CN104561245A

CN104561245A - 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒

Info

Publication number: CN104561245A
Application number: CN201310485727.9A
Authority: CN
Inventors: 罗涛; 柳清云; 高谦
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明属检测试剂领域，涉及核分枝杆菌复合群检测鉴定试剂盒及结核分枝杆菌复合群鉴定的方法，本方法通过序列比对，设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的荧光探针及扩增引物，并基于实时荧光定量PCR平台，通过非对称扩增PCR技术和探针熔解曲线分析技术，检测rrs基因上分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群特异的SNP位点，从而达到鉴定分枝杆菌属细菌，并进一步鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的目的。本发明方法具有操作简便，检测时间短，特异性强灵敏度高的特点。

Description

结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒

技术领域

本发明属检测试剂领域，涉及核分枝杆菌复合群检测鉴定试剂盒及结核分枝杆菌复合群鉴定的方法，尤其涉及通过检测分枝杆菌16S rRNA编码基因特异的单核苷酸多态性位点，鉴定分枝杆菌属细菌，并鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒及鉴定方法。

背景技术

现有技术公开了结核病是长期威胁人类健康的传染性疾病，其病原体是结核分枝杆菌，全球约三分之一人口感染结核分枝分枝杆菌。据世界卫生组织统计，2011年全球共有结核病新发病例870万，约140万人死于结核病。中国属于全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居全球第二位。我国每年约有新发病例100万，约13万人死于结核病。因此，结核病至今仍是威胁人类健康的全球性卫生问题。

结核分枝杆菌复合群（MTBC）包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，研究显示，引起人类结核病的主要病原菌是结核分枝杆菌；非结核分枝杆菌（NTM）广泛分布于环境中（如湿土、沼泽、河流），属于机会致病菌。在临床诊断中，在感染NTM引起的NTM肺病中，由于其症状、体征与MTBC感染引起的肺结核病类似，因而常难以区别。但医疗实践中，由于对两种疾病采取的治疗药物不同，因此在临床诊断中需要快速、准确地鉴别MTBC与NTM，从而选择正确的药物进行治疗。

通常，传统的鉴别MTBC和NTM的方法是通过培养、染色、进行菌型生化鉴定，其存在费时耗力的缺陷。目前，我国普遍采用对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）的罗氏培养基生长试验鉴定MTBC和NTM，该方法耗时长达1个月，因此无法满足临床快速诊断的需求。临床实践中，需要建立快速、准确、特异、敏感的MTBC/NTM菌种鉴定的方法以采用正确的药物对病患进行有效治疗、控制结核病蔓延，这是目前临床实验室中快速鉴定分枝杆菌感染所面临的巨大挑战。

16S rRNA编码基因rrs是细菌系统分类研究中最有效和最常用的分子钟，由于其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。rrs基因约1.5Kb左右，由于能体现不同菌属之间的差异，因此常被用于菌种鉴定。而基于实时荧光定量PCR的探针熔解曲线分析技术，以其特异性强、灵敏度高、速度快、全封闭反应等优点，是进行单核苷酸多态性位点检测的重要工具。本申请的发明人拟提供一种结核分枝杆菌复合群快速检测鉴定方法及其试剂盒，通过实时荧光定量PCR探针熔解曲线法检测rrs基因上分枝杆菌属和MTBC特异的SNP位点，达到鉴定分枝杆菌属细菌，并进一步鉴别MTBC和NTM的目的。

发明内容

本发明的目的之一在于针对临床结核分枝杆菌复合群鉴定中的技术缺陷，提供一种速度快、灵敏度高、特异性好的检测方法，用于鉴定分枝杆菌属，并鉴别MTBC与NTM。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定分枝杆菌属并鉴别MTBC与NTM的检测试剂盒。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：基于实时荧光定量PCR平台，结合非对称扩增PCR技术和探针熔解曲线分析技术，并在同一反应体系中检测不同荧光标记的探针与扩增产物所形成的熔解曲线峰，通过熔解曲线峰值（Tm）的判读来达到以上检测目的。

本发明的具体工作原理是通过特异性引物非对称扩增目标16S rRNA基因单链片段，基于实时荧光定量PCR技术平台，通过荧光双标记探针熔解曲线分析鉴定待测样本的基因型，判定是否属于分枝杆菌属并进一步鉴别MTBC与NTM。本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团脱氧核苷酸单链。当探针在游离状态下时，荧光基团的信号被淬灭基团所吸收，此时检测不到荧光；当探针与模板互补结合后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光激发。而在熔解曲线分析时，随着温度的升高，探针与模板的结合与解链则反应在荧光信号的改变上，而通过比较完全匹配与不完全匹配的模板DNA在荧光信号改变所对应的温度差异，可判断该样本在所检测区域的基因型，从而判断该样本所属的菌种类型。

本发明提供了结核分枝杆菌复合群快速鉴定试剂盒，用于鉴定分枝杆菌菌属并鉴别MTBC与NTM，所述的试剂盒中，包括一对引物和两条探针；所述引物包括16SrRNA基因特异性的上游引物16sR和下游引物16sL；用于鉴定分枝杆菌属的探针Probe-Myco(FAM荧光标记)；用于鉴别MTBC与NTM的探针Probe-Mtbc（ROX荧光标记）。

本发明提供了一种分枝杆菌属及结核分枝杆菌复合群鉴定方法，通过序列比对，设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的荧光探针及扩增引物，并基于实时荧光定量PCR平台，通过非对称扩增PCR技术和探针熔解曲线分析技术，检测rrs基因上分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群特异的SNP位点，从而达到鉴定分枝杆菌属细菌，并进一步鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的目的。

具体的，本发明的一种分枝杆菌属及结核分枝杆菌复合群鉴定方法，其特征在，其包括步骤：

步骤1，以分枝杆菌属16SrRNA编码基因特定序列为待测靶标，设计一对通用引物，对待测样品DNA进行PCR扩增；

步骤2，以分枝杆菌属16SrRNA编码基因特定序列为检测靶标，设计两条荧光双标记探针分别用于鉴定分枝杆菌属（FAM荧光）和结核分枝杆菌复合群（ROX荧光）；

步骤3，通过对探针熔解曲线及Tm值分析，从而鉴定待测样本是否属于分枝杆菌属或结核分枝杆菌复合群。

本发明中，通过对分枝杆菌属细菌16SrRNA编码基因比对分析，选定其中一条长度为451bp的片段作为目标序列，其序列编号为SEQ ID NO.1；

本发明中，根据目标序列设计一对通用引物，对分枝杆菌属细菌DNA进行扩增；引物序列为：

上游引物16sR：5’-TACCTGGGTTTGACATGCAC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物16sL：5’-CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3’(SEQ ID NO.3)；

本发明中，根据目标序列中的两个检测区域设计两条荧光双标记探针，探针5’端标记荧光基团（FAM或ROX），3’端标记淬灭基团（BHQ1或BHQ2）；

探针序列为：

荧光探针Probe-Myco：5’-FAM-TGCACgACCTGCACACAGGCgACAAG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.4)；

荧光探针Probe-Mtbc：5’-ROX-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3’(SEQ ID NO.5)。

更具体的，本发明的实施例中，通过下述步骤进行分枝杆菌属及结核分枝杆菌复合群鉴定：

1.通过对NCBI数据库中的分枝杆菌属与非分枝杆菌、MTBC与NTM的16SrRNA基因序列进行生物信息学比对分析，选择具有识别并区分分枝杆菌与非分枝杆菌以及MTBC与NTM的保守序列片段作为靶标，其基因片段的扩增目标序列为：

tacctgggtttgacatgcacaggacgcgtctagagataggcgttcccttgtggcctgtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctcatgttgccagcacgtaatggtggggactcgtgagagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacaaagggctgcgatgccgcgaggttaagcgaatccttaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccg靶标序列(SEQ ID NO.1)

2.应用Primer3软件设计对以上目标序列扩增的上游引物16sR和下游引物16sL。应用Primer express软件设计荧光双标记探针Probe-Myco(荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1)和Probe-Mtbc（荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2）：探针Probe-Myco用于鉴定分枝杆菌属，该探针为突变型探针，即覆盖区域与分枝杆菌属细菌该序列区域有两个错配位点，而与非分枝杆菌属细菌则由于错配更多无法结合，因此该探针的设计目的在于通过是否熔解曲线峰来判定是否属于分枝杆菌属；探针和Probe-Mtbc用于鉴别MTBC与NTM，该探针与MTBC细菌该序列区域完全互补匹配，而与NTM细菌该序列区域则存在不同位点或数量的错配，从而使MTBC的熔解曲线峰值较NTM高，因此可通过熔解曲线峰值（Tm）判定MTBC或NTM；

上游引物16sR：5’-TACCTGGGTTTGACATGCAC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物16sL：5’-CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3’(SEQ ID NO.3)

荧光探针Probe-Myco：5’-FAM-TGCACgACCTGCACACAGGCgACAAG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.4)

荧光探针Probe-Mtbc：5’-ROX-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3’(SEQ IDNO.5)

3.构建和制备内参质粒标准品

针对当反应无扩增曲线或熔解曲线峰时，出现的（1）反应体系未正常工作，（2）临床样本中无分枝杆菌DNA的两种可能，本发明合成一条DNA片段，该片段包含上下游引物结合序列和与探针Probe-Myco完全互补匹配的序列，并将该片段克隆到pMD19-T载体中，构建的重组质粒作为反应体系的内参质粒以每次反应50拷贝的数量加入到反应体系中，作为反应体系是否工作正常的监测物；

4.构建和制备阳性对照质粒标准品

将上下游引物16sR与16sL对实验室标准菌株H37Rv的扩增基因片段克隆到pMD19-T载体中，构建的重组质粒作为阳性对照在每次反应是加入到阳性对照管中，以方便检测结果的判读；

5.PCR扩增与检测反应体系

本发明的反应体系总体积为20ul/反应，具体成分包括：PCR Buffer（Tris10mM,KCl50mM），2.5mM浓度MgCl₂，0.2mM浓度dNTPs，1uM浓度16sR引物，0.05uM浓度16sL引物，2U mTaq DNA聚合酶，10～100ng模板DNA，加ddH₂0至总体积为20ul；

6.PCR扩增及熔解曲线反应条件

第一步（预变性）：95℃，3min；

第二步（PCR扩增）：如下过程进行40循环：95℃，15s；55℃，10s(检测荧光)；72℃，20s；

第三步（熔解曲线）：从45℃上升至85℃，每0.5℃检测一次荧光信号，荧光通道选用FAM和ROX；

7.熔解曲线峰的参考值（参考范围）

阳性对照：反应体系中FAM通道的阳性对照熔解曲线峰Tm值为63℃±0.5℃，ROX通道的阳性对照熔解曲线峰Tm值为67℃±0.5℃；

内参质粒：当内参质粒出现检测信号时，其熔解曲线峰Tm值为76℃±0.5℃；

以上各Tm值是在Bio-Rad CFX96Real-Time PCR仪器上所检测的常见值，作为参考。当使用其他Real-Time PCR仪器平台时，Tm值可能略有偏差，以档次实验的阳性对照所得Tm值为准；

8.结果判读

通过比较所检测样本与阳性对照之间熔解曲线Tm值的差异判定该样本是否属于分枝杆菌属并鉴别MTBC与NTM：1）当检测样本的FAM和ROX通道熔解曲线Tm值均与阳性对照一致（±1℃）时，则该样本为MTBC样本；2）当FAM通道熔解曲线Tm值与阳性对照一致，而ROX通道熔解曲线Tm值低于阳性对照1.5℃及以上时，该样本为NTM样本；3）当ROX通道无熔解曲线峰，而FAM通道的熔解曲线峰为内参质粒检测峰且Tm（74℃左右）值高于阳性对照，此时样本为非分枝杆菌或样本中无分枝杆菌DNA。

混合样本结果的判读：当检测样本为MTBC与NTM混合感染的样本时，ROX通道会出现双峰或者融合峰，分以下三种情况：1）当样本检测结果为双峰，即为混合样本，且MTBC与NTM的DNA浓度相当；2）当样本检测结果为一个融合峰，且与阳性对照的Tm值一致时，为混合样本，此时MTBC的DNA浓度高于NTM；3）当样本检测结果为一个融合峰，且Tm值低于阳性对照1.5℃及以上时，为混合样本，此时MTBC的DNA浓度低于NTM。

本发明提供了鉴定分枝杆菌属以及鉴别MTBC与NTM的方法，综合巧妙地利用了实时荧光定量PCR技术的高效扩增与探针技术的高特异性等优点，克服了普通PCR定性检测方法的不足，极大地提高了检测灵敏度和特异性。该方法广泛适用于各类实时荧光定量PCR工作平台。

本发明具有以下优点：1）操作简便，仅需将待测样本的DNA加入反应体系中，置于实时荧光PCR仪中即完成手动操作；2）所需时间短，整个检测过程只需2～3小时，为病人节省诊断时间；3）灵敏度高，最低可检测DNA浓度为50拷贝/反应的样本；4）特异性好，通过临床样本评估，能严格鉴定分枝杆菌属并鉴别MTBC与NTM；5）避免污染，整个反应过程均在封闭的反应管内进行，避免了交叉污染情况的产生。

附图说明

图1为Probe-Myco探针典型熔解曲线结果图，

图中，横坐标代表温度，纵坐标代表荧光强度与温度的负导数（-dF/dT），曲线1为分枝杆菌DNA样本检测结果峰，曲线2为阴性对照中内参质粒熔解曲线峰，若检测结果熔解曲线及Tm值如曲线1，则判定为分枝杆菌属DNA样本；若检测结果熔解曲线如曲线2，则判定为非分枝杆菌DNA样本。

图2为Probe-Mtbc探针典型熔解曲线结果图，

图中，横坐标代表温度，纵坐标代表荧光强度与温度的负导数（-dF/dT），曲线1为阳性对照的检测结果峰，其他曲线代表不同的NTM菌株DNA样本的检测结果峰，若检测结果熔解曲线及Tm值如曲线1，则判定为结核分枝杆菌复合群DNA样本；若检测结果熔解曲线及Tm值如其他曲线，则判定为NTM菌株DNA样本。

图3为Probe-Myco探针在分枝杆菌DNA样本浓度较低时（≤5×10³拷贝/反应）的检测结果图，

图中，横坐标代表温度，纵坐标代表荧光强度与温度的负导数（-dF/dT），曲线1-4分别代表分枝杆菌DNA浓度为5×10³拷贝/反应、5×10²拷贝/反应、5×10¹拷贝/反应以及阴性对照H₂O的熔解曲线峰。

图4为Probe-Mtbc探针在结核分枝杆菌DNA不同浓度下的灵敏度检测结果，

分别在DNA浓度为5×10⁵拷贝/反应，5×10⁴拷贝/反应，5×10³拷贝/反应，5×10²拷贝/反应，5×10¹拷贝/反应，5×10⁰拷贝/反应进行灵敏度检测，观察到最低在5×10¹拷贝/反应浓度时有明显的检测峰。

图5为Probe-Mtbc探针在待测样本为非分枝杆菌DNA样本时的检测结果图，

图中，横坐标代表温度，纵坐标代表荧光强度与温度的负导数（-dF/dT），当待测样本为非分枝杆菌时，由于无Probe-Mtbc探针对应的靶标序列扩增，因此检测结果峰与阴性对照相同，即无熔解曲线峰。

具体实施方式

实施例1.引物与探针设计

在NCBI数据库中检索常见分枝杆菌属（包括MTBC与NTM）与常见非分枝杆菌属细菌的16S rRNA基因序列，进行生物信息学比对分析，选择具有识别并区分分枝杆菌与非分枝杆菌以及MTBC与NTM的保守序列片段作为靶标序列，其中，靶标序列一（rrs1022-1046）用于鉴别分枝杆菌属细菌与非分枝杆菌属细菌，在该序列区域，分枝杆菌细菌表现为序列一致性，而非分枝杆菌在该区域存在不同的突变，因此可通过检测这一区域从而鉴别分枝杆菌与非分枝杆菌；靶标序列二（rrs1269-1291）用于鉴别MTBC与NTM，在该序列区域，MTBC细菌表现为序列一致性，而NTM细菌则在该区域存在不同的突变，通过检测这一区域可实现鉴别MTBC与NTM；

应用Primer3软件设计扩增以上目标序列的上游引物16sR和下游引物16sL，扩增产物长度为451bp（rrs975-1325），针对靶标序列一和靶标序列二，应用Primerexpress软件，设计荧光双标记探针Probe-Myco(荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1)，用于鉴定分枝杆菌属细菌；设计探针Probe-Mtbc（荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2），用于鉴别MTBC与NTM，其中，探针Probe-Myco中引入了两个突变位点（探针序列中用小写g表示），目的是为了区别内参质粒检测峰与样本DNA检测峰；

上游引物16sR：5’-TACCTGGGTTTGACATGCAC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物16sL：5’-CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3’(SEQ ID NO.3)

荧光探针Probe-Mtbc：5’-ROX-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3’(SEQ IDNO.5)

实施例2：内参质粒与阳性对照质粒的构建与制备

1.内参质粒与阳性对照质粒的构建

内参质粒构建：人工合成一条DNA单链片段，该片段包含上下游引物（16sR、16sL）的结合序列以及与探针Probe-Myco完全互补匹配的序列，以该序列为模板进行PCR扩增反应得到双链产物，并将该产物克隆到pMD19-T载体中，并进行DNA序列测定。将该重组质粒作为内参标准品，并命名为16s-IC。内参质粒以低（50拷贝/反应）浓度加入到每个反应体系中，目的是监测整个反应体系是否正常工作：1）当检测样本为非分枝杆菌DNA时，此时内参能够正常扩增并被检测，熔解曲线峰Tm值为76℃（±0.5℃）；2）当检测样本为分枝杆菌DNA时，由于所加临床样本DNA浓度在10⁶-10⁷拷贝/反应，远远高于内参质粒浓度，此时优先扩增分枝杆菌DNA并被检测，熔解曲线峰Tm值为67℃（±0.5℃）；3）当检测样本中存在抑制PCR反应成分时，整个体系将扩增失败，既没有内参熔解曲线峰，也没有分枝杆菌熔解曲线峰；

阳性对照质粒构建：用设计的上下游引物16sR与16sL对实验室标准菌株H37Rv的DNA模板进行扩增得到目标基因片段，将该片段克隆到pMD19-T载体中，并进行DNA序列测定，将该重组质粒作为阳性对照标准品，并命名为16s-PC。每次检测需做阳性对照检测试验，做两次重复，阳性对照熔解曲线作为判断MTBC的参照曲线；

2.质粒标准品的制备

将质粒16s-IC与16s-PC经过提取纯化后，用NanoDrop^TMND-2000分光光度计检测质粒浓度与纯度，并根据摩尔质量与阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。计算公式如下：

质粒拷贝数=（C*N）/（1*10⁹*M）

C代表质粒的浓度（ng/ul）；

M代表质粒的摩尔质量（g/mol）；

N代表阿伏伽德罗常数（6.02×10²³/mol）。

实施例3：临床分枝杆菌基因组DNA提取

用热裂解法提取分枝杆菌基因组DNA：1）从固体培养基上刮取1-2接种环分枝杆菌，重悬于100uL TE中，80℃灭活30分钟，2）灭活后的菌株拿出P3实验室进行如下操作：100℃煮沸1分钟，立即置冰上2分钟，12000r/min离心10分钟后，取上清置于另一无菌EP管中，-20℃保存，该上清液即用于PCR扩增的模板DNA。

实施例4：反应体系的建立与优化

1）引物浓度与比例的优化：在反应体系的其他条件不变的情况下，调整上下游引物16sR与16sL的浓度比例，分别在5:1，8:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1几种不同的浓度比例下验证扩增效率，经过重复实验确定20:1的最优引物扩增比例；

2）mTaq酶量的优化：比较在mTaq酶量在0.5U，1U，1.5U，2U的不同浓度下反应扩增效率，选定1U为最优酶量浓度；

3）内参质粒浓度的优化：比较在内参质粒浓度为10拷贝/反应，50拷贝/反应，100拷贝/反应，1000拷贝/反应的不同情况下阴性对照以及待测样本中内参质粒的检测信号，选定50拷贝/反应为最佳内参质粒浓度；

4）PCR反应参数的优化：根据扩增产物的长度为451bp，因此PCR反应的延伸时间在20s～25s之间，比较在15s，20s，25s不同的扩增时间下反应的扩增效率，选定72℃延伸时间为20s。

实施例5：试剂盒的灵敏度测试

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取实验室标准菌株H37Rv基因组DNA，并用NanoDrop^TMND-2000分光光度计检测DNA样本的浓度与纯度，并根据基因组DNA摩尔质量与阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。计算公式如下：

DNA拷贝数=（C*N）/（1*10⁹*M）

C代表DNA的浓度（ng/ul）；

M代表基因组DNA的摩尔质量（g/mol）；

N代表阿伏伽德罗常数（6.02×10²³/mol）

将基因组DNA浓度分别标准稀释到5×10⁵拷贝/反应，5×10⁴拷贝/反应，5×10³拷贝/反应，5×10²拷贝/反应，5×10¹拷贝/反应，5×10⁰拷贝/反应，将不同梯度浓度的DNA样本分别用于上述反应条件进行检测，每个浓度梯度做两个平行反应，结果如图4所示，5×10⁵拷贝/反应，5×10⁴拷贝/反应，5×10³拷贝/反应，5×10²拷贝/反应，5×10¹拷贝/反应均有较明显的熔解曲线峰，而5×10⁰拷贝/反应的样本信号较低。因此，本方法灵敏度可准确检测50拷贝/反应浓度以上的临床分枝杆菌DNA样本。

实施例6：试剂盒的特异性检验

为了验证本发明试剂盒的特异性，分别采用非分枝杆菌（大肠杆菌）、结核分枝杆菌（结核分枝杆菌实验室标准株H37Rv以及临床结核分枝杆菌样本）、非结核分枝杆菌（鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等）的DNA提取物按上述反应条件进行检测，结果显示，Probe-Myco探针只有分枝杆菌属细菌呈阳性检测结果，Probe-Mtbc探针只有结核分枝杆菌复合群DNA样本与阳性对照一致；本发明试剂盒可严格特异地鉴定分枝杆菌属，并鉴别MTBC与NTM。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 451

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tacctgggtt tgacatgcac aggacgcgtc tagagatagg cgttcccttg tggcctgtgt 60

gcaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 120

gagcgcaacc cttgtctcat gttgccagca cgtaatggtg gggactcgtg agagactgcc 180

ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg 240

cttcacacat gctacaatgg ccggtacaaa gggctgcgat gccgcgaggt taagcgaatc 300

cttaaaagcc ggtctcagtt cggatcgggg tctgcaactc gaccccgtga agtcggagtc 360

gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 420

cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc g 451

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物16sR

<400> 2

tacctgggtt tgacatgcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物16sL

<400> 3

cgggtgttac cgactttcat 20

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 荧光探针Probe-Myco

<400> 4

tgcacgacct gcacacaggc gacaag 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 荧光探针Probe-Mtbc

<400> 5

tgagaccggc ttttaaggat tcg 23

Claims

1.一种分枝杆菌属及结核分枝杆菌复合群鉴定方法，其特征在于，其包括步骤：

步骤3，通过对探针熔解曲线及Tm值分析，鉴定待测样本是否属于分枝杆菌属或结核分枝杆菌复合群。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过对分枝杆菌属细菌16SrRNA编码基因比对分析，选定长度为451bp的片段作为目标序列，其序列编号为SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据目标序列设计一对通用引物，对分枝杆菌属细菌DNA进行扩增；引物序列为：

上游引物16sR：5’-TACCTGGGTTTGACATGCAC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物16sL：5’-CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3’(SEQ ID NO.3)。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据目标序列中的两个检测区域设计两条荧光双标记探针，探针5’端标记荧光基团（FAM或ROX），3’端标记淬灭基团（BHQ1或BHQ2），

探针序列为：

荧光探针Probe-Mtbc：5’-ROX-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3’(SEQ IDNO.5)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中的PCR扩增与检测反应体系中，包括：10mM浓度Tris,50mM浓度KCl，2.5mM浓度MgCl₂，0.2mM浓度dNTPs，1uM浓度16sR引物，0.05uM浓度16sL引物，2U mTaq DNA聚合酶，10～100ng模板DNA，加ddH₂0至总体积为20ul。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中的PCR扩增及溶解曲线反应条件为：

第一步：95℃，3min；第二步：如下过程进行40循环：95℃，15s；55℃，10s(检测荧光)；72℃，20s；第三步：从45℃上升至85℃，每0.5℃检测一次荧光；检测通道选用FAM和ROX。

7.一种结核分枝杆菌复合群快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括一对引物和两条探针；所述引物包括16S rRNA基因特异性的上游引物16sR和下游引物16sL；用于鉴定分枝杆菌属的探针Probe-Myco(FAM荧光标记)；用于鉴别MTBC与NTM的探针Probe-Mtbc（ROX荧光标记）。