KR101962831B1 - 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 및 비결핵항산균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 퀴놀론계, 아미노글라이코사이드계 항생제항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 - Google Patents

퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 및 비결핵항산균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 퀴놀론계, 아미노글라이코사이드계 항생제항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵 및 비결핵 항산균의 검출과 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 에탄부톨, 퀴놀론, 아미노글라이코사이드계 약제의 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트에 관한 것이다.본 발명은 검체로부터 약제내성검사를 위한 분리배양에 걸리는 시간을 단축시키고, 다수의 검체를 대상으로 한 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 효율적인 약제감수성검사가 가능하며, 이는 결핵환자의 치료에 있어 올바르고 빠른 항결핵제 선택을 할 수 있도록 하여 조기 치료와 감염확산을 방지함에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 비결핵 항산균에 의한 오염이나 혼합감염에 의해 발생할 수 있는 오진 및 잘못된 처방을 예방할 수 있다.

Description

퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 및 비결핵항산균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 퀴놀론계, 아미노글라이코사이드계 항생제항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트{A method for simultaneously detecting Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria and resistance for rifampicin, isoniazid, ethambutol, quinolone and aminoglycoside of Mycobacterium tuberculosis, and a kit therefor based QuantaMatrix assay Platform}
본 발명은 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 동정 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 아미노글라이코사이드계 항생제, 퀴놀론계 항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트에 관한 것이다.
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)이 원인이 되어 발생하는 만성 감염성 질환이고 우리나라에서 결핵의 유병률은 지속적으로 감소하는 추세이나 외국에 비해 높은 편이다. 또한, 효과적인 항결핵제가 사용되어 왔음에도 불구하고 다제내성 결핵 및 광범위내성 결핵 등 난치성 결핵이 증가함에 따라 아직도 세계적으로 결핵환자가 매년 800만 명이 발병하고 결핵으로 인해서 200만 명이 사망하고 있다. 따라서 치료가 어려운 난치성 결핵균의 내성 여부를 신속하게 판별하는 것이 환자의 효과적인 치료와 생존에 필수적이다.[Wright PW, Wallace RJ Jr, Wright NW, Brown BA, Griffith DE. J Clin Microbiol 1998;36:1046-9;Marras TK and Daley CL. Clin Chest Med 2002;23:553-67;Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. This official statement of the American Thoracic Society. Management of opportunist mycobacterial infections: Joint Tuberculosis Committee Guidelines 1999. Thorax 2000;5 5:210-8].
결핵치료에 있어 1차 치료약제로는 리팜핀(rifampin, RIF), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA)의 복합제재가 사용되며, 이중 리팜핀, 아이소니아지드 두가지 약제 이상에 내성을 갖는 경우, 다제내성(Multidrug resistant, MDR) 결핵으로 정의하고 있다.
1차 약제로 치료에 실패할 경우 사용되는 대표적인 2차 약제로는 퀴놀론계(fluoroquinolones, FQ)약제와 아미노글라이코사이드계(aminoglycoside) 약제 등이 있으며 리팜핀, 아이소니아지드 내성에 한가지 이상의 퀴놀론계 약제내성과 한가지 이상의 아미노글라이코사이드계 약제에 내성을 갖는 경우를 광범위 약제내성(extensively drug resistant, XDR)결핵으로 정의하고 있다[World Health Organization (2008) Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planing, Financing: WHO report 2006. Geneva, Switzerland. ].
2016년 WHO 보고에 따르면 결핵 신환자의 3.9%인 580,000명에서 다제내성결핵이 확인되었다. 또한 다제내성결핵 환자의 9%가 광범위내성 결핵으로 보고되었다[WHO. Global TB report 2016.].
리팜핀은 RNA 중합효소의 베타 소단위체에 결합하여 전사를 방해하는 역할을 한다. 리팜핀에 내성을 갖는 결핵균의 95% 이상은 리팜핀 내성 결정 부위라고 알려진 rpoB 유전자의 81 염기쌍 부위에 돌연변이가 일어나있다[Ramaswamy S, Musser JM. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis. 1998;79:3-29.].
리팜핀과 함께 일차치료약제로 사용되는 아이소니아자이드에 대한 결핵균의 내성은 더 복잡하고 다양한 유전자들의 돌연변이로 인해 발생한다. 가장 돌연변이가 빈번하게 일어나는 대표적인 유전자는 katG와 inhA 이다 [Laurenzo D, Mousa SA. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis and current status of rapid molecular diagnostic testing. Acta Trop. 2011; 119: 5-10.; Rossetti ML, Valim AR, Silva MS, Rodrigues VS. [Resistant tuberculosis: a molecular review]. Rev Saude Publica. 2002; 36: 525-532.]. 전세계적으로 아이소니아지드 내성 결핵균의 64%에서 katG 유전자 315 부위에 돌연변이가 발생하였으며, 19%에서 inhA 유전자 -15 부위에 돌연변이가 발생하였다[Seifert M, Catanzaro D, Catanzaro A, Rodwell TC. Genetic Mutations Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis: A Systematic Review. Mokrousov I, ed. PLoS ONE. 2015;10(3): e0119628. doi: 10.1371/journal.pone.0119628.].
embB 유전자의 306코돈에 돌연변이는 에탐부톨 약제내성균과 더불어 감수성인 균에서도 306코돈 돌연변이가 확인되고 있어 유전자의 돌연변이가 꼭 내성이라 할 수는 없으나, 약제내성균에서의 돌연변이 비율이 높아 에탐부톨 내성의 잠재적인 지표라 할 수 있으며 최근에는 다제내성결핵균에서 embB 306코돈 돌연변이의 비율이 점차 높아지는 것으로 보고되고 있다[Guerrero E, Lemus D, Yzquierdo S, Vilchez G, Munoz M, Montoro E, Takiff H. 2013. Association between embB mutations and ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from Cuba and the Dominican Republic: reproducible patterns and problems. Rev Argent Microbiol. 45:21-26.].
결핵치료의 2차 약제로는 대표적으로 퀴놀론계 항생제가 사용된다. 퀴놀론계 항생제의 표적 부위는 결핵균의 DNA gyrase 로, DNA gyrase 를 구성하는 소단위체 A, B 를 암호화하고 있는 유전자인 gyrA, gyrB 의 퀴놀론 내성 결정 부위에 돌연변이가 발생하게 되면 퀴놀론계 항생제에 대한 내성을 갖게 된다[Maruri F, Sterling TR, Kaiga AW, Blackman A, van der Heijden YF, Mayer C, Cambau E, Aubry A J Antimicrob Chemother. 2012 Apr; 67(4):819-31.; Pantel A, Petrella S, Veziris N, Brossier F, Bastian S, Jarlier V, Mayer C, Aubry A Antimicrob Agents Chemother. 2012 Apr; 56(4):1990-6.].
