 126, 72 bp)을 보였다 (도 7). 이 결과는 16S rRNA 유전자 염기서열 결과와 100 % 일치하였다 (표 2). 즉 본 방법에서 개발한 Ava -II PRA는 염기서열 분석 방법 없이, 간편하고 정확하게 MAC 균주들을 감별할 수 있었다.

또한 임상분리주를 대상으로 DNA 추출 및 다중 프라이머 PCR 및 Ava-II PRA는 상기한 바와 같이 수행하였다.

한편 임상분리 MAC 35주를 대상으로 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 다음과 같이 진행하였다. 미코박테리움 속 균종의 분류가 가능한 과변이 부위 2 곳 중에서, 대장균의 16S rRNA 유전자의 전체 염기서열을 기준으로 129-bp에서 202-bp에 해당하는 과변이 부위 A를 표적으로 하여 MAC 임상 분리균의 동정에 이용하였다 (15). 16S rRNA 유전자의 9-bp에서 609-bp에 해당하는 부위를 PCR로 증폭한 후, 직접 염기서열 분석방법으로 염기서열을 결정하였다. PCR은 AccuPower PCR PreMix를 이용하였고, forward primer로 285(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(서열번호5), reverse primer로 259 (5'TTTCACGAACAACGCGACAA-3')(서열번호6)를 사용하여 16s rRNA 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 반응은 first denature 95℃서 5분, denaturation 95℃ 60초, annealing 60℃ 45초, 그리고 extention 72℃ 60초로 30 cycle을 반복하였으며 final extension 72℃ 5분으로 수행하였다. 증폭 산물은 QIAEX II Gel Extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)에 의해 정제하여 Applied Biosystems (ABI) 373A 자동염기서열 분석기와 BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems, Warrington, U.K.)을 이용하였다. 정제된 주형 DNA 60 ng, primer 244 (5'-CCCACTGCTGCCTCCCGTAG-3')(서열번호7) 3.2 pmol, BigDye Terminator RR mix (PE Applied Biosystems, Part No. 4303153) 8 ㎕를 섞은 다음, 증류수를 첨가하여 20 ㎕의 혼합물을 만들었다. 반응은 95℃ 15초, 60℃ 10초, 그리고 60℃ 4분으로 30 cycle을 수행한 후 전기영동 하였다.

4. Hae-III PRA에 의한 표준균주의 감별

Ava-II PRA에 의하여 임상적으로 중요한 MAC을 포함한 몇 개의 비결핵항산성균종의 감별이 가능하나, 서로 감별이 되지 않는 균종들이 있다. 이럴 경우 Hae-III PRA를 수행하면 대부분의 균종들의 종 수준으로의 감별이 가능하다. DNA 추출 및 다중 프라이머 PCR은 상기한 바와 같이 수행하였고, 제한효소 처리는 PCR 산물 10 ul, 제한효소 Hae-III 2U, 제한효소 완충용액 및 증류수를 첨가하여 죄총 부치를 20 ul로 조정한 다음 37℃에 2 시간 반응 후, 2.5 % 아가로스 젤상에서 전기영동 한 후 PRA 패턴을 분석하였다. 그 결과 모든 비결핵항산성균주가 도 5의 알고리즘에서 보여주는 것과 같은 PRA 패턴을 보여주었다. 도 8에서 보여주는 것처럼 Ava-II PRA에 의하여 불가능한 M. kansasii type I과 M. kansasii type II의 감별 및 M. fortuitum 및 M. peregrinum의 감별이 가능하였다.

5. 다중프라이머 PCR 과Ava-II 와 Hae-III PRA에 의한 미코박테리아 임상분리주의 동정

본 발명에서 개발된 다중 프라이머 PCR 및 PRA 방법의 미코박테리아 임상분리주의 동정에 있어서의 유용성을 평가하기 위하여, 결핵균 117 주 및 비결핵항산성균주 134 주 총 251 주의 임상분리주를 대상으로 하여 도 5에서 보여주는 알고리즘에 따라 균 동정을 수행하였다. 즉, 먼저 다중 프라이머 PCR을 수행하여 결핵균과 비결핵항산성균을 서로 감별하였고, 비결핵항산성균인 경우 PRA을 수행하여 종 수준으로의 균 동정을 수행하였다. 그리고, 이러한 결과를 기존의 생화학적인 방법으로 동정된 결과와 서로 비교하여 보았다.

다중 프라이머 PCR을 수행한 결과 251 주 중에서 117주가 결핵균 특이적인 195 bp의 증폭산물을 생산하였고, 나머지 134 주가 비결핵항산성균주 특이적인 515-bp 증폭산물을 생산하였다. 이 결과는 생화학적인 결과와 100% 일치하는 결과를 보였다 (표 2).

