CN109628619A - 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用 - Google Patents

用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109628619A
CN109628619A CN201910003861.8A CN201910003861A CN109628619A CN 109628619 A CN109628619 A CN 109628619A CN 201910003861 A CN201910003861 A CN 201910003861A CN 109628619 A CN109628619 A CN 109628619A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycobacterium
sequence
seq
sample
tested
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910003861.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109628619B (zh
Inventor
孙照刚
段慧娟
孔成成
曹廷明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Chest Hospital
Original Assignee
Beijing Chest Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Chest Hospital filed Critical Beijing Chest Hospital
Priority to CN201910003861.8A priority Critical patent/CN109628619B/zh
Publication of CN109628619A publication Critical patent/CN109628619A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109628619B publication Critical patent/CN109628619B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用，涉及菌种鉴别技术领域。该SNP分子标记共包含17个SNP位点，分布于Hsp65基因、rrs基因和pncA基因，上述SNP分子标记在结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌中具有多态性。上述引物组合物可以扩增Hsp65基因、rrs基因和pncA基因，以用于后续SNP分子标记的分析以及菌种的鉴别。

Description

用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂 盒和应用
技术领域
本发明涉及菌种鉴别技术领域，尤其是涉及一种用于鉴别分枝杆菌的 SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用。
背景技术
结核病是最严重的流行性传染疾病之一，使人类的公共健康面临着巨大的挑战。它在全世界范围内有着相当高的致病率和致死率。
传统的鉴别结核分枝杆菌菌种的方法是根据菌落形态、氧偏好性、烟酸累积、硝酸盐还原酶的活性以及生长动力学等的表型特征来判断，这些方法都制约于缓慢的细菌培养，而且涉及主观解读易于判错。目前常见的分子生物学进行菌种鉴别的方法主要根据测定插入序列16s rRNA的碱基差异来判断的，即使是采用测定16s rRNA基因序列的方法也无法的区分上述数十种分枝杆菌。因此快速鉴别分枝杆菌中的成员，对于控制传染源和早期治疗起着至关重要的作用，也可为临床治疗提供用药指导。现今的分子鉴别方法主要有IS6110-RFLP，MIRU-VNTR和Spoligotyping。IS6110-RFLP 应用广泛，分辨率较高，但该方法基于大量菌株的培养，价格高，时间长且IS6110拷贝数较少的菌株不易分型；MIRU-VNTR不需要大量培养菌株，结果容易读识，但由于位脱氧核苷酸点组合不同，其分辨率和成簇率亦不尽相同；Spoligotyping分型方法用时较短，成本较低，但分辨率较低，图片结果易产生假阳性。因此一种改进的鉴别结核分枝杆菌菌种的方法是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，该SNP分子标记在结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌中具有多态性。
本发明的第二目的在于提供一种用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，该引物组合物能够扩增分布有所述SNP标记的基因。
本发明的第三目的在于提供一种用于鉴别鉴别分枝杆菌的方法，该方法能够鉴别出的分枝杆菌包括结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。
本发明的第四目的在于提供一种上述用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记、上述用于鉴别分枝杆菌的引物组合物、上述试剂盒或上述鉴别分枝杆菌的方法在制备用于检测结核病试剂盒中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，包括：位于Hsp65基因的 SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、 SNP11和SNP12，所述Hsp65基因具有如SEQID NO.1所示序列；位于rrs 基因的SNP13、SNP14、SNP15和SNP16，所述rrs基因具有如SEQID NO.2 所示序列；和，位于pncA基因的SNP17，所述pncA基因具有如SEQ ID NO.3 所示序列；
所述SNP1自SEQ ID NO.1所示序列5’端起130位的碱基是C、T或A；
所述SNP2自SEQ ID NO.1所示序列5’端起154位的碱基是C、G或 T；
所述SNP3自SEQ ID NO.1所示序列5’端起157位的碱基是T或C；
所述SNP4自SEQ ID NO.1所示序列5’端起181位的碱基是G、T或 C；
所述SNP5自SEQ ID NO.1所示序列5’端起182位的碱基是C或T；
所述SNP6自SEQ ID NO.1所示序列5’端起184位的碱基是G、C或 T；
所述SNP7自SEQ ID NO.1所示序列5’端起187位的碱基是C、A、 G或T；
所述SNP8自SEQ ID NO.1所示序列5’端起193位的碱基是G、C或 A；
所述SNP9自SEQ ID NO.1所示序列5’端起241位的碱基是C或G；
所述SNP10自SEQ ID NO.1所示序列5’端起299位的碱基是G、A 或T；
所述SNP11自SEQ ID NO.1所示序列5’端起346位的碱基是G、T 或C；
所述SNP12自SEQ ID NO.1所示序列5’端起442位的碱基是C或G；
所述SNP13自SEQ ID NO.2所示序列5’端起87位的碱基是T或C；
所述SNP14自SEQ ID NO.2所示序列5’端起179位的碱基是A或T；
所述SNP15自SEQ ID NO.2所示序列5’端起220位的碱基是G或A；
所述SNP16自SEQ ID NO.2所示序列5’端起224位的碱基是G、T 或A；
所述SNP17自SEQ ID NO.3所示序列5’端起269位的碱基是C或G；
所述分枝杆菌包括：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。
本发明还提供了一种用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，包括引物对 Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3；
引物对Myco1包括具有如SEQ ID NO.4所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.5所示序列的引物；