퀴놀론계 항생제 내성을 보이는 결핵균의 50-90%는 gyrA 유전자에 돌연변이가 발생하였다고 보고되었으며[Xu P, Li X, Zhao M, Gui X, DeRiemer K, Gagneux S, Mei J, Gao Q Antimicrob Agents Chemother. 2009 Jul; 53(7):3170-2.; Roetzer A, Diel R, Kohl TA, Ruckert C, Nuubel U, Blom J, Wirth T, Jaenicke S, Schuback S, Rusch-Gerdes S, Supply P, Kalinowski J, Niemann S PLoS Med. 2013; 10(2):e1001387.; Huang TS, Kunin CM, Shin-Jung Lee S, Chen YS, Tu HZ, Liu YC J Antimicrob Chemother. 2005 Dec; 56(6):1058-62.], gyrA의 퀴놀론 내성 결정부위(QRDR; Quinolone resistance-determining region)에 돌연변이 발생 시, 퀴놀론 약제에 대한 내성으로 보이는 것으로 보고되었다. 이중 가장 돌연변이 발생빈도가 높은부위는 아미노산 94번으로 알려져 있으며, 그 외 88, 89, 90, 91에서 의 돌연변이가 보고되어 있다[Yin X, Yu Z. 2010. Mutation characterization of gyrA and gyrB genes in levofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Guangdong Province in China. J Infect 61:150-154.; Ginsburg AS, Woolwine SC, Hooper N, BenjaminWHJr, Bishai WR, Dorman SE, Sterling TR. 2003. The rapid development of fluoroquinolone resistance in M. tuberculosis. N Engl J Med 349:1977-1978.].
gyrB 유전자에 돌연변이 또한 퀴놀론계 항생제에 내성을 보이는 결핵균에서 발견되고 있으며, 주로 코돈 500과 538부위에 돌연변이가 발생한다[Maruri F, Sterling TR, Kaiga AW, Blackman A, van der Heijden YF, Mayer C, Cambau E, Aubry A J Antimicrob Chemother. 2012 Apr; 67(4):819-31.].
2차 치료약제인 아미노글라이코사이드계 항생제는 다제내성결핵을 치료하는데 효과적이며 광범위내성 결핵을 예방하는데 있어 중요하다. 하지만 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 내성을 갖는 결핵균들이 출몰하고 있다. 아미노글라이코사이드계 항생제에 내성을 갖는 결핵균에서 rrs 유전자 내 1401, 1402, 1484번 염기에 돌연변이가 발생하며, 최근에는 eis promoter 에 돌연변이가 발생하는 것으로 보고되었다[Kiet VS, Lan NT, An DD, Dung NH, Hoa DV, et al. (2010) Evaluation of the MTBDRsl test for detection of second-line-drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 48: 2934-2939.; Brossier F, Veziris N, Aubry A, Jarlier V, Sougakoff W (2010) Detection by GenoType MTBDRsl test of complex mechanisms of resistance to second-line drugs and ethambutol in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol 48: 1683-1689.; Feuerriegel S, Cox HS, Zarkua N, Karimovich HA, Braker K, et al. (2009) Sequence analyses of just four genes to detect extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in multidrug-resistant tuberculosis patients undergoing treatment. Antimicrob Agents Chemother 53: 3353-3356.; Zaunbrecher MA, Sikes RD, Metchock B, Shinnick TM, Posey JE (2009) Overexpression of the chromosomally encoded aminoglycoside acetyltransferase eis confers kanamycin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 20004-20009.]
가장 많이 보고 되는 rrs A1401G 변이는 아미노글라이코사이드계 항생제 내성 결핵균 중 30-90%를 차지하고 있고 알려져 있다[Angkanang Sowajassatakul,1 Therdsak Prammananan,2,4 Angkana Chaiprasert,3,4 and Saranya Phunpruch, BMC Microbiol. 2014; 14: 165.].
India, Moldova, South Africa 1,128명 결핵 환자로부터 분리한 아미노글라이코사이드계 항생제 내성 결핵균의 eis promoter 돌연변이별 발생율은 eis -12C/T mutation인 경우가 26.2%, eis -10G/A mutation은 3.5%, eis -14C/T mutation은 2.1%, eis -37G/T mutation은 2.1%로 나타났다[S. B. Georghiou, M. Selfert, D. Catanzaro, R. S. Garfein, F. Valafar, V. Crudu, C. Rodrigues, T. C. Victor, A. Catanzaro, T. C. Rodwell, Frequency and Distribution of Tuberculosis Resistance-Associated Mutations between Mumbai, Moldova, and Eastern Cape, 2016, American Society for Microbiology, 60, 3994-4004.].
아미노글라이코사이드계 항생제 중 스트렙토마이신(Streptomycin, SM)의 경우, rrs 유전자의 530 loop 부위와 rpsL 유전자의 43, 88 codon에 돌연변이 발생 시에 높은 SM 내성을 갖으며, SM 내성균의 약 50%에서 돌연변이가 있는 것으로 알려져 있다[Johansen, S. K., C. E. Maus, B. B. Plikaytis, and S. Douthwaite (2006) Capreomycin binds across the ribosomal subunit interface using tlyA-encoded 2'-O-methylations in 16S and 23S rRNAs. Mol. Cell. 23, 173-182.]
현재 표준방법으로 사용되고 있는 결핵균 약제 감수성 검사는 배양을 기반으로 한 방법이다. 배양 방법 중 고체배지를 기반으로 하는 약제 감수성 검사는 최소 4주에서 최대 8주까지의 시간이 걸리는 단점이 있어, 최근에는 검사시간을 감축하기 위해 액체배지를 이용한 약제 감수성 검사법이 시도되고 있다. 하지만 액체배지 약제 감수성 검사법은 시행하는데 있어 검사실 별로 제약이 있으며, 2차 약제에 대한 검사결과의 신뢰도가 낮다는 한계가 있다[Kang YA. J Korean Med Assoc 2014; 57(1): 27-33. Diagnosis and treatment of multidrug-resistant tuberculosis]
내성결핵균에 의한 치료지연은 내성결핵균의 지역 감염확산으로 이어지므로, 초기 결핵진단 시 결핵균의 내성 여부를 판단하는 것은 매우 중요하며, 이에 최근에는 분자생물학적 검사방법에 기반한 약제감수성 검사의 개발되고 사용이 증가하고 있다. [Chakravorty S and Tyagi JS. Novel multipurpose methodology for detection of Mycobacteria in puilmonary and extrapulmonary specimens by smear microscopy, culture, and PCR. J Clin Microbiol 2005;43:2697-702;Kim YJ, Park MY, Kim SY, Cho SA, Hwang SH, Kim HH, et al. Korean J Lab Med 2008;28:34-8]. 반면, 현재 알려져 있는 항결핵약제별 내성유발 유전자의 종류 및 돌연변이의 수가 다양해 기존의 PCR, Line probe assay, real-time PCR 등의 방법으로는 한번에 검사를 진행하기가 용이하지 않다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020130095454호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 결핵 및 비결핵 항산균의 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아소니아지드, 퀴놀론 약제, 아미노글리코시드계 약제의 내성여부를 확인할 수 있는 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 결핵 및 비결핵 항산균의 검출과 결핵균의 리팜핀, 아소니아지드, 퀴놀론 약제, 아미노글리코시드계 약제의 내성여부를 확인할 수 있는 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머를 사용하여, 상기 DNA로부터 PCR 증폭하는 단계;및 b) 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브가 커플링된 디스크와 상기 단계 a)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 단계를 포함하는 결핵균 및 비결핵 항산균 검출 및 결핵균의 항생제 약제의 내성 여부를 동시에 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 b) 단계 후 추가적으로 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 소프트웨어를 통하여 상기 디스크의 이미지를 측정하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 결핵균 및 비결핵 항산균 검출 및 항결핵약제의 내성여부를 동시에 검출하기 위해 타겟 유전자들을 다중 PCR(multiplex PCR)로 증폭시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 항생제는 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 및 아미노글라이코사이드계인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 바이오틴이 표지된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머 및 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브가 커플링된 디스크를 포함하는 결핵균 및 비결핵 항산균 검출과 동정 및, 결핵균의 항생제의 내성 여부를 동시에 확인하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항생제는 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 및 아미노글라이코사이드계인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로, DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머를 포함하는 리팜핀 내성결핵균, 아이소니아지드 내성 결핵균, 에탐부톨 내성 결핵균, 퀴놀론계 약제 내성 결핵균, 아미노글라이코사이드계 내성결핵균과 감수성 결핵균 및 결핵균과 비결핵 항산균의 구분을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 결핵균 특이, 비결핵 항산균 검출부위를 포함하는 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 3 및 서열번호 3로 구성된 리팜핀 내성관련 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 5 및 서열번호 6로 구성된 아이소니아지드 내성관련 katG 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 아이소니아지드 내성관련 inhA 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 9 및 서열번호 10로 구성된 에탐부톨 내성관련 embB 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 퀴놀론계 약제 내성관련 gyrA 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 퀴놀론계 약제 내성관련 gyrB 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 15 및 서열번호 16로 구성된 아미노글라이코사이드계 약제 내성관련 rrs 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 아미노글라이코사이드계 약제 내성관련 rrs 유전자 증폭 프라이머 세트;서열번호 19 및 서열번호 20로 구성된 아미노글라이코사이드계 약제 내성관련 rpsL 유전자 증폭 프라이머 세트; 및 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 아미노글라이코사이드계 약제 내성관련 eis 유전자 증폭 프라이머 세트로 이루어진 프라이머 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 바이오틴이 표지된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브로 이루어진 리팜핀 내성결핵균, 아이소니아지드 내성 결핵균, 에탐부톨 내성 결핵균, 퀴놀론계 약제 내성 결핵균, 아미노글라이코사이드계 내성결핵균과 감수성 결핵균 및 결핵균과 비결핵 항산균의 구분을 위한 프로브 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 QuantaMatrix assay Platform (QMAP) 기반 분자진단검사법을 개발하였다. QMAP은 퀀타매트릭스사의 원천기술 (특허 등록번호 1011013100000 (2011.12.26) / 1015823840000 (2015.12.28) 로 suspension array technology를 기반으로 하고 있으며 50μm 크기의 자성을 띠고 있는 디스크 (Microdisk)에 프로브를 결합시키고 PCR산물과 반응시킨 후, 돌연변이를 여부를 형광으로 확인할 수 있는 검사법으로 QMAP의 가장 큰 특징은 디스크에 고유의 코드를 새겨 이 코드로 간섭현상 없이 디스크를 구별하며 기술적으로 1024개의 코드가 가능하므로 각각 고유의 코드가 새겨진 1024종의 디스크를 이용한 다중검사가 가능하며 모든 과정이 96 well plate에서 진행되기 때문에 high throughput이 가능한 시스템이다 (도 1).
본 발명에서는 국내에서 개발된 QMAP기반 assay를 이용하여 약제내성결과가 있는 임상분리결핵균의 DNA 를 대상으로 유용성을 평가해 보았다.
본 발명의 QMAP 기반 항결핵약제 내성 진단키트는 종특이 다형성이 존재하는 rpoB 유전자 부위 (특허 등록번호 10-1377070 (2014.03.12)와 리팜핌 내성관련 부위를 증폭하는 biotin group이 부착된 프라이머 및 아이소니아지드, 에탄부톨, 퀴놀론계 항생제, 아미노글라이코사이드계 항생제(카나마이신, 스트렙토마이신 등)의 내성관련 유전자인 katG, inhA, embB, gyrA, gyrB, rrs, rpsL, eis 유전자를 증폭하는 biotin group이 부착된 프라이머를 포함하여 다중PCR(multiplex PCR)을 수행한다.
증폭하고 얻어진 PCR산물을 결핵균 및 비결핵항산균 특이 프로브 및 각 유전자별로 돌연변이유무를 확인할 수 있는 특이 probe가 부착 되어있는 microdisk과 반응시키고 결합여부에 따라 발현되는 형광시그널의 측정값과 probe별로 지정된 microdisk의 이미지를 구분함으로써 결핵균 및 비결핵 항산균의 검출과 동시에 항결핵제 약제에 대한 내성여부를 알 수 있는 분자진단 검사법으로 구성되었다.
자동화가 가능하여 96테스트를 진행 시 PCR 진행 (1시간 40분), TB/NTM 검출과 항결핵제약제 내성여부 (1시간 30분) 총 3시간이면 확인이 가능한 부분이 큰 장점이다.
본 발명에서 사용된 유전자 정보는 하기와 같다.
katG : gene complement(2153889..2156111)
/gene="katG"
/locus_tag="Rv1908c"
/product="Catalase-peroxidase-peroxynitritase T KatG"
inhA : NADH-dependent enoyl-acyl-carrier-protein gene 1674202..1675011
/gene="inhA"
/locus_tag="Rv1484"
/product="NADH-dependent enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase InhA (NADH-dependent enoyl-ACP reductase)"
embB : gene 4246514..4249810
/gene="embB"
/locus_tag="Rv3795"
/product="Integral membrane indolylacetylinositol arabinosyltransferase EmbB
gyrA : gene 7302..9818
/gene="gyrA"
/locus_tag="Rv0006"
/product="DNA gyrase (subunit A) GyrA (DNA topoisomerase (ATP-hydrolysing)) (DNA topoisomerase II) (type II DNA topoisomerase)"
gyrB : gene 5240..7267
/gene="gyrB"
/locus_tag="Rv0005"
/product="DNA gyrase (subunit B) GyrB (DNA topoisomerase (ATP-hydrolysing)) (DNA topoisomerase II) (type II DNA topoisomerase)"
embB:gene 4246514..4249810
/gene="embB"
/locus_tag="Rv3795"
/product="Integral membrane indolylacetylinositol arabinosyltransferase EmbB
eis: gene complement(2714124..2715332)
/gene="eis"
/locus_tag="Rv2416c"
/product="Enhanced intracellular survival protein Eis,GCN5-related N-acetyltransferase"
rrs : gene 1471846..1473382
/gene="rrs" rRNA 1471846..1473382
/gene="rrs"
/product="Ribosomal RNA 16S"
/note="rrs, 16s rRNA gene (alternate gene name: rrnS)."
rpsL : gene 781560..781934
/gene="rpsL"
/locus_tag="Rv0682"
/product="30S ribosomal protein S12 RpsL"
본 발명에서는 한번의 assay과정을 통해 결핵균 및 비결핵 항산균의 구별 및 혼재여부의 판독과, 현재까지 알려진 결핵균의 주요 1,2차 항결핵제 내성 관련 유전자의 돌연변이 유무를 판독하여 제공한다.
이에따라 검체로부터 약제내성검사를 위한 분리배양에 걸리는 시간을 단축시키고, 다수의 검체를 대상으로 한 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 효율적인 약제감수성검사가 가능하다. 이는 결핵환자의 치료에 있어 올바르고 빠른 항결핵제 선택을 할 수 있도록 하여 조기 치료와 감염확산을 방지함에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 비결핵 항산균에 의한 오염이나 혼합감염에 의해 발생할 수 있는 오진 및 잘못된 처방을 예방할 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 QMAP 시스템에 대한 그림,
도 2는 다중PCR(multiplex PCR)의 실시예
도 3은 1차 결핵약제의 QMAP 내성 분석결과의 실시예
도 4는 2차 결핵약제의 QMAP 내성 분석결과의 실시예
이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에 사용된 검체는 국제결핵연구센터(ITRC)에서 보관 중인 임상분리 결핵균으로부터 분리된 genomic DNA를 대상으로 실시되었으며, 상기 결핵균의 항결핵제 감수성검사와 기존에 제공되고 있던 line probe assay 방법(Hain lifescience Inc., GenoType MTBDRplus, MTBDRsl )에 의한 내성관련 유전자의 검사결과는 ITRC에서 제공되었다.
본 발명의 프로브 유용성을 확인하기 위하여 상기 검체에서 발견되지 않은 돌연변이형의 경우, 본 발명의 프라이머 부위를 포함하는 크기의 합성DNA를 제작하여 이를 PCR주형으로 사용하였다.
본 발명의 프로브 유용성을 확인하기 위하여 25종의 비결핵 항산균 gDNA를 추출하여 QMAP기반 assay에 사용하였다.
본 발명의 결과와 기존 molecular DST와 불일치하는 경우, 이를 Snger sequencing 분석의뢰를 통하여 염기서열을 확인하였다.
실시예 1. 결핵균 DNA의 분리
임상 분리배양된 결핵균주 및 임상검체에서 genomic DNA를 분리하여 다중PCR(multiplex PCR) 방법으로 내성관련 유전자들을 증폭하고 이를 QMAP기반 assay에 사용하였다.
실시예 1-1. 결핵균주에서의 gDNA분리
3% Ogawa 배지 또는 BACTEC MGIT 960 system에 접종하여 37℃ 에서 배양한 후, 배양액의 일부를 취하여 100℃ 에서 10분간 가열하고 13,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 취하는 방법을 이용하였다.
실시예 1-2. 임상검체에서의 gDNA분리
결핵의심 환자의 객담에 동량의 4% NaOH를 30분간 처리한 후, 3,200g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 멸균된 PBS buffer로 wash하여 다시 3,200g에서 10분간 원심분리하는 집균과정을 거친다. 도말, 배양검사에 이용하고 남은 pellet의 일부를 1.5ml tube에 옮긴 후, 5% chelex resin solution 또는 D.W를 50~100ul을 첨가하여 100℃ 에서 10분간 가열하고 13,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 취하는 방법을 이용하였다.
실시예 1-3. 결핵균 DNA의 유전자 증폭
상기 실시예 1-1 또는 실시예 1-2에서 분리한 결핵균 DNA로부터 결핵균 및 비결핵 항산균 검출 및 항결핵제 내성관련 유전자를 검출하기 위하여 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 Pre-denaturation 과정으로 94 ℃ 에서 5분, denaturation 과정으로 94 ℃ 20초와 annealing과 elongation과정으로 65℃에서 60초로 45사이클 시행하고 최종 72 ℃에서 5분간 실시하여 300bp~122bp의 PCR 산물을 얻는 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하였다.
유전자 이름 서열번호 염기서열(5'->3') 증폭산물 비고
rpoB 360_Fx1 서열번호1 TCAAGGAGAAGCGCTACGACC 267bp TB, NTM
250R-m3 서열번호2 Biotin-GGATCTGGTTYTGGATCAGCTC
rpoB rif_F5 서열번호3 CGATCAC ACCGCAGACGT T 179bp RIF 내성
TR8*-2 서열번호4 Biotin-CAG CCC GGC ACG CTC ACG T
katG katG_F3-1 서열번호5 G AGC AGA TGG GCTTGGGCT 122bp INH 내성
KatG_R3-1 서열번호6 Biotin-TCGAGGAAACTGTTGTCCCATTTCg
inhA inhA_F4 서열번호7 CAG TGC GAA AGT TCC CGC C 154bp INH 내성
inhA_R5 서열번호8 Biotin-TAACCAGGACTGAACGGGAT
embB embB_F2 서열번호9 accgacgccgtggtgatatt 182bp EMB 내성
embB_R5 서열번호10 Biotin-CAGGTTGTAATACCAGCCGAAGG
gyrA gyrA_F2 서열번호11 GTCGGTTGCCGAGACCATG 153bp FQ 내성
gyrA_R5 서열번호12 Biotin-GCCGCCGGTGGGTCATTG
gyrB gyrB_F3 서열번호13 TCGATGTTCCAGGCGATACTTCC 157bp FQ 내성
gyrB_R3 서열번호14 Biotin-GTA GCG CAG CTT GCC GAT ATC
rrs rrs-2F3 서열번호15 gttAAGCGAATCCTTAAAAGCCG 300bp Aminoglycoside 내성
rrs-2R4* 서열번호16 Biotin-CAG TTG GGG CGT TTT CGT GG
rrs rrs_1F3 서열번호17 TT CAC CAT CGA CGA AGG TCC G 218bp SM 내성
rrs_1R3 서열번호18 Biotin-TGC AGT ACT CTA GTC TGC CCG
rpsL rpsL_200F3 서열번호19 CGTCGTGGTGTATGCACCCG 233bp SM 내성
rpsL_88R3* 서열번호20 Biotin-ACA CCC TGC GTA TCC AGC G
eis eis_F-1 서열번호21 GATCCTTTGCCAGACACTGTCGt 132bp Aminoglycoside 내성
eis_sR2 서열번호22 Biotin-GGCC AGT AGG AAC ATC CCC G
TB; tuberculosis, NTM; Non-tuberculosis mycobacteria, RIF; Rifampin, INH; isoniazid, EMB; ethambutol,
FQ; fluoroquinolone, Aminoglycoside계(kanamycin, amikacin, capreomycin 등), SM; streptomycin
표 1은 본 발명에 사용된 프라이머 서열
실시예 2. QMAP 기반 항결핵약제 내성 검사 수행
상기 실시예 1-3으로부터 증폭된 PCR 산물에 1/10 볼륨의 10X Denaturation solution (1N NaOH, 1mM EDTA)을 섞어 실온에 5분간 방치한 후 hybridization buffer에 희석시켜 준비된 커플링된 disk (Quantamatrix, Seoul, Korea)에 넣은 후 35℃ 에서 30분간 반응시키고, WS (washing solution)을 이용하여 실온에서 1분간 3회 씻어준 후 1:2000 (v/v)으로 희석한 streptavidin R-phycoerythrin conjugate (Prozyme, San Leandro, CA)을 처리하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 microdisk를 washing buffer로 실온에 1분간 3회 세척하고, 제공되는 QMAP software를 통해 자동으로 disk의 이미지를 측정하여 MTB 또는 NTM을 검출, 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 에탄부톨, 퀴놀론계 항생제, 아미노글라이코 사이드계 항생제(카나마이신, 스트렙토마이신 등)의 내성관련 유전자 돌연변이 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 프로브(한국 바이오니아에 의뢰하여 합성) 서열은 표 2에 기재하였다.
유전자 Oligomer 서열번호 염기서열(5'->3')* 비고
rpoB (ID) Myc-14 서열번호 23 ACCGARGARGACGTCGTCGCCACCATCGA Mycobacteria 표지
Myc-x1 서열번호 24 GTCGCCACCATCGAGTACCTGGT NTM 표지
Myc_scro 서열번호 25 CGTCGCGACCATCGAATACCTGGT
TB_x4 서열번호 26 C GGC GAG CCC ATC ACG TCG t MTB complex 표지
rpoB (RIF) S0_x3 서열번호 27 AG TTC TTC GGC ACC AGC 504-509 wild type
S1-2 서열번호 28 GC CAG CTG AGC CAA TT 510-514 wild type
S2_x2-1 서열번호 29 ATG GAC CAG AAC AAC CC 515-520 wild type
S3-x2 서열번호 30 CG CTG TCG GGG TTG AC 521-524 wild type
S4-0 서열번호 31 G TTG ACC CAC AAG CGC CGA 524-529 wild type
S5-x2 서열번호 32 A CTG TCG GCG CTG G 529-533 wild type
531TTG-x4 서열번호 33 GA CTG TTG GCG CTG G 531TTG
516GTC-0 서열번호 34 A ATG GTC CAG AAC AAC CCG 516GTC
516TAC-4 서열번호 35 CAA TTC ATG TAC CAG AAC AA 516TAC
523GAG-1 서열번호 36 G TCG GAG TTG ACC CAC A 523GAG
526TAC-6 서열번호 37 TTG ACC TAC AAG CGC CGA 526TAC
katG katG wt-1 서열번호 38 ATCACC AGC GGCATCG 315AGC wild type
315a-x3 서열번호 39 ATCACC ACC GGCATCG S315T(ACC)
315b-2 서열번호 40 ATCACC ACA GGCATCGA S315T(ACA)
315c-2 서열번호 41 ATCACC AAC GGCATCG S315N(AAC)
inhA inhA WT-4 서열번호 42 CGAGACGATAGGTTGTC inhA UPS wild type
inhA-15-6 서열번호 43 AAAGCGAGATGATAGGTTGT 15UPS C→T
inhA -8a-3 서열번호 44 AAGACGATAGGCTGTCGG 8UPS T→C
inhA -8b-3 서열번호 45 AGACGATAGGATGTCGG 8UPS T→A
inhA-16 -4 서열번호 46 GGCGAGGCGATAGGT 16UPS A→G
inhA-17-3 서열번호 47 GGCGATACGATAGGTTGT 17UPS G→T
embB emb wt-6 서열번호 48 GC TAC ATC CTG GGC ATG G 306M wild type
306V-4 서열번호 49 TAC ATC CTG GGC GTG GC 306V(GTG)
306I-m1 서열번호 50 C TAC ATC CTG GGC ATH GC 306I(ATC), 306I(ATT)
306I-ATA 서열번호 51 TAC ATC CTG GGC ATA GC 306I(ATA)
gyrA WT1-i1(88-93) 서열번호 52 C GGC I AC GCG TCG ATC TAC 88, 90 position wild type
WT2-23(93-97) 서열번호 53 C TAC GAC ACC CTG GTG C 91, 94 position wild type
G88C-11 서열번호 54 CCACCCG CAC TGC GAC 88TGC
G88A-8 서열번호 55 CACCCG CAC GCC GAC G 88GCC
90_i4 서열번호 56 GGC IAC GTG TCG ATC TAC 92GTG
S91P-10 서열번호 57 AC GCG CCG ATC TAC GAC 91CCG
D94A-5 서열번호 58 GTCG ATC TAC GCC ACC C 94GCC
D94G-6 서열번호 59 GCG TCG ATC TAC GGC AGC 94GGC
D94H-4 서열번호 60 GACGCGTCG ATC TAC CAC AGC 94CAC
D94N-4 서열번호 61 CGTCGATC TAC AAC ACC C 94AAC
D94Y-6 서열번호 62 GCGTCGATC TAC TAC AGC 94TAC
gyrB gyrB WT 1-2 서열번호 63 CTA AAG AAC ACC GAA GTT CA Wild type
N538T-2 서열번호 64 CTA AAG ACC ACC GAA GTT C N538T
N538D-1 서열번호 65 CTA AAG GAC ACC GAA GTT C N538D
539N-1 서열번호 66 AAG AAC AAC GAA GTT CAG G 539N
E540D-1 서열번호 67 AAG AAC ACC GAC GTT CAG E540D
rrs (2) rrs WT1(1400)-9 서열번호 68 GCC CGTCACGTCAT GAA Wild type
rrs WT2(1445)-3 서열번호 69 AACCCTCGGGAGGGAGCT Wild type
rrs WT3(1484)-5 서열번호 70 GATTGGGACGAAGTCGT Wild type
MT1(A1401G)-11 서열번호 71 GTCGCGTCATGAAAGTCG A1401G
MT1(C1402A)-9 서열번호 72 CCCGTCAAGTCATGAAAGTC C1402A
MT2(C1445T)-7 서열번호 73 ACCCTTGGGAGGGAGCT C1445T
MT3(G1484T)-4 서열번호 74 GATTGGGACTAAGTCGT G1484T
eis eis WT-9 서열번호 75 CATATGCCACAGTCGGATT Wild type
8A-3 서열번호 76 GCCACAGTAGGATTCTGT 8UPS C->A
10A_8 서열번호 77 CATATGCCACAATCGGATTC 10UPS G->A
10C_2 서열번호 78 CATATGCCACACTCGGATTC 10UPS G->C
12_5 서열번호 79 GCCATAGTCGGATTCTG 12UPS C->T
C14T_11 서열번호 80 ATGCTACAGTCGGATTCT 14UPS C->T
37T-2 서열번호 81 ATTCACTTGCACGTGGCC 37UPS C->T
rrs (1) rrs WT (507-523) 서열번호 82 TGCCAGCAGCCGCGGTA Wild type
MT1_A514C-1 서열번호 83 GCCAGCCGCCGCGGTA A514C
MT3_C517T-2 서열번호 84 GTGCCAGCAGCTGCGGT C517T
rpsL WT1_43AAG-6T 서열번호 85 AAGTACCACCACTCCGAAGAAGC Wild type
MT 1_ 43AGG-2 서열번호 86 ACCACTCCGAGGAAGCCGAAC 43AGG
WT 2_88AAG-9 서열번호 87 CGGGTGAAGGACCTGC Wild type
MT 2_88AGG-5 서열번호 88 GGGTGAGGGACCTGCC 88AGG
1. 각 probe oligomer는 microdisk의 carboxyl기와 공유결합하여 고정되도록 5'에 Amine기를 표지하여 합성하였음.
2. 각 probe oligomer는 microdisk에 고정시킨 후 고정여부를 확인하기 위한 poly T linker(15T)를 5'에 표지하여 합성하였음.
표 2는 본 발명에 사용된 프로브 서열
상기 실시예의 결과를 하기에서 서술한다.
하기 표 3 내지 13에서 양성을 나타내는 부분을 붉은색으로 표시하였다.
유전자별 돌연변이형 검출을 위한 프로브 특이도 확인
하기 표 3은 리팜핀 내성유발과 관련된 rpoB 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다
Figure 112017112428246-pat00001
하기 표 4는 아이소니아지드 내성유발과 관련된 katG 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00002
하기 표 5는 아이소니아지드 내성유발과 관련된 inhA 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00003
하기 표 6은 에탄부톨 내성유발과 관련된 embB 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00004
하기 표 7은 퀴놀론계 항생제 내성유발과 관련된 gyrA 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00005
하기 표 8은 퀴놀론계 항생제 내성유발과 관련된 gyrB 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00006
하기 표 9는 아미노글라이코사이드계 항생제 내성유발과 관련된 rrs 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00007
하기 표 10은 아미노글라이코사이드계 항생제 내성유발과 관련된 eis 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00008
하기 표 11은 스트렙토마이신 항생제 내성유발과 관련된 rrs 유전자의 돌연변이 유형별 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00009
Figure 112017112428246-pat00010
하기 표 13은 결핵균 및 비결핵 항산균의 QMAP probe의 특이도 확인결과이다.
Figure 112017112428246-pat00011
QMAP 기반 결핵균/ 비결핵 항산균 검출 및 항결핵약제 내성 검사법의 유용성 평가
고체배양 234 균주를 대상으로 QMAP 기반 리팜핀 내성의 유용성 평가를 진행하였다. 234 결핵 균주 중 리팜핀 내성유발유전자인 rpoB 유전자에 돌연변이가 확인된 160균주 중 531TTG 돌연변이가 91(56.9%)균주, 516GTC돌연변이가 15(10%)균주, 526TAC돌연변이 7(4.4%)균주, 516TAC돌연변이 6(3.8%)균주가 확인되었으며, 나머지 40(25%)균주는 ΔWT1~5에 다양한 돌연변이로 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 14와 같다.
하기 표 14는 총 234 배양균 DNA에서 리팜핀 내성여부 검출을 위한 rpoB 돌연변이 분석 결과이다.
rpoB QMAP results 염기분석결과
wild type probes, n(%) Mutant type probes, n(%) mutant type n(%)
Mutant type
(n=160)		 ΔWT0 (504-509) 0(0)
ΔWT1 (510-514) 4(2.5) 511CCG 1(0.6)
513CTA 1(0.6)
513-514 CAA In 2(1.3)
ΔWT2 (515-520) 24(15) 516GTC 16(10) 516GTC 16(10)
516TAC 6(3.8) 516TAC 6(3.8)
516CTC 1(0.6)
518 del. 1(0.6)
ΔWT3 (521-524) 2(1.3) 522TTG 1(0.6)
522TGG 1(0.6)
ΔWT4 (524-529) 19(11.9) 526TAC 7 526TAC 7(4.4)
526CTC 4(2.5)
526GAC 4(2.5)
526TGC 2(1.3)
526GGC 1(0.6)
526CCC 1(0.6)
ΔWT5 (529-533) 101(63.1) 531TTG 91 531TTG 91(56.9)
531CAG 1(0.6)
531TGG(3) 3(1.9)
533CCG(6) 6(3.8)
multiple mutation 10(6.2)
ΔWT1, 523GAG, 516GTC 523GAG 2 513CTA, 523GAG 2(1.3)
ΔWT1, ΔWT2 513GAA, 516TAC 1(0.6)
ΔWT2 516TAC, 518CAC 1(0.6)
ΔWT2 515GTG, 516GGC 1(0.6)
ΔWT2, ΔWT4 516AAC, 526AAC 1(0.6)
ΔWT2, ΔWT5 516GGC, 533CCG 4(2.5)
Wild type
(n=74)		 WT0~WT5 74(100) No mutation 74(100)
고체배양 234 균주를 대상으로 QMAP 기반 아이소니아지드 내성검사의 유용성 평가를 진행하였다. 234 결핵 균주 중 아이소니아지드 내성유발유전자인 katG 유전자의 315코돈에 돌연변이가 확인된 98균주 중 S315T(ACC)형이 91(96.9%)균주, S315T(ACA)형이 4(4.1%)균주, 그 외 유형이 3(3%)로 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 15와 같다.
또다른 아이소니아지드 내성유발유전자인 inhA 유전자의 promotor에 돌연변이가 확인된 49균주 중 15UPS 돌연변이는 39(79.3%)균주, 8UPS 돌연변이 8(16.4%)균주, 17UPS 돌연변이가 2(4.1%)로 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 16과 같다.
하기 표 15는 총 234 배양균 DNA에서 아이소니아지드 내성여부 검출을 위한 katG 돌연변이 분석 결과이다.
katG QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type
(n=136)		 katG WT 136(100) no mutation 136(100)
mutant type
(n=98)		 katG MT1 91(96.9) 315ACC 91(96.9)
katG MT2 4(4.1) 315ACA. 4(4.1)
katG MT3 1(1) 315AAC 1(1)
ΔkatG WT 2(2) 315AGA 1(1)
　 　 315GGC 1(1)
하기 표 16은 총 234 배양균 DNA에서 아이소니아지드 내성여부 검출을 위한 inhA 돌연변이 분석 결과이다.
inhA QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type
(n=185)		 inhA WT 185(100) no mutation 185(100)
mutant type
(n=49)		 inhA MT1 39(79.3) -15UPS(C->T) 39(79.3)
inhA MT2 4(8.2) -8UPS(T->C) 4(8.2)
inhA MT3 2(4.1) -8UPS(T->A) 2(4.1)
inhA MT5 2(4.1) -17UPS(C->T) 2(4.1)
ΔinhA WT 2(4.1) -8UPS(T->G) 2(4.1)
고체배양 234 균주를 대상으로 QMAP 기반 에탐부톨 내성검사의 유용성 평가를 진행하였다. 234 결핵 균주 중 에타부톨 내성유발유전자인 embB유전자의 306코돈에 돌연변이가 확인된 74균주 중 306V형이 30(40.5%)균주, 306I형이 40(54.1%)균주, 306L형이 4(5.4%)로 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 17과 같다.
하기 표 17은 총 234 배양균 DNA에서 에탄부톨 내성여부 검출을 위한 돌연변이 분석 결과이다.
　embB QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type
(n=160)		 embB WT 160(100) no mutation 160(100)
mutant type
(n=74)		 embB MT1 30(40.5) 306V(GTG) 30(40.5)
embB MT2 40(54.1) 315I(ATA) 25(33.8)
306I(ATC) 9(12.2)
306I(ATT) 4(5.4)
306I(ATG) 2(2.7)
ΔembB WT 4(5.4) 306L(CTG) 3(4)
　 　 306L(TTG) 1(1.4)
고체배양 234 균주를 대상으로 QMAP 기반 퀴놀론계 약제 내성검사의 유용성 평가를 진행하였다. 234 결핵 균주 중 퀴놀론계 약제 내성유발유전자인 gyrA유전자에 돌연변이가 확인된 77균주 중 코돈 90의 돌연변이가 30(39%)균주, 코돈 91의 돌연변이가 3 (3.9%)균주, 코돈 94의 돌연변이가 40(52%)균주로 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 18과 같다.
또다른 퀴놀론계 약제 내성유발유전자인 gyrB유전자에 돌연변이가 확인된 8균주로 코돈 538,539,540에서 각각 돌연변이가 확인되었다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 19와 같다.
하기 표 18은 총 234 배양균 DNA에서 퀴놀론계 항생제 내성여부 검출을 위한 gyrA 돌연변이 분석 결과이다.
　gyrA QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type (n=157) WT1, WT2, MT3 157(100) no mutation 157(100)
mutant type (n=77) ΔWT1, ΔWT2, MT3 30(39) 90V 30(39)
ΔWT1, WT2, MT4 3(3.9) 91P 3(3.9)
WT1, ΔWT2, MT3, MT5 8(10.4) 94A 8(10.4)
WT1, ΔWT2, MT3, MT6 20(26) 94G 20(26)
WT1, ΔWT2, MT3, MT8 6(7.8) 94N 6(7.8)
WT1, ΔWT2, MT3, MT9 6(7.8) 94Y 6(7.8)
double mutation
WT1, ΔWT2 2 90V, 94G 2(2.6)
ΔWT1, WT2 2 91P, 91P 2(2.6)
하기 표 19는 총 234 배양균 DNA에서 퀴놀론계 항생제 내성여부 검출을 위한 gyrB 돌연변이 분석 결과이다.
gyrB　 QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type
(n=226)		 gyrB WT 226(100) no mutation 226(100)
mutant type
(n=8)		 ΔWT, MT1 2(25) 538D 2(25)
ΔWT, MT2 2(25) 538T 2(25)
ΔWT, MT3 1(12.5) 539N 1(12.5)
ΔWT, MT4 3(37.5) 540D 3(37.5)
고체배양 234 균주를 대상으로 QMAP 기반 아미노글라이코사이드계 약제 내성검사의 유용성 평가를 진행하였다. 234 결핵 균주 중 아미노글라이코사이드계 약제 내성유발유전자인 rrs , eis, rpsL유전자에 돌연변이와 염기서열을 확인하였다. 각 돌연변이별 QMAP기반 assay 결과와 염기서열 분석결과는 아래 표 20 내지 23과 같다.
하기 표 20은는 총 234 배양균 DNA에서 아미노글라이코사이드계(KM, AMK, CAP) 항생제 내성여부 검출을 rrs 돌연변이 분석 결과이다.
　 rrs (1401-1484) QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type (n=190) WT1, WT2, MT3 190(100) no mutation 190(100)
mutant type (n=44) ΔWT1, WT2, MT1-1 44(100) 1401G 44(100)
하기 표 21은 총 234 배양균 DNA에서 아미노글라이코사이드계(KM, AMK, CAP) 항생제 내성여부 검출을 eis 돌연변이 분석 결과이다.
eis QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type (n=216) WT 216(100) no mutation 216(100)
mutant type (n=18) ΔWT, MT1 1(5.6) 8A 1(5.6)
ΔWT, MT2 7(38.9) 10A 6(33.3)
10C 1(5.6)
ΔWT, MT3 5(27.8) 12T 5(27.8)
ΔWT, MT4 3(16.7) 14T 3(16.7)
　 ΔWT, MT5 2(11.1) 37T 2(11.1)
하기 표 22는 총 234 배양균 DNA에서 스트렙토마이신 내성여부 검출을 위한 rpsL 돌연변이 분석 결과이다.
rpsL QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type (n=202) WT1, WT2 216(100) no mutation 216(100)
mutant type (n=32) ΔWT1, WT2, MT1 29 43AGG 29
WT1, ΔWT2, MT2 3 88AGG 3
하기 표 23은 총 234 배양균 DNA에서 스트렙토마이신 내성여부 검출을 위한 rrs 돌연변이 분석 결과이다.
rrs (514-517) QMAP results, n(%) 염기분석결과
mutant type n(%)
wild type (n=218) WT 218(100) no mutation 218(100)
mutant type (n=44) ΔWT, MT1 9(60) 514C 9(60)
ΔWT, MT2 5(33.3) 517T 5(33.3)
ΔWT 1(6.7) 514T 1(6.7)
mixed case (n=1) WT, MT2 1 517T/wt mix 1
<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS <120> A method for simultaneously detecting Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria and resistance for rifampicin, isoniazid, ethambutol, quinolone and aminoglycoside of Mycobacterium tuberculosis, and a kit therefor based QuantaMatrix assay Platform <130> P17-0201HS <160> 88 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tcaaggagaa gcgctacgac c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggatctggtt ytggatcagc tc 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgatcacacc gcagacgtt 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cagcccggca cgctcacgt 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagcagatgg gcttgggct 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcgaggaaac tgttgtccca tttcg 25 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cagtgcgaaa gttcccgcc 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 taaccaggac tgaacgggat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 accgacgccg tggtgatatt 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 caggttgtaa taccagccga agg 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gtcggttgcc gagaccatg 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gccgccggtg ggtcattg 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tcgatgttcc aggcgatact tcc 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gtagcgcagc ttgccgatat c 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gttaagcgaa tccttaaaag ccg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 cagttggggc gttttcgtgg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ttcaccatcg acgaaggtcc g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tgcagtactc tagtctgccc g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cgtcgtggtg tatgcacccg 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 acaccctgcg tatccagcg 19 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gatcctttgc cagacactgt cgt 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggccagtagg aacatccccg 20 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 23 accgargarg acgtcgtcgc caccatcga 29 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 24 gtcgccacca tcgagtacct ggt 23 <210> 25 <211> 24 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aatggtccag aacaacccg 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 35 caattcatgt accagaacaa 20 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 36 gtcggagttg acccaca 17 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 37 ttgacctaca agcgccga 18 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 38 atcaccagcg gcatcg 16 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 39 atcaccaccg gcatcg 16 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 40 atcaccacag gcatcga 17 <210> 41 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 41 atcaccaacg gcatcg 16 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 42 cgagacgata ggttgtc 17 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 43 aaagcgagat gataggttgt 20 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 44 aagacgatag gctgtcgg 18 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 45 agacgatagg atgtcgg 17 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 46 ggcgaggcga taggt 15 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 47 ggcgatacga taggttgt 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 48 gctacatcct gggcatgg 18 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 49 tacatcctgg gcgtggc 17 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 50 ctacatcctg ggcathgc 18 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 51 tacatcctgg gcatagc 17 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 52 cggcnacgcg tcgatcta 18 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 53 ctacgacacc ctggtgc 17 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 54 ccacccgcac tgcgac 16 <210> 55 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 55 cacccgcacg ccgacg 16 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 56 ggcnacgtgt cgatctac 18 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 57 acgcgccgat ctacgac 17 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 58 gtcgatctac gccaccc 17 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 59 gcgtcgatct acggcagc 18 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 60 gacgcgtcga tctaccacag c 21 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 61 cgtcgatcta caacaccc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 62 gcgtcgatct actacagc 18 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 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Claims (13)

  1. a)서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머를 사용하여, DNA로부터 PCR 증폭하는 단계; 및
    b) 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브가 커플링된 디스크와 상기 단계 a)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 단계를 포함하는
    결핵균 및 비결핵 항산균 검출 및 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 및 아미노글라이코사이드계 항생제 약제의 내성 여부를 동시에 확인하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 b) 단계 후 추가적으로 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 소프트웨어를 통하여 상기 디스크의 이미지를 측정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 결핵균 및 비결핵 항산균 검출 및 항결핵약제의 내성여부를 동시에 검출하기 위해 타겟 유전자들을 다중 PCR(multiplex PCR)로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 바이오틴이 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머 및
    서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브가 커플링된 디스크를 포함하는 결핵균 및 비결핵 항산균 검출과 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 및 아미노글라이코사이드계 항생제의 내성 여부를 동시에 확인하기 위한 키트.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로, DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 서열번호 1 내지 서열번호 22의 프라이머 및 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브를 유효성분으로 포함하는 리팜핀 내성결핵균, 아이소니아지드 내성 결핵균, 에탐부톨 내성 결핵균, 퀴놀론계 약제 내성 결핵균, 아미노글라이코사이드계 내성결핵균과 감수성 결핵균 및 결핵균과 비결핵 항산균의 구분을 위한 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 서열번호 23 내지 88의 올리고머 프로브로 이루어진 리팜핀 내성결핵균, 아이소니아지드 내성 결핵균, 에탐부톨 내성 결핵균, 퀴놀론계 약제 내성 결핵균, 아미노글라이코사이드계 내성결핵균과 감수성 결핵균 및 결핵균과 비결핵 항산균의 구분을 위한 프로브 조성물.
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