비결핵항산성균주를 PRA로 분석하여 보았을 때, 모든 균주가 종 수준으로 감별이 가능하였다. 심지어는 생화학적인 방법으로 감별이 불가능한 MAC, M. fortuitum complex, M. chelonae complex의 종 수준으로의 감별 및 M. kansasii의 subspecies 수준으로의 감별 또한 가능하였다.

이상의 결과는 본 발명의 다중 프라이머 PCR 및 PRA 방법이 미코박테리아 균종 동정에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준다.

<본 발명의 다중 프라이머 PCR 및 PRA 방법에 사용한 결핵균 및 비결핵항산성균 임상분리주>

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에서 소개된 방법 및 알고리 즘을 실제 임상분리주에 적용하여 보았을 때 100%의 민감도를 보이면서 성공적으로 균 동정을 수행할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 향 후 임상적으로 문제가 되고 있는 미코박테리아 균종을 간편하고, 정확하게 동정하든 데에 상당한 기여를 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(S1) 미코박테리움 균속의 전체 1623bp로 구성된 열 충격 단백 65 (HSP65) 유전자 중 5'말단에서 228번째 염기, 243번째 염기, 543번째 염기, 600번째 염기, 705번째 염기 및 718-720번째 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 유전자 분절을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여, 해당 유전자 분절을 증폭하는 단계,

(S2) 상기 증폭된 유전자 분절의 염기서열을 분석하는 단계,

(S3) 상기 228번째 염기, 243번째 염기, 543번째 염기, 600번째 염기, 705번째 염기 또는 718번-720번째까지의 염기를 비교하여 비결핵항산성균과 결핵균을 감별하는 방법,

상기 비교에서 비결핵항산성균은 228번째 염기가 C, 243번째 염기가 C, 543번째 염기가 C, 600번째 염기가 C 또는 T, 705번째 염기가 G 또는 718번-720번째까지의 염기가 CAG이며, 결핵균은 228번째 염기가 A, 243번째 염기가 T, 543번째 염기가 T, 600번째 염기가 G, 705번째 염기가 C 또는 718번-720번째까지의 염기가 GGA임.
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비결핵항산성균에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍.
제5항의 프라이머 쌍을 이용한 비결핵항산성균 군을 감별하는 방법.
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제6항에 있어서, 상기 방법은 서열번호3 및 서열번호4에 기재된 프라이머쌍을 더욱 포함하는 결핵균 및 비결핵항산성균 군을 감별하는 방법.
제5항의 프라이머 쌍을 이용하여 515bp의 PCR 반응 산물을 얻고, 이 반응 산물을 제한효소로 처리하는 것을 포함하는 비결핵항산성 균주 감별방법.
제10항에 있어서, 상기 제한효소는 Ava-II 또는 Hae-III인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제한효소 처리 후, 제한효소 절단 단편 분석에 의하여 비결핵항산성 균주를 감별하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 Ava-II 제한효소 처리시 단편의 크기는 515bp; 또는 465bp; 또는 420bp; 또는 417bp 및 98bp; 또는 411bp; 또는 411bp 및 95bp; 또는 393bp 및 72bp; 또는 357bp; 또는 267bp 및 126bp; 또는 231bp 및 198bp; 또는 222 bp 및 198bp; 또는 222bp 및 126bp; 또는 213bp 및 198bp; 또는 213bp 및 126bp인 방법.
제12항에 있어서, 상기 Hae-III 제한효소 처리시 단편의 크기는 337bp; 또는 286bp; 또는 286bp 및 100bp; 또는 250bp 및 146bp; 또는 245bp 및 128bp; 또는 245 bp 및 92bp; 또는 192bp; 또는 192bp 및 181bp; 또는 192bp, 145bp 및 129bp; 또는 192bp, 145bp 및 95bp; 또는 192bp, 145bp 및 78bp; 또는 192bp 및 145bp; 또는 192 bp 및 123bp; 또는 192bp 및 122bp; 또는 192bp 및 119bp; 또는 192bp, 114bp 및 97bp; 또는 192bp, 112bp 및 83bp; 또는 192bp 및 112bp; 또는 192bp, 111bp 및 87bp; 또는 192bp, 103bp 및 101bp; 또는 192bp, 103bp 및 78bp; 또는 192bp 및 103bp; 또는 192bp, 94bp 및 78bp; 또는 192bp, 87bp 및 83bp; 또는 192bp 및 87bp; 또는 192bp 및 81bp; 또는 192bp 및 78bp; 또는 168bp, 106bp 및 86bp; 또는 114bp, 103bp 및 97bp; 또는 106bp, 103bp 및 86bp인 방법.
서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 결핵균 및 비결핵항산성균군 감별 키트.