引物对Myco2包括具有如SEQ ID NO.6所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.7所示序列的引物；
引物对Myco3包括具有如SEQ ID NO.8所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.9所示序列的引物。
优选地，所述引物组合物中的引物经过修饰；所述修饰包括磷酸化修饰、生物素修饰、地高辛修饰、硫代修饰、反向dT修饰或荧光修饰。
本发明还提供了一种包含上述引物组合物的试剂盒。
本发明还提供了一种鉴别分枝杆菌的方法，该方法包括检测待测样品的所述SNP分子标记的多态性，比较待测样品的分子标记与野生型的区别，以判定待测样品的菌种；
所述野生型的Hsp65基因具有如SEQ ID NO.1所示序列；rrs基因具有如SEQ IDNO.2所示序列；pncA基因具有如SEQ ID NO.3所示序列；
其中，若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP2为G、 SNP4为T、SNP6为T、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为脓肿分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP12为G，则鉴别为非洲分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP6为C、SNP9为G、SNP10 为T和SNP11为C，则鉴别为鸟分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP17为G，则鉴别为牛型分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为G、SNP3为C、SNP4 为T、SNP7为A、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为偶发分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP3为C、SNP6为C、SNP7 为G、SNP9为G和SNP11为C，则鉴别为胃分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP7为G、SNP9为G和SNP10 为T，则鉴别为胞内分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为T、SNP3为C、SNP6 为T、SNP7为T、SNP9为G和SNP11为C，则鉴别为堪萨斯分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP10为T、SNP11 为C、SNP14为T、SNP15为A和SNP16为T，则鉴别为海分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A，则鉴别为田鼠分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP5为T、SNP9为G和SNP10 为T，则鉴别为瘰疬分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为T、SNP3为C、SNP4 为C、SNP7为T、SNP8为C、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为耻垢分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP9为G、SNP10 为T和SNP11为C，则鉴别为苏加分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A，则鉴别为结核分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP10为T、SNP11 为C、SNP13为C、SNP14为T和SNP16为A，则鉴别为溃疡分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP7为G、SNP9为G、SNP10 为A和SNP11为C，则鉴别为蟾蜍分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP3为C、SNP7为G、SNP8 为A、SNP9为G、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为戈登分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP6为C、SNP7为T、SNP9 为G和SNP10为T，则鉴别为猿分枝杆菌。
优选地，使用上述引物组合物或试剂盒扩增待测样品的基因，然后分析扩增产物的序列，确定所述SNP分子标记的多态性。
优选地，使用常规PCR方法扩增待测样品的基因，退火温度为55～65℃，优选为58～62℃，更优选为60℃。
优选地，使用基因芯片分析扩增产物以确定所述SNP分子标记的多态性。
优选地，使用测序的方法分析扩增产物以确定所述SNP分子标记的多态性。
本发明还提供了上述用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记、上述用于鉴别分枝杆菌的引物组合物、上述试剂盒或上述鉴别分枝杆菌的方法在制备用于检测结核病试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
发明提供的SNP分子标记在上述18种分枝杆菌中均具有多态性，通过检测待测分枝杆菌在17个SNP位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。并且本发明提供的用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记包含的 SNP位点分布于三个不同的基因，从三个不同的基因上的SNP的多态性来区别不同种类的分枝杆菌，可以增加不同种类的分枝杆菌的SNP之间的多态性的差别，提高鉴别的准确度。本发明还提供了用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，该引物组合物能够扩增分布有所述SNP标记的基因，以快速、灵敏、特异的扩增待测样品种分枝杆菌的Hsp65基因、rrs基因和pncA基因。
本发明还提供了一种鉴别分枝杆菌的方法，该方法可以检测包括如下 18种分枝杆菌：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。该鉴别分枝杆菌的方法与现有技术比较，具有如下优点：无需培养及生化检验等繁琐的步骤，简便；无需等待4-8周得到检测结果，快速；综合结核分枝杆菌复合群的18个菌种的鉴别，不仅包括主要侵染人体并引起严重耐药的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，还包括同时能够引起人结核病的牛型分枝杆菌(M.Bovis)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)和溃疡分枝杆菌 (M.ulcerans)等18中主要分枝杆菌，鉴别较全面。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的引物组合物扩增产物的凝胶电泳的结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，该SNP分子标记共包含17个SNP位点，其中SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、 SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11和SNP12分布于具有如SEQ ID NO.1 所示序列的Hsp65(热休克蛋白)基因；SNP13、SNP14、SNP15和SNP16 分布于具有如SEQ ID NO.2所示序列的rrs基因；SNP17分布于具有如SEQ ID NO.3所示序列的pncA基因。所述SNP分子标记中各SNP的位点的位置以及碱基类型如表1～表3所示。
