CN103562405A - 用于检测和鉴定分枝杆菌属的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本文提供检测和鉴定分枝杆菌属的菌株的方法，以及进行这些方法的组合物和试剂盒。具体而言，提供核酸扩增和荧光检测方法用于基于例如病原性、种类，和抗生素抗性或敏感性的分枝杆菌属的检测和分化。本文提供在不同分枝杆菌属以及分枝杆菌属和非分枝杆菌属的混合物中鉴定和区分分枝杆菌属的组合物和方法。

Description

用于检测和鉴定分枝杆菌属的组合物、方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本发明要求2010年12月10日提交的美国临时专利申请系列No.61/412,190的优先权，其据此通过引用整体并入。
领域
本文提供检测和鉴定分枝杆菌属(mycobacteria)的菌株的方法，以及进行这些方法的组合物和试剂盒。具体而言，提供核酸扩增和荧光检测方法用于基于例如病原性、种类，和抗生素抗性或敏感性的分枝杆菌属的检测和分化。本文提供在不同分枝杆菌属和非分枝杆菌属的混合物中鉴定和分化分枝杆菌属的组合物和方法。
背景
分枝杆菌属是放线菌门(Actinobacteria)的种属，归入它自己的科，即分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)。该种属包括已知导致在哺乳动物中包括结核病(TB)和麻风病的严重疾病的病原体(Ryan和Ray(编辑)(2004).Sherris Medical Microbiology(第四版).McGraw Hill.；其据此通过引用整体并入)。分枝杆菌属可在它们的宿主内定殖而不会使宿主显示不利迹象。例如，世界范围内数十亿人被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染，但没有症状。分枝杆菌属对诸如青霉素的大量抗生素具有天然抗性，并且已经出现许多其他抗生素抗性菌株。
为了诊断和治疗，将分枝杆菌属分类为结核分枝杆菌复合群(MTBC)或非结核分枝杆菌(NTM)。MTBC包括以下可导致结核病的种类：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、坎纳分枝杆菌(M.canetti)，和田鼠分枝杆菌(M.microti)。NTM是所有其他分枝杆菌属，其可导致类似结核病的肺病、淋巴结炎、皮肤病、弥散性疾病、汉森氏病(Hansen’s disease)，和麻风病。在MTBC和NTM中，不同种类在世界上不同区域或多或少相同，并表现出不同的病原性和病毒性特征。
抗生素抗性TB和多药抗性TB(MDR TB)，尤其是广谱药物抗性TB(XDR TB)的存在给医疗机构带来巨大忧虑。MDR TB是对通常用于治疗患有TB疾病的所有人员的两种一线抗TB药物，异烟肼和利福平具有抗性。XDR TB是当前相对少些的MDR TB，它定义为对异烟肼和利福平，并对任何氟喹诺酮以及三种可注射二线药物(例如，阿米卡星、卡那霉素，或卷曲霉素)至少之一具有抗性的TB。由于XDR TB对一线和二线药物产生抗性，患者只能采用效果较差的治疗方法。TB的抗药形式增加了对未来TB流行、但治疗方法有限的忧虑，并且危害世界范围内TB治疗和控制的进展。
分枝杆菌属感染通常能够由以下的混合感染组成：在其他传染原存在下的分枝杆菌属；NTM和MTBC；NTM或MTBC的不同种类；和/或具有不同抗生素抗性特征的分枝杆菌属。
概述
在一些实施方案中，本文提供鉴定样品中的分枝杆菌属的一种或多种类型的方法，其包括：(a)提供：(i)疑似包含一种或多种分枝杆菌属的样品，以及(ii)包含至少一对引物以及与在一种或多种分枝杆菌属中相邻靶核酸序列杂交的两种杂交探针的至少一个可检测区分的探针组的检测试剂，各探针组包含：(A)使用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，以及(B)使用发射荧光染料和非荧光猝灭剂标记的信号传导探针，其中当未与它的靶序列杂交时，信号探针不发射背景以上荧光，但在没有结合的猝灭剂探针的情况下一旦与它的靶序列杂交，则发射背景以上的荧光信号，其中，如果信号传导和猝灭剂探针均与它们相邻靶核酸序列杂交，则猝灭剂探针的非荧光猝灭剂猝灭来自信号传导探针的信号；(b)使用引物由一种或多种分枝杆菌属扩增核酸；(c)检测在一系列温度下来自各可检测区分的探针组的发射荧光染料的荧光；(d)生成各发射荧光染料的温度依赖性荧光标签；以及(e)分析温度依赖性荧光标签以鉴定样品中的一种或多种分枝杆菌属。
在一些实施方案中，在探针组中信号传导探针的解链温度高于缔合的猝灭剂探针的解链温度。在一些实施方案中，猝灭剂探针和/或信号传导探针被配置成与分枝杆菌属核酸的可变区杂交。在一些实施方案中，各探针组的发射荧光染料和非荧光猝灭剂能够通过FRET相互作用。在一些实施方案中，检测试剂包含两个或多个探针组。在一些实施方案中，两个或多个探针组包含在可检测地不同的波长下发射的不同发射荧光染料。在一些实施方案中，两个或多个探针组包含相同发射荧光染料。在一些实施方案中，包含相同发射荧光染料的探针组在对它们的靶核酸序列的可检测地不同的解链温度下与它们的靶核酸序列杂交。在一些实施方案中，两个或多个探针组分别通过以下与在所述检测试剂中所有其他探针组可检测区分：(1)解链温度，(2)所述发射荧光染料的发射波长，或者(3)其组合。在一些实施方案中，检测试剂包含5个或更多个探针组。在一些实施方案中，检测试剂包含10个或更多个探针组。在一些实施方案中，探针组用于在不同病原性、种类，或抗生素抗性的分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，所述探针组的一种或两种探针包含与在两种或多种不同分枝杆菌属中它们的靶序列的不同程度的互补性。在一些实施方案中，不同程度的互补性导致通过探针组和靶序列生成的不同的温度依赖性荧光标签。在一些实施方案中，不同的温度依赖性荧光标签用于分化样品中不同的分枝杆菌属。在一些实施方案中，温度依赖性荧光标签包含解链曲线或退火曲线。在一些实施方案中，分析温度依赖性荧光标签包括与之前建立的解链曲线或退火曲线比较。在一些实施方案中，通过计算机进行分析。在一些实施方案中，扩增是通过在第一次少量扩增循环之后包括引物的延伸和平均引物退火温度的非对称扩增方法。在一些实施方案中，扩增是LATE-PCR扩增。在一些实施方案中，在至少一个可检测区分的探针组中探针具有扩增反应的至少一种引物的退火温度以下的对它们的靶核酸序列的解链温度。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在NTM和MTBC之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在NTM和MTBC之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含16s rRNA。在一些实施方案中，所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：53和SEQ ID NO.：54或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：51和SEQ ID NO.：52或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在MTBC的不同种类之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在MTBC的不同种类之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含gyrB基因。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：61和SEQ ID NO.：62或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：59或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：60或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：57和SEQ ID NO.：58或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，三个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含rpoB基因。在一些实施方案中，三个或多个可检测区分的探针组包含SEQ IDNO.：30、SEQ ID NO.：31、SEQ ID NO.：32、SEQ ID NO.：33、SEQ IDNO.：34，和SEQ ID NO.：35或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含embB基因。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组包含SEQID NO.：69和SEQ ID NO.：70或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：67和SEQ ID NO.：68或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与包含tlyA基因的分枝杆菌属核酸的区杂交。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在分枝杆菌属的种类之间变化的分枝杆菌属tlyA核酸核酸的区。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：71和SEQ ID NO.：72或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含mabA启动子区。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ IDNO.：47和SEQ ID NO.：48或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：45和SEQ ID NO.：46或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与包含ahpC基因的分枝杆菌属核酸的区杂交。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在分枝杆菌属的种类之间变化的分枝杆菌属ahpC核酸的区。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：73和SEQ ID NO.：74或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与包含katG基因的分枝杆菌属核酸的区杂交。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在分枝杆菌属的种类之间变化的分枝杆菌属katG核酸的区。在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：41和SEQ ID NO.：42或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。在一些实施方案中，一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：39和SEQ ID NO.：40或者与其具有70％或更大的同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％)。
在一些实施方案中，一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，一个或多个引物对被配置成扩增在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间变化的分枝杆菌属核酸的区。在一些实施方案中，分枝杆菌属核酸的区包含gyrA基因。
在一些实施方案中，鉴定样品中的一种或多种分枝杆菌属包括：(a)在NTM和MTBC之间分化；(b)在MTBC的不同种类之间分化；(c)在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化；(d)在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化；(e)在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化；和/或(f)在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，使用多种引物和探针进行多元反应(例如，在单个密闭管或其他反应容器中)以得到(a)至(f)任一项或多项或者全部。在一些这样的实施方案中，在多元反应中采用四种或更少(三、二，或一种)光学可区分标记。例如，在一些实施方案中，使用四种或更少“颜色”来得到(a)至(f)中各项，使得可采用配置检测至多四种颜色的仪器以收集和分析数据。
在一些实施方案中，待检测的所需靶(例如，分枝杆菌属的具体药物抗性菌株)存在于包含来自非靶来源的大量核酸的样品中。这些非靶来源包括但不限于人基因组核酸、来自非分枝杆菌属病原生物的核酸、其他分枝杆菌属，以及具有不同药物抗性性能的分枝杆菌属。在一些实施方案中，靶存在于小于20％的样品中总核酸(以拷贝数计)(例如，小于10％、小于5％、小于1％、小于0.5％，或小于0.1％)。
在一些实施方案中，本文提供鉴定样品中的分枝杆菌属的一种或多种类型的试剂盒，其包括：(a)至少一对引物，其中所述引物被配置成结合保留在分枝杆菌属的两种或多种类型之间的分枝杆菌属核酸的区，并且其中引物被配置成扩增分枝杆菌属核酸的可变区；以及(b)与在分枝杆菌属核酸的可变区内相邻靶核酸序列杂交的两种杂交探针的至少一个可检测区分的探针组，其包含：(i)使用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，以及(ii)使用发射荧光染料和非荧光猝灭剂标记的信号传导探针，其中当未与它的靶序列杂交时，所述信号探针不发射背景以上荧光，但在没有结合的猝灭剂探针的情况下一旦与它的靶序列杂交，则发射背景以上的荧光信号，其中，如果信号传导和猝灭剂探针均与它们相邻靶核酸序列杂交，则猝灭剂探针的非荧光猝灭剂猝灭来自信号传导探针的信号。在一些实施方案中，在探针组中信号传导探针的解链温度高于缔合的猝灭剂探针的解链温度。在一些实施方案中，各探针组的发射荧光染料和所述非荧光猝灭剂能够通过FRET相互作用。在一些实施方案中，探针组分别通过以下与在检测试剂盒中所有其他探针组可检测区分：(1)解链温度，(2)所述发射荧光染料的发射波长，或者(3)其组合。在一些实施方案中，检测试剂包含5个或更多个探针组。在一些实施方案中，检测试剂包含10个或更多个探针组。在一些实施方案中，探针组用于在不同病原性、种类，或抗生素抗性的分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，以合适定量提供所述引物用于通过LATE-PCR来扩增。在一些实施方案中，在至少一个可检测区分的探针组中探针具有扩增反应的至少一种引物的退火温度以下的对它们的靶核酸序列的解链温度。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个可检测区分的探针组，其被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在NTM和MTBC之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个可检测区分的探针组，其被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在MTBC的不同种类之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括三个或多个可检测区分的探针组，其被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个可检测区分的探针组，其被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个可检测区分的探针组，其被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括被配置成如下的引物和探针：在NTM和MTBC之间分化；(b)在MTBC的不同种类之间分化；(c)在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化；(d)在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化；(e)在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化；和/或(f)在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸被配置成抑制扩增反应时的错误引发。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸被配置成破坏扩增反应时或在探测扩增的序列时在靶核酸序列内的结构元件。
在一些实施方案中，试剂盒可包括探针组、引物、扩增试剂(例如，扩增缓冲液、DNA聚合酶、对照试剂(例如，阳性和阴性对照)或用于实施本文所述的任意方法可使用、必要，或充分的任何其他组分，以及说明书、分析软件(例如，便于数据收集、分析、显示，和记录)、计算装置、仪器，或其他系统或组件。
在一些实施方案中，本文提供分析样品中至少一种单链核酸分枝杆菌属靶序列的同类分析方法，其包括：(a)提供包含单链形式的至少一种分枝杆菌属核酸靶序列的样品以及用于各核酸靶序列的两种相互作用杂交探针的至少一个可检测区分的组，其各自与至少一种靶杂交，其包括(i)使用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，以及(ii)信号传导探针，在没有猝灭剂探针的情况下，一旦与样品中至少一种靶序列杂交则发射背景以上信号，其中，如果两探针均与至少一种靶序列杂交，则猝灭剂探针的非荧光猝灭剂猝灭来自信号传导探针的信号；以及(b)将信号传导和猝灭探针与至少一种分枝杆菌属靶序列的杂交分析为温度的函数，该分析包括由于它的缔合的猝灭剂探针对各信号传导探针的作用，包括但不限于分析对各信号传导探针的信号增加、信号降低，或两者。
在一些实施方案中，信号传导探针包括猝灭的荧光团。在一些实施方案中，在探针组中信号传导探针的解链温度高于缔合的猝灭探针的解链温度。
在一些实施方案中，本文提供在单一反应容器中进行的方法。在一些实施方案中，本文提供在单一容器(例如，管、孔等)筛选测定法中进行的方法以鉴定来自一组多种可能的靶序列的哪种或哪几种分枝杆菌属核酸靶序列存在于样品中。在一些实施方案中，一组多个靶序列包含与保守，或至少相对保守序列旁侧相连的可变序列。在一些实施方案中，在单链形式中靶序列的样品通过产生单链扩增子的扩增方法来生成，例如，非对称聚合酶链反应(PCR)方法，最优选LATE-PCR。在一些实施方案中，使用与旁侧序列杂交的仅几对引物，通常不超过三对，优选不超过两对，以及更优选仅一对引物。在一些实施方案中，在扩增反应混合物中包括引物和至少一组的信号传导和猝灭剂探针(例如，两组、三组等)。
在一些实施方案中，探针组(例如，信号传导和猝灭剂探针)被配置成与分枝杆菌属可变序列杂交以及在多种分枝杆菌属靶序列之间分化(例如，在单一样品或混合物中)。在一些实施方案中，使不同Tm探针与不同靶序列的可变序列杂交。在一些实施方案中，探针组的一种或两种探针(例如，信号传导和/或猝灭剂探针)包括与不同靶序列的可变区的不同程度的互补性。在一些实施方案中，信号传导探针和/或猝灭剂探针被配置成与多个靶序列(例如，使不同Tm与不同靶序列)的可变序列(例如，覆盖实际序列差异)杂交。在一些实施方案中，信号传导探针被配置成与多个靶序列(例如，使不同Tm与不同靶序列)的可变序列杂交。在一些实施方案中，猝灭剂探针被配置成与多个靶序列(例如，使不同Tm与不同靶序列)的可变序列杂交。
在一些实施方案中，提供在本文提供的方法中使用的引物和探针。在一些实施方案中，本文提供的引物包括：SEQ ID NO：28、29、39、40、45、46、51、52、57、58、67、68、71、72、73、74，其部分，以及与其互补的序列。在一些实施方案中，本文提供的引物包括与SEQ ID NO：28、29、39、40、45、46、51、52、57、58、67、68、71、72、73，或74，其部分，以及与其互补的序列具有70％或更大序列同一性的寡核苷酸(例如，具有70％...75％...80％...90％...95％...98％...99％序列同一性的寡核苷酸)。在一些实施方案中，本发明提供引物，其基本上类似地用作本文提供的引物。在一些实施方案中，本文提供的探针包括：SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、41、42、47、48、53、54、59、60、61、62、69、70，其部分，以及与其互补的序列。在一些实施方案中，本文提供的探针包括与SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、41、42、47、48、53、54、59、60、61、62、69、70，其部分，以及与其互补的序列具有70％或更大序列同一性的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供探针，其基本上类似地用作本文提供的探针。在一些实施方案中，本文提供的引物和探针的靶序列包括：SEQ ID NO：36、37、38、43、44、49、50、55、56、63、64、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84，其部分，以及与其互补的序列。在一些实施方案中，靶序列包含与SEQ ID NO：36、37、38、43、44、49、50、55、56、63、64、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84，其部分，以及与其互补的序列具有70％或更大序列同一性的序列。在一些实施方案中，靶序列包含分枝杆菌属核酸的区，其包括与以下基因或启动子中的可变区旁侧相连的保守区：rpoB、embB、mabA、ahpC、katG、gyrA、16s rRNA，和gyrB。在一些实施方案中，引物和探针与包括但不限于以下的分枝杆菌属中靶杂交：结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、田鼠分枝杆菌、牛分枝杆菌、龟分枝杆菌(M.Chelonae)、亚洲分枝杆菌(M.Asiaticum)、鸟型分枝杆菌(M.Avium)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。在一些实施方案中，本文提供用于鉴定，和分化包括以下种类的组合物、方法，和试剂盒：结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、胞内分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、牛分枝杆菌、龟分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、偶发分枝杆菌。
在一些实施方案中，本文提供的探测和分析方法应用于含有单链分枝杆菌属核酸靶序列的样品。方法包括分析单一序列；分析相同链中的两个或多个序列；分析不同链中的序列；以及前述的组合。单链核酸靶序列可以为加入样品中的对照序列。核酸靶序列可以是DNA、RNA或者DNA和RNA的混合物。它可来自任何来源。例如，它可以为天然存在的，或者靶序列可以双链形式出现，在这种情况下通过链分离和纯化来获得单链靶序列。如果单链核酸靶序列是cDNA序列，则通过逆转录由RNA来源获得它。
在许多情况下，天然来源没有探测和分析用的足够拷贝数的靶序列。在这种情况下，通过扩增(通常包括指数扩增的扩增方法)来获得单链靶序列。在一些实施方案中，扩增反应直接生成单链核酸靶序列。在一些实施方案中，扩增反应生成双链形式的靶序列，在该情况下单链靶序列通过链分离和纯化来获得。可采用的有用的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，包括对称PCR、不对称PCR和LATE-PCR，其任一项均可与用于扩增RNA序列、NASBA、SDA、TMA，和滚环扩增的逆转录联用。如果单链核酸靶序列是cDNA序列，则扩增方法包括逆转录，例如，RT-PCR。在一些实施方案中，当利用非对称扩增(例如，LATE-PCR)时，则探针组包含在扩增之前的扩增反应混合物中以避免污染。
在一些实施方案中，在本文提供的方法中使用的探针组包括信号传导探针和缔合的猝灭剂探针。信号传导探针是杂交探针，当与样品中的单链核酸靶序列杂交时，其发射可检测信号，优选荧光信号，其中通过缔合的猝灭剂探针可猝灭信号。猝灭剂探针不发射可见光能。通常，信号传导探针具有共价结合的荧光部分。信号传导探针包括使用荧光团或其他荧光部分(例如，量子点)来标记的探针。在一些实施方案中，优选荧光团标记的探针。一类信号传导探针是
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探针。
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探针是使用接受来自DNA染料的荧光以及重新发射更长波长的可见光的荧光团标记的单链寡核苷酸。
Figure BDA00003491155400123
探针的使用包括使用当它与双链DNA缔合时发出荧光的双链DNA染料、分子，在这种情况下，当探针与单链核酸靶序列杂交时，它是杂交形成的。对于
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探针的使用，DNA染料，例如，在含有单链核酸靶序列的样品中包含SYBR Green或SYBRGold以及一个或多个探针组。分析包括激发染料和检测来自一种或多种
Figure BDA00003491155400125
探针的发射。由于它们不直接激发并且仍旧是单链，无需去除未结合的信号传导探针。在一些实施方案中，优选的信号传导探针是猝灭的探针；即，当在溶液中发射较少或不发射信号的探针即使受到刺激，也不会被猝灭，因而当它们与在待分析的样品中单链核酸序列杂交时，也发射信号。阴阳探针(Yin-yang probe)是猝灭的信号传导探针。阴阳探针是在一条链上含有荧光团以及在另一条链上(它是较短链)含有相互作用非荧光猝灭剂的双链探针。当阴阳探针在检测温度下的溶液中时，则将荧光团猝灭。单链核酸靶序列胜过猝灭剂标记的链用于结合荧光团标记的链。因此，荧光团标记的链与单链核酸靶序列和信号杂交。本文提供的一些实施方案的信号传导探针是分子信标探针，即在一端具有荧光剂(通常是荧光团)而在另一端具有猝灭剂(通常是非荧光生色团)的形成单链发夹序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文提供具有任何合适类型的二级结构的单链寡核苷酸，其在一端上具有发射荧光染料而在另一端上具有猝灭剂(分子信标类型探针)。在本文实施方案中使用的各信号传导探针包括不同程度的二级结构(例如，不同长度的发夹序列(2个碱基对、3个碱基对、4个碱基对、5个碱基对等))。当分子信标探针和其他类似类型的探针在溶液中时，它们呈现其中猝灭剂与荧光剂相互作用，并且探针为黑色的构型(例如，发夹构型、密闭构型)。然而，当探针与它的靶杂交时，迫使它称为开放构型，其中荧光剂从猝灭剂分离，并且探针传导信号。
在猝灭的信号传导探针中，可通过任何机制达到猝灭，通常通过在荧光团和非荧光猝灭部分之间的FRET(荧光共振能量转移)或者通过接触猝灭。在一些实施方案中，优选的信号传导探针是在溶液中黑色或非常接近黑色以最小化背景荧光。尽管使用一些荧光团-猝灭剂组合和探针构建的FRET猝灭是足够的，但接触猝灭更加常见地达到该目的。
探针组的猝灭剂探针由包含非荧光猝灭剂的核酸链组成。在一些实施方案中，猝灭剂是例如非荧光生色团，例如dabcyl或Black Hole猝灭剂(由Biosearch Technologies市售的Black Hole猝灭剂是一系列猝灭剂，其中之一或其他由生产商建议用于特定荧光团)。在一些实施方案中，优选的猝灭探针包括非荧光生色团。在一些实施方案中，猝灭剂是Black Hole猝灭剂。该组的猝灭剂探针与相邻或接近信号传导探针的单链核酸靶序列杂交，使得当两者杂交时，猝灭剂探针猝灭，或者使信号传导探针变黑。猝灭可通过荧光共振能量转移(FRET)或者通过接触(“碰撞猝灭”或“接触猝灭”)。
图1示出说明在本文提供的分析方法中探针组作用的实施方案。在该实施方案中，有两个探针组，探针2、4和探针6、8。探针2是信号传导探针，即具有荧光团3的分子信标类型探针。探针6也是信号传导探针，即具有荧光团7的分子信标类型探针。荧光团3、7相同。探针4、8是仅使用Black Hole猝灭剂5和9分别标记的猝灭剂探针。探针-靶杂交体(与单链核酸靶序列1杂交的探针)的解链温度(Tm)如下：Tm探针2＞Tm探针4＞Tm探针6＞Tm探针8。当样品的温度由没有探针结合时的高温降低时，根据它们杂交特征，探针2、4、6和8结合单链核酸靶序列1。探针2，即信号传导探针首先结合。图1，图框A示出与序列1杂交的探针2。当样品的温度继续降低时，猝灭剂探针4接着结合、并临接探针2，使得猝灭剂5和荧光团3彼此靠近或接触。图1，图框B示出与探针2相邻的与单链核酸序列1杂交的探针4。在该点处，探针2为黑色，或者至少接近黑色。然而，如果信号传导探针6开始结合，它会独立地发射探针2、4的荧光。图1，图框C示出与探针4相邻的与单链靶序列1杂交的探针6。最后，当温度继续降低时，探针8将结合，并且它的猝灭剂9会猝灭由探针6的荧光团7发射的荧光。图1，图框D示出与探针6相邻杂交的探针8。对杂交的分析显示在图1，图框E中，其示出作为温度的函数的来自荧光团3、7的荧光的增加和降低。当温度降低时可获得退火(杂交)曲线的这些曲线，或者当温度升高时可获得解链曲线。当样品温度降低至70℃时，由于探针2与单链核酸序列1杂交在图框E中荧光曲线10首先升高，然后由于探针4结合而降低，之后由于探针6杂交而再次升高，最后由于探针8杂交而降低至非常低的水平。由曲线10可推导出，各信号传导探针具有比它缔合的猝灭剂探针更高的Tm。
在本文提供的方法中使用的信号传导和猝灭探针通常是错配耐受的(mismatch tolerant)(能够与含有一种或多种错配的核苷酸，或缺失或附加物杂交)。在一些实施方案中，分枝杆菌通过由探针和靶序列之间错配生成的独特的温度依赖性荧光标签来分化。在一些实施方案中，探针可以是等位基因特异性的(能够仅与方法中完全互补的单链核酸靶序列杂交)。在一些实施方案中，一组的一种探针可以是等位基因特异性的；并且其他探针是错配耐受的。在实施本文提供的实施方案中进行的试验证实，在与探针杂交的序列外靶链的二级结构可影响退火或解链分析的结果。相应地，在一些实施方案中，在核酸靶序列中不是每种核苷酸均需与探针杂交。例如，如果靶序列含有发夹序列，则在一些情况下可设计相应探针杂交穿过发夹序列的底部，而将发夹序列排除在外。在优选的实施方案中，探针组的信号传导和猝灭剂探针都是错配耐受的。在一些实施方案中，探针组可包括等位基因特异性信号传导探针和等位基因特异性猝灭剂探针、错配耐受信号传导探针和错配耐受猝灭剂探针、等位基因特异性信号传导探针和错配耐受猝灭剂探针，或者错配耐受信号传导探针和等位基因特异性猝灭剂探针。错配耐受探针可优选与可变靶序列的一种变体互补，或者它可以是优选与任何变体互补的共有探针。多个探针组可包括任意前述类型组的组合。此外，本文提供的分析方法可利用联合一旦与诸如分子信标探针的它们的靶杂交则发信号的一种或多种常见探针的一个或多个信号传导/猝灭探针组。
在一些实施方案中，未标记的寡核苷酸被配置成结合在或靠近引物、信号传导探针，或猝灭剂探针的靶序列的区。在一些实施方案中，这些沉默探针破坏靶序列内或附近的二级结构，并帮助其他探针在合适Tm处结合靶序列以用于后续分析。在一些实施方案中，提供用作结构元件(例如，二级结构元件)的“开启工具(opener)”的未标记的寡核苷酸。
在本文提供的方法中使用的探针可以为DNA、RNA，或者DNA和RNA的组合。它们可以包括非天然核苷酸，例如，PNA、LNA，或2’o-甲基核糖核苷酸。它们可以包括非天然核苷酸间连接，例如，硫代磷酸连接。无论它是等位基因特异性的还是错配耐受的，特定探针的长度取决于它所需解链温度(Tm)，以及它的组成，例如，DNA探针的GC含量。
在一些实施方案中，各信号传导探针具有与它缔合的单独的猝灭探针。然而，在一些实施方案中，一种探针可以是两个探针组的一部分。例如，在各端点处使用猝灭剂可标记猝灭剂探针，由此端点与不同信号传导探针相互作用，在这种情况下，三种探针包括两个探针组。而且，一些实施方案可利用猝灭的信号传导探针的两端，例如，在一端具有荧光团而在另一端具有猝灭剂的分子信标信号传导探针。荧光团与包含一组的猝灭剂探针相互作用，并且猝灭剂与包含另一组的信号传导探针相互作用。
为了分析含有分枝杆菌属的一种或多种类型或者疑似含有分枝杆菌属的一种或多种类型的样品，使用的探针组通过例如发射波长(颜色)或解链温度(Tm)可检测区分。以任何合适的方式完成从其他探针组通过Tm可区分标记探针组。例如，在一些实施方案中，在测定法中所有信号传导探针具有不同的Tm。可选择地，在一些实施方案中，所有信号传导探针具有相同Tm，但猝灭剂探针具有不同的Tm。在一些实施方案中，通过信号传导探针Tm和猝灭探针Tm的组合可区分探针组。荧光检测器可通常解析1-10种不同颜色的荧光团。因此，利用本文提供的方法的测定法可利用至多10种荧光团(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者更多种，只要荧光检测器允许)。在用于样品的多于一种信号传导探针上可使用相同荧光发射体，例如，相同荧光团，只要通过它们的解链温度可区分信号传导探针以用于检测。在本文提供的测定法中，Tm应当分开至少2℃，优选至少5℃，以及在某些实施方案中，至少10℃。可获得的温度间隔限制具有相同荧光团的多种信号传导探针的使用。如果在80℃至20℃的范围内设计退火和/或解链分析的测定法，例如，人们可利用比在70℃至40℃的范围内设计用于这种分析的测定法可使用的具有同一颜色的更多个探针组，在70℃至40℃的范围内人们仅能够使用具有同一颜色的3-5个探针组。使用四种颜色以及仅具有同一颜色的各两个探针组，四色检测器相当于仅使用通过颜色可区分的八种探针所使用的八色检测器。使用具有同一四种颜色的三个探针组，可区分十二个不同的探针组。
在一些实施方案中，优选猝灭剂探针具有比它们缔合的信号传导探针更低的Tm。由于这种关系，当溶液的温度降低用于退火曲线分析时，信号传导探针发射在一组的两探针的退火温度范围内温度依赖性信号；并且当溶液的温度升高用于解链曲线分析时，则在一组的两探针的解链温度范围内。另一方面，如果探针组的猝灭剂探针具有比它的缔合的信号传导探针更高的Tm，则在该组的两探针的退火温度范围至解链温度范围内信号传导探针的发射猝灭，并且没有发射用于检测的荧光信号。通过检查退火曲线或解链曲线可确定这点。信号的缺失提供比作为温度函数的探针的荧光曲线关于单链核酸靶序列更少的信息。在一些实施方案中，当将错配耐受探针用于分析可变序列时，相对于所有或者除靶序列变体之一外所有来使用具有比它们缔合的信号传导探针更低Tm的猝灭剂探针。如果猝灭剂探针具有比仅有一个变体更高的Tm，则信号故障揭示，只要信号故障包括单链核酸靶序列(尤其是扩增反应的失败)，则通过对照或通过单链核酸靶序列的另一探针组来解释变体。类似地，如果并非已知所有变体，则这些信号故障揭示未知变体的存在。在一些实施方案中，优选在测定法中为至少一种核酸靶序列利用多个探针组，至少一个探针组的猝灭剂探针具有比它缔合的信号传导探针更低的Tm。
解链温度Tm是指在诸如探针-靶杂交体或引物-靶杂交体的核酸杂交体为50％双链和50％单链时的温度。对于特定的测定法，可测定相关的Tm。利用已知技术可计算Tm。在一些实施方案中，优选的技术基于“最近邻”方法(Santa Lucia，J.(1998)，PNAS(USA)95：1460-1465；和Allawi，H.T.和Santa Lucia，J.(1997)，Biochem.36：10581-10594；其据此通过引用整体并入)。可获得利用“最近邻”准则的计算机程序以用于计算相对完全互补的靶序列和错配的靶序列的探针和引物的Tm。在该应用中，有时相对于与它杂交的经鉴定的序列来给出引物或探针的Tm。然而，如果未给出这些序列，对于与单链核酸靶序列的一种变体完全互补的错配耐受探针，则Tm是相对完全互补变体的Tm。在许多实施方案中，有与探针完全互补的靶序列。然而，本方法可利用一种或多种错配耐受引物或探针，其为“共有引物”或“共有探针”。共有引物或探针是不与任何变体靶序列互补，或者如果不是所有可能的靶序列为任何预期或已知的序列的引物或探针。共有引物用于在选择的扩增退火温度下引发靶序列的多种变体。共有探针缩小用于分析多种变体所需的温度间隔。对于共有引物或探针，如果没有给出相应的靶序列，则Tm是指在已知变体中最高的Tm，这使得有可能未知变体可与引物或探针更加互补，因此，其具有更高的引物-靶Tm或探针-靶Tm。
本文提供的测定法利用比靶核酸浓度更大或更小的探针浓度。根据探针生产商提供的信息了解探针浓度。在靶序列未扩增的情况下，基于已知样品中存在的细胞、细胞核、染色体，或分子的直接或间接计数，以及通过了解通常存在于每个细胞、细胞核、染色体，或分子中的靶序列预期数目来了解靶浓度。在扩增的靶序列的情况下，有大量确定在扩增反应的过程中已经生成多少种靶序列的拷贝的方法。例如，在LATE-PCR扩增反应的情况下，可如下计算单链扩增子的数目：在诸如50nM的有限浓度和诸如150nM的过量的它的对应猝灭剂探针中使用没有猝灭剂的信号传导探针(在猝灭的信号传导探针的情况下，即探针减去猝灭剂)，降低荧光至零(或者，在实际条件下，至它的最小背景水平)所采用的循环次数与单链扩增子的扩增速率成比例。当荧光到达零(最小背景水平)时，所有信号传导探针均找到它们的靶，并且扩增子的浓度超过信号传导探针的浓度。在某些实施方案中，可继续进行扩增反应直至待产生的扩增子到达“终点浓度”。在本文提供的实施方案实施中进行的试验证实，使用不同量的靶开始的LATE-PCR扩增倾向于最后产生相同最大浓度的扩增子(“终点浓度”)，尽管由高起始量的靶开始的扩增以比由低起始量的靶开始的扩增更少次循环到达最大值。为了达到终点浓度，使用少量靶开始可能需要延长扩增至70或甚至80次循环。
一些实施方案利用其中信号传导探针的浓度比它缔合的猝灭剂探针的浓度更低的探针组。这确保当两探针均与它们至少一种核酸靶序列杂交时，信号传导探针可最大程度地被猝灭，从而最小化背景荧光。应当理解，在测定法中背景荧光是给定颜色的各信号传导探针的累积背景以及不同颜色的探针可进一步增加背景信号。
本文提供的方法包括分析探针组与单链分枝杆菌属核酸靶序列的杂交。在本文提供的方法中，分析作为温度函数的信号传导探针和猝灭剂探针的杂交，以便鉴定、特征化或者分析样品中的至少一种分枝杆菌属核酸靶序列。在一些实施方案中，分析包括：获得当样品的温度降低时，来自信号传导探针的信号的一条曲线，或者，如果使用多种颜色，则多条曲线(参见图1，图框E)；或者获得当样品温度升高时信号的一条或多条曲线；或两者。已知由于二级结构，两类曲线的形状不一定要相同。可将那些曲线之一或两者与之前建立的诸如鉴定待探测的单链核酸靶序列的作为分析的一部分的已知单链核酸靶序列的曲线比较。可利用导数曲线以获得例如针对核酸靶序列的信号传导探针的Tm。不是总必要，并且可能不需要利用全部荧光曲线或它们的导数。在某些实施方案中，对信号传导探针和猝灭剂探针的杂交的分析包括获得当样品温度降低或升高时在一个或多个温度下荧光读数，其中那些读数反馈由于它缔合的猝灭剂探针对各信号传导探针的作用。例如，如果需要区分靶序列的已知变体，并且人们由变体的杂交曲线获知在两种温度下荧光区分变体，则人们需要仅需获得在那两温度下荧光来用于直接比较或者计算可比较的比率。在大部分实施方案中，分析包括来自各信号传导探针的信号增加、信号降低，或两者。
在一些实施方案中，在温度范围内使用特定探针组的荧光读数生成温度依赖性荧光标签。温度依赖性荧光标签可包括曲线、数据点、峰，或显示和/或分析测定或样品的其他方式。在一些实施方案中，温度依赖性荧光标签的分析鉴定和/或区分分枝杆菌属。在一些实施方案中，通过用户进行分析。在一些实施方案中，通过计算机或其他装置上的分析软件进行分析。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括核酸扩增。一些优选的方法是生成靶序列或单链形式的序列的那些方法。在一些实施方案中，特别优选DNA序列或RNA序列的LATE-PCR扩增(RT-LATE-PCR)。LATE-PCR扩增和扩增测定法描述于例如欧洲专利EP1,468,114和相应的美国专利7,198,897；公开的欧洲专利申请EP1805199A2；Sanchez等人，(2004)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)101：1933-1938；以及Pierce等人，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)102：8609-8614中。所有这些参考文献全部通过引用方式在此并入。LATE-PCR是采用聚合酶链反应(PCR)方法的非对称DNA扩增方法，其利用相对其他引物(“限制性引物(Limiting Primer)”)至少过量5倍的一种寡核苷酸引物(“过剩引物(Excess Primer)”)，其自身采用至多200nM的低浓度，从而在大致足够的PCR循环下可耗尽以产生荧光可检测的双链扩增子。在限制性引物耗尽之后，扩增继续所需数次循环以仅使用过剩引物来产生单链产物，本文称为过剩引物链。LATE-PCR考虑到在扩增开始处限制性引物的浓度调节的解链温度，Tm[0] L；在扩增开始处过剩引物的浓度调节的解链温度，Tm[0] X；以及单链扩增产物(“扩增子”)的解链温度，TmA。对于LATE-PCR引物，使用在我们的扩增中通常为0.07M一价阳离子浓度的盐浓度调节，可经验测定Tm[0]，如果当使用非天然核苷酸时则必需，或者根据“最近邻”方法来测定(Santa Lucia，J.(1998)，PNAS(USA)95：1460-1465；以及Allawi，H.T.和Santa Lucia，J.(1997)，Biochem.36：10581-10594)。对于LATE-PCR，利用下式计算扩增子的解链温度：Tm＝81.5+0.41(％G+％C)一500/L+16.6log[M]/(1+0.7[M])，其中L是核苷酸的长度，[M]是一价阳离子的摩尔浓度。可计算引物的直链，或无规卷曲的探针的解链温度。诸如分子信标探针的有结构的探针的解链温度可经验测定或者可近似于与扩增子杂交的部分(环或环加主链部分)的Tm。在LATE-PCR扩增反应中，Tm[0] L优选比Tm[0] X低不超过5℃，更优选为至少同样高或者甚至更优选为高3-10℃，并且TmA优选比Tm[0] X高不超过25℃，并且对于一些优选的实施方案，优选高不超过约18℃。
LATE-PCR是非对称PCR扩增，除了其他优势外，它提供可产生作用的大“温度间隔”。参见以上引用的WO03/054233和Sanchez等人(2004)。LATE-PCR扩增的某些实施方案包括使用杂交探针，在这种情况下，信号传导和猝灭剂探针的组的Tm比在首先几次循环之后指数扩增中平均引物退火温度低，更优选低至少5℃。信号传导和猝灭剂探针的组包含在扩增开始之前的LATE-PCR扩增混合物中。如果使用，则DNA染料也可合并至在扩增开始之前的反应混合物内。
在一些实施方案中，提供包括临床样品、诊断样品、研究样品、环境样品等的在本发明中使用的样品。在一些实施方案中，在使用本文所述的方法之前样品需要通过本领域理解的一种或多种技术处理。
附图简述
图1，图框A-D是显示两组信号传导和猝灭剂探针与样品中的单链核酸靶序列的杂交作为温度的函数的示意图；图1，图框E显示样品中荧光对比温度。
图2图示可存在于rpoB基因靶中的可能的中和突变。
图3图示在rpoB基因靶中的药物抗性突变。图4图示一些NTM种类和MTBC种类的系统发生关系。
图5图示在一系列温度下使用四种，或任选五种染料的端点靶检测。
图6A图示用于在表1中描述的rpoB基因靶的探针组位置。图6B图示探针组的替代组的位置，其中在rpoB基因靶内大部分突变在猝灭剂探针下方。
图7A和7B分别图示探针组5A和5B的rpoB基因靶的荧光标签。
图8图示在10,000人基因组的存在下rpoB靶的1000、100，或10个分子的扩增的检测。
图9是显示探针结合位置和引物结合位置的来自实施例1的单链核酸序列的示意图。
图10A和10B展示在实施例1中描述的多种菌株的扩增的解链曲线分析。
图11A-4D展示如在实施例2中描述的各比例的TB菌株的混合物的导数解链曲线。
图12是显示探针结合位置和引物结合位置的来自实施例3的单链核酸序列的示意图。
图13是显示探针结合位置和引物结合位置的来自实施例3的另一单链核酸序列的示意图。
图14A-14C是在实施例3的样品中各荧光团的荧光对比温度的曲线图。
图15显示在引物、探针，和靶序列设计中使用的示例性序列对齐。
图16显示在分枝杆菌种属的成员之间证实种类差异和药物抗性的检测的曲线图。
图17显示在具有非分枝杆菌属的混合样品中证实结核分枝杆菌的多药抗性和种类鉴定的曲线图。
图18显示以下的平均解链导数：(A)具有结核分枝杆菌复合群(MTBC)的成员的促旋酶B探针组；(B)MTBC和NTM种类的16s探针；(C)促旋酶B和16s探针。
发明详述
本文提供用于分析分枝杆菌属的组合物(例如，试剂、反应混合物等)、方法(例如，研究、筛选、诊断)，和系统(例如，试剂盒、数据收集和分析)。具体而言，本文提供使得可敏感和特异性检测在简单和复杂样品(包括含有混合药物抗性性能的分枝杆菌属的多种不同种类的样品)中的一种或多种所需分枝杆菌属核酸分子的组合物、方法，和系统。在一些实施方案中，提供使用快速和有效测定法和检测设备可同时鉴定和区分在复杂样品中多种不同分枝杆菌属种类和药物抗性性能的多元、单管反应。
例如，本文提供用于检测和分析分枝杆菌属的各种类型的一组单管同质多元测定法，其包括结核分枝杆菌的各种菌株，而且无论这些种类和菌株是否对各种抗生素敏感或抗性。在一些实施方案中，本文提供的测定法利用LATE-PCR(美国专利No.7,198,897；其据此通过引用整体并入)；PRIMESAFE II(PRIMESAFE是Smiths Detection Inc.的商标)(美国专利申请No.20080193934；其据此通过引用整体并入)；以及开灯/关灯探针组(Lights-On/Lights-Off probe set)国际申请No.PCT/US10/53569；其据此通过引用整体并入)。
本文提供的方法、组合物，和试剂盒提供诊断相关的信息以及为可能由于分枝杆菌属感染表现出肺部感染的患者提供治疗基础。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定样品是否含有分枝杆菌属。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定肺部感染是否含有分枝杆菌属。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定在样品或感染中分枝杆菌属是否为结核分枝杆菌复合群(MTBC)的成员或者非结核分枝杆菌(NTM)。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定NTM是否为胞内分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，或麻风分枝杆菌(M.leprae)或者一些其他种类。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定MTBC是否为非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、坎纳分枝杆菌(M.canettii)、田鼠分枝杆菌，或结核分枝杆菌。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定样品是否含有，或者感染是否由于NTM和MTBC的混合物。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定样品是否含有抗生素敏感性结核分枝杆菌、抗生素抗性结核分枝杆菌，或两者。在一些实施方案中，本文提供的测定法确定样品中的结核分枝杆菌抵抗何种，以及多少剂量的抗生素。
本文提供的组合物、试剂盒，和方法提供使用低起始数的靶序列(例如，绝对数或者相对于非靶序列)开始的敏感性和强大扩增。在一些实施方案中，使用探针组来分析基本上比单独的荧光杂交探针更长的扩增的靶序列，所述探针组使用相同颜色的荧光团。在一些实施方案中，不导致药物抗性的中和突变区分于导致药物抗性的突变。在一些实施方案中，导致药物抗性的不同可能突变各自区别于其他突变。在一些实施方案中，在包含野生型药物敏感性基因组和突变药物抗性突变体的基因组DNA混合物中检测药物抗性突变体。
在一些实施方案中，提供分枝杆菌属鉴定测定法使用的信号传导探针和猝灭探针。信号传导探针和猝灭探针通常是错配耐受的。在测定中错配耐受探针不仅与探针完全互补的靶序列杂交，也与由于取代、添加或缺失导致含有一个或多个错配的靶序列的变体杂交。对于错配耐受探针，相对完全互补的靶变化越大，则探针-靶杂交体的Tm越低。在一些实施方案中，采用序列特异性探针。在测定中序列特异性探针仅与探针完全互补的靶序列杂交(例如，在给定温度下)。在一些实施方案中，在测定中采用序列特异性和错配耐受探针的组合。如果探针是序列特异性的，则显而易见在解链曲线和导数曲线中它没有杂交。例如，如果信号传导探针杂交，则导致荧光增加，但它缔合的猝灭剂探针没有杂交，则当温度降低至猝灭剂探针的Tm时，荧光不会降低，这揭示猝灭剂探针没有杂交，并且表明在与猝灭剂探针互补的序列中靶突变。尽管该结果表明猝灭剂探针的靶序列中突变，但它不能测定为序列存在的多种可能突变中哪一种。在一些实施方案中，如果测定是为了提供由于不同突变的不同Tm作用通过对解链曲线(和导数曲线)它们不同的作用区分的不同突变的分化，则优选缔合的猝灭剂探针是错配耐受的。
在一些实施方案中，组的信号传导探针相对于单链核酸靶序列比它缔合的猝灭剂探针具有更高的Tm。由于这层关系，当将样品进行解链分析时，例如，当温度增加时，由于猝灭剂探针解链，信号首先增加，然后当信号传导探针解链时信号降低。利用相反关系，当较低Tm信号传导探针解链时信号保持猝灭，并且当较高Tm猝灭剂探针解链时信号也未增加。优选关系因而提供更多信息。在一些实施方案中，优选组的猝灭剂探针由它缔合的信号传导探针非常大程度地降低信号。在这些实施方案中，优选猝灭剂探针的浓度等于或超过信号传导探针的浓度。为了最大化信号幅度，某些实施方案利用超过单链核酸靶序列的探针浓度，从而确保靶序列的所有或几乎所有拷贝具有杂交的探针。
本文提供的方法包括使用单一组的相互作用信号传导和猝灭剂探针。方法也包括使用多组的相互作用信号传导和猝灭剂探针，其中各信号传导探针可与其他探针检测区分。通过颜色(发射波长)、通过Tm，或者通过颜色和Tm的组合可区分荧光探针。可将多组相互作用探针用于查询样品中的单个靶序列或多个靶序列，包括在相同靶链上多个靶序列或者在不同链上多个靶序列。多个靶序列的多元检测可利用例如对各靶序列特异的一组或多组信号传导/猝灭剂探针。在一些实施方案中，多元方法利用各靶序列的不同荧光颜色。某些实施方案利用只要温度间隔允许即可获得的两个不同靶序列的相同颜色。
在一些实施方案中，本方法包括分析作为温度的函数的信号传导/猝灭剂探针组与一个或多个单链分枝杆菌属核酸靶序列的杂交。当样品的温度降低(退火)或升高(解链)时可获得来自信号传导探针或探针的信号，优选荧光信号。如在图1，图框E中所图示，分析可包括获得完全退火或解链曲线，包括由各信号传导探针增加和降低的信号。可选择地，分析可仅基于信号增加和信号降低。分析可仅利用在选择的温度下的信号，而不是在与退火或解链相关的所有温度下的信号。分析可包括未知单链核酸靶序列的杂交与之前已经构建的已知靶序列的杂交之间的比较，例如，已知种类的解链曲线的编制或者已知序列的数字化数据的表格。
在本文提供的方法中，通过通常为指数扩增的核酸扩增可提供待分析的一个或多个单链分枝杆菌属核酸靶序列。可使用任何合适的核酸扩增方法。优选的扩增方法是生成单链形式的扩增产物(扩增子)的那些，从而无需由待分析的单链靶序列中去除互补链。探针组可包含在开始扩增之前的这些扩增反应混合物中，从而无需打开含有扩增产物的反应容器。当在探针组的存在下进行扩增时，优选设计系统使得探针不干扰扩增。在一些实施方案中，利用诸如不对称PCR或LATE-PCR的非对称PCR方法以生成单链拷贝。可联合逆转录来进行PCR扩增以生成来自RNA靶的扩增子。例如，可联合LATE-PCR进行逆转录以生成对应RNA靶或RNA靶的补体的DNA扩增子。在一些实施方案中，因为需要分离单链形式的靶序列，并且由于两个扩增子容易折拢以及射出杂交探针，使用双链扩增子进行解链曲线分析更难，所以仅生成双链扩增子的扩增方法并不是优选的。在一些实施方案中，本文提供的方法未利用通过诸如在5’核酸酶扩增测定法中出现的信号传导探针的消化生成的可检测信号。在PCR扩增反应中，例如，通过使用Tm在引物延伸温度以下的探针；通过使用诸如包含抵抗通过DNA聚合酶降解的2’O-甲基核糖核苷酸的那些探针；或者通过使用缺乏5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶可避免探针消化。通过利用Tm在引物延伸温度以下的探针使得在引物延伸时(并且更优选地，在引物退火时，至少为在首先数次扩增循环之后引物退火时)探针解链它们的互补序列来完成避免扩增反应对探针的干扰。例如，在实施例1的扩增测定方法中，LATE-PCR扩增方法利用在针对野生型靶序列(它与探针完全互补)的具有范围为75℃至50℃的Tm的错配耐受分子信标探针组的存在下的具有75℃的引物-退火/引物延伸温度的两步PCR，其确保没有探针显著干扰靶序列的扩增。
在LATE-PCR扩增中，例如，过剩引物链是与探针组杂交的单链扩增子。它因而是或含有待分析的单链核酸序列。它的5’端是过剩引物，并且它的3’端是限制性引物的补体。如果待分析的序列位于过剩引物和限制性引物之间，待扩增的起始序列和过剩引物链均含有该序列。如果在待扩增的起始序列中所需分析的序列包括一部分引发区，则需要引物与那部分完全互补，从而使得过剩引物链含有所需序列。引物无需与引发区的其他部分完全互补。本方法的某些实施方案提供通过利用与待扩增的起始序列不是完全互补的“共有引物”的扩增反应得到待分析的单链核酸靶序列，并且小心确保过剩引物链含有所需序列，该过剩引物链是或者含有实际上分析的单链靶序列。
在一些实施方案中，本文提供的测定法利用PRIMESAFE II(描述于美国专利申请No.20080193934中，其据此通过引用整体并入)。PRIMESAFE II是加入PCR反应以抑制错误引发的一类试剂。PRIMESAFE II试剂由在它们的5’和3’端处经化学修饰的直链寡核苷酸组成。在一些实施方案中，本文所使用的primesafe试剂包括SEQ IDNO.：65和SEQ ID NO.：66。在一些实施方案中，在此描述的测定法利用具有两条链的PRIMESAFE II的配制物，它的一条链在5’端和3’端处均通过dabcyl部分的共价连接来修饰，它的第二条链与第一条所述链互补以及通过在5’端和3’端处加入dabcyl部分来化学修饰。
本文提供的实施方案的一方面能够鉴定分枝杆菌属的药物抗性菌株，由可含有中和突变的药物敏感性菌株分化。图2图示在rpoB基因靶结核分枝杆菌中可存在、但不会导致药物抗性的可能的中和突变。图3图示已知导致药物抗性的在rpoB基因靶中一些突变。关于在结核分枝杆菌中导致药物抗性的另外的基因和它们的突变的信息可在Sandgren A，Strong M，Muthukrishnan P，Weiner BK，Chruch，GM，Murray MB.(2009)Tuberculosis Drug Resistance Mutation Database.PLoS Med6(2).中找到；其据此通过引用整体并入。
一些NTM种类和MTBC种类的系统发生关系图示在图4中。在一些实施方案中，构建在此描述的测定法中所采用的LATE-PCR限制性引物和过剩引物与来自结核分枝杆菌基因组的DNA靶互补。鉴于在分枝杆菌属中观察到的进化趋异，所述限制性和过剩引物与在NTM的一些其他种类中相关靶序列并不完全互补。所述引物可能与在其成员与结核分枝杆菌最紧密相关的其他MTBC种类中基因靶完全互补。MTBC包括非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、田鼠分枝杆菌，和结核分枝杆菌。
表1概述在各扩增子、特异性基因靶、探测的靶区的长度，以及利用的探针数目的目的方面在九元测定法(nine-plex assay)中采用的靶和探针。
表1
gyrA、gyrB，和embB的扩增子具有重要的发夹序列，其倾向于防止探针-靶相互作用。在这些情况下，将高Tm的未标记的寡核苷酸(例如，沉默探针)加入以抑制发夹序列形成从而结合信号传导和/或猝灭剂探针。16s rRNA靶用于由NTM区分MTBC。在表1中所描述的实施方案中，采用一个探针组以由所有NTM区分所有MTBC，以及彼此区分许多NTM。
图5图示在25℃至75℃的温度范围内如何使用四种颜色(例如，Quasar670、Cal Red610、Cal Orange570，和FAM)来检测表1中靶的端点。如本领域技术人员所理解，一些荧光温度循环器具有多于四种荧光颜色的能力。据预估，可利用一种或多种另外的颜色用于扩增和检测使用一种或多种另外的探针或探针组检测的一种或多种另外的扩增子。在最终用户希望检测具有特定临床意义的特定靶序列时，可将这些另外的扩增子构建至测定内。在一些实施方案中，使用本文所述的测定法多元化通过其他方法检测或分析的扩增子。在一些实施方案中，通过使用方便测序在多元LATE-PCR测定法中生成的DNA的一条或多条链的诸如“Dilute-N-Go”测序的方法测序来分析这些扩增子(Jia，Y.，Osborne，A.，Rice，J.E.，和Wangh，L.J.(2010)Dilute-‘N’-Go Dideoxy Sequencing of All DNA Strands Generated inMultiplex LATE-PCR Assays，Nucleic Acids Research.；其据此通过引用整体并入)。
图5示出使用多元探针组来分析单个靶(rpoB)的实施方案，该多元探针组一起在宽温度范围内生成复合荧光信号，本文以下称为温度依赖性荧光标签。
图5进一步图示通过设计在与单独的靶(例如，gyrB和16s)的温度范围不同的温度范围中用于一组探针的信号使用相同颜色的探针组来可视化多于一种靶的实施方案。来自两种靶的信号融合至复合温度依赖性荧光标签内，这可为多于一种靶的存在/缺乏或特征提供信息。
在一些实施方案中，在多元测定法中采用各靶的探针组以达到在相关序列之间所有可能序列差异的最大覆盖，以及在这些序列变体之间最大分辨率。图6A图示在表1和图5中描述的rpoB基因靶利用的探针组的位置。在rpoB基因靶内大部分突变在信号传导探针内，从而降低信号传导探针与靶的相应Tm。因此，在较低温度下观察到来自信号传导探针的荧光信号。图6B图示替代探针组的位置，其中在rpoB基因靶内大部分突变在猝灭剂探针下。因此，在较低温度下来自邻近的打开探针(on probe)的荧光信号仅被它配对的关闭探针(off-probe)猝灭。图7A和7B分别图示在图6A和6B中用于探针组的rpoB基因靶的荧光标签。在该实例中，在图6B中探针组表现出比在6A中探针组更高的分辨率。
由于人唾液具有高浓度的人基因组DNA，唾液样品是用于TB分析最长使用的样品来源。用于示出本文的示例性实施方案的LATE-PCR测定法对它们预期靶高度特异，但由于以下原因存在高浓度的人DNA：1)LATE-PCR化学法对标准PCR化学法内在更加特异；2)分枝杆菌基因组具有非常高的GC含量，其意味着联合高温可利用用于扩增的高Tm引物以用于退火和延伸；3)可采用具有四个dabcyl和高Tm的PRIMESAFE II以抑制在低于退火-延伸温度的所有温度下的错误引发。在一些实施方案中，使用表现出对所需序列偏向(例如，结核病偏向)的引物。图8图示在10,000个人基因组的存在下rpoB靶的1000、100，或10个分子全部有效扩增。表2图示多元反应的设计，其中将10,000个人基因组和PRIMESAFE II加入所有反应。
表2
Figure BDA00003491155400311
TB感染和临床样品通常由分枝杆菌属的多于一种菌株以及其他生物体组成，例如与药物敏感性菌株混合的药物抗性菌株，或者两种不同种类的分枝杆菌属。在各种情况下，这些混合物的单独组分可以大量比例存在，例如低至0.1％至99.9％、至多50％至50％。在一些实施方案中，在表2中描述的测定法提供在过量水平的NTM、胞内分枝杆菌的存在下能够检测低水平的结核分枝杆菌的五元反应。在表3中概述的结果证实，在99.9-99.5％的胞内分枝杆菌存在下可检测低至0.1-0.5％的结核分枝杆菌。在一些实施方案中，在被配置成检测分枝杆菌属的其他亚群(例如，在过量的利福平敏感性结核分枝杆菌中利福平抗性结核分枝杆菌)的测定法中获得类似的结果。由于各扩增的靶利用的引物与MTBC基因型完全互补，但与NTM基因型仅部分互补，该测定法的敏感性扩展至在过量的任意NTM存在下任何MTBC。
表3
Figure BDA00003491155400321
表3也概述在所述MTBC的过量野生型药物抗性菌株的存在下检测MTBC的药物抗性菌株的这些测定法敏感性的测定值，在这种情况下，引物与两靶基因组相等地互补，并且在药物敏感性存在下药物抗性的区别完全取决于视觉化药物抗性和药物敏感性菌株的荧光标签所使用的探针。在表3中在90％药物敏感性存在下10％药物抗性的评估值基于采用在利福平靶的图6A中显示的探针的经验观察。基于在图7中图示的结果，使用在图6B中显示的探针组，检测的低限值可能为在99％药物敏感性中1％药物抗性。
试验
本文提供的方法的特征和实施方案连同附图示出以下所示实施例中。实施例的范围应当理解为示例性而非限制性。
实施例1
在结核分枝杆菌的菌株的rpoB基因中药物抗性的检测
使用一对引物进行LATE-PCR扩增以分别扩增结核分枝杆菌的多种菌株的rpoB基因的150个碱基对区。扩增提供作为单链核酸靶序列的基因的101个碱基对区，已知其含有对利福平产生药物抗性的突变(各LATE-PCR扩增的过剩引物链)。在扩增之后，使用包含在起始扩增反应混合物中六种单独的探针来探测各单链核酸靶序列。
探针联合跨越单链核酸靶序列的101个碱基对。探针中三种为信号传导探针。信号传导探针是具有两个核苷酸长度主链的猝灭的分子信标探针。各自包含共价结合的标记：在一端上荧光团Quasar670和在另一端上Black Hole猝灭剂2，BHQ2，(Biosearch Technologies，Novato CA)。其他三种探针是仅使用BHQ2、未使用荧光团末端标记的猝灭剂探针。在该实施例中，关于药物敏感性菌株的信号传导探针的Tm彼此不同，并且关于药物敏感性菌株的猝灭剂探针的Tm彼此不同。三种探针组可检测区分。
在扩增的末端处，分析作为温度的函数的探针-靶杂交。在该实施例中，使用解链性能分析来特征化杂交。反应组分和条件如下：
限制性引物：5’CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG(SEQ IDNo.1)
过剩引物：5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAG(SEQ ID No.2)
靶：菌株13545
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAG(SEQ ID No.3)
靶：菌株18460
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGTCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAG(SEQ ID No.4)
靶：菌株9249
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTTGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAG(SEQ ID No.5)在菌株18460和9249的各序列中下划线表示药物敏感性菌株13545的核苷酸变化的位置。
探针1：
5’-BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C3(SEQ ID No.6)
探针2：
5’-BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-Quasar670(SEQ ID No.7)
探针3：
5’-BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C3(SEQ ID No.8)
探针4：
5’-BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-Quasar670(SEQ ID No.9)
探针5：
5’-Quasar670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTTBHQ2(SEQ ID No.10)
探针6：
5’-ACAGACCGCCGG BHQ2(SEQ IDNo.11)
使用C3表示三个碳接头，而Black Hole猝灭剂2使用BHQ2(Biosearch Technologies，Novato CA)表示。
在由1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、2mM MgCl2、200nM dNTP、50nM限制性引物、1000nM过剩引物、1.25单位的铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、500nM的探针1、3和6，以及200nM的探针2、4和5组成的25μl体积中进行LATE PCR扩增。对于各测试菌株，使用约1000个基因组当量。各菌株的扩增反应一式三份进行。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/40s进行50次循环，随后为在30s间隔下以1℃减量由75℃开始至34℃的退火、随后为在34℃下10min的各种程度的荧光采集。这之后为在30s间隔下以1℃增量由34℃开始至81℃的解链。
根据分别为100nM、200nM和500nM的靶、信号传导探针，和猝灭剂探针的浓度、利用计算机程序Visual OMP7.0来得到探针的解链温度。Tm为如下：探针1，50℃；探针2，63℃；探针3，56℃；探针4，67℃；探针5，75℃；以及探针6，63℃。通过使用在35℃至78℃之间温度的Quasar670荧光的一阶导数的解链曲线分析来进行在扩增之后探针靶杂交的分析。由该数据组，将最高荧光值用于归一化数据至一。如果所使用的值为负数，则将它乘以(-15)；如果它为正数，则将它乘以十五。
图9图示利用药物易感菌株13545作为靶的三个探针组(探针1/探针2；探针3/探针4；和探针5/探针6)与单链核酸靶序列的结合。在图9中，链21是靶链；链23是过剩引物；链22是限制性引物。为了说明，显示探针1-6与链21以3’至5’方向与它们错配的上端杂交。将探针和链21之间以及限制性引物和链21之间的错配标示粗体。图9中省略荧光团和猝灭剂标记，但在以上序列描述中给出。在探针序列中故意将一些核苷酸与敏感菌株13545错配，例如探针1，其含有相对链21的5’端的位置31(A至G)和38(T至G)的错配。其他错配是在探针2，位置62(A至A)；探针4，位置86(A至C)中。错配在位置142(A至G)处限制性引物内，包含其以减少在原始靶链中出现的发夹序列。除了在敏感菌株13545中这些错配之外，菌株18460具有在位置59(T至T)处的核苷酸错配，而菌株9249具有在位置104(G至T)处的错配。
应当理解，LATE-PCR扩增提供含有过剩引物链的样品，其包含实际待探测的单链核酸靶序列。过剩引物链包括在一端处的过剩引物序列以及在另一端处的限制性引物序列的补体。在这种情况下，由于在限制性引物和链21之间的错配，过剩引物链在位置142处不同于链21，其是T而不是G。至于与探针1-6互补的链21的区，过剩引物链与链21相同。
图10A展示结核分枝杆菌的两种不同菌株，即菌株13545和菌株18460的分析结果。为了说明，将两种菌株的单独扩增的一式三份样品的分析数据重叠。圆圈311表示药物抗性菌株18460(D516V，位于氨基酸位置516处的天冬氨酸变为缬氨酸)，而圆圈312显示药物敏感性菌株13545(V146F，位于氨基酸位置146处的缬氨酸变为苯丙氨酸)的平行试验。图10B展示药物抗性菌株9249和药物敏感性菌株13545的结果，其中圆圈313显示药物抗性菌株9249(S531L，位于氨基酸位置513处的丝氨酸变为亮氨酸)的平行试验并且圆圈314显示药物敏感性菌株13545(V146F)的平行试验。
实施例2
在混合的样品中结核分枝杆菌的药物抗性菌株的检测
使用不同比率的抗性结核分枝杆菌菌株18640(D516V，位于氨基酸516处的天冬氨酸变为缬氨酸)和敏感性菌株13545进行LATEPCR扩增以提供单链核酸靶序列，从而检测在混合的样品内敏感性的水平。除了在反应混合物中包含的起始靶序列之外，反应组分和条件描述于实施例1中。由实施例1使用引物从菌株18640和菌株13545生成的扩增子包含在探针2的杂交序列内的单个核苷酸变化形式。在该实施方案中，探针2是信号传导探针。可选择地，在一些实施方案中，可采用与含有可变核苷酸的扩增子的区杂交的猝灭剂探针，并且设计相应信号传导探针临近处杂交。一种反应混合物仅含有菌株18460，而另一反应混合物仅含有菌株13545。这些的100％对照分别含有相关菌株的约100,000个基因组DNA拷贝。用于第一次混合的样品的反应混合物含有20％(约20，000个基因组)的抗性菌株18460以及80％(约80,000个基因组)的敏感性菌株13545。用于第二次混合的样品的反应混合物含有10％的菌株18460(10,000个基因组)以及90％的菌株13545(90,000个基因组)。用于第三次混合的样品的反应混合物含有5％的菌株18460(5，000个基因组)以及95％的菌株13545(95,000个基因组)。用于第四次混合的样品的反应混合物含有1％的菌株18460(1,000个基因组)以及99％的菌株13545(99,000个基因组)。扩增反应一式三份进行。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/40s进行50次循环，随后为在30s间隔下以1℃减量由75℃开始至34℃的退火、随后为在34℃下放置10min的各种程度的荧光采集。这之后为在30s间隔下以1℃增量由34℃开始至81℃的解链，随后为在30s间隔下以1℃减量由75℃开始至34℃的退火。该解链/退火性能再重复三次。
用于六种探针的杂交的曲线分析的数据是最后三次解链性能的各平行测定的平均值。由这些平均值，减去在35℃下荧光，并通过将所有值除以在78℃下荧光来归一化所得值。然后使用最大正值除所有值来生成和归一化所得数据的一阶导数。
如上所述，为了去除来自含有敏感性和抗性菌株DNA的混合物的敏感性菌株DNA的作用，将纯的敏感性菌株DNA样品(100％对照)的平行试验用于得到在每一温度下的平均导数值。然后将这些值减去各混合物的平均导数值得到抗性菌株的作用。此外，通过由各纯的敏感性DNA的单独样品减去纯的敏感性DNA的导数平均值得到纯的敏感性DNA的单独样品之间的分散情况。
图11A-11D显示结果分析。它们展示在敏感性菌株13545的增加背景中抗性菌株18460的各百分比的信号。图11A显示在80％敏感性菌株13545的背景中20％抗性菌株18460的混合样品的该信号，其中圆圈410表示在混合物的平行试验中抗性菌株的作用，而圆圈411表示纯的敏感性菌株的平行试验中分散情况。图11B显示使用10％混合物的该信号，圆圈412表示在混合物的平行试验中抗性菌株的作用，而圆圈413表示纯的敏感性菌株的平行试验之间分散情况。图11C显示来自5％抗性菌株平行试验的混合物的信号(圆圈414表示在混合物的平行试验中抗性菌株的作用，而圆圈415表示在纯的敏感性菌株的平行试验之间分散情况)。图11D显示来自1％抗性菌株的混合物中信号。圆圈416表示在混合物的平行试验中抗性菌株的作用，而圆圈417表示在纯的敏感性菌株的平行试验中分散情况。
实施例3
在结核分枝杆菌的菌株中的多药抗性检测
多元LATE-PCR测定法用于提供多元单链靶核酸以检测在三种菌株，即13545、202626和15552的三种基因，即gyrA(氟喹诺酮)、katG(异烟肼)，和rpoB(利福平)中各自的药物抗性。对于gyrA基因，菌株13545和202626具有药物敏感性，而菌株15552(A90V，位于氨基酸位置90处的天冬氨酸变为缬氨酸)为药物抗性。对于katG基因，菌株202626具有药物敏感性，而菌株13545(S315T，位于氨基酸位置315处的丝氨酸变为酪氨酸)和菌株15552(S315N，位于氨基酸位置315处的丝氨酸变为天冬酰胺)具有抗性。对于rpoB基因，菌株13545为敏感性菌株，而菌株15552(S531L，位于氨基酸位置513处的丝氨酸变为亮氨酸)和菌株202626(H526D，位于氨基酸位置513处的组氨酸变为天冬氨酸)具有抗性。
反应组分和条件如下：
对于gyrA基因
限制性引物：5’ACCAGGGCTGGGCCATGCGCACCA(SEQ ID No.12)
过剩引物：5’GGACCGCAGCCACGCCAAGTC(SEQ ID No.13)
靶：菌株13545
5’GGACCGCAGCCACGCCAAGTCGGCCCGGTCGGTTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGCACGGCGACGCGTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGT(SEQ ID No.14)
靶：菌株202626
与菌株13545相同
靶：菌株15552
5’GGACCGCAGCCACGCCAAGTCGGCCCGGTCGGTTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGCACCGGCGACGTGTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGT(SEQ ID No.15)
探针1：
5’CGACCGGGCC-BHQ2(SEQ ID No.16)
探针2：
5’Cal Red610-AACCCATGGTCTCGGCAACTT-BHQ2(SEQ ID No.17)
探针3：
5’Cal Red610-AATCGCCGTGCGGGTGGTAGTT-BHQ2(SEQ ID No.18)
探针4：
5’GCTGTCGTAGATCGACGCG-BHQ2(SEQ ID No.19)
对于katG基因
限制性引物：5’AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC(SEQ ID No.20)
过剩引物：5’TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC(SEQ ID No.21)
靶：菌株202626
GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT(SEQ ID No.22)
靶：菌株13545
GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT(SEQ ID No.23)
靶：菌株15552
GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAACGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT(SEQ ID No.24)
探针1：
5’Cal Orange560-AAGTGATCGCGTCCTTACCTT-BHQ2(SEQ ID No.25)
探针2：
5’GACCTCGATGCAGCTG-BHQ2(SEQ ID No.26)
对于rpoB基因
限制性引物：与实施例1中相同
过剩引物：与实施例1中相同
靶：菌株202626
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAG(SEQ ID No.27)
靶：菌株15552
与在实施例1中所示菌株9249相同
靶：菌株13545
示出在实施例1中
用于rpoB基因的探针：
示出在实施例1中探针1-6
在靶序列中下划线表示药物敏感性菌株的核苷酸变化的位置
在由1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、2mM MgCl2、200nM dNTP、50nM限制性引物和用于各引物组的1000nM过剩引物、1.25单位的铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、用于gyrA探针的具有200nM的探针2和4的500nM的探针1和3、用于katG探针的200nM的探针1和500nM的探针2，以及用于rpoB探针的示出在实施例1中的浓度组成的25μl体积中进行LATE PCR扩增。对于各测试菌株，使用约1000个基因组当量的预先扩增靶，并且各菌株的扩增反应一式三份进行。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/40s进行50次循环，随后为在30s间隔下以1℃减量由75℃开始至34℃的退火、随后为在34℃下10min。这之后为在30s间隔下以1℃增量由34℃开始至81℃的解链。
通过单独使用在35℃至78℃之间温度的各荧光的一阶导数的解链曲线分析来分析探针-靶杂交。由各数据组，将最高荧光值用于规一化数据至一。如果所使用的值为负数，则将它乘以-15(负十五)；如果它为正数，则将它乘以+15(正十五)。各测试的菌株在药物抗性上区分开来。参见下表1。例如，菌株13545对异烟肼药物具有抗性，而对氟喹诺酮类和利福平敏感，而菌株15552对所有三种药物均具有抗性。
表1
药物 基因 菌株13545 菌株202626 菌株15552
氟喹诺酮类 gyrA 敏感性 敏感性 抗性
异烟肼 katG 抗性 敏感性 抗性
利福平 rpoB 敏感性 抗性 抗性
图12图示引物和探针与链51、菌株13545的gyrA靶的探针结合，因为引物与起始靶链完全互补，所述菌株13545的gyrA靶与过剩引物链相同。在图12中，序列51的下划线部分53是过剩引物的核苷酸并且序列52是限制性引物。显示使用以上它们未匹配的末端，探针1-4与链51以3’至5’方向杂交。使用如上所述的它们各自的猝灭剂或荧光团(未显示)标记探针。菌株15552不同于在位置72处的5’端，来自在该位置处具有C核苷酸的菌株13545和202626的T核苷酸。
图13图示引物和探针与链61，菌株202626的katG靶的探针结合，由于引物与起始靶链完全互补，所述菌株202626的katG靶与过剩引物链相同，即，LATE-PCR扩增反应的三种单链产物之一。在图13中，下划线序列63是过剩引物的核苷酸，以及下划线序列62是限制性引物。显示探针1、2使用以上它们错配末端与链61以3’至5’方向杂交。关于链61的5’端，所有三种菌株在位置56(G，粗体)处均与探针2不同。在位置54处，菌株202626为所显示的“G”，而在菌株13545中它为“C”并且在菌株15552中为“A”。过剩引物含有在5’端处故意的错配(在各靶处为“T”而不是“G”)以减少LATE-PCR扩增的直链阶段的可能错误引发。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/40s进行50次循环，随后为在30s间隔下以1℃减量由75℃开始至34℃的退火、随后为在34℃下10min。这之后为在30s间隔下以1℃增量由34℃开始至81℃的解链。
图14A展示作为温度函数的在结核分枝杆菌的三种不同菌株中rpoB基因的所有六种探针的归一化荧光读数。圆圈711表示菌株202626的平行试验，而圆圈712表示菌株15552的平行试验，而圆圈713是菌株13545的平行试验。图14B显示gyrA探针的结果，其将敏感性菌株202626和13545(圆圈714)与药物抗性菌株15552(圆圈715)区分开来。katG基因探针的结果显示在图14C中，其中所有三种解链导数均不同，圆圈716是敏感性菌株202626的平行试验，而抗性菌株13545和15552分别通过圆圈717和圆圈718表示。
实施例4
在分枝杆菌种属的成员之间药物抗性的种类分化和检测
将多元LATE-PCR测定法用于提供多元单链靶核酸以使用katG加mabA基因的启动子区检测异烟肼的药物抗性并且使用rpoB基因检测利福平的抗性。而且，通过使用两种基因的组合，16s核糖体和促旋酶B基因，测定法由分枝杆菌种属的其他成员中独特地鉴定结核分枝杆菌。
引物、探针，和靶序列是序列对齐(参见图15)和经验测定的广泛分析结果，从而得到当在测定法中使用时提供丰富信息结果的序列。反应组分和条件如下：
rpoB基因的引物序列；
rpoB限制性引物：5’CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG(SEQ ID No.28)
rpoB过剩引物：5’CCGGTGGTCGCCGTCGATCAAGGAG(SEQ ID No.29)
rpoB基因的探针序列：
rpoB关闭探针1
5’-BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAGC3(SEQ ID No.30)
rpoB打开探针1
5’-Quasar670-TCAGGTCCATGAATTGGCTTCAGA BHQ2(SEQ ID No.31)
rpoB关闭探针2
5’-BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C3(SEQ ID No.32)
rpoB打开探针2
5’-Quasar670-ATGGGCTTGTGGATCAACCCCGATBHQ2(SEQ IDNo.33)
rpoB打开探针3
5’-Quasar670-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTTBHQ2(SEQ ID No.34)
rpoB关闭探针3
5’-ACAGACCGCCGGBHQ2(SEQ ID No.35)
rpoB靶序列：
结核分枝杆菌菌株8094；
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGGCCAGAACAACCCGCTGTCGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG(SEQ ID No.36)
结核分枝杆菌菌株8545；
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCCATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG(SEQ ID No.37)
非洲分枝杆菌；
5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAG(SEQ ID No.38)
胞内分枝杆菌；
未获得
katG基因的引物序列：
katG限制性引物：AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC(SEQ IDNo.39)
katG过剩引物：5’TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC(SEQ ID No.40)
katG基因的探针序列：
katG打开探针
5’CalOrange560-GTATCGCGTCCTTACCGGTTCCAC-BHQ2(SEQ IDNo.41)
katG关闭探针
5’CTCGATGCTGCTGGTG-BHQ2(SEQ ID No.42)
katG靶序列：
结核分枝杆菌菌株8545和8094；
5’GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT(SEQ ID No.43)
胞内分枝杆菌；
5’GGCTGGGCTGGAAGAGCTCGTACGGCACCGGTTCGGGCAAGGATGCGATCACCAGCGGCCTCGAGGTGGTCTGGACGCCCACCCCGACGAAGTGGGACAACAGCTTCCTGGAGACGCTGTACGGCTACGAATGGGAGCT(SEQ ID No.44)
非洲分枝杆菌；
未获得
mabA启动子区的引物序列：
mabA限制性引物：
5’TTCCGGTAACCAGGACTGAACGGGATACGAATGGGGGTTTGG(SEQ ID No.45)
mabA过剩引物：5’TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATAC(SEQ ID No.46)
mabA启动子区的探针序列：
mabA打开探针
5’CalRed610-TTACAACCTATCGTCTCGCCGCAA-BHQ2(SEQ IDNo.47)
mabA关闭探针
5’GCAGTCACCCCG-BHQ2(SEQ ID No.48)
mabA启动子靶序列：
结核分枝杆菌菌株8094；
5’TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAAACCGGGGGATCGGGCTGGCGATCGCACAGCGGCTGGCTGCCGA(SEQ ID No.49)
结核分枝杆菌菌株8545；
5’TCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAAACCGGGGGATCGGGCTGGCGATCGCACAGCGGCTGGCTGCCGA(SEQ ID No.50)
胞内分枝杆菌；
未获得
非洲分枝杆菌；
未获得
16s的引物序列：
16s限制性引物：5’-ACACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCG(SEQ ID No.51)
16s过剩引物：5’-GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACG(SEQ ID No.52)
16s的探针序列：
16s打开探针：5’-BHQ1TTGGCTCATCCCACACCGCTAAAGTGCTTTAA-FAM(SEQ ID No.53)
16s关闭探针：5’-BHQ1CCACCACAAGATATGCGTCTCGTGTTCCTAT-C3(SEQ ID No.54)
16s靶序列：
结核分枝杆菌菌株8545、8094和非洲分枝杆菌；
5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT(SEQ ID No.55)
胞内分枝杆菌
5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTTTAGACGCATGTCTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT(SEQ ID No.56)
促旋酶B基因的引物序列：
促旋酶B过剩引物：5’ATACGGGCTTGCGCCGAGGACAC(SEQ ID No.57)
促旋酶B限制性引物：5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACC(SEQ IDNo.58)
促旋酶B基因的未标记的寡核苷酸：
寡核苷酸-gyrB：5’-CCACTGGTTTGAAGCCAACCCCA-C3(SEQ ID No.59)
促旋酶B基因的探针序列：
促旋酶B打开探针：5’BHQ1AGGACGCGAAAGTCGTTGCT-C3-FAM(SEQ ID No.61)
促旋酶B关闭探针：5’BHQ1TG AACAAGGCT-C3(SEQ ID No.62)
促旋酶B靶序列：
结核分枝杆菌菌株8545和8094；
5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACGCGAAAGTGGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT(SEQ ID No.63)
非洲分枝杆菌；
5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCACACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACTCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT(SEQ ID No.64)
胞内分枝杆菌
未获得.
PRIMESAFE046的序列：5’Dabcyl-GGAGCAGACTAGCACTGAGGT A-Dabcyl(SEQ ID No.65)5’Dabcyl-TACCTCAGTGCTAGTCTCCTCC-Dabcyl(SEQ ID No.66)
使用C3表示三个碳接头，而black hole猝灭剂1或2使用BHQ1或BHQ2分别表示(Biosearch Technologies，Novato CA)。
一式三份进行LATE-PCR扩增，并在1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、2mM MgCl2、300nM dNTP、50nM限制性引物、1000nM过剩引物、1.5单位的铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、500nM的各关闭探针、200nM的各打开探针，和100nM的PRIMESAFE046组成的25μl体积中进行。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/45s进行60次循环，随后为在75℃下10min，随后在25℃下10min，在45s间隔下以1℃增量由25℃开始至81℃的解链的各种程度的荧光采集。通过单独使用在25℃至80℃之间温度的各荧光团的一阶导数的解链曲线分析来分析探针-靶杂交。
如通过在图16A-D中温度依赖性荧光标签的导数曲线图所证实，以上测定法提供分枝杆菌属的分化平均值。
实施例5
在具有非分枝杆菌属的混合样品中结核分枝杆菌的多药抗性和种类分化的检测
使用不同比率的多药抗性结核分枝杆菌菌株8094(rpoB基因具有D516G，位于氨基酸516处的天冬氨酸变为甘氨酸，katG基因具有S315T，位于氨基酸315处的丝氨酸变为苏氨酸，mabA启动子没有突变，因此为野生型序列)和胞内分枝杆菌(其未经这些基因特征化)进行LATE PCR扩增以提供单链核酸靶序列，从而测定在混合的样品内的敏感性水平。一种反应混合物仅含有菌株8094，而另一种反应混合物仅含有胞内分枝杆菌。这些的100％对照分别含有相关菌株的约20,000个基因组DNA拷贝。用于第一次混合的样品的反应混合物含有10％(约2,000个基因组)的抗性菌株8094以及80％(约18,000个基因组)的胞内分枝杆菌。用于第二次混合的样品的反应混合物含有5％的菌株8094(1,000个基因组)以及95％的胞内分枝杆菌(19,000个基因组)。用于第三次混合的样品的反应混合物含有1％的菌株8094(200个基因组)以及99％的胞内分枝杆菌(19,800个基因组)。用于第四次混合的样品的反应混合物含有0.5％的菌株8094(100个基因组)以及99.5％的胞内分枝杆菌(19,900个基因组)。用于第五次混合的样品的反应混合物含有0.1％的菌株8094(20个基因组)以及99.9％的胞内分枝杆菌(19,980个基因组)。反应组分和PCR条件描述于实施例1中并且扩增反应一式三份进行。
用于所有五种基因和它们各自探针组的杂交曲线分析的数据为来自解链性能的三次平行试验的平均一阶导数。
图17A-17D显示结果分析。它们展示在胞内分枝杆菌的增加背景以及没有模板对照中抗性菌株8094的各百分比的信号。图17A显示16s和促旋酶B基因的合并荧光导数，其中100％胞内分枝杆菌和100％的抗性菌株8094明显不同。当菌株8094的混合物由10％、5％、1％、0.5％降低时，这些荧光标签与100％胞内分枝杆菌更加类似，然而，即使在0.1％的菌株8094下，差异也是可辨别的。图17B显示katG基因的解链导数，其中100％胞内分枝杆菌与100％的抗性菌株8094分散开。对于katG，该明显图谱差异提供抗性菌株8094的所有百分比的明确检测。图17C显示mabA启动子区导数以及是胞内分枝杆菌和100％的抗性菌株8094均具有相同标签形状的实例。菌株8094的百分比降低显示信号朝向100％胞内分枝杆菌的类似降低。图17D显示胞内分枝杆菌和100％的抗性菌株8094的不同荧光标签的rpoB基因导数。如在16s和促旋酶B的实例中，由10％、5％、1％、0.5％，和0.1％这些荧光标签的不同百分比的菌株8094与100％胞内分枝杆菌类似，但仍然不同并保持独特性。
实施例6
来自其他分枝杆菌属的结核分枝杆菌的特异性鉴定
除了以下之外，促旋酶B的引物和探针序列与实施例4相同：
促旋酶B打开探针：5’FAMCGTGTAATGAATAGCTGCG-BHQI(SEQ ID No.60)
gyrB靶序列：
结核分枝杆菌
5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACGCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT(SEQ ID No63)
田鼠分枝杆菌
5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACTCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT(SEQ ID No.75)
牛分枝杆菌
5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAATGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACTCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT(SEQ ID No.76)
龟分枝杆菌5’GTCGGCGAACCTCAGTTCGAGGGTCAAACCAAGACCAAGCTGGGCAACACCGAGGTCAAGTCGTTTGTGCAGAAGGTGTGCAACGAGCAGCTGCAGCACTGGTTCGACTCGAACCCCGCCGA(SEQ ID No.77)
胞内分枝杆菌5’GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGTCAGACCAAGACCAAGCTGGGCAACACCGAAGTGAAGTCGTTCGTGCAGAAGGTCTGCAACGAACAGCTCACCCACTGGTTCGAGGCCAACCCCGCGGA(SEQ ID No.78)
亚洲分枝杆菌5’GTCGCCGAACCCCAGTTCGAGGGCCAGACAAAGACCAAGCTGGGCAACACCGAGGTCAAGTCGTTCGTGCAGAAGGTGTGCAACGAACAGCTCACCCACTGGTTCGAGGCCAATCCGTCGGA(SEQ ID No.79)
鸟型分枝杆菌5’GTGAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAACTGGGCAACACCGAGGTGAAGTCGTTCGTGCAGAAGGTGTGCAACGAACAGCTCACCCACTGGTTCGAAGCCAACCCCGCAG(SEQ ID No.80)
16s的引物和探针序列均与实施例4相同。
16s靶序列：
龟分枝杆菌5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATGGTGAGTGGTGCAAAGCTTTTGCGGTTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGA(SEQ ID No.81)
亚洲分枝杆菌5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATGCATGTCCTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT(SEQ ID No.82)
鸟型分枝杆菌5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCAAGACGCATGTCTTCTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGGCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT(SEQ ID No.83)
胞内分枝杆菌
与实施例4相同
偶发分枝杆菌
5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATAGGACCGCGCTCTTCATGTGGGGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT(SEQ ID No.84)
结核分枝杆菌复合群的成员(结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、牛分枝杆菌)
与实施例4相同
在由1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、2mM MgCl2、200nM dNTP、50nM限制性引物、1000nM过剩引物、1.25单位的铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)组成的25μl体积中一式三份进行LATE PCR扩增。制备三种单独的混合物；第一种具有200nM的各促旋酶B打开探针、500nM的促旋酶B关闭探针和1uM的未标记的gyrB寡核苷酸；第二种混合物具有200nM的16s打开探针和500nM的16s关闭探针，而第三种合并促旋酶B和16s的所有探针和未标记的寡核苷酸。
扩增反应的热性能如下：98℃/3min进行1次循环，随后为在98℃/10s-75℃/45s进行60次循环，随后在75℃下10min，随后在25℃下10min，在45s间隔下以1℃增量由25℃开始至81℃的解链的各种程度的荧光采集。通过单独使用在25℃至80℃之间温度的各荧光的一阶导数的解链曲线分析来分析探针-靶杂交。
图18A-C显示各混合物组的平均解链导数。图18A是具有结核分枝杆菌复合群(MTBC)的成员；结核分枝杆菌菌株10460、菌株15601、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌的促旋酶B探针组的荧光标签。非结核分枝杆菌(NTM)种类是偶发分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、龟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、亚洲分枝杆菌，并且没有模板对照。荧光标签的结果由MTBC的成员中明确分离NTM，所有NTM显示如NTC类似的结果。对于MTBC内成员，各自标签也不同；结核分枝杆菌在61C下具有尖峰，然后在49℃下具有反峰；田鼠分枝杆菌在54℃下具有峰并且在49℃下具有较小峰；并且牛分枝杆菌在54℃和42℃下具有正峰并且在49℃下具有较小反峰。图18B显示16s探针的结果，其中所有MTBC成员具有相同荧光标签，而所有NTM种类具有它们自身独特的标签。在图18C中，将两探针组合并，并且结果显示测试的所有种类具有它们自身独特的荧光标签。
在本申请中所提及的所有出版物和专利均其据此通过引用整体并入。在未违背本发明的范围和精神下，所描述特征和实施方案的各种修订、重新组合，和变化形式对于本领域技术人员而言显而易见。尽管已经描述具体实施方案，但应当理解，权利要求不应不适当地受到这些具体实施方案的限制。实际上，在未违背本文所述的发明构思下，可进行所描述的方式和实施方案的各种修改。

Claims (102)

1.一种鉴定样品中的分枝杆菌属的一种或多种类型的方法，其包括：
a)提供：
i)疑似包含一种或多种分枝杆菌属的样品，以及
ii)包含至少一对引物以及与在所述一种或多种分枝杆菌属中相邻靶核酸序列杂交的两种杂交探针的至少一个可检测区分的探针组的检测试剂，各探针组包含：
A)使用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，以及
B)使用发射荧光染料和非荧光猝灭剂标记的信号传导探针，其中当未与它的靶序列杂交时，所述信号探针不发射背景以上荧光，但在没有结合的猝灭剂探针的情况下一旦与它的靶序列杂交，则发射背景以上的荧光信号，其中，如果所述信号传导和猝灭剂探针均与它们相邻靶核酸序列杂交，则所述猝灭剂探针的所述非荧光猝灭剂猝灭来自所述信号传导探针的信号；
b)使用所述引物由所述一种或多种分枝杆菌属扩增核酸；
c)检测在一系列温度下来自各可检测区分的探针组的所述发射荧光染料的荧光；
d)生成各发射荧光染料的温度依赖性荧光标签；以及
e)分析所述温度依赖性荧光标签以鉴定所述样品中的一种或多种分枝杆菌属。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述探针组中所述信号传导探针的解链温度高于缔合的所述猝灭剂探针的解链温度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述猝灭剂探针和/或信号传导探针被配置成与分枝杆菌属核酸的可变区杂交。
4.根据权利要求1所述的方法，其中各探针组的所述发射荧光染料和所述非荧光猝灭剂能够通过FRET相互作用。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测试剂包含2个或更多个探针组。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述两个或更多个探针组包含在可检测地不同的波长下发射的不同发射荧光染料。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述两个或多个探针组包含相同发射荧光染料。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述包含相同发射荧光染料的探针组在对它们的靶核酸序列的可检测地不同的解链温度下与它们的靶核酸序列杂交。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述两个或多个探针组分别通过以下与在所述检测试剂中所有其他探针组可检测区分：(1)解链温度，(2)所述发射荧光染料的发射波长，或者(3)其组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述检测试剂包含5个或更多个探针组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述检测试剂包含10个或更多个探针组。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针组用于在不同病原性、种类，或抗生素抗性的分枝杆菌属之间分化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述探针组的一种或两种探针包含与在两种或多种不同分枝杆菌属中它们的靶序列的不同程度的互补性。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述不同程度的互补性导致通过所述探针组和所述靶序列生成的不同的温度依赖性荧光标签。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述不同的温度依赖性荧光标签用于分化样品中不同的分枝杆菌属。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度依赖性荧光标签包含解链曲线或退火曲线。
17.根据权利要求16所述的方法，其中分析所述温度依赖性荧光标签包括与之前建立的解链曲线或退火曲线比较。
18.根据权利要求16所述的方法，其中通过计算机进行所述分析。
19.根据权利要求1所述的方法，其中扩增是通过在第一次少量扩增循环之后包括引物的延伸和平均引物退火温度的非对称扩增方法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述扩增是LATE-PCR扩增。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一个可检测区分的探针组中的所述探针具有扩增反应的至少一种引物的所述退火温度以下的对它们的靶核酸序列的解链温度。
22.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在NTM和MTBC之间分化。
23.根据权利要求22所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含16s rRNA。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：53和SEQ ID NO.：54。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：51和SEQ ID NO.：52。
27.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在MTBC的不同种类之间分化。
28.根据权利要求27所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含gyrB基因。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：61和SEQ ID NO.：62。
31.根据权利要求30所述的方法，所述一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：59。
32.根据权利要求31所述的方法，所述一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：60。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：57和SEQ ID NO.：58。
34.根据权利要求1所述的方法，其中三个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。
35.根据权利要求34所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含rpoB基因。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述三个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：30、SEQ ID NO.：31、SEQ ID NO.：32、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：34，和SEQ ID NO.：35。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29。
39.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化。
40.根据权利要求39所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含embB基因。
42.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化。
43.根据权利要求42所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含mabA启动子区。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：47和SEQ ID NO.：48。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：45和SEQ ID NO.：46。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含ahpC基因。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含katG基因。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：41和SEQ ID NO.：42。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：39和SEQ ID NO.：40。
51.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化。
52.根据权利要求51所述的方法，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含gyrA基因。
54.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定样品中的一种或多种分枝杆菌属包括：
a)在NTM和MTBC之间分化；
b)在MTBC的不同种类之间分化；
c)在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化；
d)在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化；
e)在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化；以及
f)在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。
55.一种鉴定样品中的分枝杆菌属的一种或多种类型的试剂盒，其包括：
a)至少一对引物，其中所述引物被配置成结合在分枝杆菌属的两种或多种类型之间保守的分枝杆菌属核酸的区，并且其中所述引物被配置成扩增分枝杆菌属核酸的可变区；以及
b)与在所述分枝杆菌属核酸的可变区内相邻靶核酸序列杂交的两种杂交探针的至少一个可检测区分的探针组，其包含：
i)使用非荧光猝灭剂标记的猝灭剂探针，以及
ii)使用发射荧光染料和非荧光猝灭剂标记的信号传导探针，其中当未与它的靶序列杂交时，所述信号探针不发射背景以上荧光，但在没有结合的猝灭剂探针的情况下一旦与它的靶序列杂交，则发射背景以上的荧光信号，其中，如果所述信号传导和猝灭剂探针均与它们相邻靶核酸序列杂交，则所述猝灭剂探针的所述非荧光猝灭剂猝灭来自所述信号传导探针的信号。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中在所述探针组中所述信号传导探针的解链温度高于缔合的所述猝灭剂探针的解链温度。
57.根据权利要求55所述的试剂盒，其中各探针组的所述发射荧光染料和所述非荧光猝灭剂能够通过FRET相互作用。
58.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述探针组分别通过以下与在所述检测试剂盒中所有其他探针组可检测区分：(1)解链温度，(2)所述发射荧光染料的发射波长，或者(3)其组合。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述检测试剂包含5个或更多个探针组。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述检测试剂包含10个或更多个探针组。
61.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述探针组用于在不同病原性、种类，或抗生素抗性的分枝杆菌属之间分化。
62.根据权利要求55所述的试剂盒，其中以合适定量提供所述引物用于通过LATE-PCR来扩增。
63.根据权利要求55所述的试剂盒，其中在所述至少一个可检测区分的探针组中所述探针具有扩增反应的至少一种引物的所述退火温度以下的对它们的靶核酸序列的解链温度。
64.根据权利要求63所述的试剂盒，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在NTM和MTBC之间分化。
65.根据权利要求64所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含16s rRNA。
67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：53和SEQ ID NO.：54。
68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：51和SEQ ID NO.：52。
69.根据权利要求55所述的试剂盒，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在MTBC的不同种类之间分化。
70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
71.根据权利要求70所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含gyrB基因。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：61和SEQ ID NO.：62。
73.根据权利要求72所述的试剂盒，所述一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：59。
74.根据权利要求73所述的试剂盒，所述一个或多个可检测区分的探针组进一步包含SEQ ID NO.：60。
75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：57和SEQ ID NO.：58。
76.根据权利要求55所述的试剂盒，其中三个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。
77.根据权利要求76所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
78.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含rpoB基因。
79.根据权利要求78所述的试剂盒，其中所述三个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：30、SEQ ID NO.：31、SEQ IDNO.：32、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：34，和SEQ ID NO.：35。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29。
81.根据权利要求55所述的试剂盒，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化。
82.根据权利要求81所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含embB基因。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含mabA启动子区。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：47和SEQ ID NO.：48。
87.根据根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：45和SEQ ID NO.：46。
88.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含ahpC基因。
89.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含katG基因。
90.根据权利要求89所述的试剂盒，其中所述一个或多个可检测区分的探针组包含SEQ ID NO.：41和SEQ ID NO.：42。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物对包含SEQ ID NO.：39和SEQ ID NO.：40。
92.根据权利要求55所述的试剂盒，其中一个或多个可检测区分的探针组被配置成与分枝杆菌属核酸的区杂交以在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化。
93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中一个或多个引物对被配置成扩增所述分枝杆菌属核酸的区。
94.根据权利要求93所述的试剂盒，其中所述分枝杆菌属核酸的区包含gyrA基因。
95.根据权利要求55所述的试剂盒，其中鉴定样品中的一种或多种分枝杆菌属包括：
a)在NTM和MTBC之间分化；
b)在MTBC的不同种类之间分化；
c)在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化；
d)在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化；
e)在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化；以及
f)在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。
96.根据权利要求55所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种另外的寡核苷酸。
97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述另外的寡核苷酸被配置成抑制扩增反应时的错误引发。
98.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述另外的寡核苷酸被配置成破坏扩增反应时或在探测扩增的序列时在靶核酸序列内的结构元件。
99.一种分析分枝杆菌属的一种或多种类型的方法，其包括：在使得所述样品中存在分枝杆菌属的如下条件下，暴露包含分枝杆菌属的样品至在单一反应体积中的多种探针：
a)在NTM和MTBC之间分化；
b)在MTBC的不同种类之间分化；以及
c)在异烟肼抗性和异烟肼敏感性分枝杆菌属之间分化。
100.根据权利要求99所述的方法，其中存在于所述样品中的所述分枝杆菌属进一步：
d)在氟喹诺酮抗性和氟喹诺酮敏感性分枝杆菌属之间分化；
e)在乙胺丁醇抗性和乙胺丁醇敏感性分枝杆菌属之间分化；以及
f)在利福平抗性和利福平敏感性分枝杆菌属之间分化。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述探针共同包含四种或更少的光学可区分标记。
102.根据权利要求99所述的方法，其中所述样品进行LATEPCR扩增反应。
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