BR112017007229A2 - primers de reação de cadeia de polimerase e sondas para mycobacterium tuberculosis - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a novos primers e sondas “sloppy A de diferentes genes de Mycobacterium tuberculosis para identificar a presença de Mtb. DNA e/ou resistência a drogas genes em Mycobacterium tuberculosis para identificar a presença de M.tb DNA e/ou resistência a drogas anti-tuberculose.antituberculose molecular beacon” (SMB) e “molecular beacon” (MB) para amplificar segumentos de diferentes.

Description

PRIMERS DE REAÇÃO DE CADEIA DE POLIMERASE E SONDAS PARA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

[0001] CAMPO DE APLICAÇÃO

[0002] Aplicações em Biotecnologia e engenharia genética

[0003] REFERÊNCIA CRUZADA PARA OS PEDIDOS CORRELATOS

[0004] O pedido de patente reivindica prioridade do Pedido Provisório dos EUA No. 62/062,351, depositado em 10/10/2014 cuja descrição é incorporada presentemente como referência.

[0005] INTERESSE DE GOVERNO

[0006] A invenção descrita presentemente foi realizada, pelo menos em parte, com apoio governamental sob a concessão Nos.UO1AI082174 e RO1AI080653 dos Institutos Nacionais de Saúde. Consequentemente, o Governo dos EUA possui certos direitos na presente invenção.

[0007] CAMPO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção refere-se a novos primers e sondas (sloppy molecular beacon, SMB, e molecular beaco, MB) moleculares para amplificar e detectar segmentos de diferentes genes em Mycobacterium tuberculosis (M.tb) para o propósito de identificar a presença de M.tb DNA e identificar resistência a drogas anti-tuberculose.

[0009] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0010] A tuberculose (TB) foi declarada uma emergência global quase vinte anos atrás (WHO Global Tuberculosis Report 2013). Apesar da taxa de novos casos ter decrescido mundialmente o alvo da meta de desenvolvimento do milênio de descréscimo de 50% da redução da doença por 2015 é improvável de ser conseguida (WHO Global Tuberculosis Report 2013). A MDR TB é definida como TB resistente ao tratamento com pelo menos Rifampicina e Isoniazida e XDR TB é definida como MDR TB que é adicionalmente resistente ao tratamento com antiobióticos da classe Fluoroquinolona e drogas injetável Amikacin, Kavamincin e Capreomicin. Os pacientes com TB resistente a droga são melhor identificado o quanto antes de modo que o controle apropriado da infecção e os tratamentos podem ser rapidamente iniciado. Boheme, C.C., et al. 2011 Lancet 377: 1495-1505).

[0011] Os métodos fenotípicos convencionais podem levar semanas a meses para totalmente definir o padrão de resistência a droga de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) devido ao crescimento muito lento dessa bactéria (Heifets, L., et al., J Clin Microbiol 38:1227-1230; Kim, S. J., 2005, Eur Respir J 25:564-569; and PT, K., and K. GP., 1985, Public health Mycobacteriology: A guide for level III laboratory. Center for Disease Control, U.S Department of Health and Human Services, Atltanta, Georgia.). Os testes moleculares oferecem a promessa de detecção mais rápida de resistência a drogas. Mtb não contém naturalmente plasmídeos de resistência a droga; então, os testes moleculares são direcionados contra o DNA cromossomial. Os ensaios genotípicos são relativamente fáceis de se projetar porque o genoma Mtb possui um alto grau de conservação de sequência. Virtualmente todos os isolados de Mtb clínicos suscetíveis a droga possuem sequências idênticas de DNA em alvos de resistência a droga, exceto para alguns “polimorfismos naturais” encontrados facilmente. Isso segue que qualquer desvio da sequência do tipo selvagem em um gene alvo de resistência a droga indica a presença de resistência a droga para a droga correspondente. Os ensaios genotípicos são mais rápidos e sensíveis do que ensaios fenotípicos porque alvos DNA podem ser amplificados por PCR. Riscos biológicos podem ser minimizados matando precocemente organismos infecciosos.

[0012] Os alvos genéticos que contam para a maioria dos casos de resistência a droga em TB são agora bem estabelecidos. PCR em tempo real permanece o mais sensível, rápido e robusto método para detectar mutações em bactérias. Virtualmente todos os outros métodos de detecção de mutação incluindo PCR-MS, microarranjos, e sequenciamento da próxima geração requerem amplificação do ácido nucleico como uma primeira etapa no processo de detecção. Em contraste PCR em tempo real possibilita amplificação de amostra, detecção e análise para tudo a ser realizado em um único poço. Os tubos não têm que ser abertos e fluídica convencional é desnecessária. Entretanto, foi capaz de desenvolver uma ampla metodologia de testagem de resistência a droga que é suficientemente simples e robusta para ser realizada fora de laboratórios de referência. Então existe uma necessidade por novos primers e sondas pra detectar M.tb e resistência a droga M.tb para as primeira e segunda linhas de droga.

[0013] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção refere-se a primers, sondas e usos correlatos na detecção de M.tb e resistência a droga M.tb.

[0015] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um conjunto de oligonucleotídeos isolados ou conjunto de primer para amplificar uma porção de uma região M.tuberculosis selecionada de um grupo que consiste de gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB, gene katG, gene dosR, gene IS6110, gene IS1081. O conjunto inclui um par de primers de avanço e reverso específico para a porção, onde cada primer possui uma sequência que é substancialmente idêntico a uma sequência de nucleotídeo selecionada daqueles listados nas Tabelas 1A e 1B abaixo. Consequentemente, cada primer possui uma sequência que é substancialmente complementar ao complemento da sequência de oligonucleotídeo selecionada a partir daqueles listados nas Tabelas. Em algumas modalidades, a sequência do primer é idêntico à sequência selecionada a partir daquelas listadas nas Tabelas 1A e 1B.

[0016] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um ácido nucleico tendo uma sequência que é substancialmente idêntico àqueles listados na Tabela 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui ua sequência de um dos selecionada na Tabela 2. O ácido nucleico pode ser rotulado com, i,e., um fluoroforo ligado a um nucleotídeo na sonda. Exemplos de fluorofos inclui fluresceina, cianina 5, ou TexasRed e TAMRA. Exemplos de atenuadores incluem BHQ1, BHQ2 e DABCYL.

[0017] A invenção proporciona um kit que contem um ou mais dos conjuntos de oligonucleotídeos acima identificados e ácido nucleico. O kit pode também incluir uma DNA polimerase, nucleotídeos de extensão e um tampão.

[0018] Em um terceiro aspecto, as características da invenção proporciona um método para detecção de resistência a droga em M. tuberculosis. O método inclui etapas de amplificação de uma primeira sequência alvo de ácido nucleico cmo um primeiro par primer para gerar um primeiro amplicon, onde (i) o primeiro par primer é específico para uma porção de uma região selecionada a partir de um grupo que consiste de gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB e gene katG e (ii) cada primer possui uma sequência que é substancialmente idêntica a uma sequência de oligonucleotídeo selecionada daquelas listadas nas Tabelas 1A e 1B, e detectar uma mutação no primeiro amplicon. A presença da mutação é indicativa da resistência a droga. No método, a etapa de detecção pode ser conduzida por várias técnicas de detecção de ácido nucleico conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, técnicas com base em sequenciamento e técnicas com base em hibridização de ácido nucleico ou sonda de ácido nucleico ou peptídeo ácido nucleico.

[0019] Em uma modalidade, a etapa de detecção é realizada por um processo que compreende (i) contatar o primeiro amplicon com uma primeira sonda específica para a mutação sob condições que conduzem a uma hibridização para formar um híbrido sonda-alvo (ii) conduzir uma análise de temperatura (Tm) para determinar um valor de teste Tm para o híbrido sonda-alvo; e (iii) comparar o valor teste Tm com um determinado valor Tm de referência. O valor de teste Tm, se diferente do valor Tm predeterminado, indica a presença de mutação. Por exemplo, uma mudança no valor de teste Tm de pelo menos 3 (por exemplo, 3,4 ou 5) desvios padrão fora da referência. O valor Tm indica a presença de mutação. Inversamente, a mudança no valor teste Tm de menos d3 desvios padrão do valor Tm de referência indica a ausência de mutação. Conforme descrito presentemente, o valor Tm de referência pode ser o valor Tm tipo selvagem. Em um exemplo o valor Tm teste, se inferior ao valor Tm de referência pré-determinado por, por exemplo pelo menos três desvios padrões, indica a presença da mutação. De outra forma, o valor Tm teste, se não for inferior ao valor Tm de referência, por exemplo, 3 desvios padrões indica a ausência de mutação.

[0020] O método pode também incluir amplificação de uma segunda sequência alvo de ácido nucleico, com um segundo par primer para gerar um segundo amplicon, o segundo par primer sendo específico para uma porção de uma segunda região selecionada de um grupo consistindo de gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB e gene katG gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB e gene katG. Em algumas modalidades, a primeira região é o gene rrs ou o promotor eis. Por exemplo, a primeira região pode ser o gene rrs e a segunda região pode ser o promotor eis. As duas regiões podem ser amplificadas independentemente ou amplificada no mesmo sistema de reação utilizando técnicas tal como PCR nested. Nesse caso, a mutação podem ser uma mutação A140G ou C1402T no gene rrs. A mutação pode estar dentro da região do promotor acionada pelas sequência de primer eis.

[0021] O método acima descrito permite detectar resistência a uma droga selecionada a partir de um grupo que consiste de isoniazida, rifampicin, amicacina, canamicina, capreomicina, etambutol e da classe de drogas fluoroquinolona. O par primer pode ser um dos selecionados daqueles listados nas Tabelas 1A e 1B. A sonda pode ter uma sequência que é substancialmente idêntica ou completamente idêntica para o que for selecionado dentre aqueles listados na Tabela 2.

[0022] Em um quarto aspecto, a invenção propociona um método para detecção de M. tuberculosis em um amostra teste, por exemplo, de um indivíduo. O método inclui contactar a amostra teste com um primeiro par primer sob condições condutiva para uma reação de amplificação para render um primeiro amplicon, e detectar a presença do amplicon detectando dessa forma a presença de Mycobacterium tuberculosis na amostra teste. O primeiro par primer pode ser um oligonucleotídeo pronto para amplificar uma porção de uma região M. tuberculosis selecionada a partir de um grupo que consiste de gene gene gyrB, promotor inhA, promotor eis, gene embB e gene katG, gene dosR, gene IS6110, gene IS1081. Cada primer do primeiro par primer possui uma sequência que pode ser substancialmente indêntica em uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir daqueles listados na Tabela 1B. O método pode também incluir contactar a amostra teste ou outro amplicon gerado pelo primeiro par primer com o segundo par primer sob condições condutivas em uma reação de amplificação para render um segundo amplicon, e detectar a presença de um segundo amplicon. Nesse caso, a presença de ambos primeiro e segundo amplicons indica a presença de Mycobacterium tuberculosis na amostra teste.

[0023] Em um quinto aspecto, a invenção proporciona um outro método para detectar a presença de M. tuberculosis em uma amostra teste. O método inclui contatar a amostra teste com uma primeira sinalizadora molecular sob conduções condutiva para uma reação de hibridização para render um híbrido sonda-alvo, e detectar a presença do híbrido sonda- alvo dessa forma detectar a presença de Mycobacterium tuberculosis na amostra teste. Nesse método, a primeira sonda sinalizadora molecular possui uma sequência que substancialmente idêntica a uma que é selecionada daquelas listadas na Tabela 2. Em um exemplo, a primeira sonda sinalizadora molecular é selecionada a partir do grupo que consiste de IS1081, dosR2, e sonda IS6110 (SEQ ID No 67- 69).

[0024] Os detalhes de uma ou mais modalidades da presente invenção são apresentados na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes a partir da descrição e das reivindicações.

[0025] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A Figura 1 é um diagrama que mostra a detecção de resistência AMK e ou KAN em 603 amostras clínicas de DNA utilizando sonda SMB que gerou um perfil Tm de três pontos. Cada um dos ensaios SMB foram testados contra todas asmostras DNA de M.tb em reação PCR multiplex. Os resultados para cada amostra são mostrados como um gráfico Tm de três pontos no eixo X, com o valor Tm de cada SMB indicado no eixo Y. Foram selecionados isolatos da esquerda para a direita como fenotipicamente suscetível e então como resistente. As mudanças Tm distintas de pelo menos uma das três sondas podem ser vistas em cada isolato resistente.

[0027] As Figuras 2A, 2B são diagramas que mostram os primeiros perfis de pico de fusão derivativa de três sondas SMB. Os perfis de pico de fusão de amostras do tipo selvagem, mutante e DNA misturados são mostrados para a sonda SMB rrs-1400 (2A), a sonda SMB eisI (2B) e a sonda SMB eis2 (2C). Cada curva de fusão representa uma cepa individual.

[0028] A Figura 3 é um diagrama que mostra valores MIC de cepas rrs e eis mutante e tipo selvagens. Os valores MIC para AMK e KAN para cepas mutantes rrs e eis e tipo selvagem são mostradas. Barras de erro representam ± um desvio padrão dos valores MIC eis-P indicam gene promotor.

[0029] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0030] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, em uma descoberta inesperada de novos primers, sondas SMB e sondas MB para amplificar segmentos de 11 genes diferentes em M.tb para identificar a presença de DNA M.tb e resistência a drogas anti-tuberculose tais como isoniazida, rifampicin, kanamicin, capreomicin, etambutol, e drogas da classe fluorquinolona.

[0031] Primers e Sonda

[0032] Os primers descritos presentemente amplificando gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB e gene katG permitr amplificação seletiva de resistência a droga induzindo pontos-chave de mutação em M.tb. As sondas SMB correspondentes marcam e identificam essas mutações que resulta na resistência às drogas de primeira e segunda linha comumente usados. Esses primers podem ser utilizados com muito alta eficiência em ambos os ensaios simétricos e assimétricos de PCR. As sequências de primer e a sonda descritas presentemente foram utilizadas pelo inventores para desenvolver ensaios de testagem de susceptibilidade molecular às drogas para M. Tb. Fora suas óbvias utilidades no ensaio diagnóstico molecular para M.tb esses primers irão também ter uso para sequenciamento dos genes alvo para identificar mutações indutoras de resistência em ensaios de pesquisa e qualquer outra sonda com base em ensaios que objetivam a identificação específica e seletiva das mutações indutoras de resistência a droga comum em M.tb. As sequência de Primer que amplificam genes disR, IS6110 e IS1081 permitem alta sensibilidade e identificação específica de M.tb e podem ser utilizadas em qualquer formato de ensaio PCR objetivado em diagnósticos moleculares específicos e sensitivos de tuberculose. Primers e sondas exemplificativas da presente invenção estão listadas nas tabelas abaixo.

[0033] Tabela 1A Primer # SEQ ID Nome do Primer Sequência do Primer Porção Gene No. Alvo #1 1 gyrA-F CCGGTCGGTTGCCGAGACC gyrA #2 2 gyrA-asym-F CGGTCGGTTGCCGAGACCATGG #3 3 P2-gyrA-nested-F GTCGGTTGCCGAGACCATGGGC #4 4 gyrA-P1-R AGCGGGTAGCGCAGCGACCAG #5 5 P2-gyrA-nested-R CGGGTAGCGCAGCGACCAGGGC #6 6 gyrA-R CCAGCGGGTAGCGCAGCGACCAG #12 12 rpo-R0 CGTCGCGGACCTCCAGCCCGGCA rpo B

#13 13 rpo-R2a TCACGTGACAGACCGCCGGGC #14 14 rpo-R2b GCTCACGTGACAGACCGCCGGGC #49 49 rpoB-iF ATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCC #50 50 rpoB-R AGCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT #15 15 rrs-F GCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGC rrs #16 16 rrs-R CCTCCCGAGGGTTAGGCCACTGG #17 17 P3-AMG-R GGTTAGGCCACTGGCTTCGG #51 51 AMG-F GCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGC #52 52 AMG-R CCTCCCGAGGGTTAGGCCACT

[0034] Tabela 1B Primer # SEQ ID Nome do Primer Sequência do Primer Porção de No. Gene Alvo #7 7 katG-F GCTGGAGCAGATGGGCTTGG katG #8 8 P1-katG-F CCGCTGGAGCAGATGGGCTTGG #9 9 P2-katG-F GGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCG #10 10 katG-asym-R GTCCCATTTCGTCGGGGTGTTCGTCC #11 11 P2-katG-R2 CCATTTCGTCGGGGTGTTCGTCCATAC #18 18 eis-F CACAGGGTCACAGTCACAGAATC eis #19 19 P1-eis-F CGTCCTCGGTCGGGCTACACAGG #20 20 P2-eis-nested-F CGGTCGGGCTACACAGGGTCACAGT #21 21 P3-eis-interno-F CACAGGGTCACAGTCACAGAATC #22 22 eis-R GCATCGCGTGATCCTTTGCCAGACA #53 53 eis-R1 GCATCGCGTGATCCTTTGCCAGAC #23 23 dosR-F CTCGCCGGTGCCAGCGGATATGTC dosR #24 24 dosR-R CGACCGTCCAGCGCCCACATCTTT #25 25 IS6110-F CCGCGAGGGCCCCGATGGTTT IS6110 #26 26 IS6110-R GGCTGGGCTCCCGGTTGATGTGG #27 27 IS-SPADE R GGCTCCCGGTTGATGTGGTCGTAG #28 28 ISBcnSA-iR TGGGGCGATCGGCACACCCAGC #29 29 gyrB1-F ATCGGTGGATTGCCCGGCAAGCTG gyrB #30 30 P2-gyrB1-nested F CGTTCCACGGATCCGCGCAAGTC #31 31 P1-gyrB1-F GCTGGCCGATTGCCGTTCCACG #32 32 P3-gyrB-interno-F GATCATCAATGTGGAGAAAGCGC #33 33 P2-gyrB1-R2 CTGGAACATCGAATCGCGACCGCTT #34 34 gyrB1-R ATCGCGACCGCTTTTTGCAGAA #35 35 embB306-F CTGACCGACGCCGTGGTGATA embB #36 36 embB306-R GGAAATAGTTGGACATGTAGCCGGCGT #37 37 gyrB2-F CGATTCGATGTTCCAGGCGATACTT gyrB #38 38 P2-gyrB2-F GCGCGGCAAGATCATCAATGTGGAG #39 39 P3-gyrB-interno-F GATCATCAATGTGGAGAAAGCGC #40 40 P1-gyrB2-externo-R GTGGATCCCGGTGCCCAGCGCC #41 41 P2-gyrB2-R2 GGTGCCCAGCGCCGTGATGATC #42 42 inhA-F CGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCG inhA #43 43 P2-inhA-F TTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGC #44 44 P1-inhA-R GGACTGAACGGGATACGAATGGGG #45 45 P2-inhA-R GTTTGGCCCCTTCAGTGGCTGTGG #46 46 IS1081-externo-F CAGCCCGACGCCGAATCAGTTGTT IS1081 #47 47 IS1081-externo-R GGTGCGGGCGGTGTCGAGGTG #48 48 IS1081-interno-R GCCACCGCGGGGAGTTTGTCG

[0035] Tabela 2

Sonda SEQ ID Nome da Sonda Sequência da Sonda Porção de # No. Gene Alvo #1 54 gyrA-1 CCTGCgcgcaccagggtgccctagatcgacgcgt gyrA cGCAGG #2 55 gyrA-2 CCAGGGgItgUcgtagatcgacgcgtcgccgCgC

CCTGG #3 56 katG CCGGCGACATCAATGGTGCTGGTGATCGCGTCCG katG

CCGG #4 57 rpo3 CGCGGCcgacagtTggcgcttgtgggtTaacccc rpoB gacGCCGCG #5 58 rpo4 CGCGCGccgggccccagcaccaacagtcggagct tCGCGCG #6 59 rrs1400 cacgACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTcgt rrs g #7 60 eis1d agcgGTCGTAATATTCACGTGCACcTGGCCGCGG eis Ccgct promotor #8 61 eis2b ctcgcGGCATATGCCACAGTCGGATTCTcTGACg cgag #16 62 eis 1d caggcggtcgtaatattcacgtgcacctggccgc cgcctg #9 63 gyrB500 cgagcGTATGTAGTAGAAGGTGACTCGGCCGGCG gyrB ctcg #10 64 inhA RC acctgccGCGGCGAGACGATAGGUTGTaGGGGTG inhA ACggcaggt promotor #11 65 gyrB2 ccgagctGATCGUCTGAACTTCGGCGTUCTTTAG gyrB CACCCGGTUGATagctcgg #12 66 embB306 caccggcgactcggGccacgtccaggatgtagcc embB ggtg #13 67 IS1081 CgcgcaCCAATATGATCGGGTACTCGACtgcgcg IS1081 #14 68 dosR2 tcggccatcaagggaatggagttggcgcgcggcc dosR ga #15 69 IS6110 ccgcgtGGGTGTCGAGTCGATCTGCACACAGCTa IS6110 cgcgg

[0036] Uma ou mais sequências de sonda na Tabela 2 pode ser feita em vários formatos de detecção tal como sondas marcadas duais incluindo sondas de forro (liner), sondas Taqman, sondas sinalizadoras moleculares e sondas sinalizadoras moleculares sloppy. Uma sonda “sloppy refere- se a uma sonda que é tolerante a incompatibilidade. Sondas tolerantes a incompatibilidade hibridizam e geram sinal detectável para mais de uma sequência em uma temperatura de detecção em um ensaio, e vários híbridos assim formados terão diferentes pontos de fusão. Sondas lineares, de mola aleatória, de fita única são geralmente tolerantes a incompatibilidade. Exemplos de tais sondas são sondas

“hairpin” ou sondas lineares com uma porção fluorescente interna cujo nível de fluorescência aumenta mediante hibridização em uma ou outra fita alvo. (ver por exemplo, U.S. Pat. Nos. 7662550 e 5925517. US 20130095479.

[0037] Preferivelmente, as sondas “sloppy” são sondas “hairpin” dupla-marca ou sondas sinalizadoras molecular, descritas em U.S. Pat. Nos. 7662550 e 5925517 U.S. Pat. Nos. 7662550 e 5925517. Essas sondas “hairpin” contêm uma sequência de aglutinação alvo flanqueada por um par de braços complementares reciprocamente. Essas podem ser DNA, RNA ou PNA, ou uma combinação de todos os três aminoácidos. Além disso, podem conter nucleotídeos modificados e ligações de internucleotídeos modificados. Podem ter um primeiro fluoroforo, As sondas “hairpin” mais preferidas são “sondas sinalizadoras moleculares” que possuem um fluoroforo em um braço e um atenuador em um outro braço, tal que as sondas são escuras quando livres em solução. Podem ser sondas sinalizadoras molecular de mudança de comprimento de onda com, por exemplo, múltiplos fluoroforos em um braço que interage por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), e um atenuador no outro braço. As sequências de aglutinação alvo podem ser, por exemplo, 12 a 50, ou 25 a 50 nucleotídeos em comprimento, e os braços de hibridização podem ser 4 a 10 ou 4 a 6 (por exemplo, 5 ou 6) nucleotídeos em comprimento. Sondas sinalizadoras moleculares podem ser encadeadas a primers, conforme descrito em U.S. Pat. Nos. 7662550 e 5925517 e WO01/31062.

[0038] Sondas sinalizadoras moleculares ‘sloppy” então referem-se a uma classe de sondas de hibridização de oligonucleotídeo “hairpin” fluorescentemente marcada. Essas sondas produzem um sinal detectável em um ensaio homogêneo, que é, sem ter que separar sodas hibridizadas em alvo de sondas não unidas. Devido a sua habilidade de aglutinar a mais de uma variante de uma dada sequência de aglutinação alvo, sua avidez relativa para diferentes variantes são diferentes. Por exemplo, uma primeira sonda pode aglutinar fortemente em uma sequência do tipo selvagem, moderadamente a um primeiro alelo, fracamente para um segundo alelo e de forma alguma para um terceiro alelo, enquanto uma segunda sonda pode aglutinar fracamente a um tipo selvagem e o primeiro variante, e moderadamente para uma segunda variante e a terceira variante. Sondas “sloppy” adicionais exibirão ainda diferentes padrões de aglutinação devido a suas diferentes sequências de aglutinação alvo. Então os espectros de emissão de fluorescência de combinações de sondas “sloppy” definem cepas microbianas diferentes ou espécie, bem como variantes/mutação de genes.

[0039] Como as sondas “sloppy” fluorescem reprodutivamente com intensidades variáveis após aglutinar em diferentes sequências de DNA, podem ser utilizadas combinações, por exemplo, ensaios de reação de amplificação de ácido nucleico simples, rápidos e sensíveis (por exemplo, ensaios baseados em PCR) que identifica múltiplos patógenos ou variantes em um único recipiente de reação. Deve ser entendido, entretanto, que os ensaios podem ser realizados ou também em amostras suspeitas de conter quantidades detectáveis diretamente de ácido nucleico alvo amplificado. Esse ensaio de identificação é baseado na análise do espectros de um conjunto de sondas de uma pluralidade de sondas de sinalização “sloppy”, tal como sondas sinalizadoras “sloppy” molecular, cada um marcado com um fluoróforo que emite Liz com um comprimento ótimo diferente para gerar “espectro de assinatura” de espécie- específica ou sequências de DNA variante-específicas.

[0040] Utilizando as sondas, pode ser conseguida multiplexação, por exemplo, ao projetar uma sonda sinalizadora molecular alelo-discriminatório diferente para cada alvo e rotular cada sonda diferencialmente (ver U.S. Pat. Nos. 7662550 e 5925517 e WO01/31062 e Tyagi et al. (200) Nature Biotecnology 18: 1191-1196). As misturas de sondas alelo-discriminadoras, cada uma compreende alíquotas de múltiplas cores, se estende o número de assinaturas de sonda. Para esse fim, todo híbrido sinalizador molecular - alvo com uma única temperatura de fusão terá correspondente uma única intensidade de sinal em uma temperatura e concentração definidas de sonda e amplicon. Então, um número limitado de sondas “sloppy” poderia ser utilizada como sondas para identificar muitas sequências alvo possíveis e diferentes em reação PCR em tempo real. As sondas podem ser adicionadas na mistura de reação de amplicon, antes, durante ou depois da aplificação (ver U.S. Pat. Nos. 7662550).

[0041] Essa invenção também proporciona kits que contêm reagentes para realizar os métodos acima mencionado, icluindo PCR e/ou reações de hibridação sonda-alvo. Para esse fim, um ou mais componentes de reação, por exemplo, primers de PCR , polimerase e sondas, para os métodos descritos presentemente podem ser supridos na forma de um kit de uso. Em cada kit, uma quantidade apropriada de um ou mais componente de reação é então proporcionada em um ou mais recipientes ou mantidos no substrato.

[0042] O kit também contém materiais adicionais para praticar os métodos acima mencionados. Em algumas modalidades, o kit contém alguns ou todos os reagentes, materiais para realizar um método que utiliza primers e/ou sondas de acordo com a invenção. Alguns dentre todos os componentes do kit pode ser proporcionado em containers separadamente em relação ao contanier que contém os primers e/ou sondas da invenção. Exemplos de componentes adicionais incluem, mas não se limitam a uma ou mais polimerases diferentes, um ou mais reagentes de controle (por exemplo, sondas ou primers PCR ou templates de controle), e tampões para as reações (em 1X ou formas concentadas). O kit pode também incluir um ou mais dos seguintes componentes: suportes, terminadores, modificadores ou reagentes de digestão, osmólitos e aparelhos para detecção.

[0043] Os componentes de reação utilizados podem ser proporcionados em uma variedade de formas. Por exemplo, os componentes (por exemplo, enzimas, sondas e/ou primers) podem ser suspensos em uma solução aquosa ou como um pó congelado-seco ou liofilizado, em pelotas ou pérolas. No último caso, os componentes quando reconstituídos, formam uma mistura completa em qualquer temperatura adequada. Por exemplo, para armazenamento de kits que contêm componentes de proteína (por exemplo, uma enzima) em um líquido, é preferido que sejam proporcionados e mantidos abaixo de 0°C, preferivelmente em ou abaixo de 20°C ou de outra forma em um estado congelado.

[0044] Um kit ou sistema dessa invenção pode conter, em uma quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, qualquer combinação dos componentes descritos presentemente. Em algumas aplicações, um ou mais componentes de reação podem ser proporcionados em quantidades de uso único pré-medido em tubos ou recipientes individuais, tipicamente descartáveis equivalentes. Com esse arranjo, uma reação PCR pode ser realizada ao adicionar um ácido nucleico alvo ou uma amostra/célula que contém o ácido nucleico alvo nos tubos individuais diretamente. A quantidade de um componente suprido no kit pode ser qualquer quantidade apropriada, e pode depender do mercado alvo para o qual o produto é direcionado. O recipiente em que os componentes são supridos podem ser qualquer um recipiente convencional que é capaz de manter a forma suprida, por exemplo, tubos micrófagos, ampolas, garrafas ou dispositivos de testagem integral, tal como dispositivos fluídicos, cartuchos, dispositivo de fluxo lateral ou outros dispositivos similares.

[0045] Os kits também incluem materiais de embalagem para manter o recipiente ou combinação de recipientes. Materiais de embalagem típicos para tais kits e sistemas inclui matrizes sólidas (por exemplo, vidro, plástico, papel, folha, micropartículas e similares) que mantém os componentes de reação ou sondas de detecção em qualquer uma das variedades de configurações (por exemplo, em um frasco vial, microtitulador, placa de poços, microarranjos e similares). Os kits podem também incluir instruções gravadas em uma forma tangível para uso dos componentes.

[0046] Definições

[0047] Um ácido nucleico refere-se a uma molécula de DNA por exemplo, mas sem se limitar a cDNA ou DNA genômico), uma molécula de RNA (por exemplo, mas sem se limitar a um mRNA), ou um DNA ou análogo de RNA. Um análogo de DNA ou RNA pode ser sintetizado a partir de análogos de RNA. Um análogo de DNA ou RNA pode ser sintetizado a partir de análogos nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla. Como ácido nucleico isolado, é um ácido nucleico, a estrutura do qual não é idêntica a de qualquer acido nucleico naturalmente ocorrente ou de que qualquer fragmento de um ácido nucleico genômico. O termo, portanto, cobre, por exemplo, (a) DNA que possui a sequência de parte de uma molécula de DNA genômico que ocorre naturalmente, mas não flanqueado por ambas a sequências que flanqueiam a parte da molécula no genoma do organismo em que naturalmente ocorre; (b)um ácido nucleico incorporado dentro de um vetor ou dentro de DNA genômico de um procariota ou eucariota em uma maneira tal que a molécula resultante não seja idêntica a qualquer vetor que ocorre naturalmente ou DNA genômico; (c) uma molécula separada tal como um cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido por PCR, ou um fragmento de restrição, e (d) uma sequência de nucleotídeo recombinante que é parte de um gene híbrido i.e., um gene que codifica uma proteína de fusão.

[0048] Conforme utilizado presentemente, “ácido nucleico alvo” ou “alvo” refere-se a um ácido nucleico que contém uma sequência de ácido nucleico alvo de interesse. O ácido nucleico alvo pode ser de fita simples ou de fita dupla e frequentemente é um DNA de fita dupla. Uma “sequência de ácido nucleico alvo”, “sequência alvo” ou “região alvo” significa uma sequência específica que compreende todo ou parte da sequência de ácido nucleico de fita única. Uma sequência alvo pode estar dentro de um template de ácido nucleico ou dentro do genoma da celular, que pode ser qualquer forma de ácido nucleico de fita única ou de dupla fita. Um template pode ser um ácido nucleico purificado ou isolado, ou pode ser não purificado ou não isolado.

[0049] Sequências “complementares”, conforme utilizado pode incluir ou serem formadas inteiramente a partir de pares de base Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G), pares de base não Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotídeos não naturais e modificados e assim conformemente os requisitos acima com relação a capacidade de tais sequências para hibridizar são atendidos. Um complemento total ou totalmente complementar pode significar 100% (completamente) complementares ou pareamento de base substancialmente complementar entre nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos de moléculas de ácidos nucleicos.

[0050] ‘Substancialmente complementares” significam que um ácido nucleico ou oligonucleotídeo possui uma sequência que contém pelo menos 10 bases contíguas que são pelo menos 80% (por exemplo, 85%,90%, 95%, 97$, 98%, 99% e 100%) a pelo menos 10 bases contíguas em uma sequência de ácido nucleico de modo que o ácido nucleico ou oligonucleotídeo pode hibridizar ou anelar em relação à sequência de ácido nucleico alvo e sob, por exemplo, condição de anelação de uma reação PCR ou condição sonda-alvo. A complementaridade entre as sequências pode ser expresso um número de incompatibilidades em cada conjunto de pelo menos 10 bases contíguas sendo comparadas. O termo “substancialmente idêntico” significa que um primeiro um ácido nucleico está a pelo menos a 80% (por exemplo, 85%,90%, 95%, 97$, 98%, 99% e 100%) complementar a um segundo ácido nucleico de modo que o o primeiro ácido nucleico é substancialmente complementar e é capaz de hibridizar com o componente de um segundo ácido nucleico sob condições de hibridização sonda- alvo.

[0051] “Hibridização” ou “hibridação” ou “hibridizar” refere-se a capacidade de completamente ou parcialmente complementar fitas de ácidos nucleicos para reunir sob condições de hibridação especificadas em uma orientação paralela ou preferivelmente antiparalela para formar uma estrutura de dupla fita estável ou região (às vezes chamada de um “hibrido” ou duplex ou ramo) em que as duas fitas constituintes são unidas por ligações hidrogênio. Apesar das ligações hidrogênio normalmente formare entre adenina e timina ou uracila (A e T ou U) ou citosina e guanina (C e G), outros pares de base poderão ser formados (por exemplo,

Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 11th ed., 1992).

[0052] “duplex de ácido nucleico”, “duplex”, “ramo”, “hibrido de ácido nucleico” ou “hibrido” refere-se a um ácido nucleico estável e estrutura que compreende uma região de dupla fita, de ligação hidrogênio, por exemplo moléculas duplex RNA:RNA, RNA:DNA e DNA:DNA e seus análogos. Tal estrutura pode ser detectada por quaisquer métodos conhecidos, por exemplo, utilizando uma sonda marcada, uma sonda-substrato oticamente ativa sensível a mudanças na massa de sua superfície (US Pat No. 6060237) e agentes aglutinantes (US Pat No. 5994056).

[0053] Conforme utilizado presentemente o termo “amplificação” e suas variantes inclui qualquer processo para produção de múltiplas cópias ou complementos de pelo menos uma porção de polinucleotídeo, o polinucleotídeo pode ser de fita única ou fita dupla. Um template pode ser um purificado ou isolado ácido nucleico ou pode não purificado ou não isolado. A amplificação de um dado template pode resultar na geração de uma população de amplificação de produtos de polinucleotídeo, coletivamente referido como um “amplicon”, Os polinucleotídeos do amplicon podem ser de fita única ou de fita dupla ou uma mistura desses. Tipicamente, o template incluirá uma sequência alvo, e o amplicon resultante incluirá polinucleotídeos que possuem uma sequência que é tanto substancialmente idêntica ou substancialmente complementar à sequência alvo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos de um amplicon particular são substancialmente idêntico ou substancialmente complementar, um ao outro, alternativamente, em algumas modalidades o polinucleotídeo dentro de um dado amplicon pode ter sequências de nucleotídeos que variam de um para o outro. O amplicon pode proceder de maneira linear ou exponencial, e pode envolver replicações consecutivas ou repetidas de um dado template para formar dois ou mais produtos de amplificação. Algumas reações de amplificação típicas envolvem ciclos sucessivos e repetidos de síntes de ácido nucleico com base em template, resultando na formação de uma pluralidade de polinucleotídeos filhos que contêm pelo menos uma porção da sequência de nucleotídeo do template e compartilhando pelo menos algum grau de identidade de sequência de nucleotídeo (ou complementaridade) com o template. Em algumas modalidades, cada exemplo de síntese de ácido nucleico que pode ser referido como um “ciclo” de amplificação, inclui criar terminação 3’ livre (por exemplo cortando uma fita de um dsDNA) e dessa forma gerando um primer ou etapas de extensão de primer; opcionalmente, uma etapa de desnaturação adicional pode também ser incluída em que o template seja parcialmente ou completamente desnaturado. Em algumas modalidades, uma rodada de amplificação inclui um dado número de repetições de um ciclo único de amplificação. Por exemplo uma rodada de amplificação pode incluir 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, ou mais repetições de um ciclo particular. Em uma modalidade exemplificativa, a amplificação inclui qualquer reação em que um template de polinucleotídeo particular seja submetido a dois ciclo consecutivos de síntese de ácido nucleico. A síntese pode incluir síntese de ácido nucleico template-dependente.

[0054] A amplificação da presente invenção pode incluir amplificação isotérmica. O termo “isotérmico” significa conduzir uma reação a uma temperatura substancialmente constante, i.e., sem variar a temperatura de reação em que a reação de polimerização do ácido nucleico ocorre. As temperaturas isotérmicas para reações de amplificação isotérmica depende da polimerase fita-deslocadora de ácido nucleico utilizada nas reações. Geralmente, as temperaturas isotérmicas são abaixo do ponto de fusão (Tm, a temperatura em que metade das moléculas potencialmente de dupla-fita em uma mistura estão em um estado desnaturado de uma única fita). O produto de reação predominante, i.e., geralmente 90°C ou abaixo, usualmente entre cerca de 20°C e 75°C, preferivelmente entre 30°C e 60°C, ou mais preferivelmente a cerca de 37°C.

[0055] O termo “primer” ou “oligonucleotídeo primer” refere-se a uma fita de ácido nucleico ou um oligonucleotídeo capaz de hibridizar em um ácido nucleico template e atuar como ponto de iniciação para incorporar nucleotídeos de extensão de acordo com a composição do acido nucleico template para síntese de ácido nucleico. “nucleotídeos de extensão” refere-se a quaisquer nucleotídeos (por exemplo, dNTP) e análogos desses capazes de serem incorporados dentro de um produto de extensão durante amplificação, i.e., DNA, RNA, ou um derivado de DNA ou RNA, que pode incluir uma marcação.

[0056] Conforme utilizado presentemente, o termo “oligonucleotídeo” refere-se a um polinucleotídeo curto normalmente menor ou igual a 300 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, na faixa de 5 e 150 preferivelmente na faixa de 10 a 100, mais preferivelmente na faixa de 15 a 50 nucleotídeos de comprimento). Entretanto, conforme utilizado presentemente, o termo é também intencionado abranger cadeias de polinucleotídeos mais longas ou mais curtas. Um “oligonucleotídeo” pode hibridizar em outro polinucleotídeo, portanto, servindo como sonda para detecção de polinucleotídeo, ou um primer para extensão de cadeia de polinucleotídeo.

[0057] O termo “sonda” conforme utilizado presentemente refere-se a um oligonucleotídeo capaz de aglutinar em um ácido nucleico alvo de sequência complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, usualmente através de pareamento de base complementar, usualmente através da formação de ligação hidrogênio. As sondas podem aglutinar sequências alvo faltando complementaridade completa com a sequência alvo e Os ácidos nucleicos de fita única descritos presentemente. Entretanto, se o número de mutações for tão grande que nenhuma hibridação ocorra sob mesmo pelo menos condições de hibridização rigorosas, a sequência não é uma sequência alvo complementar. Uma sonda pode ser de fita única, de dupla fita ou de fita parcialmente única. A característica de fita da sonda é ditada pela estrutura, composição e propriedades e sequência alvo. As sondas podem ser diretamente marcadas ou indiretamente marcadas com uma marcação tal como com biotina para que um complexo de estreptavidina pode posteriormente aglutinar.

[0058] O termo “sonda de detecção” refere-se a um oligonucleotídeo que possui uma sequência suficientemente complementar a sua sequência alvo para formar um híbrido alvo sonda estável detecção sob condições rigorosas de hibridação. Uma sonda é tipicamente um oligômero sintético que pode incluir bases complementares à sequência fora da região alvo que não previne hibridização sob condições de hibridização rigorosas no ácido nucleico alvo. Uma sequência não complementar ao alvo pode ser um trato homopolímero (por exemplo, poli-A ou poli-T), sequência promotora, sequencia de reconhecimento de endonuclease de restrição, ou sequência para conferir estrutura secundária ou terciária desejada (por exemplo, sítio catalítico ou estrutura “hairpin”), ou uma região alvo que pode facilitar a detecção e/ou amplificação. “Estável” ou “estável para detecção” significa que a temperatura de uma mistura de reação é de pelo menos 2°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) de um duplex ácido nucleico contido na mistura, mais preferivelmente pelo menos 5°C abaixo da Tm, e ainda mais preferivelmente pelo menos 10°C abaixo da Tm.

[0059] Uma “marcação (label)” ou “molécula repórter” é uma porção química ou bioquímica útil para marcar ácido um ácido nucleico (incluindo um único nucleotídeo), polinucleotídeo, oligonucleotídeo, ou ligante de proteína, por exemplo, aminoácido ou anticorpo. Exemplos incluem agentes fluorescentes, agentes químioluminescentes, agentes quimiogênicos, agentes atenuadores, radionucleotídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e ouras porções conhecidas na arte. Marcadores ou moléculas repórteres são capazes de gerar um sinal mensurável e pode ser covalentemente ou não convalentemente juntada em um oligonucleotídeo ou nucleotídeo (por exemplo, um nucleotídeo não natural) ou ligante.

[0060] Conforme utlizado presentemente, o termo “contatar” e suas variantes quando utilizado em referência a qualquer conjunto de componentes, inclui qualquer processo pelo qual os componentes sejam contatados são misturados dentro da mesma mistura (por exemplo, são adicionados dentro do mesmo componente ou solução), e não necessariamente requer contato físico real entre os componentes citados. Os componentes citados podem ser contatados em qualquer ordem ou qualquer combinação (ou subcombinação), e pode incluir situações onde um ou mais dos componentes citados podem ser contatados em qualquer ordem ou qualquer combinação (ou subcombinação), e pode incluir situações onde um ou mais dos componentes citados são subsequentemente removidos da mistura, opcionalmente antes da adição de outros componentes citados. Por exemplo, “contatar A com B e C” inclui qualquer e todas as seguintes situações (i) A é misturado com C, então B é adicionado à mistura, (ii) A e B são misturados em uma mistura, B é removido da mistura e então C é adicionado à mistura; e (iii)A é adicionado a uma mistura de B e C. “Contatar” um ácido nucleico alvo ou uma célula que um ou mais componentes de reação, tal como uma polimerase, um conjunto de primer ou uma sonda inclui qualquer ou todas as seguintes situações: (i) o alvo ou célula é contatada com um primeiro componente de uma mistura reacional para criar uma mistura; então outros componentes da mistura reacional são adicionados em qualquer outra combinação à mistura; e (ii) a mistura reacional é totalmente formada antes da mistura com o alvo ou célula.

[0061] O termo “mistura conforme utilizado presentemente refere-se a uma combinação de elementos que são intercalados e não em qualquer ordem particular. Uma mistura é heterogênea e não espacialmente separável dentro de seus diferentes constituintes. Exemplos de mistura de elementos incluem um número de diferentes elementos vinculados a um suporte sólido aleatoriamente ou sem qualquer ordem em particular com diferentes elementos são não espacialmente distintos. Em outras palavras, uma mistura não é direcionável.

[0062] Conforme utilizado presentemente, o termo “indivíduo” refere-se a qualquer organismo que possua um genoma, preferivelmente um animal vivo, por exemplo, mamífero, que foi objeto de diagnose, tratamento, observação ou experimento. Exemplos de um indivíduo podem ser humano, animal de criação (para carne bovina, aviária, suína, gado de leite, ovina, etc.) ou um animal de estimação (cães, gatos, cavalos, etc.).

[0063] Uma amostra, conforme utilizado presentemente, significa qualquer fluido biológico ou tecido obtido a partir de um organismo (por exemplo, paciente) ou de componentes (por exemplo, sangue) de um organismo. A amostra pode ser qualquer tecido biológico, célula ou fluido. A amostra pode ser uma “amostra clínica” que é uma amostra derivada de um indivíduo, tal como um paciente humano ou indivíduo veterinário. Amostras biológicas úteis incluem, sem limitação, a totalidade do sangue, saliva, urina, líquido sinovial, medula óssea, fluido cerebroespinal, muco vaginal, muco cervical, secreções nasais, cuspe, sêmen, fluido amniótico, fluido de lavagem bronco alveolar e outros exsudados celulares de um paciente ou indivíduo. Essas amostras podem também ser diluídos com solução salina, tampão, ou um diluente fisiologicamente aceitável. Alternativamente, tais exemplos são concentrados por meios convencionais. Amostras biológicas pode também incluir secções de tecidos tal como seções congeladas tomadas para fins histológicos. Uma amostra biológica pode também ser referida como “amostra paciente”. Uma amostra biológica pode também incluir uma proteína substancialmente purificada ou isolada , preparação de membrana ou cultura de célula.

[0064] Os termos “determinação”, “medição”, “avaliação” e “ensaio” são utilizados intercambiavelmente e inclui medições tanto qualitativa ou quantitativa e inclui determinar se uma característica, traço ou apresentação está presente ou não. Avaliar pode ser relativo ou absoluto. Avaliar a presença de um alvo inclui determinar a quantidade do presente alvo, bem como se está presente ou ausente.

[0065] Conforme utilizado presentemente, o termo “referência” refere-se a um valor que estatisticamente se correlaciona a um resultado particular quando comparado a um resultado de ensaio. Em modalidades preferidas, o valor de referência pode ser determinado a partir de análise estatística que examina o significado dos valores do tipo selvagem. O valor de referência pode ser um valor de pontuação limiar ou um valor de pontuação de corte. Normalmente, um valor de referência será um limiar acima (ou abaixo) em que um resultado é mais provável e abaixo do que um resultado alternativo é menos provável.

[0066] Conforme descrito presentemente, a diferença dos valore é indicativa da presença ou ausência de um patógeno (por exemplo Mycobacterium tuberculosis) ou uma mutação. O termo “diferença” do nível ou valor refere-se a diferenças em um valor (por exemplo, Tm) de um analito (por exemplo, um híbrido de sonda-alvo) em uma amostra quando comparada ao controle ou nível de referência ou valor. Em uma modalidade, uma diferença de um valor ou nível pode ser uma diferença estatisticamente significante entre as quantidades de um analito presente em uma amostra conforme comparado a um controle. Por exemplo, uma diferença pode ser estatisticamente significativa se o nível medido do analito cair fora de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ou 5,0 de desvio padrão do valor significativo de qualquer grupo de referência.

[0067] Conforme descrito presentemente, um número de faixas de valores é então proporcionado. É entendido que cada valor interveniente, na décima unidade do limite inferior, a menos que no contexto claramente de outra forma, entre os limites inferior e superior da faixa é também especificamente descrito. Cada faixa menor entre cada valor estabelecido ou valor interveniente em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente em que essa faixa estabelecida é abrangida dentro da invenção. Os limites superiores e inferiores dessas faixas menores podem independentemente ser incluídas ou excluídas na faixa e cada faixa onde um ou outro ou ambos limites são incluídos nas faixas menores é também englobado dentro da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, as faixas que excluem tanto ou ambos daqueles limites incluídos são também incluídos na presente invenção. O termo “cerca de” geralmente refere a mais ou menos 10% do número indicado. Por exemplo, cerca de 10% pode indicar uma faixa de 9% a 11% e “cerca de 20” pode significar de 18-22. Outros significados podem se tornar aparentes a partir do contexto, tal como ao redor de, por exemplo “carca de 1” pode também significar de 0,5 a 1,4.

[0068] Dois ensaios SMB separados que rapidamente e confiavelmente identificam as mutações de M.tb que são amplamente responsáveis por resistência a Rifampin e Fluorquinolona (FQ), foram recentemente descritas (Chakravorty, S.B., et al., 2011, J.Clin.Microbiol. 49:932- 940; Chakravorty, S.B., et al., 2012, J.Clin.Microbiol. 50:2194-2202). Os ensaios descritos presentemente possuem a vantagem de serem no formato PCR em tempo real, de modo que facilmente utilizam e não submetem o amplicon a contaminação cruzada. Além do mais, a detecção de mutação foi mostrada como sendo robusta e amena para testagem de alto processamento. Os exemplos abaixo apresentam um sistema de ensaio de detecção de resistência a droga SMB TB, adicionando ensaios que possibilitam a detecção e resistência a AMK E KAN. As causas de discordância entre o ensaio presentemente descrito e os métodos de testagem de suscetibilidade fenotípica foram também explorados. Os resultados mostrados abaixo que alguns dos mais métodos fenotípicos comumente usados podem perder isolados de M.tb com mutações que conferem resistência, se essas mutações apenas moderadamente aumentam as concentrações inibitórias (MICs) a KAN.

Novas simulações com whiB7 que são associadas com o nível de resistência KAN foram então descobertas.

Conforme descrito presentemente, o PCR SMB multiplexado e o ensaio de fusão identificaram precisamente mutações do gene rrs e promotor eis associado com resistência a AMK e/ou KAN.

O ensaio não produziu resultados de falsa resistência quando testado contra bactérias NTM gram positiva e gram negativa.

A maioria dos casos de hetero-resistência foram também detectada pelo ensaio, quando presente.

Diferentemente da plataforma MTBDRsl, o ensaio pode ser realizado em um sistema PCR em tempo real fechado e pode facilmente ser adaptado a uma testagem de alto processamento como todas as etapas são realizadas em placas de 384 poços.

O ensaio SMB também evita problemas potenciais associados com métodos alternativos para detecção de mutação.

A análise de curva de fusão de alta resolução requer a capacidade de detectar variações sutis adequadas nas curvas de fusão (Yadav, R.

S., et al. 2012, J.

Appl.

Microbiol. 113:856-862). Outro ensaio molecular de fusão pós PCR deve detectar mutações ao decodificar contornos de fluorescência complexa (Rice, J.E. et al., 2012 Nucleic Acid Res. 40:e164). Em contraste, o ensaio SMB produz picos Tm claros e distinguíveis e mudanças Tm definitivas para identificar mutações de interesse.

Valores Tm individuais podem também ser utilizados em amostras cluster que possuem o mesmo genótipo.

Conforme descrito presentemente, um ensaio foi testado em um painel de 603 amostras clínicas que representam tanto novos casos de TB quanto casos não resolvidos ou de retratamento e avaliada a relação de mutações marcadas com padrão de susceptibilidade dos isolados clínicos.

Foi observado que 100% dos isolados com mutações rrs e A1401G tinham forte correlação com o alto nível de resistência tanto AMK quanto KAN.

Entretanto, mutações do promotor eis resultaram apenas em nível moderado ou baixo de resistência KAN e nenhuma resistência a AMK, o que é consistente com os estudos prévios (Campbell, P.J., et al., 2011, Antimicrob.

Agents Chemother 55: 2032-2041; Zaunbrecher, M.

A.,et al. 2009, Proc.

Natl Acad.

Sci.

USA 106: 20004-20009). O estudo também mostrou que o método de concentração LJ absoluta para testar susceptibilidade não detectou adequadamente resistência a níveis de baixo a moderado de resistência a KAN.

De fato, dois terços das amostras com mutações no promotor eis foram detectados como KAN suscetível no meio LJ.

Entretanto, todos menos uma amostra com mutações de promotor eis foram detectados como KAN resistente pelo método MGIT.

Dois dos referidos isolados continham uma mutação eis C(-12)T.

Esses mutantes foram também resistentes a KAN quando testados por MYCOTB, que mostraram um KAN MIC de 5µg/mL.

Estudos prévios sugeriram que os isolados clínicos com mutações C(-12)T não se correlacionam (Zaunbrecher (2009) ou se correlacionam fracamente (Campbell, 2011; Hoshide, M.L. et al. 2014, J.

Clin Microbiol. 52:1322-1329) com resistência KAN.

Esses estudos possivelmente perderam a relação entre essa mutação e resistência KAN de baixo nível devido ao método de testagem utilizado para estabelecer susceptibilidade fenotípica.

Esses resultados sugerem que os métodos MGIT ou MYCOTB deveriam ser preferidos para testagem de resistência fenotípica a KAN.

Eles também destacam o poder dos testes de resistência fenotípica, tal como descrito presentemente, para detectar mutações que causam baixo nível de resistência e pode ser perdido por testes fenotípicos isoladamente (Rigouts, L. M. et al., 2013, J. Clin. Microbiol 51:2641-2645; Sirgel, F.A., et al., 2012, Microb.Drug Resist 18:193-197; e Van Deun, A. et al. 2013 J. Clin. Microbiol. 51:2633-2640).

[0069] O estudo conduzido presentemente incluiu uma amostra que foi uma mistura de mutantes rrs tipo selvagem e rrs C1402. Essa amostra foi suscetível a ambos AMK e KAN em meio LJ. Isolados com mutações C1402 foram reportadas por serem suscetíveis a AMK, mas resistentes a KAN (Maus, C.E. et al. 2005, Antimicrob. Agents Chemother 49: 3192-3197). Nesse caso particular, testes de susceptibilidade repetidos utilizando meio LJ mostraram susceptibilidade a KAN presumivelmente por causa da natureza hetero-resistente da amostra. Aqui, o ensaio molecular serviu como um melhor previsor de resistência potencialmente emergente do que o ensaio fenotípico, conforme o ensaio SMB claramente detectou a presença de ambos os tipos: tipo selvagem e DNA mutante.

[0070] A incidência de mutações rrs 1484 em cepas clínicas com resistência a AMK ou KAN tem sido muito baixa (Georghiou, S. B., et al., 2012, PLoS One 7: e33275) tornando seu significado clínico discutível. Uma versão separada do ensaio que visava o códon rrs 1484, não detectou mutações em nenhum dos 603 isolados no estudo, bem como em 259 isolados adicionais da área de Nova Jersey-Nova Iorque, que incluíam 33 isolados resistentes a AMK e KAN. A falta de mutações rrs 1484 neste conjunto de estudo ampliado foi confirmada pelo sequenciamento de Sanger (dados não mostrados). À luz da muito baixa prevalência de mutações rrs 1484, é improvável que este códon forneça muito valor na predição da resistência a aminoglicosídeos. Assim, recomenda-se que os ensaios moleculares para a resistência à aminoglicosídeos visem apenas os códons 1401- 1402 no gene rrs.

[0071] Verificou-se que 22 amostras resistentes a AMK ou KAN apresentavam sequências de tipo selvagem no gene rrs e na região do promotor eis. Um estudo recente mostrou uma possível associação entre as mutações no 5'UTR de whiB7 e resistência a KAN, identificando uma mutação 5'UTR de whiB7 em uma única cepa clínica com resistência inexplicável a KAN (Reeves, AZ, et al., 2013, Antimicrob Agents Chemother 57: 1857-1865). Também foram descritas várias novas mutações 5'UTR de whiB7, bem como uma deleção, que parecem estar associadas à resistência a KAN. Não foram identificados biomarcadores universais adequados que possam explicar a resistência a KAN e AMK nos 15-20% restantes de cepas clínicas com rrs de tipo selvagem, região do promotor eis. As amostras contendo o gene rrs do tipo selvagem e a região do promotor eis, misturadas com uma quantidade traço de alvos mutantes de uma subpopulação resistente a KAN ou AMK, também podem explicar as discordâncias remanescentes entre os testes de resistência fenotípica e o ensaio SMB aqui divulgado. No entanto, uma investigação dispendiosa de heteroresistência estava além do escopo deste estudo. Alguns estudos recentes sugeriram que os genes PPE60 e Rv3168 poderiam estar envolvidos na resistência inexplicável a KAN (Farhat, MR, et al., 2013. Nat Genet 45: 1183-1189; Zhang, H., et al., 2013, Nat Genet 45: 1255- 1260), embora isso ainda não tenha sido verificado em contextos clínicos.

[0072] Em resumo, um ensaio sensível e específico é desenvolvido para a detecção de resistência a AMK e KAN em M. tb e validado em isolados clínicos com alta prevalência de MDR e XDR TB. Os resultados mostram que as mutações rrs A1401G codificam a resistência cruzada de alto nível tanto a AMK como a KAN, e que as mutações do promotor eis codificam a resistência a KAN de nível moderado a baixo, o que é consistente com os estudos anteriores de genômica funcional (Zaunbrecher 2009). A comparação do desempenho do ensaio aqui revelado com três diferentes métodos de teste de susceptibilidade fenotípica em meios sólidos e líquidos revelou que a resistência a KAN de nível baixo a moderado causada por mutações do promotor eis é largamente perdida pelos testes de susceptibilidade baseados em LJ. Estes resultados defendem fortemente o valor dos testes genotípicos para detectar a resistência aos aminoglicosídeos, e os resultados demonstram a utilidade específica do ensaio baseado em SMB aqui divulgado

[0073] EXEMPLOS

[0074] Exemplo 1

[0075] Este exemplo descreve materiais e métodos usados nos EXEMPLOS 2-7 abaixo.

[0076] Amostras de DNA

[0077] As amostras de teste de M. tb consistiram em DNA isolado de 603 isolados de M. tb sequenciais cultivados de 503 pacientes matriculados em um estudo de história natural de tuberculose MDR (NCT00341601 em clinicaltrials.gov) no Hospital Nacional de Masan em Changwon, República da Coréia. Foram testadas duas coortes. A coorte A consistiu no tratamento de casos de tuberculose natural recém- suspeitadas (158 amostras) e a coorte B consistiu em retratamento de casos de TB (445 amostras). Amostras frescas de escarro foram coletadas de cada paciente no início do tratamento e cultivadas para M. tb. Em um subconjunto de pacientes, as amostras repetidas de escarro foram coletadas nos 1º, 4º e 6º meses de tratamento e também cultivadas para M.tb. As micobactérias não tuberculosas (NTM) e as amostras de bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas foram retiradas do repositório de DNA da Escola de Medicina de Nova Jersey (NJMS) como descrito anteriormente (Chakravorty, S., 2012. J Clin Microbiol 50: 2194-2202).

[0078] Teste fenotípico de suscetibilidade ao fármaco

[0079] O teste fenotípico de susceptibilidade ao fármaco foi realizado em todos os 603 isolados pelo método de concentração absoluta no meio LJ para determinar a susceptibilidade a AMK e KAN usando concentrações críticas de 40 μg/ml (a concentração padrão usada durante 2012 quando os isolados foram testados) tanto para ambos os antibióticos (Jnawali, HN, 2013, Diagn Microbiol Infect Dis 76: 187-196) no Centro Internacional de Pesquisas sobre Tuberculose (ITRC), Coréia do Sul. As MICs para AMK e KAN para amostras de 173/603 também foram avaliadas utilizando as placas TREK Sensititre® MYCOTB MIC ("MYCOTB", TREK Diagnostic Systems, Cleveland, Ohio, EUA), conforme descrito anteriormente (Lee, J., 2014, Antimicrob Agents Chemother 58: 11-18). Para amostras de 560/603, a resistência a KAN também foi avaliada utilizando o sistema MCP (Mycobacterial Growth Indicator Tube) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) a uma concentração crítica de 2,5 μg/ml. Para as amostras com resultados de teste de susceptibilidade fenotípica que foram discordantes com os resultados de sequenciamento de Sanger dos genes alvo, os testes de susceptibilidade fenotípica foram repetidos para confirmar os achados iniciais. Nos casos em que os resultados do teste de susceptibilidade de MGIT e LJ mostraram discordância, ambos os ensaios foram repetidos para confirmar ou corrigir os achados iniciais.

[0080] Preparação e Sequenciamento de DNA

[0081] O DNA para o teste de ensaio SMB e o sequenciamento de Sanger foram preparados a partir de isolados cultivados por ebulição de uma ansa de cultura em 200 μl de resina Instagene Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA) na presença de 0,1% de Triton X100 durante 10-15 minutos.

O sobrenadante foi recuperado após centrifugação e quantificado usando um espectrofotômetro de micro volume Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). Para o sequenciamento de Sanger, dois fragmentos diferentes do gene rrs (nucleotídeos 420-980 e 1293-1537) e uma parte da região de codificação eis a montante mais o promotor eis inteiro foram amplificados usando 0,5 μM de iniciadores direto e reverso, tampão de PCR 1X, DNTPs de 250 mM, 2,5 mM de MgCl2 e 0,03 U/μl de enzima de DNA polimerase de ouro AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA) de acordo com os seguintes parâmetros: desnaturação inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10s, 58-60 °C durante 30s e 72 °C durante 10-30s dependendo do tamanho do amplicon.

A região do promotor eis e os fragmentos do gene rrs foram amplificados como descrito anteriormente (10, 33). Para um subconjunto de amostras, um fragmento de 538 pb do gene whiB7 incluindo 412 pb da região 5 'não traduzida e 126 pb da ORF foi amplificado e sequenciado usando iniciadores whiB7F 5'aaacgcgcaggtcagaaaat 3' e whiB7R 5'cagtgtcttggctacctcga 3'(SEQ ID Nos: 70 e 71). Além disso, um fragmento de 275 pb do gene whiB7, que incluiu quase todo o ORF whiB7 também foi amplificado usando os iniciadores whiB7-ingene-F 5 'GTCGGTACTGACAGTCCCC 3' e whiB7-ingene-R 5'ATGCAACAGCATCCTTGCG 3 '(SEQ ID Nos: 72 e 73). Os produtos de PCR foram submetidos ao sequenciamento bidirecional utilizando os iniciadores diretos e reversos específicos do gene em um analisador de genética 3130XL (Applied Bio- systems, Foster City, Califórnia, EUA) usando um terminal

BigDye, versão 3.1, kit de sequência de ciclos (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante.Teste de Beacons Moleculares e iniciadores

[0082] Os ensaios SMB visaram mutações M.tb nos códons 1401 e 1402 do gene rrs e mutações ao longo da região promotora do gene eis. Um fragmento de 113 pb (nucleotídeos 1335-1451) foi amplificado a partir do gene rrs utilizando os iniciadores AMG-F (5'-GCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGC-3 ', SEQ ID No: 51) e AMG-R (5'-CCTCCCGAGGGTTAGGCCACT-3', SEQ ID No: 52) e um fragmento de 98 pb que abrange a região promotora e os cinco códons iniciais do gene eis (nucleotídeos 81 a 17) foi amplificado usando os iniciadores eis-F (5'-CACAGGGTCACAGTCACAGAATC-3 ', SEQ ID No: 18) e eis-R (5'-GCATCGCGTGATCCTTTGCCAGAC-3 ', SEQ ID No: 53). Os iniciadores rrs foram projetados para serem específicos do gênero Mycobacterium e os iniciadores eis foram projetados para serem específicos do complexo de M.tb. Uma sonda SMB rrs-1400 (5'-6carboxifluoresceína- cacgaccgcccgtcacgtcatgaagtcggtcgtg-BHQ1-3', SEQ ID No: 59) e duas sondas SMB eis-1 (5'-Cianina5 caggcggtcgtaatattcacgtgcacctggccgccgcctg-BHQ2-3', SEQ ID No: 16) e eis-2 (5'-TexasRed- ctcgcggcatatgccacagtcggattctctgacgcgag-BHQ2-3 ', SEQ ID No: 61) (onde as sequências sublinhadas representam a porção da haste do SMB e BHQ representam o extintor de buraco negro) foram direcionadas contra o gene rrs e a região do promotor eis, respectivamente. A sonda rrs foi projetada para ser complementar à cadeia antisentido e as sondas eis foram projetadas para serem complementares da cadeia sentido. As PMEs foram projetadas usando o programa de dobragem de DNA in silico em http://mfold.rna.albany.edu/?q_mfold/dna- folding-form e o programa de dobragem de sonda-alvo híbrida em http: //mfold.rna. Albany.edu/?q_DINAMelt/Two-state-

melting foi usado para prever as possíveis estruturas de sonda-alvo híbridas e temperaturas de fusão (Tfs). As sondas foram projetadas para gerar uma diferença máxima de Tf entre as sequências de tipo selvagem e mutante em suas respectivas regiões alvo para permitir a identificação de mutação inequívoca. Os iniciadores foram obtidos da Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA) e sondas SMB da Biosearch Technologies (Novato, Califórnia, EUA).

[0083] Procedimento de ensaio

[0084] Todas as amostras foram codificadas de forma independente e distribuídas aleatoriamente para garantir que a validação do ensaio tenha sido realizada de forma cega. O ensaio foi testado tanto na ITRC em Masan, Coréia do Sul e na escola de medicina de Nova Jersey (NJMS), Rutgers, Newark, Nova Jersey. Uma vez que o teste de todo o conjunto de 603 amostras foi concluído, as amostras foram decodificadas e os resultados do PCR foram comparados com o sequenciamento correspondente e resultados do teste de susceptibilidade fenotípica ao fármaco. Os resultados obtidos em cada site também foram comparados. Os resultados do ensaio não foram notificados aos médicos que tratam e não foram utilizados para orientar as decisões de tratamento. O PCR foi realizado em placas de 384 poços usando um sistema de PCR em tempo real Roche Light Cycler 480 II (Roche Diagnostics Co. Indianapolis, Indiana, EUA) em volumes de 20 μl de reação contendo 100 nM do iniciador direto e 1 μM do iniciador reverso para o gene rrs e 1 μM do iniciador direto e 50nM do iniciador reverso para a região do promotor eis, 1 ng/μl de sondas rrs-1400 e eis-1 e 0,8 ng/μl de sonda eis-2, 4 mM de MgCl2, 250 mM de desoxinucleosídeos trifosfatos (dNTPs), tampão 1XPCR, glicerol a 8% , 0,06U/μl de Platinum® TfiExo (-) DNA polimerase (Life Technologies, Grand Island, Nova Iorque,

EUA) e 2 a 5ng de amostra de DNA ou um volume equivalente de água. O PCR foi realizado com as seguintes etapas: ativação da enzima durante 2 min a 95 °C, seguida de 50 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 10s e recozimento combinado e extensão a 67 °C durante 30s. Após o ciclo de PCR, a análise pós-PCR-Tf foi realizada por desnaturação a 95 °C durante 2 minutos, seguida de arrefecimento até 45 °C e depois aquecimento gradual a 85 °C, com monitoramento contínuo da fluorescência durante o processo a uma taxa 1 de aquisição de dados por grau centigrado. Os valores de Tf foram identificados no final da reação usando o software de chamada Tf (software Light Cycler 480). No entanto, cada Tf também foi verificado por um observador treinado antes da identificação final do valor de Tf. As amostras que mostram picos duplos distintos para quaisquer sondas de tipo selvagem e mutantes correspondentes a Tfs foram consideradas indicativas de heteroresistência. Um controle sem modelo usando água estéril em vez de DNA como o modelo foi usado como o controle negativo do DNA, e um controle positivo de DNA usando 1 ng de DNA genômico de M. tb H37Rv como modelo também foi incluído em cada placa de ensaio.

[0085] Aprovações de indivíduos humanos

[0086] Este estudo foi aprovado pelo Hospital Nacional de Masan, bancas de revisão institucional NIAID e Rutgers (anteriormente UMDNJ), e todos os indivíduos deram consentimento informado por escrito (Rutgers IRB protocolo número 0120090104).

[0087] Exemplo 2. Identificação de valores de Tf associados a sequências de tipo selvagem e mutantes

[0088] O ensaio baseado em SMB aqui descrito detectou resistência a AMK e KAN procurando por mutações no gene rrs de M.tb e promotor eis que tinham associações conhecidas com resistência. O ensaio consistiu em uma etapa de PCR seguida por uma análise de Tf na presença de sondas SMB complementares a porções dos amplicons alvo rrs e eis. Os inventores avaliaram pela primeira vez a capacidade do ensaio para identificar as mutações alvo em oligonucleotídeos artificiais e modelos de DNA sequenciados selecionados de cepas de M.tb de tipo selvagem e mutante (dados não apresentados). As sequências de tipo selvagem foram identificadas pela presença de valores de Tf dentro de 1 °C dos valores médios conhecidos para alvos de tipo selvagem.

[0089] As sequências mutantes foram identificadas por uma mudança nos valores de Tf de pelo menos cinco desvios padrão para longe dos valores médios de Tf de tipo selvagem. A capacidade do ensaio para detectar as mutações mais prevalentes associadas à resistência à AMK e KAN foi então avaliada nas amostras clínicas de DNA. Os testes foram realizados em um painel de 603 amostras clínicas, consistindo de 487 amostras com sequências de tipo selvagem e 116 amostras com mutações nos alvos do ensaio. Cinco dessas amostras apresentaram misturas de DNA tipo selvagem e mutante detectadas no sequenciamento de Sanger. O ensaio SMB identificou corretamente as amostras 115/116 (99%) mutantes ou misturadas (amostras heterogêneas contendo DNA de tipo mutante e selvagem) como amostras de tipo selvagem mutantes ou misturadas e 487/487 (100%) como tipo selvagem. Uma única amostra mista (como indicado pelo sequenciamento de Sanger) foi identificada como uma amostra de tipo selvagem pelo ensaio aqui descrito. Os valores de Tf produzidos por cada sonda SMB na configuração de alvos mutantes ou de tipo selvagem foram altamente reprodutíveis. Para os alvos de tipo selvagem, as sondas rrs-1400, eis-1 e eis-2 apresentaram valores médios de Tf de 70,1 °C ± 0,15, 63,9 °C ± 0,19 e 69 °C ± 0,23, respectivamente (Tabela 3).

Para alvos de Tf mutantes, A1401G e C1402T, as mutações resultaram em diminuição de 3,9 °C (± 0,17) e 5,6 °C (± 0,21) nos valores de Tf na sonda rrs-1400, respectivamente (Tabela 3). Da mesma forma, as sondas eis-1 e eis-2 detectaram de forma robusta uma faixa de mutações na região do promotor eis como mutante, desenvolvendo uma queda de 4,3 °C a 6,5 °C nos valores de Tf, em comparação com os valores de Tf esperados de tipo selvagem (Tabela 3). Os ensaios de PCR realizados nos dois laboratórios diferentes em Rutgers e ITRC estavam totalmente de acordo para todas as amostras detectadas como tipo selvagem e mutantes, bem como misturas.

[0090] Os resultados do ensaio nos permitiram separar claramente as 603 amostras em grupos de Tf de tipo selvagem e mutante com base em seus padrões individuais de Tf de três pontos (Fig. 1). O ensaio identificou corretamente as mutações em todas as 75 amostras que apenas continham a mutação A1401G (Tabela 3, Fig. 2, painel A). Três das quatro amostras contendo misturas de A1401G e sequência de tipo selvagem também foram detectadas como mutantes / mutantes misturados com base na presença de um pico de Tf duplo. Uma única amostra que continha uma mistura da mutação C1402T e do DNA de tipo selvagem também foi identificada pela presença de picos de Tf duplos da amostra com um Tf mutante específico para a mutação C1402T (Tabela 3, Fig. 2, painel A). As 32 amostras com mutações da região do promotor eis incluíram cinco polimorfismos diferentes (nas posições -8, -10, -12, -14 e -37). Todas essas mutações foram detectadas com sucesso por qualquer uma das SMBs - eis (Tabela 3, Fig. 2, painéis B e C). Quatro amostras que apresentaram mutações no gene rrs e na região do promotor eis também foram corretamente detectadas como mutantes duplos (Tabela 3). O sequenciamento do gene rrs não identificou amostras com uma mutação do códon 1484, independentemente do seu padrão de suscetibilidade ao fármaco.

[0091] Exemplo 3. Identificação da resistência a amicacina

[0092] Neste exemplo, foram realizados ensaios para avaliar o desempenho do ensaio molecular em relação aos resultados do teste de susceptibilidade fenotípica ao fármaco. O desempenho aparente de um teste de susceptibilidade genotípica pode variar dependendo das mutações selecionadas para inclusão no teste e do ensaio fenotípico que é usado como padrão-ouro (Kim, SJ 2005 Eur Respir J 25: 564-569; Rigouts, L., Et al., 2013, J Clin Microbiol 51: 2641-2645, e Van Deun, A., et al., 2013, J Clin Microbiol 51: 2633-2640). Considerando o método de teste de susceptibilidade ao fármaco baseado em LJ como o padrão-ouro (realizado para todas as 603 amostras de estudo), a característica da Tf da SMB- rrs da mutação A1401G, classificou 82/90 das amostras resistentes a AMK como resistentes (sensibilidade de 91,1%; IC 95%, 82,8% a 96,8%). A Tf de tipo selvagem classificou 512/513 das amostras sensíveis a AMK como susceptíveis. Um único isolado entre os 513 isolados sensíveis de AMK foi identificado como uma mistura de DNA de tipo selvagem e mutante C1402T pelo ensaio SMB aqui revelado devido à presença de um pico duplo claro gerado pela sonda SMB rrs, correspondente ao Tf de tipo selvagem e um Tf específico do mutante C1402T (Figura 2, painel A). Isso também foi confirmado pelo sequenciamento de Sanger. Uma vez que estudos anteriores mostraram que a mutação C1402T não codifica a resistência AMK (24), o Tf específico correspondente à mutação C1402T pode ser considerado como um indicador de susceptibilidade ao AMK. Esta consideração resultou no ensaio aqui descrito que detecta corretamente todas as amostras suscetíveis a AMK 513/513 resultando em uma especificidade de 100% (IC 95%, 99 a 100%). A inclusão dos valores de Tf característicos das mutações na região do promotor eis na análise não aumentou a sensibilidade para a detecção da resistência a AMK, mas diminuiu a especificidade de 100% para 93,8% (IC 95%, 91,2 a 95,6%). Esses resultados são consistentes com os relatórios anteriores que sugerem que as mutações do promotor eis não estão associadas à resistência a AMK, conforme definido pelo teste de susceptibilidade ao fármaco LJ (Campbell 2011 e Zaunbrecher 2009).

[0093] Exemplo 4. Identificação da resistência a canamicina

[0094] O desempenho de um ensaio para detectar a resistência a KAN também foi avaliado usando teste de susceptibilidade ao fármaco baseado em LJ como padrão-ouro para todas as 603 amostras. Usando os valores de Tf gerados pela SMB rrs aqui descritos típicos para a A1401G ou a mutação C1402T para definir resistência, o teste detectou 82/106 amostras como resistentes a KAN (sensibilidade 77,4%; IC 95% 68,0 a 84,7%). Por outro lado, utilizando uma Tf característica de SMB rrs para o alvo de tipo selvagem para definir susceptibilidade, identificou como suscetíveis 496/497 amostras suscetíveis a KAN (Tabela 4) (especificidade 99,8%; IC 95%, 98,7 a 100%). Adicionando valores de Tf características das duas SMBs eis para mutações na região do promotor eis para a definição de resistência, aumentou a sensibilidade para a detecção de resistência a KAN de 77,4% a 87,7% (IC 95%, 79,5 a 93%), como 11 amostras adicionais resistentes a KAN foram classificadas como resistentes. No entanto, a especificidade diminuiu de 99,8% para 95,6% (IC 95%, 93,3 a

97,1%), uma vez que 21 amostras suscetíveis a KAN, com mutações do promotor eis, agora foram "falsamente" detectadas como resistentes a KAN (Tabela 4).

[0095] Em seguida, uma análise semelhante foi realizada utilizando os resultados do teste de susceptibilidade ao fármaco baseado em MGIT como padrão-ouro para as 560 das amostras para as quais um resultado MGIT estava disponível. Este subconjunto incluiu todas as amostras que abrigam apenas mutações do promotor eis. A comparação dos resultados do ensaio com o padrão ouro baseado em MGIT ajudou a esclarecer os mutantes eis com resistência a KAN discordantes no meio LJ. Usando MGIT como padrão ouro e apenas os valores de Tf característicos de SMB rrs para mutações A1401G ou C1402T para definir a resistência a KAN, apenas 63/113 amostras resistentes a KAN foram identificadas como resistentes pelo ensaio SMB (sensibilidade 55,8%; IC 95%, 46,1 a 65%). Por outro lado, o uso da Tf característica de SMB rrs para o alvo de tipo selvagem para definir a suscetibilidade identificou amostras 445/447 como suscetíveis ao KAN (especificidade 99,8%; IC 95%, 98,5 a 100%; Tabela 4). Ao contrário do caso com testes de susceptibilidade baseados em LJ, incluindo os valores característicos de Tf para mutações do promotor eis nesse caso, o aumento da sensibilidade para testes de resistência de 55,8% a 82,3% com a especificidade do ensaio para a resistência a KAN ainda permanece muito alto a 99,5% (IC 95%, 98,2 a 100%). Assim, com base em um teste de susceptibilidade baseado em MGIT, o ensaio eis permitiu a detecção de 29 amostras resistentes a KAN adicionais sem afetar a especificidade (Tabela 4).

[0096] Exemplo 5. Relação entre Mutações Detectadas pelo Ensaio e Mic

[0097] A discordância entre a resistência como definida pelo ensaio aqui revelado e a resistência como definida por dois métodos de teste de susceptibilidade fenotípica aqui descritos envolvem principalmente isolados com mutações do promotor eis. Estudos anteriores mostraram que as mutações do promotor eis dão origem a níveis relativamente baixos de resistência a KAN, enquanto que as mutações do gene rrs resultam em resistência de alto nível a AMK, KAN e CAP (Campbell 2011; Du, Q., et al., 2013, Diagn Microbiol Infect Dis 77: 138-142; Georghiou 2012 e Zaunbrecher 2009). Uma descoberta adicional nos resultados foi a discordância entre os resultados do teste de susceptibilidade baseado em LJ versus MGIT. O teste de MIC foi realizado para explorar mais cuidadosamente a relação entre as mutações do promotor eis e rrs e seus padrões de susceptibilidade diferencial no LJ e no sistema MGIT.

[0098] Amostras que eram tanto suscetíveis a AMK e KAN (e tipo selvagem em ambas as regiões alvo) ou escolhidas para ser representativas dos tipos de mutação mais comuns nos dois genes alvo (rrs A1401G e eis G (-10) A, C (-14) T e G (-37) T) foram testadas pelo método MYCOTB para determinar o MIC. Os isolados adicionais conhecidos como sendo de tipo selvagem em ambos os alvos do ensaio também foram testados como controles. Observou-se que as MIC de AMK dos isolados que possuíam apenas mutações do promotor eis (sem mutações rrs) variaram entre 0,25 μg/ml e 2 μg/ml, sendo que a maioria das amostras apresentou MIC de 0,5 μg/ml a 1 μg/ml (Fig. 3). Apenas um mutante do promotor eis tinha uma MIC de AMK de 4 ug/ml. Os isolados de controle sem promotor eis ou mutações rrs apresentaram MICs entre 0,25 μg/ml e 0,5 μg/ml. Assim, as MIC de AMK dos isolados com sequências de promotores eis de tipo selvagem ou mutante se sobrepõem substancialmente. Em contraste, as MIC de KAN para a maioria dos mesmos mutantes do promotor eis variaram de 5 μg/ml a 20 μg/ml, com um isolado mostrando uma MIC de 40 μg/ml (Fig. 3). Apenas dois mutantes do promotor eis apresentaram MIC abaixo de 2,5 μg/ml. Os isolados com sequências do promotor eis de tipo selvagem mostraram MICs entre 0,6 μg/ml a 2,5 μg/ml, o que é 2 a 30 vezes menor do que a MIC média dos mutantes do promotor eis (Fig. 3). Assim, em contraste com a situação com a AMK, as MICs de KAN dos isolados de tipo selvagem se sobrepunham muito pouco com as MICs de KAN dos mutantes do promotor eis. Estes resultados sugerem fortemente que os mutantes do promotor eis devem ser considerados de baixa ou moderada resistência a KAN, mesmo que a resistência não seja detectada em testes de susceptibilidade baseados em LJ ou mesmo com base em MGIT.

[0099] Exemplo 6. Especificidade de ensaio contra bactérias diferentes de M. Tb.

[00100] A especificidade analítica do ensaio foi testada contra um painel de 18 espécies de micobactérias não tuberculosas (NTM) obtidas do repositório ATCC (Manassas, Virgínia, EUA), 121 cepas clínicas de NTM que representam 26 espécies e 18 espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A região rrs alvo no ensaio aqui é altamente conservada entre diferentes espécies de NTM. Assim, o ensaio rrs gerou uma Tf de 70 °C (que é idêntica a Tf gerada na presença de DNA de M. tb de tipo selvagem) para todas as NTM testadas como esperado com base na homologia de sequência esperada para M. xenopi, que não gerou qualquer Tf. Não se espera que as espécies NTM que geraram valores de Tf idênticos às sensíveis ao aminoglicosídeos M. tb causem um resultado de teste de falsa resistência. Quando o DNA de M. tb de variedades mutantes de rrs resistentes a AMK e KAN foi misturado com

10 a 20 vezes o excesso de DNA de NTM, um pico de Tf duplo distinto foi produzido pelo ensaio, correspondendo um valor de Tf mutante do alvo de M. tb e um valor de Tf de tipo selvagem a partir da sequência NTM (dados não mostrados) indicando que as mutações rrs associadas à resistência podem ser detectadas em M.tb pelo ensaio aqui mesmo na presença de uma grande variedade de DNA de NTM. Nenhuma curva de fusão visível foi gerada pelas sondas eis na presença de qualquer espécie de NTMs testada mesmo quando 107 equivalentes de DNA do genoma foram adicionados ao ensaio de PCR. Nenhuma das bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas produziu valores de Tf para qualquer uma das SMBs rrs ou eis; assim, eles não causaram nenhuma chamada de resistência falsa a ser feita pelo ensaio.

[00101] Exemplo 7. Causas Genéticas Adicionais de Resistência a AMK e KAN

[00102] O estudo neste exemplo incluiu 22 amostras que eram resistentes a AMK e/ou KAN, mas possuíam sequências promotoras do gene eis de tipo selvagem. Pesquisas recentes sugeriram que mutações na região 5 'não traduzida (UTR) do gene whiB7 podem causar resistência a aminoglicosídeos em M. tb. (27). Para determinar se as mutações de WhiB7 poderiam ser responsáveis por alguns dos isolados fenotipicamente resistentes, porém susceptíveis ao ensaio, todas as 22 amostras foram sequenciadas em uma região de 412 pb a montante do local de início do gene whiB7 mais uma porção do quadro de leitura aberto whiB7. Como um conjunto de controle, 30 isolados não-susceptíveis colhidos aleatoriamente também foram sequenciados. Dos 22 isolados discordantes, seis isolados de três pacientes apresentaram mutações na região 5'UTR de whi57. Uma amostra teve uma deleção de citosina na posição +138 no 5'UTR, duas amostras de um paciente continham uma mutação A a G na posição +237 e as três amostras restantes de um único paciente apresentavam mutação A a C na posição +273 (Tabela 5) considerando o local de início da transcrição como +1 (Reeves, AZ, 2013, 57: 1857-1865). Três amostras de um único paciente não conseguiram gerar qualquer amplificação do 5'UTR após tentativas de PCR repetidas, apesar de ter controles de PCR positivos. Isso sugeriu a presença de uma grande deleção na região 5'UTR, uma vez que um fragmento de 275 pb poderia ser facilmente amplificado a partir do ORF whiB7 para todas as três amostras. Todas as amostras com mutações de whiB7 foram resistentes apenas a KAN, o que é consistente com o mecanismo de ação presumido pela regulação positiva do gene eis (Reeves 2013). As MIC de KAN para estes isolados também foram abaixo de 5 μg/ml, o que é semelhante ao observado para os mutantes do promotor eis. Nenhuma das 30 amostras de controle que eram suscetíveis a aminoglicosídeos apresentou mutações no 5'UTR do gene whiB7. Estudos adicionais são necessários para confirmar a relação dessas mutações e a deleção no 5'UTR do gene whiB7 com resistência a aminoglicosídeos. No entanto, a ausência de tais mutações nas cepas susceptíveis implica que eles possam ter algum papel a desempenhar na resistência a aminoglicosídeos e futuros ensaios poderiam direcionar essas mutações para melhorar a sensibilidade para detectar a baixa resistência de KAN.

[00103] Tabela 3: Valores de temperatura de fusão (Tf) das sondas rrs e eis testadas contra DNA clínico com sequências de tipo selvagem e mutantes DP (°C) p/ dTf (°C) p/ No. De Tf média (°C) sonda no: sonda no. isolados detectados rrs-1400 eis1 eis2 1 2 3 1 2 3 / No. Total de isolados com o tipo mutante Sem mutação (NM) 70.10 63.90 69.00 0.15 0.19 0.23 487/487 - A1401G 66.20 63.90 69.10 0.10 0.20 0.20 3.90 0.00 75/75

0.10

66.20 - - - A1401G + NM 64.00 69.10 0.18 0.10 0.10 3.90 3/4

70.10 0.10 0.10 Gene rss

64.50 - - - C1402T + NM 64.10 69.20 0.00 0.00 0.00 5.60 1/1

70.10 0.20 0.20 - C(-8) deletion 70.10 64.10 63.10 0.00 0.00 0.00 0.00 5.90 1/1

0.20 - G(-10)A 70.20 63.80 64.70 0.10 0.20 0.20 0.10 4.30 14/14

0.10

64.80 - - G(-10)A + NM 70.20 63.80 0.10 0.20 0.20 0.10 4.20 1/1

69.10 0.10 - - C(-12)T 70.15 64.04 62.92 0.08 0.22 0.03 6.08 2/2

0.05 0.13 Promotor eis - C(-14)T 70.10 64.00 62.60 0.10 0.20 0.20 0.00 6.40 10/10

0.10 - - G(-37)T 70.20 58.80 69.10 0.10 0.10 0.20 5.10 4/4

0.10 0.10 gene rss promotor rrs-A1401G + eis -

66.30 64.10 62.50 0.12 0.14 0.17 3.80 6.50 4/4 + C(-14)T 0.20 eis

[00104] DP representa o desvio padrão +/- dos valores de Tf para cada uma das sondas para as diferentes amostras clínicas e dTf representa a diferença de Tf das sequências mutantes das sequências de tipo selvagem para cada sonda.

[00105] DP; Desvio padrão, dTf; Delta Tf

[00106] As sondas nos. 1, 2 e 3 correspondem às sondas rrs-1400, eis-1 e eis-2, respectivamente.

[00107] Tabela 4: Susceptibilidade das cepas clínicas para AMK e KAN pelos métodos LJ e MGIT e sua relação com as mutações presentes no gene rrs e na região do promotor eis rrs Tipo selvagem rrs Mutações do Número total do gene rss e A1401G C1402T promotor eis de isolados do promotor eis AMK-Resistente (LJ) 82 0 1 7 90 AMK-Suscetível (LJ) 0 1 31 481 513 KAN-Resistente (LJ) 82 0 11 13 106 KAN-Suscetível (LJ) 0 1 21 475 497 KAN-Resistente 63 0 30 20 113 (MGIT) KAN-Suscetível 1 0 1 445 (MGIT)

[00108] LJ e MGIT implicam testes de susceptibilidade pelas proporções LJ e os métodos MGIT, respectivamente.

[00109] Tabela 5: Susceptibilidade das cepas clínicas para AMK e KAN e mutações na região 5' não traduzida do gene whiB7 Isolado Paciente # # AMK (LJ) KAN (LJ) KAN (MGIT) 5' UTR de whiB7 #1 1 S S R NM #2 2 S S R NM #3 3 S S R NM #4 3 S S R NM #5 4 S R R NM #6 5 S R R +273-A-> C #7 5 S R ND +273-A-> C

Isolado Paciente # # AMK (LJ) KAN (LJ) KAN (MGIT) 5' UTR de whiB7 #8 5 S R R +273-A-> C #9 6 R R R NM #10 6 S S R NM #11 6 R R ND NM #12 7 S S R Deleção de +138-C #13 8 S S R NM Provável deleção em 9 S R #14 S UTR Provável deleção em 9 S R #15 S UTR Provável deleção em 9 S R #16 S UTR #17 10 R R R NM #18 11 S S R NM #19 12 R R S NM #20 13 S R R +237-A->G #21 13 S R R +237-A->G #22 14 R R R NM

[00110] LJ e MGIT implicam testes de susceptibilidade pelas proporções LJ e os métodos MGIT, respectivamente.

[00111] ND; não determinado, NM; sem mutação, R; resistente S; suscetível.

[00112] Os exemplos anteriores e a descrição das formas de realização preferidas devem ser tomados como ilustrando, em vez de limitar a presente invenção tal como definido pelas reivindicações. Como será facilmente apreciado, podem ser utilizadas inúmeras variações e combinações das características acima descritas sem se afastar da presente invenção, conforme estabelecido nas reivindicações. Tais variações não são consideradas como uma saída do âmbito da invenção, e todas essas variações são destinadas a serem incluídas no âmbito das reivindicações seguintes.

Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Conjunto de oligonucleotídeo para amplificação de uma porção de uma região de M. tuberculosis selecionada de um grupo consistindo de gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB, gene katG, gene dosR, gene IS6110, gene IS1081, caracterizado por compreender um par de primers de avanço e recuo specífico para a referida porção, em que cada primer possui uma sequência que é substancialmente idêntica à sequência de oligonucleotídeos selecionada daqueles listados nas Tabelas 1A e 1B.

2. Conjunto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência ser idêntica à sequência de oligonucleotídeo selecionado a partir daqueles listados nas Tabelas 1A e 1B.

3. Ácido nucleico isolado caracterizado por compreender uma sequência que é substancialmente idêntica a uma selecionada daqueles listados na Tabela

2.

4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender a sequência selecionada daquelas listadas na Tabela 2.

5. Ácido nucleico, de acordo com as reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo ácido nucleico ser marcado.

6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo ácido nucleico ser marcado com um fluoróforo e um arrefecedor em suas duas extremidades, respectivamente.

7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fluoróforo é fluorescein, cianina 5 ou TexasRed ou TAMRA.

8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caraceterizado pelo arrefecedor ser BHQ1, BHQ2 ou DABCYL.

9. Kit caracterizado por compreender um conjunto de oligonucleotídeos ou ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-8.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender uma DNA polimerase, nucleotídeos de extensão e um tampão.

11. Método, de acordo para detecção de resistência a droga em M.tuberculosis, caracterizado por compreender amplificar, o primeiro par primer sendo específico para uma porção de uma região selecionada do grupo que consiste de gene embB, gene katG e cada primer possui uma sequência que é substancialmente idêntica a uma sequência de oligonucleotídeos selecionada daquelas listadas nas Tabelas 1A e 1B.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por etapa detecção é conduzida por sequenciamento.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela etapa de detecção ser realizada por um processo que compreende: • Contactar o primeiro amplicon com uma primeira sonda específica para a referida maturação sob condições condutivas para uma hibridização para formar um híbrido sonda-alvo; • Conduzir uma análise de temperatura de fusão (Tm) para determinar um valor de Tm teste para o referido híbrido sonda-alvo; e • Comparar o valor Tm teste com um valor Tm de referência em que o valor Tm teste, se diferente do valor Tm predeterminado, é indicativo da presença da mutação.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado o valor Tm teste se inferior ao valor Tm de refência predeterminado, é indicativo da presença de mutação.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-14, caracterizado por compreender amplificar uma segunda sequência de ácido nucleico alvo com um segundo par primer para gerar um segundo amplicon, o segundo par primer sendo específico para uma porção de uma segunda região selecionada a partir de um grupo que consiste de gene rpoB, gene gyrA, gene gyrB, promotor inhA, gene rrs, promotor eis, gene embB, gee katG.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela primeira região ser o gene rrs ou o promotor eis.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela primeira região é o gene rrs.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela segunda região ser o promotor eis.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela mutação ser A1401G ou C1402T no gene rrs.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, onde a mutação está dentro da região do promotor eis acionado pelas sequências do primer eis.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-20, caracterizado pela resistência é para uma droga selecionada a partir de um grupo grupo que consiste de isoniazid, rifampicin, a classe de drogas da fluoroquinolona, amikacin, kanamicin, capreomicin e etambutol.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-21 caracterizado pelo par primer é um selecionado daqueles listados nas Tabelas 1A e 1B.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-22, caracterizado pela sonda compreende uma sequência que é substancialmente idêntico para ou completamente identico a um selecionado a partir daqueles listados na Tabela 2.

24. Método para detecção da presença de M. tuberculosis em uma amostra teste caracterizado por compreender: • Contactar a amostra teste com um primeiro par primer sob condições condutiva em uma reação de amplificação para render um primeiro amplicom, e • Detectar a presença do amplicon e dessa forma detectar a presença de M. tuberculosis na referida amostra, • Em que o primeiro par primer é um conjunto oligonucleotídeo para amplificar uma porção de uma região de M. tuberculosis selecionado do grupo que consiste de gene gyrB, promotor inhA, promotor eis, gene embB, gene katG, gene dosR, gene IS6110, gene IS1081 e em que cada primer do primeiro par primer possui uma sequência que é substancialmente idêntica em uma sequência de oligonucleotídeo selecionada daquelas listadas na Tabela 1B.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo par primer é um selecionad a partir daqueles listados na Tabela 1B.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25, caracterizado por compreender: • Contactar a amostra teste com um segundo par primer sob condições conditva para uma reação de amplificação para render um segundo amplicon, e

• Detectar a presença do segundo amplicon, • Em que a presença de ambos os primeiro amplicon e segundo amplicon indica a presença de M. tubeculosis na amostra teste.

27. Método para detectar a presença de M.tuberculosis em uma amosta teste caracterizado por compreender: • Contactar a amostra teste com uma primeira sonda sinalizadora sob condições condutivas para uma reação de hibridização para render um híbrido sonda-alvo, e • Detectar a presneça do híbrido sonda-alvo e dessa forma detectar a presença de M. tuberculosis na amostra teste, • Em que a primeira sonda molecular compreende uma sequência que é substancialmente idêntica àquela selecionada de um grupo que consiste daqueles listados na Tabela 2.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela primeira sonda molecular ser selecionado do grupo que consiste de SEQ ID No 67-69