本发明所述的鉴别分枝杆菌主要检测引起结核病的病原菌，所述引起结核病的病原菌包括致病性的分枝杆菌菌种和条件性致病分枝杆菌菌种，主要包括在国内主要发现的如下18个菌种：结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.Bovis)、非洲分枝杆菌(M.Africanum subtype I)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胃分枝杆菌(M. gastri)、海分枝杆菌(M.marinum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、苏加分枝杆菌 (M.szulgai)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)和猿分枝杆菌(M. simiae)。
表1脓肿分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌和胃分枝杆菌的SNP分子标记中各SNP位点的分布和碱基类型
表2胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的SNP分子标记中各SNP位点的分布和碱基类型
表3苏加分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌的SNP分子标记中各SNP位点的分布和碱基类型
分枝杆菌是一类抗酸染色阳性、革兰氏染色阳性、胞内寄生的杆状细菌。他包括高致病性的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB) 复合群、麻风分枝杆菌和条件致病性或非致病性的肺结核分枝杆菌 (nontuberculosis mycobacterium，NTM)。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指同一位点的不同等位基因间只有一个核苷酸的差异或只有小的插入、缺失。本发明提供的SNP分子标记在上述18种分枝杆菌中均具有多态性，通过检测待测分枝杆菌在17个SNP位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。并且本发明提供的用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记包含的SNP位点分布于三个不同的基因，从三个不同的基因上的SNP的多态性来区别不同种类的分枝杆菌，可以增加不同种类的分枝杆菌的SNP之间的多态性的差别，以提高鉴别的准确度。
本发明还提供了用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，该引物组合物能够扩增分布有所述SNP分子标记的基因，包括用于扩增待测样品中的分枝杆菌的Hsp65基因的引物对Myco1，引物对Myco1包括具有如SEQ ID NO.4 所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.5所示序列的引物；用于扩增待测样品中的分枝杆菌的rrs基因的引物对Myco2，引物对Myco2包括具有如SEQ ID NO.6所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.7所示序列的引物；和，用于扩增待测样品中的分枝杆菌的pncA基因的引物对Myco3，引物对Myco3 包括具有如SEQ ID NO.8所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.9所示序列的引物。从1985年Mullis创建了聚合酶链式反应(PCR)技术，到1989 年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，再到1990年我国引进该项技术，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。 PCR检测序技术来鉴别分枝杆菌具有快速、灵敏、特异的优点，非常适合生长缓慢的分枝杆菌的快速诊断。
在一些可选的实施方式中，上述引物组合物中的引物还可以经过修饰，例如可以但不限于包括括磷酸化修饰、生物素修饰、地高辛修饰、硫代修饰、反向dT修饰或荧光修饰等，可以理解的是只要符合分子生物学实验的常规实验原理，本发明不限制引物的修饰方式。
基于上述发明构思，本发明还提供了一种包含上述引物组合物的试剂盒。将上述引物组合物预先制备成为试剂盒，可提高实验效率，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂可以具有广泛的用途。例如该试剂盒可选地包括盐离子、dNTP、DNA聚合酶等PCR试剂时可以作为PCR扩增试剂盒。
本发明还提供了一种鉴别分枝杆菌的方法，该方法可以检测包括如下 18种分枝杆菌：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌；该方法包括检测待测样品的所述SNP分子标记的多态性，比较待测样品的SNP分子标记与野生型的区别，根据待测样品中SNP分子标记中与各 SNP位点与野生型的差别以判定待测样品的菌种；其中上述18种分枝杆菌中每种分枝杆菌与野生型的差别如表1～表3所示。本发明所述的野生型是指Hsp65基因具有如SEQ ID NO.1所示序列，rrs基因具有如SEQID NO.2 所示序列，和pncA基因具有如SEQ ID NO.3所示序列的分枝杆菌。
本发明提供的鉴别分枝杆菌的方法与现有技术比较，具有如下优点：无需培养及生化检验等繁琐的步骤，简便；无需等待4-8周得到检测结果，快速；综合结核分枝杆菌复合群的18个菌种的鉴别，不仅包括主要侵染人体并引起严重耐药的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，还包括同时能够引起人结核病的牛型分枝杆菌(M.Bovis)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)等18中主要分枝杆菌，鉴别较全面。
在一些可选的实施方式中，使用上述引物组合物或上述试剂盒扩增待测样品的基因，然后分析扩增产物的序列，确定所述SNP分子标记的多态性，无需大型昂贵的检测仪器，只需普通的PCR仪及其试剂即可进行实验。
在一些可选的实施方式中，使用上述引物组合物中的各引物对优选在各自独立的体系中进行PCR扩增反应，其扩增效率优于将各引物对混合至同一体系的复合PCR，其中引物对Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3 的退火温度分别独立的为55～65℃，例如可以为但不限于为55℃、56℃、 57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃；优选为58～62℃，更优选为60℃，通过优化退火温度可以进一步优化扩增效率。
在一些可选的实施方式中，使用基因芯片或者测序的方法分析扩增产物的序列以确定所述SNP分子标记的多态性。可选地，所述测序方法包括一代测序、二代测序或者三代测序，例如可以为但不限于为基于Roche454、 Illumina、Life SOLID/Ion Torrent或PacBio RS测序平台的二代测序；或例如可以为但不限于为基于PacBio SMRT或OxfordNanopore测序平台的三代测序，可以理解的是，只要能获得待测样品中SNP分子标记中各位点的具体碱基类型即可，本发明对此不做限制。
由于结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌是主要的结核病的致病菌或条件致病菌，因此本发明还提供一种上述用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记、上述用于鉴别分枝杆菌的引物组合物、上述试剂盒或上述鉴别分枝杆菌的方法在制备用于检测结核病试剂盒中的应用，以制备出能够快速、准确的检测出结核病的试剂盒。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，包括引物对 Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3，具体的如表4所示。
表4引物对Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3
实施例2
使用实施例1提供的引物组合物鉴别18种分枝杆菌，其中包括属于结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌M.tuberculosis(ATCC 27294)、牛型分枝杆菌M.Bovis(ATCC19210)和田鼠分枝杆菌M.Microti(ATCC 19422)；还包括属于结核分枝杆菌复合群之外的非结核分枝杆菌(MOTT)的鸟分枝杆菌M.avium(ATCC 25291)。所有菌株均为首都医科大学附属北京胸科医院的北京结核病临床数据和样本资源库保存的菌株。
以供试菌株的基因组DNA为模板，采用实施例1设计的引物对进行 PCR扩增。
PCR反应：使用表4中三组引物对，采用常规的PCR反应体系，反应体系如下：总体积为20μl，包括2×Premix Taq(Code No.:R004A，Takara 公司，Premix是由DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture组成的2倍浓度的混合液)10μl，10μM的上下游引物各1μl(终浓度为0.5μM)，DNA 模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。
反应条件：94℃5min，30个循环：94℃45sec、60℃45sec、72℃50sec，最终延伸72℃7min。对引物采用同一个退火温度，减少了操作步骤，节省了菌种鉴别时间。
实验重复三次。
对上述各受试菌种的PCR扩增产物进行序列测定，之后与表1～表3进行比较，以结核分枝杆菌M.tuberculosis为例，其PCR扩增产物的序列分别如SEQ ID NO.10(Hsp65基因)、SEQ ID NO.11(rrs基因)和SEQ ID NO.12 (pncA基因)所示，以测序获得的序列和野生型比较，得到SNP1相对于野生型突变为A，与表3中的结果相符，因此该方法可以鉴别出分枝杆菌的种类。其余菌种中SNP位点的突变形式也均与表1～表3列出的相符，上述几种结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌全部得到正确的菌种判断。
实施例3
本实施例提供了一种鉴别分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
1.临床痰液样本的收集，使用QIAamp DNA Mini Kit(CAT.No.51304) 试剂盒，通过预处理提取DNA；
2.PCR反应：使用表4中三组的引物对，采用常规的PCR反应体系，反应体系如下：总体积为20μl，包括2×Premix Taq(Code No.:R004A，Takara 公司，Premix是由DNAPolymerase、Buffer、dNTP Mixture组成的2倍浓度的混合液)10μl，10μM的上下游引物各1μl(终浓度为0.5μM)，DNA 模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。
反应条件：94℃5min，30个循环：94℃45sec、60℃45sec、72℃50sec，最终延伸72℃7min。对引物采用同一个退火温度，减少了操作步骤，节省了菌种鉴别时间。
PCR结果如图1所示，其中泳道M1为marker，条带由大到小分别为700/600/500/400/300bp；泳道1为引物对Myco1的扩增产物，泳道2为引物对Myco2的扩增产物，泳道3为引物对Myco3的扩增产物。
3.PCR结果的序列分析，然后根据序列分析结果，对照表1～表3中的所列举的SNP位点的信息判定属于何种分枝杆菌菌种。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
<120> 用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 710
<212> DNA
<213> 分枝杆菌（Mycobacterium）
<400> 1
gggccgcaac gtcgtcctgg aaaagaagtg gggtgccccc acgatcacca acgatggtgt 60
gtccatcgcc aaggagatcg agctggagga tccgtacgag aagatcggcg ccgagctggt 120
caaagaggtc gccaagaaga ccgatgacgt cgccggtgac ggcaccacga cggccaccgt 180
gctggcccag gcgttggttc gcgagggcct gcgcaacgtc gcggccggcg ccaacccgct 240
cggtctcaaa cgcggcatcg aaaaggccgt ggagaaggtc accgagaccc tgctcaaggg 300
cgccaaggag gtcgagacca aggagcagat tgcggccacc gcagcgattt cggcgggtga 360
ccagtccatc ggtgacctga tcgccgaggc gatggacaag gtgggcaacg agggcgtcat 420
caccgtcgag gagtccaaca cctttgggct gcagctcgag ctcaccgagg gtatgcggtt 480
cgacaagggc tacatctcgg ggtacttcgt gaccgacccg gagcgtcagg aggcggtcct 540
ggaggacccc tacatcctgc tggtcagctc caaggtgtcc actgtcaagg atctgctgcc 600
gctgctcgag aaggtcatcg gagccggtaa gccgctgctg atcatcgccg aggacgtcga 660
gggcgaggcg ctgtccaccc tggtcgtcaa caagatccgc ggcaccttca 710
<210> 2
<211> 483
<212> DNA
<213> 分枝杆菌（Mycobacterium）
<400> 2
gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacggaaagg tctcttcgga gatactcgag 60
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtgat ctgccctgca cttcgggata agcctgggaa 120
actgggtcta ataccggata ggaccacggg atgcatgtct tgtggtggaa agcgctttag 180
cggtgtggga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtgg ggtgacggcc taccaaggcg 240
acgacgggta gccggcctga gagggtgtcc ggccacactg ggactgagat acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac 360
gccgcgtggg ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcaccatcga cgaaggtccg 420
ggttctctcg gattgacggt aggtggagaa gaagcaccgg ccaactacgt gccagcagcc 480
gcg 483
<210> 3
<211> 687
<212> DNA
<213> 分枝杆菌（Mycobacterium）
<400> 3
gtcatgttcg cgatcgtcgc ggcgtcatgg accctatatc tgtggctgcc gcgtcggtag 60
gcaaactgcc cgggcagtcg cccgaacgta tggtggacgt atgcgggcgt tgatcatcgt 120
cgacgtgcag aacgacttct gcgagggtgg ctcgctggcg gtaaccggtg gcgccgcgct 180
ggcccgcgcc atcagcgact acctggccga agcggcggac taccatcacg tcgtggcaac 240
caaggacttc cacatcgacc cgggtgacca cttctccggc acaccggact attcctcgtc 300
gtggccaccg cattgcgtca gcggtactcc cggcgcggac ttccatccca gtctggacac 360
gtcggcaatc gaggcggtgt tctacaaggg tgcctacacc ggagcgtaca gcggcttcga 420
aggagtcgac gagaacggca cgccactgct gaattggctg cggcaacgcg gcgtcgatga 480
ggtcgatgtg gtcggtattg ccaccgatca ttgtgtgcgc cagacggccg aggacgcggt 540
acgcaatggc ttggccacca gggtgctggt ggacctgaca gcgggtgtgt cggccgatac 600
caccgtcgcc gcgctggagg agatgcgcac cgccagcgtc gagttggttt gcagctcctg 660
atggcaccgc cgaaccggga tgaactg 687
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggccgcaac gtcgtcctg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaaggtgcc gcggatctt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctggcggcg tgcttaaca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcggctgct ggcacgtag 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcatgttcg cgatcgtcg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagttcatcc cggttcggc 19
<210> 10
<211> 710
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）
<400> 10
gggccgcaac gtcgtcctgg aaaagaagtg gggtgccccc acgatcacca acgatggtgt 60
gtccatcgcc aaggagatcg agctggagga tccgtacgag aagatcggcg ccgagctggt 120
caaagaggta gccaagaaga ccgatgacgt cgccggtgac ggcaccacga cggccaccgt 180
gctggcccag gcgttggttc gcgagggcct gcgcaacgtc gcggccggcg ccaacccgct 240
cggtctcaaa cgcggcatcg aaaaggccgt ggagaaggtc accgagaccc tgctcaaggg 300
cgccaaggag gtcgagacca aggagcagat tgcggccacc gcagcgattt cggcgggtga 360
ccagtccatc ggtgacctga tcgccgaggc gatggacaag gtgggcaacg agggcgtcat 420
caccgtcgag gagtccaaca cctttgggct gcagctcgag ctcaccgagg gtatgcggtt 480
cgacaagggc tacatctcgg ggtacttcgt gaccgacccg gagcgtcagg aggcggtcct 540
ggaggacccc tacatcctgc tggtcagctc caaggtgtcc actgtcaagg atctgctgcc 600
gctgctcgag aaggtcatcg gagccggtaa gccgctgctg atcatcgccg aggacgtcga 660
gggcgaggcg ctgtccaccc tggtcgtcaa caagatccgc ggcaccttca 710
<210> 11
<211> 483
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）
<400> 11
gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacggaaagg tctcttcgga gatactcgag 60
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtgat ctgccctgca cttcgggata agcctgggaa 120
actgggtcta ataccggata ggaccacggg atgcatgtct tgtggtggaa agcgctttag 180
cggtgtggga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtgg ggtgacggcc taccaaggcg 240
acgacgggta gccggcctga gagggtgtcc ggccacactg ggactgagat acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac 360
gccgcgtggg ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcaccatcga cgaaggtccg 420
ggttctctcg gattgacggt aggtggagaa gaagcaccgg ccaactacgt gccagcagcc 480
gcg 483
<210> 12
<211> 687
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）
<400> 12
gtcatgttcg cgatcgtcgc ggcgtcatgg accctatatc tgtggctgcc gcgtcggtag 60
gcaaactgcc cgggcagtcg cccgaacgta tggtggacgt atgcgggcgt tgatcatcgt 120
cgacgtgcag aacgacttct gcgagggtgg ctcgctggcg gtaaccggtg gcgccgcgct 180
ggcccgcgcc atcagcgact acctggccga agcggcggac taccatcacg tcgtggcaac 240
caaggacttc cacatcgacc cgggtgacca cttctccggc acaccggact attcctcgtc 300
gtggccaccg cattgcgtca gcggtactcc cggcgcggac ttccatccca gtctggacac 360
gtcggcaatc gaggcggtgt tctacaaggg tgcctacacc ggagcgtaca gcggcttcga 420
aggagtcgac gagaacggca cgccactgct gaattggctg cggcaacgcg gcgtcgatga 480
ggtcgatgtg gtcggtattg ccaccgatca ttgtgtgcgc cagacggccg aggacgcggt 540
acgcaatggc ttggccacca gggtgctggt ggacctgaca gcgggtgtgt cggccgatac 600
caccgtcgcc gcgctggagg agatgcgcac cgccagcgtc gagttggttt gcagctcctg 660
atggcaccgc cgaaccggga tgaactg 687

Claims (10)

1.一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，包括：位于Hsp65基因的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11和SNP12，所述Hsp65基因具有如SEQ IDNO.1所示序列；位于rrs基因的SNP13、SNP14、SNP15和SNP16，所述rrs基因具有如SEQ IDNO.2所示序列；和，位于pncA基因的SNP17，所述pncA基因具有如SEQ ID NO.3所示序列；
所述SNP1自SEQ ID NO.1所示序列5’端起130位的碱基是C、T或A；
所述SNP2自SEQ ID NO.1所示序列5’端起154位的碱基是C、G或T；
所述SNP3自SEQ ID NO.1所示序列5’端起157位的碱基是T或C；
所述SNP4自SEQ ID NO.1所示序列5’端起181位的碱基是G、T或C；
所述SNP5自SEQ ID NO.1所示序列5’端起182位的碱基是C或T；
所述SNP6自SEQ ID NO.1所示序列5’端起184位的碱基是G、C或T；
所述SNP7自SEQ ID NO.1所示序列5’端起187位的碱基是C、A、G或T；
所述SNP8自SEQ ID NO.1所示序列5’端起193位的碱基是G、C或A；
所述SNP9自SEQ ID NO.1所示序列5’端起241位的碱基是C或G；
所述SNP10自SEQ ID NO.1所示序列5’端起299位的碱基是G、A或T；
所述SNP11自SEQ ID NO.1所示序列5’端起346位的碱基是G、T或C；
所述SNP12自SEQ ID NO.1所示序列5’端起442位的碱基是C或G；
所述SNP13自SEQ ID NO.2所示序列5’端起87位的碱基是T或C；
所述SNP14自SEQ ID NO.2所示序列5’端起179位的碱基是A或T；
所述SNP15自SEQ ID NO.2所示序列5’端起220位的碱基是G或A；
所述SNP16自SEQ ID NO.2所示序列5’端起224位的碱基是G、T或A；
所述SNP17自SEQ ID NO.3所示序列5’端起269位的碱基是C或G；
所述分枝杆菌包括：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。
2.用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，其特征在于，包括引物对Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3；
引物对Myco1包括具有如SEQ ID NO.4所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.5所示序列的引物；
引物对Myco2包括具有如SEQ ID NO.6所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.7所示序列的引物；
引物对Myco3包括具有如SEQ ID NO.8所示序列的引物和具有如SEQ ID NO.9所示序列的引物。
3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中的引物经过修饰；所述修饰包括磷酸化修饰、生物素修饰、地高辛修饰、硫代修饰、反向dT修饰或荧光修饰。
4.包含上述权利要求2或3项所述的引物组合物的试剂盒。
5.一种鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，包括检测待测样品的所述SNP分子标记的多态性，比较待测样品的分子标记与野生型的区别，以判定待测样品的菌种；
所述野生型的Hsp65基因具有如SEQ ID NO.1所示序列；rrs基因具有如SEQ ID NO.2所示序列；pncA基因具有如SEQ ID NO.3所示序列；
其中，若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP2为G、SNP4为T、SNP6为T、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为脓肿分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP12为G，则鉴别为非洲分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP6为C、SNP9为G、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为鸟分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP17为G，则鉴别为牛型分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为G、SNP3为C、SNP4为T、SNP7为A、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为偶发分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP3为C、SNP6为C、SNP7为G、SNP9为G和SNP11为C，则鉴别为胃分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP7为G、SNP9为G和SNP10为T，则鉴别为胞内分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为T、SNP3为C、SNP6为T、SNP7为T、SNP9为G和SNP11为C，则鉴别为堪萨斯分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP10为T、SNP11为C、SNP14为T、SNP15为A和SNP16为T，则鉴别为海分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A，则鉴别为田鼠分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP5为T、SNP9为G和SNP10为T，则鉴别为瘰疬分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为T、SNP3为C、SNP4为C、SNP7为T、SNP8为C、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为耻垢分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP9为G、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为苏加分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A，则鉴别为结核分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP10为T、SNP11为C、SNP13为C、SNP14为T和SNP16为A，则鉴别为溃疡分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP7为G、SNP9为G、SNP10为A和SNP11为C，则鉴别为蟾蜍分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP3为C、SNP7为G、SNP8为A、SNP9为G、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为戈登分枝杆菌；
若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP6为C、SNP7为T、SNP9为G和SNP10为T，则鉴别为猿分枝杆菌。
6.根据权利要求5所述的鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，使用权利要求2或3所述的引物组合物或权利要求4所述的试剂盒扩增待测样品的基因，然后分析扩增产物的序列，确定所述SNP分子标记的多态性。
7.根据权利要求6所述的鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，使用常规PCR方法扩增待测样品的基因，退火温度为55～65℃，优选为58～62℃，更优选为60℃。
8.根据权利要求6所述的鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，使用基因芯片分析扩增产物以确定所述SNP分子标记的多态性。
9.根据权利要求6所述的鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，使用测序的方法分析扩增产物以确定所述SNP分子标记的多态性。
10.权利要求1所述的用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记、权利要求2或3所述的用于鉴别分枝杆菌的引物组合物、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5-9中任一项所述的鉴别分枝杆菌的方法在制备用于检测结核病试剂盒中的应用。
CN201910003861.8A 2019-01-03 2019-01-03 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用 Active CN109628619B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910003861.8A CN109628619B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910003861.8A CN109628619B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109628619A true CN109628619A (zh) 2019-04-16
CN109628619B CN109628619B (zh) 2022-05-03

Family

ID=66056677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910003861.8A Active CN109628619B (zh) 2019-01-03 2019-01-03 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109628619B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110453001A (zh) * 2019-08-28 2019-11-15 北京市结核病胸部肿瘤研究所 1073个snp位点在结核分枝杆菌谱系3中的应用
CN112538538A (zh) * 2020-11-26 2021-03-23 中国医学科学院北京协和医院 用于脓肿分枝杆菌检测的试剂盒及系统
CN113373251A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于鉴定结核分枝杆菌复合群的snp分子标记、pcr引物及应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100692484B1 (ko) * 2005-11-03 2007-03-13 재단법인서울대학교산학협력재단 결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에사용되는 뉴클레오타이드들
CN1995380A (zh) * 2006-01-05 2007-07-11 中国人民解放军总医院第二附属医院 一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒
CN102634575A (zh) * 2012-03-26 2012-08-15 中国人民解放军第三O九医院 一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒
CN103088139A (zh) * 2013-01-28 2013-05-08 清华大学 用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用
CN103882130A (zh) * 2014-03-24 2014-06-25 中国科学院微生物研究所 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用
CN104561245A (zh) * 2013-10-16 2015-04-29 复旦大学 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒
CN104651520A (zh) * 2015-03-05 2015-05-27 首都医科大学附属北京胸科医院 一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物及应用
CN105112510A (zh) * 2015-08-02 2015-12-02 昆明理工大学 一种用于分枝杆菌分型的基因芯片及其使用方法
CN105331709A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 昆明理工大学 用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒
CN106834498A (zh) * 2017-03-03 2017-06-13 广州金域医学检验中心有限公司 一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100692484B1 (ko) * 2005-11-03 2007-03-13 재단법인서울대학교산학협력재단 결핵균 및 비결핵항산성균 감별 또는 동정 방법 및 이에사용되는 뉴클레오타이드들
CN1995380A (zh) * 2006-01-05 2007-07-11 中国人民解放军总医院第二附属医院 一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒
CN102634575A (zh) * 2012-03-26 2012-08-15 中国人民解放军第三O九医院 一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒
CN103088139A (zh) * 2013-01-28 2013-05-08 清华大学 用于检测分枝杆菌的引物对和标准品以及它们的应用
CN104561245A (zh) * 2013-10-16 2015-04-29 复旦大学 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒
CN103882130A (zh) * 2014-03-24 2014-06-25 中国科学院微生物研究所 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用
CN104651520A (zh) * 2015-03-05 2015-05-27 首都医科大学附属北京胸科医院 一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物及应用
CN105112510A (zh) * 2015-08-02 2015-12-02 昆明理工大学 一种用于分枝杆菌分型的基因芯片及其使用方法
CN105331709A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 昆明理工大学 用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒
CN106834498A (zh) * 2017-03-03 2017-06-13 广州金域医学检验中心有限公司 一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG KIM ET AL: "Differentiation of Mycobacterium species by analysis of the heat-shock protein 65 gene (hsp65)", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY》 *
MOHAMMAD S. BAMAGA ET AL: "An assessment of a multiplex PCR assay for differentiating clinically important mycobacteria based on pncA gene variation", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
孙谦: "分子生物学快速鉴定分枝杆菌方法学比较及其耐药研究", 《万方学位论文》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110453001A (zh) * 2019-08-28 2019-11-15 北京市结核病胸部肿瘤研究所 1073个snp位点在结核分枝杆菌谱系3中的应用
CN110453001B (zh) * 2019-08-28 2022-11-11 北京市结核病胸部肿瘤研究所 1073个snp位点在结核分枝杆菌谱系3中的应用
CN112538538A (zh) * 2020-11-26 2021-03-23 中国医学科学院北京协和医院 用于脓肿分枝杆菌检测的试剂盒及系统
CN113373251A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于鉴定结核分枝杆菌复合群的snp分子标记、pcr引物及应用
CN113373251B (zh) * 2021-08-03 2022-07-12 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于鉴定结核分枝杆菌复合群的snp分子标记、pcr引物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109628619B (zh) 2022-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Azadi et al. Mycobacteriosis and tuberculosis: laboratory diagnosis
Neonakis et al. Molecular diagnostic tools in mycobacteriology
Cloud et al. Identification of Mycobacterium spp. by using a commercial 16S ribosomal DNA sequencing kit and additional sequencing libraries
Abadia et al. Resolving lineage assignation on Mycobacterium tuberculosis clinical isolates classified by spoligotyping with a new high-throughput 3R SNPs based method
CN102634575B (zh) 一种分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒
Ladrón et al. Rapid identification of Rhodococcus equi by a PCR assay targeting the choE gene
Tortoli et al. Survey of 150 strains belonging to the Mycobacterium terrae complex and description of Mycobacterium engbaekii sp. nov., Mycobacterium heraklionense sp. nov. and Mycobacterium longobardum sp. nov.
CN109628619A (zh) 用于鉴别分枝杆菌的snp分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用
CN101023170A (zh) 结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法
Pfyffer et al. Mycobacterium: laboratory characteristics of slowly growing mycobacteria
da Silva Rocha et al. Use of PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene for rapid identification of mycobacteria in Brazil
US7960106B2 (en) Diagnostic method and products useful therein
Leão et al. Identification of two novel Mycobacterium avium allelic variants in pig and human isolates from Brazil by PCR-restriction enzyme analysis
WO2012087135A1 (en) Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use
Toney et al. Revival and emended description of ‘Mycobacterium paraffinicum’Davis, Chase and Raymond 1956 as Mycobacterium paraffinicum sp. nov., nom. rev.
Abbadi et al. Strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex isolated from sputum of pulmonary tuberculosis patients
EP1098003A2 (en) Identification method and specific detection method of slow growing mycobacteria utilizing DNA gyrase gene
KR101765677B1 (ko) 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법
Shin et al. Novel diagnostic algorithm using tuf gene amplification and restriction fragment length polymorphism is promising tool for identification of nontuberculous mycobacteria
Gürtler et al. Direct identification of slowly growing Mycobacterium species by analysis of the intergenic 16S-23S rDNA spacer region (ISR) using a GelCompar II database containing sequence based optimization for restriction fragment site polymorphisms (RFLPs) for 12 enzymes
Glennon et al. Detection and diagnosis of mycobacterial pathogens using PCR
Chawla et al. Accurate subspecies-level identification of clinically significant Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare by whole-genome sequencing
Cattoir et al. The sodA gene as a target for phylogenetic dissection of the genus Haemophilus and accurate identification of human clinical isolates
CN110499380A (zh) 一种检测黄杆菌的引物对和检测方法
CN112501328B (zh) 用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记、特异性引物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant