JP2017530710A - 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ - Google Patents
結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017530710A JP2017530710A JP2017518819A JP2017518819A JP2017530710A JP 2017530710 A JP2017530710 A JP 2017530710A JP 2017518819 A JP2017518819 A JP 2017518819A JP 2017518819 A JP2017518819 A JP 2017518819A JP 2017530710 A JP2017530710 A JP 2017530710A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- nucleic acid
- probe
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 154
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 115
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 71
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 68
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 claims description 41
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 30
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 30
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 17
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 12
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 11
- 101150005343 INHA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150062801 embB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- -1 eis promoter Proteins 0.000 claims description 7
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims description 7
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 6
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 claims description 5
- 101150054168 devR gene Proteins 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N (3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8e,11s,15s)-15-amino-11-[(6r)-2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl]-8-[(carbamoylamino)methylidene]-2-(hydroxymethyl)-3,6,9,12,16-pentaoxo-1,4,7,10,13-pentazacyclohexadec-5-yl]methyl]hexanamide;(3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8 Chemical compound N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1.N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1 VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N 0.000 claims description 4
- 108010065839 Capreomycin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 229960004602 capreomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 4
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 claims description 3
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 101150060849 whiB7 gene Proteins 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 8
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 101150111189 eis gene Proteins 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 3
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241001529548 Megasphaera cerevisiae Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000036984 extensively drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187494 Mycobacterium xenopi Species 0.000 description 1
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000009670 mycobacterial growth Effects 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000011268 retreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940049413 rifampicin and isoniazid Drugs 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/143—Modifications characterised by incorporating a promoter sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/185—Modifications characterised by incorporating bases where the precise position of the bases in the nucleic acid string is important
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
Description
本出願は、2014年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/062,351号の優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書中に援用される。
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部が国立衛生研究所の認可番号U01AI082174およびR01AI080653に基づく政府の支援によりなされた。したがって、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。
本発明は、結核菌のDNAの存在を同定するおよび抗結核薬への耐性を同定するために、結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)における異なる遺伝子のセグメントを増幅および検出するための新規プライマーならびにスロッピー(sloppy)分子ビーコン(SMB)および分子ビーコン(MB)プローブに関する。
本発明は、1以上の上記オリゴヌクレオチドセットおよび核酸を含むキットを提供する。前記キットは、DNAポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含むことができる。
本明細書では、rpoB、gyrA、gyrB、inhAプロモーター領域、rrs、eisプロモーター領域、embBおよびkatG遺伝子を増幅することを特徴とするプライマーは、M.tbにおける突然変異ホットスポットを誘発する薬剤耐性の感受性増幅を可能にする。対応するSMBプローブは、最も一般的に使用される第一および第二選択薬への薬剤耐性をもたらすこれらの突然変異を標的および同定する。これらのプライマーは、対称および非対称の両方のPCRアッセイにおいて非常に高い効率で使用することができる。本明細書に記載のプライマーおよびプローブ配列は、M.tbに対する迅速で正確な分子薬剤感受性試験アッセイを開発するために本発明者らにより使用されている。M.tbに対する分子診断アッセイにおける明らかな有用性とは別に、これらのプライマーはまた、ターゲット遺伝子をシークエンシングするために使用され、サーベイランスアッセイおよびその他のプローブに基づくアッセイにおける突然変異を誘発する耐性を同定し、M.tbにおける突然変異を誘発する共通の薬剤耐性の特異的で高感度な同定を目的とする。dosR、IS6110およびIS1081遺伝子を増幅するプライマー配列は、M.tbの非常に高感度で特異的な同定を可能にし、結核の非常に特異的で高感度な分子診断を目的とするいかなるPCRアッセイフォーマットにおいても使用できる。下記表において記載されたものは、本発明の例示的なプライマーおよびプローブである。
核酸は、DNA分子(例えば、制限されないが、cDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(例えば、制限されないが、mRNA)、またはDNAもしくはRNAアナログを意味する。DNAまたはRNAアナログは、ヌクレオチドアナログから合成することができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。「単離された(isolated)」核酸は、その構造がいかなる天然起源の核酸構造、または天然起源のゲノム核酸のいかなる断片の構造とも同一ではない核酸である。したがって、この用語は、例えば、(a)天然起源のゲノムDNA分子の一部の配列を有するが、天然起源の生物のゲノムにおける分子のその部分に隣接するコード配列の両方に隣接していないDNA;(b)結果として生じる分子がいかなる天然起源のベクターまたはゲノムDNAと同一ではないように、ベクターまたは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸;(c)cDNA、ゲノム断片、PCRにより生成された断片、または制限断片などの別の分子;ならびに(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換え核酸配列をカバーする。
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)」は、短いポリヌクレオチド、通常300以下の長さ(例えば、5から150の範囲、好ましくは10から100の範囲、より好ましくは15から50の範囲の長さ)を意味する。しかし、本明細書において、この用語はまた、より長いまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意味する。「オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)」は、他のポリヌクレオチドとハイブリダイズでき、よってポリヌクレオチド検出のためのプローブ、またはポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとしての機能を果たす。
リファンピンおよびフルオロキノロン(FQ)耐性に大きく関与しているM.tb突然変異体を迅速かつ確実に同定する2つの別々なSMBアッセイは、最近説明された(Chakravorty,S.,B.et al.,2011,J Clin Microbiol 49:932−940;Chakravorty,S.,H.,et al.,2012,J Clin Microbiol 50:2194−2202)。本明細書に開示されるアッセイは、リアルタイムPCRフォーマットであるという利点を有するので、それらは使用が容易であり、単位複製配列二次汚染を受けない。また、突然変異の検出では、ハイスループット試験に対して頑強で適していることが示されている。以下の実施例は、SMB TB薬剤耐性検出アッセイシステムを示し、AMKおよびKANに対する耐性の検出を可能にするアッセイを追加する。本明細書で開示されるアッセイと表現型感受性試験方法との間の不一致の原因もまた、調査された。結果は、最も一般的に使用される表現型方法のいくつかが、突然変異がKANへの最小発育阻止濃度(MIC)を適度に増加させるだけの場合、耐性−付与突然変異を有するM.tb単離株を見逃し得ることを示す。低レベルKAN耐性に関連するwhiB7での新規の突然変異もまた、発見された。
この実施例は、下記実施例2〜7で使用した材料および方法を記載する。
M.tbテストサンプルは、大韓民国カンウォンのナショナルマサン病院のMDR結核(NCT00341601 clinicaltrials.gov)の自然史研究に登録された503人の患者から培養された603の一連の単離株から単離されたDNAから構成された。2つのコホートを試験した。コホートAは、未治療の新たに疑われるTBのケース(158サンプル)から構成され、コホートBは、再治療のTBケース(445サンプル)から構成された。新鮮な唾液サンプルを処置の開始時に各患者から採取し、M.tbを培養した。患者のサブセットにおいて、反復して唾液サンプルを処置の1、4および6月目に採取し、まtM.tbのために培養された。非結核性抗酸菌(Non−Tuberculosis Mycobacteria)(NTM)ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌テストサンプルを以前に記載のNew Jersey Medical School(NJMS) DNAリポジトリから採取した(Chakravorty,S.,2012.J Clin Microbiol 50:2194−2202)。
表現型薬剤感受性試験(phenotypic drug susceptibility testing)は、韓国のInternational Tuberculosis Research Center (ITRC)で、LJ培地上で絶対濃度法により603の単離株の全てで行われ、両方の抗生物質(Jnawali,H.N.,2013,Diagn Microbiol Infect Dis 76:187−196)に対して40μg/mlの臨界濃度(2012年の間に、単離株を試験したときに使用した標準濃度)を用いてAMKおよびKANに対する感受性を決定した。173/603サンプルのAMKおよびKANに対するMICもまた、以前に記載されているように(Lee,J.,2014,Antimicrob Agents Chemother 58:11−18)、TREK Sensititre(登録商標) MYCOTB MICプレート(“MYCOTB”;TREK Diagnostic Systems,Cleveland,Ohio,USA)を用いて評価された。560/603サンプルについて、KANに対する耐性はまた、2.5μg/mlの臨界濃度でMycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT)システム(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)を用いて評価された。ターゲット遺伝子のサンガーシークエンシング結果と一致しなかった表現型感受性試験結果を有するサンプルについて、表現型感受性試験を繰り返して、初期の所見を確認した。MGITおよびLJ感受性試験結果が不一致を示した場合、両方のアッセイを繰り返して、初期の所見を確認または修正した。
SMBアッセイ試験およびサンガーシークエンシングのためのDNAは、10〜15分間、0.1% Triton X100の存在下で200μlのInstagene Matrix樹脂(Bio−Rad Laboratories,Hercules California,USA)中の一白金耳量の培養物をボイルすることにより培養した単離株から調製された。上清を遠心分離後に回収し、Nanodropマイクロボリューム分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)を用いて定量した。サンガーシークエンシングのために、rrs遺伝子の2つの異なる断片(ヌクレオチド420〜980および1293〜1537)ならびに上流のeisコード領域およびeisプロモーター全体を0.5μMのフォワードおよびリバースプライマー1X PCRバッファー、250mM dNTPs、2.5mM MgCl2および0.03U/μlのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ酵素 (Applied Biosystems,Foster City,California,USA)を用いて、以下のパラメータに従って増幅した:最初の変性を95℃で10分間、続いて95℃で10秒、58〜60℃で30秒、および単位複製配列のサイズに依存して70℃で10〜30秒の40サイクル。eisプロモーター領域およびrrs遺伝子断片を以前に記載されているように(10,33)増幅した。サンプルのサブセットについて、412bpの5’非翻訳領域およびORFからの126bpを含むwhiB7遺伝子からの538bpの断片を増幅し、whiB7F 5’aaacgcgcaggtcagaaaat 3’およびwhiB7R 5’cagtgtcttggctacctcga 3’(配列番号70および71)のプライマーを用いて配列決定した。さらに、ほぼ全体のwhiB7 ORFを含む、whiB7遺伝子からの275bpの断片もまた、whiB7−ingene−F 5’ GTCGGTACTGACAGTCCCC 3’およびwhiB7−ingene−R 5’ATGCAACAGCATCCTTGCG 3’(配列番号72および73)のプライマーを用いて増幅した。PCR産物は、製造業者の説明書に従い、BigDye Terminator,version 3.1,cycle sequencing kit (Applied Biosystems)を用いる3130XL Genetic Analyzer(Applied Bio−systems,Foster City,California,USA)で遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いて、双方向性のシークエンシングを受けた。
SMBアッセイは、rrs遺伝子のコドン1401および1402のM.tb突然変異およびeis遺伝子のプロモーター領域に沿った突然変異をターゲットにした。113bpの断片(ヌクレオチド1335〜1451)をAMG−F(5’−GCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGC−3’,配列番号51)およびAMG−R(5’−CCTCCCGAGGGTTAGGCCACT−3’,配列番号52)のプライマーを用いてrrs遺伝子から増幅し、プロモーター領域およびeis遺伝子の最初の5つのコドン(ヌクレオチド−81から17)を包含する98bpの断片をeis−F(5’−CACAGGGTCACAGTCACAGAATC−3’,配列番号18)およびeis−R(5’−GCATCGCGTGATCCTTTGCCAGAC−3’,配列番号53)のプライマーを用いて増幅した。rrsプライマーは、マイコバクテリウム属(Mycobacterium genus)に特異的に設計され、eisプライマーは、M.tb複合体に特異的に設計された。1つのSMBプローブrrs−1400(5’−6carboxyfluorescein−cacgaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtcgtg−BHQ1−3’,配列番号59)と2つのSMBプローブeis−1(5’−Cyanine5−caggcggtcgtaatattcacgtgcacctggccgccgcctg−BHQ2−3’,配列番号16)およびeis−2(5’−TexasRed−ctcgcggcatatgccacagtcggattctctgacgcgag−BHQ2−3’,配列番号61)(配列がSMBのステム部分を示すものおよびBHQがブラックホールクエンチャーを示すものに下線を引いた)とは、それそれrrs遺伝子およびeisプロモーター領域に対するターゲットとされた。rrsプローブは、アンチセンス鎖に相補的であるように設計され、eisプローブは、センス鎖に相補的であるように設計された。SMBは、http://mfold.rna.albany.edu/?q_mfold/dna−folding−formのin silico DNAフォールディングプログラムを用いて設計され、http://mfold.rna.albany.edu/?q_DINAMelt/Two−state−meltingのプローブ−ターゲットハイブリッドフォールディングプログラムは、可能なプローブ−ターゲットハイブリッド構造および溶解温度(Tm)を予測するために使用された。プローブは、明確な突然変異の同定を可能にするために、それぞれの標的領域における野生型配列および突然変異体配列の間の最大のTm差を生成するように設計された。プライマーは、Sigma Aldrich(St.Louis,Missouri,USA)から、SMBプローブは、Biosearch Technologies(Novato,California,USA)から手に入れた。
全てのサンプルは、アッセイの検証が盲検法で行われることを確保するために、独立してコード化して、ランダムに分配された。アッセイは、韓国マサンのITRCおよびニュージャージーメディカルスクール(NJMS),Rutgers,Newark,New Jerseyの両方で試験された。603サンプル全体の試験が完了すると、サンプルはデコードされ、PCR結果は、対応するシークエンシング、および表現型薬剤感受性試験結果と比較された。各サイトで得られた結果も比較された。アッセイ結果は、治療する医師に報告されず、いかなる治療決定を導くために使用されなかった。PCRは、Roche Light Cycler 480 II real−time PCR system(Roche Diagnostics Co.Indianapolis,Indiana,USA)を用いて384ウェルプレートで実施され、20μlの反応ボリュームは、rrs遺伝子のための100nMのフォワードプライマーおよび1μMのリバースプライマーならびにeisプロモーター領域のための1μMフォワードプライマーおよび50nMリバースプライマー、1ng/μlのrrs−1400およびeis−1プローブならびに0.8ng/μlのeis−2プローブ、4mM MgCl2、250mMデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTPs)、1X PCRバッファー、8%グリセロール、0.06U/μlのPlatinum(登録商標) TfiExo(−) DNAポリメラーゼ (Life Technologies,Grand Island,New York,USA),ならびに2から5ngのサンプルDNAまたは等ボリュームの水を含む。PCRは、以下の工程で実施された:95℃で2分間の酵素の活性化、続いて95℃で10秒間の変性および67℃で30秒間のアニーリングと伸長との組み合わせの50サイクル。PCRサイクル後、1℃あたり1データの取得速度でプロセス中の蛍光の連続モニタリングと共に、95℃で2分間の変性後、45℃に冷却して、85℃に徐々に加熱することにより、ポストPCR−Tm分析を行った。Tm値は、Tmコーリングソフトウェア(Light Cycler 480 software)を用いて反応終了時に同定された。しかし、各Tmはまた、Tm値の最終的な同定が行われる前に、訓練を受けた観察者により検証された。野生型および突然変異体のTmに対応する任意のプローブの明確なダブルピークを示すサンプルは、ヘテロ耐性を示すと考えられた。テンプレートとしてDNAの代わりに滅菌水を用いたテンプレートなしのコントロールは、DNA−ネガティブコントロールとして使用され、テンプレートとしてM.tb H37Rvからの1ngのゲノムDNAを用いたDNA−ポジティブコントロールはまた、各アッセイプレートに含まれた。
この研究は、National Masan Hospital、NIAIDおよびRutgers(旧UMDNJ)institutional review boardsにより承認され、すべての被検体は、同意書を渡した(Rutgers IRB protocol number 0120090104)。
本明細書に開示されるSMBに基づくアッセイは、耐性との関連性が知られているM.tbのrrs遺伝子およびeisプロモーターにおける突然変異を探すことによりAMKおよびKANに対する耐性を検出した。本アッセイは、rrsおよびeisターゲット単位複製配列の一部分に相補的なSMBプローブの存在下でのTm分析に続くPCR工程からなる。本発明者らは、最初に、人工オリゴヌクレオチドでのターゲットの突然変異を同定するためにアッセイの能力を評価し、選択された野生型および突然変異体のM.tb株からのDNAテンプレートを配列決定した(データ示さず)。野生型の配列は、野生型ターゲットの既知の平均値の1℃以内のTm値の存在によって同定された。突然変異体の配列は、平均野生型Tm値から少なくとも5標準偏差のTm値のシフトによって同定された。AMKおよびKAN耐性に関連する最も一般的な突然変異を検出する本アッセイの能力は、その後の臨床DNAサンプルで評価された。試験は、野生型配列を有する487のサンプルおよびアッセイターゲットに突然変異を有する116のサンプルからなる、603の臨床サンプルのパネルで行われた。これらのサンプルの5つは、野生型およびサンダーシークエンシングで検出された突然変異株のDNAの混合物を有していた。SMBアッセイは、突然変異体または混合として115/116(99%)の突然変異体または混合(突然変異体および野生型のDNAの両方を含む不均一サンプル)サンプルおよび野生型として487/487(100%)の純野生型サンプルを正確に同定した。ただ一つの混合サンプル(サンガーシークエンシングにより示される)は、本明細書で開示するアッセイにより野生型サンプルとして同定された。野生型および突然変異体のターゲットの設定において各SMBプローブにより生成されたTm値は、高い再現性があった。野生型ターゲットについて、rrs−1400、eis−1およびeis−2のプローブは、それぞれ70.1℃±0.15、63.9℃±0.19および69℃±0.23の平均Tm値を示した(表3)。A1401GおよびC1402Tの突然変異体のTmターゲットについて、突然変異は、それぞれプローブrrs−1400におけるTm値の3.9℃(±0.17)および5.6℃(±0.21)の減少もたらした(表3)。同様に、eis−1およびeis−2プローブは、期待された野生型Tm値と比較して、Tm値の4.3℃から6.5℃の減少を発生させることによって突然変異としてeisプロモーター領域における突然変異の範囲を確実に検出した(表3)。RutgersおよびITRCでの2つの異なる実験室で実施されたPCRアッセイは、野生型および突然変異体ならびに混合物として検出されたすべてのサンプルについて完全に一致した。
この実施例では、アッセイを行い、表現型薬剤感受性試験結果と比較して、分子アッセイの性能を評価した。遺伝型薬剤感受性試験の見かけの性能は、試験に含まれるために選択された突然変異およびゴールドスタンダードとして使用される表現型アッセイに依存して変化しうる(Kim,S.J.2005 Eur Respir J 25:564−569;Rigouts,L.,et al.,2013,J Clin Microbiol 51:2641−2645;およびVan Deun,A.,et al.,2013,J Clin Microbiol 51:2633−2640)。LJに基づく薬剤感受性試験方法をゴールドスタンダードとして考慮すると(603の試験サンプルすべてに対して実施された)、A1401G突然変異のrrs SMB Tm特性は、AMK耐性サンプルの82/90を耐性として分類した(91.1%の感度;95%CI、82.8%から96.8%)。野生型Tmは、AMK感受性サンプルの512/513を感受性として分類した。513のAMK感受性単離株中のただ一つの単離株は、野生型Tmおよび特異的なC1402T突然変異体Tmに対応する、rrs SMBプローブによって生成された明らかな二重ピークの存在により、本明細書に開示されるSMBアッセイによって野生型およびC1402T突然変異体のDNAの混合物として同定された(図2パネルA)。これは、サンガーシークエンシングによっても確認された。これまでの研究では、C1402T突然変異がAMK耐性をコードしていないことが示されているため(24)、C1402T突然変異に対応する特異的なTmは、AMK感受性の指標として考えることができる。この考察は、100%の特異性(95%CI、99から100%)をもたらすすべての513/513AMK感受性サンプルを正しく検出する本明細書に開示されるアッセイをもたらした。分析においてeisプロモーター領域での突然変異に特徴があるTm値を含むことは、AMK耐性を検出する感受性を増加させないが、特異性は100%から93.8%に減少した(95%CI、91.2から95.6%)。これらの結果は、eisプロモーター突然変異がLJ薬剤感受性試験によって明らかにされたようにAMK耐性に関連しないことを示唆する以前の報告と一致する(Campbell 2011およびZaunbrecher 2009)。
KAN耐性を検出するアッセイの性能はまた、603のサンプルのすべてについてゴールデンスタンダードとしてLJに基づく薬剤感受性試験を用いて評価された。耐性を明らかにするためにA1401GまたはC1402T突然変異のいずれかに典型的な本明細書に開示されたrrs SMBにより生成されたTm値を用いて、本アッセイは、82/106サンプルをKAN耐性として検出した(感受性77.4%;95%CI 68.0から84.7%)。逆に、感受性を明らかにするために野生型ターゲットに特徴的なrrs SMB Tmを用いると、496/497のKAN感受性サンプルが感受性として同定された(表4)(特異性99.8%;95%CI、98.7から100%)。eisプロモーター領域において突然変異に特徴的な2つのeisSMBのTM値を耐性の定義に加えると、11の追加のKAN耐性サンプルが耐性として分類されたので、KAN耐性を検出する感受性が77.4%から87.7%(95%CI、79.5から93%)に増加した。しかし、eisプロモーター突然変異を有する21のKAN感受性サンプルが現状KAN耐性として「誤って(falsely)」検出されたので、特異性は、99.8%から95.6%(95%CI、93.3から97.1%)に減少した(表4)。
本明細書で開示されるアッセイにより明らかにされた耐性と本明細書で開示される2つの表現型感受性試験方法によって明らかにされた耐性との間の不一致は、主にeisプロモーター突然変異を有する単離株に関係していた。以前の研究は、eisプロモーター突然変異が比較的低レベルのKAN耐性を引き起こし、一方rss遺伝子突然変異がAMK、KANおよびCAPに対する高レベルの耐性をもたらすことを示している(Campbell 2011;Du,Q.,et al.,2013,Diagn Microbiol Infect Dis 77:138−142;Georghiou 2012;およびZaunbrecher 2009)。結果についてのさらなる知見は、LJ対MGITに基づく感受性試験結果の間の不一致であった。MIC試験は、rrsおよびeisプロモーター突然変異、ならびにLJおよびMGITシステムにおけるそれらの感受性パターンの間の関係をより慎重に探索するために行われた。AMKおよびKAN(およびターゲット領域の両方で野生型)の両方に対して感受性であるもの、または2つのターゲット遺伝子(rrs A1401Gならびにeis G(−10)A、C(−14)TおよびG(−37)T)における最も一般的な突然変異型を代表するように選択されるものいずれかであるサンプルは、MYCOTB法によって試験され、それらのMICを決定した。アッセイターゲットの両方における野生型として知られる追加の単離株もまた、コントロールとして試験された。eisプロモーター突然変異のみ(rrs突然変異なし)を有する単離株のAMK MICは、0.5μg/mlから1μg/mlのMICを示すサンプルの大部分で、0.25μg/mlおよび2μg/mlの間の範囲であることが観察された(図3)。一つのeisプロモーター突然変異体だけが4μg/mlのAMK MICを有した。eisプロモーターまたはrrs突然変異を有さないコントロールの単離株は、0.25μg/mlおよび0.5μg/mlの範囲の間にMICを有した。したがって、野生型または突然変異体のeisプロモーター配列のいずれかを有する単離株のAMK MICは、実質的に重複していた。一方、同じeisプロモーター突然変異のほとんどのKAN MICは、5μg/mlから20μg/mlの範囲であり、一つの単離株が40μg/mlのMICを示した(図3)。2つのeisプロモーター突然変異体だけが2.5μg/mlの低いMICを有した。野生型eisプロモーター配列を有する単離株は、eisプロモーター突然変異体の平均MICの2から30分の1である、0.6μg/mlおよび2.5μg/mlの間のMICを示した(図3)。したがって、AMKの状況とは対照的に、野生型単離体のKAN MICは、eisプロモーター突然変異体のKAN MICとほとんど重複しなかった。これらの結果は、耐性がLJに基づくまたはMGITに基づく感受性試験で検出されなくても、eisプロモーター突然変異体が小から中レベルKAN耐性を有すると考えられるべきであることを強く示唆する。
本アッセイの分析特異性は、ATCCリポジトリ(Manassas、Virginia、USA)から得られた非結核性マイコバクテリア(Mycobacteria)(NTM)の18種、26種を代表する121の臨床NTM株、ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌の18種のパネルに対して試験された。本アッセイでターゲットとするrrs領域は、異なるNTM種の間で高度に保存されている。したがって、rrsアッセイは、いかなるTmも生成しない、M・ゼノピ(M.xenopi)を除き、配列ホモロジーに基づいて予想されたとおり、試験したすべてのNTMについて70℃のTmを生成した(野生型M.tb DNAの存在下で生成されたTmと同一である)。アミノグリコシド感受性M.tbと同一のTm値を生成するNTM種は、偽の耐性試験結果の原因になるとは予想されない。rrs突然変異体AMKおよびKAN耐性株からのM.tb DNAが10から20倍過剰なNTM DNAと混合された場合、明確な二重Tmピークがアッセイによって生成され、M.tbターゲットからの突然変異体Tm値およびNTM配列からの野生型Tm値(データ示さず)に相当することは、耐性−関連rrs突然変異がNTM DNAの大きなバックグラウンドの存在下でさえ本アッセイによってM.tbで検出され得ることを示している。107ゲノム当量のDNAをPCRアッセイに添加した場合でさえ、試験した任意のNTM種の存在下で、eisプローブによって明らかな融解曲線は生成されなかった。グラム陽性またはグラム陰性菌のいずれも、rrsまたはeis SMBのいずれにもTm値を生成しなかった;したがって、それらは、アッセイによって生成されるべきいかなる偽の耐性コールを引き起こさなかった。
この実施例における研究は、AMKおよび/またはKANに対して耐性であるが、野生型rrs遺伝子およびeisプロモーター配列を有する22のサンプルを含んでいた。最近の研究により、whiB7遺伝子の5’非翻訳領域(UTR)での突然変異がM.tbにおけるアミノグリコシド耐性を引き起こすことが示唆されている。whiB7突然変異が表現型の上では耐性であるがアッセイ−感受性である単離株のいくつかの原因でありうるかどうかを決定するために、22サンプル全ては、whiB7遺伝子開始部位の上流412bp領域、加えてwhiB7オープンリーディングフレームの一部分において、配列決定された。コントロールセットとして、30のランダムに選別された総感受性単離株もまた、配列決定された。22の不一致な単離株のうち、3人の患者からの6の単離株がwhiB7 5’UTR領域において突然変異を示した。転写開始部位を+1と考えると、1つのサンプルは、5’UTRの+138位にシトシン欠失を有し、一人の患者からの2つのサンプルは、+237位にAからGの突然変異を含み、ただ一人の患者からの残りの3つのサンプルは、+237位にAからGの突然変異を示した(表5)(Reeves,A.Z.,2013,57:1857−1865)。ただ一人の患者からの3つのサンプルは、機能するポジティブPCRコントロールにもかかわらず、繰り返しPCRを試した後、5’UTRからのいかなる増幅も生成しなかった。これは、275bpの断片が3つのサンプル全てについてwhiB7 ORF内から容易に増幅されうるため、5’UTR領域での大きな欠失の存在を示唆した。whiB7突然変異を有するすべてのサンプルは、eis遺伝子の上方制御によって推定されるwhiB7作用機序と一致するKANに対してのみ耐性であった(Reeves 2013)。これらの単離株についてのKAN MICはまた、5μg/mlと低く、これはeisプロモーター突然変異株で観察されたものと同じであった。アミノグリコシドに感受性である30のコントロールサンプルのいずれも、whiB7遺伝子の5’UTRにいかなる突然変異も有していなかった。これらの突然変異とアミノグリコシド耐性を有するwhiB7遺伝子の5’UTRにおける欠失との関係を確認するために、さらなる研究が必要である。しかし、感受性株にかかる突然変異が存在しないことは、それらがアミノグリコシド耐性において何らかの役割を有するであろうことを暗示し、さらなるアッセイが低レベルKAN耐性を検出するための感受性を改善するためにこれらの突然変異をターゲットにすることができる。
プローブ番号1、2および3は、それぞれrrs−1400、eis−1およびeis−2プローブに対応する。
Claims (28)
- rpoB遺伝子、gyrA遺伝子、gyrB遺伝子、inhAプロモーター、rrs遺伝子、eisプロモーター、embB遺伝子、katG遺伝子、dosR遺伝子、IS6110遺伝子およびIS1081遺伝子からなる群から選択される結核菌(M.tuberculosis)領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであって、
前記一部分に特異的な一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、各プライマーは、表1Aおよび表1Bに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有する、オリゴヌクレオチドセット。 - 前記配列が表1Aおよび表1Bに記載のものから選択される前記オリゴヌクレオチド配列と同一である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドセット。
- 表2に記載のものから選択される配列と実質的に同一である配列を含む、単離された核酸。
- 表2に記載のものから選択される一つの配列を含む、請求項3に記載の核酸。
- 前記核酸がラベル化されている、請求項3または4に記載の核酸。
- 前記核酸が2つの末端それぞれでフルオロフォアおよびクエンチャーでラベル化されている、請求項5に記載の核酸。
- 前記フルオロフォアがフルオレセイン、シアニン5、またはTexasRed(登録商標)もしくはTAMRAである、請求項6に記載の核酸。
- 前記クエンチャーがBHQ1、BHQ2またはDABCYLである、請求項6に記載の核酸。
- 請求項1もしくは2に記載のオリゴヌクレオチドセットまたは請求項3〜8のいずれか1項に記載の核酸を含む、キット。
- DNAポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 第1のプライマー対で第1の核酸ターゲット配列を増幅して、第1の単位複製配列を生成すること、および
前記第1の単位複製配列における突然変異を検出することを含み、
前記第1のプライマー対がrpoB遺伝子、gyrA遺伝子、gyrB遺伝子、inhAプロモーター、rrs遺伝子、eisプロモーター、embB遺伝子およびkatG遺伝子からなる群から選択される領域の一部分に特異的であり、各プライマーは、表1Aおよび表1Bに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有し、
前記突然変異の存在が薬剤耐性を示す、
結核菌(M.tuberculosis)における薬剤耐性を検出する方法。 - 前記検出する工程をシークエンシングにより行う、請求項11に記載の方法。
- 前記検出する工程を以下:
ハイブリダイゼーションを促す条件下で、前記第1の単位複製配列と前記突然変異に特異的な第1のプローブとを接触させて、プローブ−ターゲットハイブリットを形成すること;
融解温度(Tm)分析を行い、前記プローブ−ターゲットハイブリットのためのテストTm値(test Tm value)を決定すること;および
前記テストTm値と所定の基準Tm値とを比較すること、を含み、
前記テストTm値は、前記所定の基準Tm値と異なる場合、突然変異の存在を示す、
のプロセスにより行う、請求項11に記載の方法。 - 前記テストTm値が、前記所定の基準Tm値より小さい場合、突然変異の存在を示す、請求項13に記載の方法。
- 第2のプライマー対で第2の核酸ターゲット配列を増幅して、第2の単位複製配列を生成することをさらに含み、
前記第2のプライマー対がrpoB遺伝子、gyrA遺伝子、gyrB遺伝子、inhAプロモーター、rrs遺伝子、eisプロモーター、embB遺伝子、およびkatG遺伝子からなる群から選択される第2の領域の一部分に特異的である、
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1の領域が前記rss遺伝子または前記eisプロモーターである、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の領域が前記rss遺伝子である、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の領域が前記eisプロモーターである、請求項17に記載の方法。
- 前記突然変異が前記rrs遺伝子におけるA1401GまたはC1402Tである、請求項16に記載の方法。
- 前記突然変異がeisプライマー配列によりクエリされるeisプロモーター領域内にある、請求項17に記載の方法。
- 前記耐性がイソニアジド、リファンピシン、フルオロキノロン類の薬剤、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、およびエタンブトールからなる群から選択される薬剤に対するものである、請求項11〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマー対が表1Aおよび表1Bに記載のものから選択される一つである、請求項11〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブが表2に記載のものから選択される一つと実質的に同一であるまたは完全に同一である配列を含む、請求項13〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅反応を促す条件下、テストサンプルと第1のプライマー対とを接触させて、第1の単位複製配列を得ること、および
前記単位複製配列の存在を検出して、それによって前記テストサンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の存在を検出すること、を含み、
前記第1のプライマー対がgyrB遺伝子、inhAプロモーター、eisプロモーター、embB遺伝子、katG遺伝子、dosR遺伝子、IS6110遺伝子、およびIS1081遺伝子からなる群から選択される結核菌(M.tuberculosis)領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであり、
前記第1のプライマー対の各プライマーが表1Bに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有する、
テストサンプルにおける結核菌(M.tuberculosis)の存在を検出する方法。 - 前記プライマー対が表1Bに記載のものから選択される一つである、請求項24に記載の方法。
- 増幅反応を促す条件下、前記テストサンプルと第2のプライマー対とを接触させて、第2の単位複製配列を得ること、および
前記第2の単位複製配列の存在を検出すること、をさらに含み、
前記第1の単位複製配列および第2の単位複製配列の両方の存在がテストサンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の存在を示す、
請求項24または25に記載の方法。 - ハイブリッド形成反応を促す条件下、テストサンプルと第1の分子ビーコンプローブとを接触させて、プローブ−ターゲットハイブリッドを得ること、および
前記プローブ−ターゲットハイブリッドの存在を検出して、それによってテストサンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の存在を検出すること、を含み、
前記第1の分子ビーコンプローブが表2に記載のものから選択される一つと実質的に同一である配列を含む、
テストサンプルにおける結核菌(M.tuberculosis)の存在を検出する方法。 - 前記第1の分子ビーコンプローブが配列番号67〜69からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020100009A JP7432237B2 (ja) | 2014-10-10 | 2020-06-09 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
JP2023201360A JP2024026210A (ja) | 2014-10-10 | 2023-11-29 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462062351P | 2014-10-10 | 2014-10-10 | |
US62/062,351 | 2014-10-10 | ||
PCT/US2015/054916 WO2016057905A1 (en) | 2014-10-10 | 2015-10-09 | Polymerase chain reaction primers and probes for mycobacterium tuberculosis |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020100009A Division JP7432237B2 (ja) | 2014-10-10 | 2020-06-09 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017530710A true JP2017530710A (ja) | 2017-10-19 |
JP6835712B2 JP6835712B2 (ja) | 2021-02-24 |
Family
ID=55653846
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017518819A Active JP6835712B2 (ja) | 2014-10-10 | 2015-10-09 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
JP2020100009A Active JP7432237B2 (ja) | 2014-10-10 | 2020-06-09 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
JP2023201360A Pending JP2024026210A (ja) | 2014-10-10 | 2023-11-29 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020100009A Active JP7432237B2 (ja) | 2014-10-10 | 2020-06-09 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
JP2023201360A Pending JP2024026210A (ja) | 2014-10-10 | 2023-11-29 | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11180816B2 (ja) |
EP (2) | EP3204517B1 (ja) |
JP (3) | JP6835712B2 (ja) |
CN (2) | CN116042880A (ja) |
AU (1) | AU2015330738B2 (ja) |
BR (1) | BR112017007229A2 (ja) |
CA (1) | CA2964265A1 (ja) |
ES (1) | ES2896198T3 (ja) |
LT (1) | LT3204517T (ja) |
PT (1) | PT3204517T (ja) |
RU (1) | RU2717655C2 (ja) |
WO (1) | WO2016057905A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101962831B1 (ko) * | 2017-11-13 | 2019-03-27 | 연세대학교 원주산학협력단 | 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 및 비결핵항산균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 퀴놀론계, 아미노글라이코사이드계 항생제항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
KR102030005B1 (ko) * | 2018-05-24 | 2019-11-08 | 연세대학교 원주산학협력단 | 개선된 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신와 같은 이차 주사제 및 스트렙토마이신 약제에 대한 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JOP20160086B1 (ar) | 2015-05-08 | 2021-08-17 | 2 Katholieke Univ Leuven Ku Leuven Research And Development | مشتقات اندول مستبدلة احاديا او ثنائيا بصفتها مانعات للتكاثر الفيروسي لحمى الفنك |
CN107557435B (zh) * | 2017-10-08 | 2021-04-06 | 福建医科大学 | MC-ARMS-mMB三联技术在耐药结核菌诊断试剂盒的制备方法和应用 |
CN108192989A (zh) * | 2018-03-28 | 2018-06-22 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒 |
SG11202111871WA (en) * | 2019-05-03 | 2021-11-29 | Meso Scale Technologies Llc | Kits for detecting one or more target nucleic acid analytes in a sample and methods of making and using the same |
US20230087018A1 (en) * | 2020-02-06 | 2023-03-23 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Crispr-based assay for detecting tb in bodily fluids |
CN112481399B (zh) * | 2020-12-21 | 2022-08-30 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 |
CN112680534B (zh) * | 2021-01-21 | 2022-10-28 | 哈尔滨医科大学 | 一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用 |
CN112725486A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-30 | 四川大学华西医院 | 一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法 |
CN115992272B (zh) * | 2022-10-17 | 2023-08-04 | 杭州遂真生物技术有限公司 | 用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物及一体式试剂盒 |
CN117070645A (zh) * | 2023-07-25 | 2023-11-17 | 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 | 检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10500857A (ja) * | 1994-06-09 | 1998-01-27 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | ミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルの検出方法 |
JP2001103981A (ja) * | 1999-08-03 | 2001-04-17 | Nisshinbo Ind Inc | 結核菌診断キット |
CN1351176A (zh) * | 2000-10-31 | 2002-05-29 | 杨梦甦 | 诊断结核杆菌及其耐药性的dna芯片 |
JP2003500038A (ja) * | 1999-05-24 | 2003-01-07 | ザ・パブリック・ヘルス・リサーチ・インスティテュート・オブ・ザ・シティ・オブ・ニュー・ヨーク・インコーポレーテッド | 高い特異性を有するプライマー、増幅法およびキット |
US20130244887A1 (en) * | 2010-04-29 | 2013-09-19 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid genotyping analysis and devices thereof |
WO2013155189A1 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-17 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Detection of drug resistant mycobacterium tuberculosis |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6060237A (en) | 1985-02-26 | 2000-05-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for optical detection of nucleic acid hybridization |
US5541308A (en) * | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
US5652106A (en) | 1993-06-04 | 1997-07-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Rapid amplification-based subtyping of mycobacterium tuberculosis |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US6235479B1 (en) * | 1999-04-13 | 2001-05-22 | Bio Merieux, Inc. | Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample |
EP1076099A3 (en) * | 1999-08-03 | 2003-03-05 | Nisshinbo Industries, Inc. | Kit for diagnosis of tubercle bacilli |
CA2387306C (en) | 1999-10-22 | 2010-04-27 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Assays for short sequence variants |
CN1153969C (zh) | 2001-04-13 | 2004-06-16 | 中国科学院上海冶金研究所 | 结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法 |
US7226732B2 (en) * | 2001-07-16 | 2007-06-05 | Cepheid | Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe |
US20060121487A1 (en) | 2002-12-27 | 2006-06-08 | David Alland | Method for single nucleotide polymorphism detection |
GB0403039D0 (en) | 2004-02-11 | 2004-03-17 | Health Prot Agency | TB resistance assay |
DE602005025791D1 (de) | 2004-10-18 | 2011-02-17 | Univ Brandeis | Verfahren zur nukleinsäureamplifikation |
CN101168767A (zh) | 2006-10-25 | 2008-04-30 | 复旦大学附属华山医院 | 一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒 |
WO2010030049A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Lg Life Sciences, Ltd. | Composition for detection of m. tuberculosis complex or mycobacteria genus and simultaneous detection method for m. tuberculosis complex and mycobacteria genus with multiplex real time pcr using the same |
CN101580879B (zh) | 2009-04-30 | 2012-04-11 | 广西医科大学 | 检测结核杆菌耐药基因膜芯片 |
WO2011140237A2 (en) | 2010-05-04 | 2011-11-10 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
CN101845503B (zh) * | 2010-06-10 | 2013-02-06 | 无锡锐奇基因生物科技有限公司 | 检测耐药结核分枝杆菌(mdr-tb)的试剂盒 |
KR101261292B1 (ko) | 2010-06-28 | 2013-05-06 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 실시간 pcr을 이용한 미코박테리움 속 균종의 동시 감별 방법 및 이를 위한 키트 |
CN103025893A (zh) * | 2010-07-29 | 2013-04-03 | 彼格泰格私人有限公司 | 用于登革热检测的探针和引物 |
ES2689257T3 (es) | 2010-11-10 | 2018-11-12 | Brandeis University | Kit para la detección e identificación de micobacterias |
CN103045716B (zh) | 2011-10-11 | 2015-04-08 | 上海市肺科医院 | 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法 |
CN103184270A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 检测结核分枝杆菌(tb)的耐药基因突变型的方法和试剂盒 |
CN102559916B (zh) * | 2012-02-24 | 2014-04-16 | 孙爱华 | 一种结核分枝杆菌耐多药检测方法 |
TWM467671U (zh) | 2012-09-14 | 2013-12-11 | Fooyin University Hospital | 結核病快速診斷及藥效檢測結構 |
RU127074U1 (ru) | 2012-12-27 | 2013-04-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России) | Молекулярно-генетическая тест-система для экспресс-определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам группы фторхинолонов, аминогликозидам (амикацину, канамицину) и капреомицину |
WO2014139330A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid genotyping analysis and kits thereof |
-
2015
- 2015-10-09 WO PCT/US2015/054916 patent/WO2016057905A1/en active Application Filing
- 2015-10-09 BR BR112017007229-7A patent/BR112017007229A2/pt active Search and Examination
- 2015-10-09 ES ES15848780T patent/ES2896198T3/es active Active
- 2015-10-09 RU RU2017113727A patent/RU2717655C2/ru active
- 2015-10-09 LT LTEPPCT/US2015/054916T patent/LT3204517T/lt unknown
- 2015-10-09 CN CN202310103213.6A patent/CN116042880A/zh active Pending
- 2015-10-09 AU AU2015330738A patent/AU2015330738B2/en active Active
- 2015-10-09 US US15/517,042 patent/US11180816B2/en active Active
- 2015-10-09 JP JP2017518819A patent/JP6835712B2/ja active Active
- 2015-10-09 EP EP15848780.1A patent/EP3204517B1/en active Active
- 2015-10-09 PT PT158487801T patent/PT3204517T/pt unknown
- 2015-10-09 CA CA2964265A patent/CA2964265A1/en active Pending
- 2015-10-09 EP EP21186118.2A patent/EP3957753A1/en active Pending
- 2015-10-09 CN CN201580067512.2A patent/CN107002148B/zh active Active
-
2020
- 2020-06-09 JP JP2020100009A patent/JP7432237B2/ja active Active
-
2021
- 2021-11-16 US US17/527,576 patent/US20220064715A1/en active Pending
-
2023
- 2023-11-29 JP JP2023201360A patent/JP2024026210A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10500857A (ja) * | 1994-06-09 | 1998-01-27 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | ミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルの検出方法 |
JP2003500038A (ja) * | 1999-05-24 | 2003-01-07 | ザ・パブリック・ヘルス・リサーチ・インスティテュート・オブ・ザ・シティ・オブ・ニュー・ヨーク・インコーポレーテッド | 高い特異性を有するプライマー、増幅法およびキット |
JP2001103981A (ja) * | 1999-08-03 | 2001-04-17 | Nisshinbo Ind Inc | 結核菌診断キット |
CN1351176A (zh) * | 2000-10-31 | 2002-05-29 | 杨梦甦 | 诊断结核杆菌及其耐药性的dna芯片 |
US20130244887A1 (en) * | 2010-04-29 | 2013-09-19 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid genotyping analysis and devices thereof |
WO2013155189A1 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-17 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Detection of drug resistant mycobacterium tuberculosis |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANTONOVA O. V. ET AL.: "Detection of Mutations in Mycobacterium tuberculosis Genome Determining Resistance to Fluoroquinolon", BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 145, no. 1, JPN6019035788, 2008, pages 108 - 113, ISSN: 0004360627 * |
CHAKRAVORTY S. ET AL.: "Rapid Detection of Fluoroquinolone-Resistant and Heteroresistant Mycobacterium tuberculosis by Use o", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 49, no. 3, JPN6019035786, 2011, pages 932 - 940, XP055225174, ISSN: 0004360626, DOI: 10.1128/JCM.02271-10 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101962831B1 (ko) * | 2017-11-13 | 2019-03-27 | 연세대학교 원주산학협력단 | 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 및 비결핵항산균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 퀴놀론계, 아미노글라이코사이드계 항생제항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
KR102030005B1 (ko) * | 2018-05-24 | 2019-11-08 | 연세대학교 원주산학협력단 | 개선된 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신와 같은 이차 주사제 및 스트렙토마이신 약제에 대한 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
WO2019225959A1 (ko) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | 연세대학교 원주산학협력단 | 개선된 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵균 검출 및 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 에탐부톨, 퀴놀론, 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신와 같은 이차 주사제 및 스트렙토마이신 약제에 대한 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2017113727A (ru) | 2018-11-13 |
EP3204517B1 (en) | 2021-08-11 |
CA2964265A1 (en) | 2016-04-14 |
CN116042880A (zh) | 2023-05-02 |
JP2020168007A (ja) | 2020-10-15 |
JP2024026210A (ja) | 2024-02-28 |
EP3204517A1 (en) | 2017-08-16 |
JP7432237B2 (ja) | 2024-02-16 |
EP3957753A1 (en) | 2022-02-23 |
PT3204517T (pt) | 2021-11-16 |
BR112017007229A2 (pt) | 2021-02-09 |
US20170247747A1 (en) | 2017-08-31 |
EP3204517A4 (en) | 2018-07-04 |
CN107002148B (zh) | 2023-02-17 |
WO2016057905A1 (en) | 2016-04-14 |
AU2015330738A1 (en) | 2017-05-04 |
US20220064715A1 (en) | 2022-03-03 |
US11180816B2 (en) | 2021-11-23 |
AU2015330738B2 (en) | 2021-10-14 |
ES2896198T3 (es) | 2022-02-24 |
RU2017113727A3 (ja) | 2019-05-20 |
RU2717655C2 (ru) | 2020-03-24 |
JP6835712B2 (ja) | 2021-02-24 |
CN107002148A (zh) | 2017-08-01 |
LT3204517T (lt) | 2021-11-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7432237B2 (ja) | 結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ | |
JP6574703B2 (ja) | 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリdnaを検出するための方法 | |
JP6007652B2 (ja) | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 | |
US20220136046A1 (en) | Detection and antibiotic resistance profiling of microorganisms | |
US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
KR20160009397A (ko) | 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 | |
JP2024507981A (ja) | うつ病の診断及び抗うつ剤治療に対する応答の予測のための環状rna | |
WO2018065830A1 (en) | Multiplex realtime pcr kit for diagnosing multidrug resistance (mdr) and extensively drug resistance (xdr) tuberculosis | |
WO2013157215A1 (ja) | 子宮体がん発症感受性の判定方法 | |
KR20200048076A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
FI126289B (en) | Method for detecting the presence of a hypervirulent Clostridium difficile strain | |
US10190176B2 (en) | Primers, probes, and methods for mycobacterium tuberculosis specific diagnosis | |
WO2022203008A1 (ja) | 敗血症の原因細菌を同定する方法及びキット | |
WO2009087688A2 (en) | Method for detection of nucleic acid of mycobacterium and uses thereof | |
RU2636458C1 (ru) | Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий | |
JP6672760B2 (ja) | 病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法 | |
RU2548797C2 (ru) | Способ одновременной амплификации и флуоресцентного маркирования нескольких сегментов генома микобактерий туберкулезного комплекса | |
KR20230037111A (ko) | 대사증후군 특이적 후성유전 메틸화 마커 및 이의 용도 | |
JP2012249629A (ja) | HGF遺伝子のpolyArepeat数変異多型検出用プローブおよびその用途 | |
JP2006280273A (ja) | 新規ポリヌクレオチド、それを用いた深在性輸入真菌症原因菌ヒストプラズマ属菌(Histoplasma属菌には、Histoplasmacapsulatumvar.capsulatum,Histoplasmacapsulatumvar.farciminosum,Histoplasmacapsulatumvar.duboisiiと有性世代の菌名であるEmmonsiellacapsulataを含む)の検出用マーカ、プローブ、プライマー、検出方法およびキット | |
US20160102369A1 (en) | Detection of echinocandin-resistant candida glabrata | |
AU2018350052A1 (en) | Meca gene amplification primer pair, meca gene detection kit and meca gene detection method |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170818 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180928 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190917 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191209 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200609 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200609 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200611 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200707 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200714 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201006 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201104 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210112 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210204 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6835712 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |