JP2003500038A - 高い特異性を有するプライマー、増幅法およびキット - Google Patents
高い特異性を有するプライマー、増幅法およびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長過程を含む核酸増幅のための、特異性の高いプライマーを提供する。該プライマーはある種のヘアピン構造を含み、その構造では一重鎖ループ構造が相補的な3'および5'アームを分離し、該ループおよび該3'アームは標的核酸に対して相補的である。そのようなプライマーを含む増幅方法、アッセイ、およびキットが本発明で提供される。
Description
【０００１】
本発明は標的配列の増幅を含む核酸の検出法に関する。
【０００２】本発明の背景
DNAプライマーおよびDNAポリメラーゼを用いる増幅法は標的核酸配列を検出す
るための技法としてよく知られている。指数関数的増幅のための方法としては、
ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、ストランド置換反応(strand displacement ampl
ifiction (SDA))、核酸配列ベース増幅(nucleic acid sequence-based amplific
ation (NASBA))、転写介在増幅(transcription-mediated amplification (TMA))
、およびローリングサイクル増幅(rolling-cycle amplification (RCA))が挙げ
られる。多数のDNAポリメラーゼのうち、Thermus aquaticusのDNAポリメラーゼ
、および逆転写酵素が一般的に用いられている。直鎖状のDNAオリゴヌクレオチ
ド増幅プライマーのデザインは通常はその目的のためにデザインされたコンピュ
ータープログラムの助けを借りて行われる。利用可能なプログラムとしては、PR
IDE(Haasら, 1998)、OLIGO(Rychlikら, 1989)、OSP(Hilberら, 1991)、Primo(Li
ら, 1997)、およびPrimer Master(Proutskiら, 1996)がある。
るための技法としてよく知られている。指数関数的増幅のための方法としては、
ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、ストランド置換反応(strand displacement ampl
ifiction (SDA))、核酸配列ベース増幅(nucleic acid sequence-based amplific
ation (NASBA))、転写介在増幅(transcription-mediated amplification (TMA))
、およびローリングサイクル増幅(rolling-cycle amplification (RCA))が挙げ
られる。多数のDNAポリメラーゼのうち、Thermus aquaticusのDNAポリメラーゼ
、および逆転写酵素が一般的に用いられている。直鎖状のDNAオリゴヌクレオチ
ド増幅プライマーのデザインは通常はその目的のためにデザインされたコンピュ
ータープログラムの助けを借りて行われる。利用可能なプログラムとしては、PR
IDE(Haasら, 1998)、OLIGO(Rychlikら, 1989)、OSP(Hilberら, 1991)、Primo(Li
ら, 1997)、およびPrimer Master(Proutskiら, 1996)がある。
【０００３】
よくある問題点は「プライマーダイマー」として知られている。プライマーダ
イマーは、2つのプライマーがオーバーハングのある状態でお互いにハイブリダ
イズし、それによってポリメラーゼの結合部位が作られ、DNAの合成が開始され
るために作られる偽の増幅産物(アンプリコン)である。プライマーダイマーは、
目的の増幅と競合し、通常はアッセイの信頼性と感度を低下させる。もう1つの
ある問題点は、そのプライマーに対して部分的に相補的なサンプル中の配列のミ
スプライミングである。これによっても偽の増幅産物が生じ、信頼性と感度が低
下する。
イマーは、2つのプライマーがオーバーハングのある状態でお互いにハイブリダ
イズし、それによってポリメラーゼの結合部位が作られ、DNAの合成が開始され
るために作られる偽の増幅産物(アンプリコン)である。プライマーダイマーは、
目的の増幅と競合し、通常はアッセイの信頼性と感度を低下させる。もう1つの
ある問題点は、そのプライマーに対して部分的に相補的なサンプル中の配列のミ
スプライミングである。これによっても偽の増幅産物が生じ、信頼性と感度が低
下する。
【０００４】
標的増幅法の適用用途の主要なものの１つはin vitroの診断である。核酸をベ
ースとする技法による病的状態の診断においては、病原体由来のユニークな核酸
配列が臨床で採取されたサンプル中の核酸全体の中のまれな構成成分であること
が一般的な状況である。例えば、マラリア原虫のゲノムDNAは患者の血液から抽
出されるDNA全体の非常に小さな画分を占める。まれにしか存在しない、病因と
なる標的配列の増幅は、ある場合には検出のための有効な方法となるが、それは
豊富に存在するヒトの配列を診断目的のために十分な程度に無視するようにプラ
イマーをデザインすることができるからである。しかし、まれな標的配列が豊富
に存在する配列と類似しているような状況も多数存在し、ある場合にはヌクレオ
チド1個のみが相異する。例えば、ある種のヒトの癌は遺伝子中のわずか1個のヌ
クレオチドの位置における変化によって特徴づけられている(Lengauerら, 1998)
。これらの癌を早期の段階で検出するため、または腫瘍を外科的に除去した後に
残存したものがないか検出するために、豊富に存在する配列との相異がヌクレオ
チド1個分である、まれな配列を検出することが必要である。癌の存在を示す配
列がまれなものである場合には、その配列を検出する困難性は時に「最小残基疾
患問題(minimal residual disease problem)」と言われる。患者が薬剤での治療
を受ける際に、薬剤耐性細菌もしくはウイルスの出現をできるだけ早期に検出す
る必要がある場合には同様な問題が生じるが、それは多数の薬剤耐性遺伝子型は
、病原性配列中で1個のヌクレオチドのみの置換によって特徴づけられるからで
ある。上述の用途などに適用するためには、単一標的増幅法は効果的ではない。
なぜならば、プライマーが1個のヌクレオチドのみの置換によって互いに相異し
ている2つの配列を十分に区別できないからである。
ースとする技法による病的状態の診断においては、病原体由来のユニークな核酸
配列が臨床で採取されたサンプル中の核酸全体の中のまれな構成成分であること
が一般的な状況である。例えば、マラリア原虫のゲノムDNAは患者の血液から抽
出されるDNA全体の非常に小さな画分を占める。まれにしか存在しない、病因と
なる標的配列の増幅は、ある場合には検出のための有効な方法となるが、それは
豊富に存在するヒトの配列を診断目的のために十分な程度に無視するようにプラ
イマーをデザインすることができるからである。しかし、まれな標的配列が豊富
に存在する配列と類似しているような状況も多数存在し、ある場合にはヌクレオ
チド1個のみが相異する。例えば、ある種のヒトの癌は遺伝子中のわずか1個のヌ
クレオチドの位置における変化によって特徴づけられている(Lengauerら, 1998)
。これらの癌を早期の段階で検出するため、または腫瘍を外科的に除去した後に
残存したものがないか検出するために、豊富に存在する配列との相異がヌクレオ
チド1個分である、まれな配列を検出することが必要である。癌の存在を示す配
列がまれなものである場合には、その配列を検出する困難性は時に「最小残基疾
患問題(minimal residual disease problem)」と言われる。患者が薬剤での治療
を受ける際に、薬剤耐性細菌もしくはウイルスの出現をできるだけ早期に検出す
る必要がある場合には同様な問題が生じるが、それは多数の薬剤耐性遺伝子型は
、病原性配列中で1個のヌクレオチドのみの置換によって特徴づけられるからで
ある。上述の用途などに適用するためには、単一標的増幅法は効果的ではない。
なぜならば、プライマーが1個のヌクレオチドのみの置換によって互いに相異し
ている2つの配列を十分に区別できないからである。
【０００５】
この問題に対処するために2種類のアプローチが用いられてきた。第1は増幅に
必要な2個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの1個をヌクレオチドの置換部
位を包含する配列で標的に結合するようにデザインすることである。そのプライ
マーが目的の標的配列に対して完全に相補的な場合には、プライマー−標的ハイ
ブリッドが形成され、標的核酸配列の増幅されたコピーが作成される。ヌクレオ
チドの置換が存在している場合には、ミスマッチしたプライマー−標的ハイブリ
ッドが形成されず、その核酸配列の増幅コピーが作成されなくなることが望まし
い。しかし、この二分法は実際にはうまく働かず、変異型および野生型の鋳型の
双方が増幅される。完全なおよびミスマッチの標的増幅産物（アンプリコン）は
互いに区別が付かない。サンプル中にミスマッチの標的配列のみが存在している
としても、そのプライマーは時にはそのミスマッチの標的配列のDNA合成を開始
してしまう。その結果得られる産物は用いたプライマー配列の完全な相補物を含
有しているので、この初回産物の指数関数的な増幅が急速に起こる。標的配列中
の変異を検出するために用いられる第2のアプローチは、変異を有している可能
性のある配列の外側に結合するプライマーを用いてその変異の部位を含む配列が
結果として得られる増幅産物の一部となるようにすることである。次いで別のハ
イブリダイゼーションプローブを用いてその増幅産物の内部に変異が存在するか
否かを調べる。変異を有している増幅産物の比率は出発サンプル中の変異の相対
量もしくは絶対量の尺度である。このアプローチは多くの状況下でうまく働くが
(Tyagiら, 1996、Tyagiら, 1998)、感度の点では限界がある：変異を含む増幅産
物が全増幅産物の2〜3%未満である場合には、検出することができない。
必要な2個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの1個をヌクレオチドの置換部
位を包含する配列で標的に結合するようにデザインすることである。そのプライ
マーが目的の標的配列に対して完全に相補的な場合には、プライマー−標的ハイ
ブリッドが形成され、標的核酸配列の増幅されたコピーが作成される。ヌクレオ
チドの置換が存在している場合には、ミスマッチしたプライマー−標的ハイブリ
ッドが形成されず、その核酸配列の増幅コピーが作成されなくなることが望まし
い。しかし、この二分法は実際にはうまく働かず、変異型および野生型の鋳型の
双方が増幅される。完全なおよびミスマッチの標的増幅産物（アンプリコン）は
互いに区別が付かない。サンプル中にミスマッチの標的配列のみが存在している
としても、そのプライマーは時にはそのミスマッチの標的配列のDNA合成を開始
してしまう。その結果得られる産物は用いたプライマー配列の完全な相補物を含
有しているので、この初回産物の指数関数的な増幅が急速に起こる。標的配列中
の変異を検出するために用いられる第2のアプローチは、変異を有している可能
性のある配列の外側に結合するプライマーを用いてその変異の部位を含む配列が
結果として得られる増幅産物の一部となるようにすることである。次いで別のハ
イブリダイゼーションプローブを用いてその増幅産物の内部に変異が存在するか
否かを調べる。変異を有している増幅産物の比率は出発サンプル中の変異の相対
量もしくは絶対量の尺度である。このアプローチは多くの状況下でうまく働くが
(Tyagiら, 1996、Tyagiら, 1998)、感度の点では限界がある：変異を含む増幅産
物が全増幅産物の2〜3%未満である場合には、検出することができない。
【０００６】
希少である、すなわち野生型配列の2〜3%、この量はハイブリダイゼーション
プローブによる検出には必要な量であるが、これより少量しか存在しない変異型
を検出するためには、"amplification refractory mutation system"(ARMS)が用
いられてきた(Newtonら, 1989; Wuら, 1989)。この方法では2つの増幅反応が別
々の反応管で行われる。2つの反応の相異はプライマーの一方が各試験管内でわ
ずかに異なることを意味する。2つのプライマー間の相異はそれらの3'末端にあ
る。一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレオチドは野生型ヌクレオチドとその
変異の起こる部位で相補的であり、もう一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレ
オチドは変異の部位で変異型ヌクレオチドと相補的である。もし反応管中のその
プライマーが標的配列に対してそのプライマーの3'末端のヌクレオチドを含めて
完全に相補的であるならば、そのプライマーはDNAポリメラーゼとインキュベー
トすることによって効果的に伸長させることができる。しかし、反応管内のプラ
イマーの標的配列との結合がミスマッチした3'末端ヌクレオチドを作る場合には
、プライマーはDNAポリメラーゼとのインキュベーションによって効果的に伸長
させることはできない。ミスマッチの鋳型の増幅は著しく遅くなる、すなわち、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅で増幅産物が検出可能となるまでに必要な熱サ
イクルの数(もしくは等温増幅で増幅産物の量が検出可能な程度に生成されるた
めにかかる時間)が、プライマーの3'ヌクレオチドがサンプル中に存在する配列
と相補的でない場合には著しく大きくなる。
プローブによる検出には必要な量であるが、これより少量しか存在しない変異型
を検出するためには、"amplification refractory mutation system"(ARMS)が用
いられてきた(Newtonら, 1989; Wuら, 1989)。この方法では2つの増幅反応が別
々の反応管で行われる。2つの反応の相異はプライマーの一方が各試験管内でわ
ずかに異なることを意味する。2つのプライマー間の相異はそれらの3'末端にあ
る。一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレオチドは野生型ヌクレオチドとその
変異の起こる部位で相補的であり、もう一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレ
オチドは変異の部位で変異型ヌクレオチドと相補的である。もし反応管中のその
プライマーが標的配列に対してそのプライマーの3'末端のヌクレオチドを含めて
完全に相補的であるならば、そのプライマーはDNAポリメラーゼとインキュベー
トすることによって効果的に伸長させることができる。しかし、反応管内のプラ
イマーの標的配列との結合がミスマッチした3'末端ヌクレオチドを作る場合には
、プライマーはDNAポリメラーゼとのインキュベーションによって効果的に伸長
させることはできない。ミスマッチの鋳型の増幅は著しく遅くなる、すなわち、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅で増幅産物が検出可能となるまでに必要な熱サ
イクルの数(もしくは等温増幅で増幅産物の量が検出可能な程度に生成されるた
めにかかる時間)が、プライマーの3'ヌクレオチドがサンプル中に存在する配列
と相補的でない場合には著しく大きくなる。
【０００７】
ARMSプライマーおよび従来のプライマーは共に擬陽性のシグナルを生じやすい
が、それはそれらが目的ではない増幅産物の指数関数的増殖を完全に相補的な標
的配列がなくとも開始できるからである。これらの「偽の増幅産物」はプライマ
ーの3'末端領域が、サンプル中に存在する標的とは無関係の、部分的に相補的な
配列と結合しうるために生ずる。「偽の増幅産物」はまた、1つのプライマー分
子が別のプライマー分子と結合し、その結果DNA合成が開始されること(プライマ
ーダイマー)からも生ずる。どちらの場合においても、結果として得られる伸長
産物は通常どおり指数関数的に増幅することができ、その結果、偽の増幅産物が
合成される。偽の増幅産物の生成は、目的の増幅産物の同定を困難にするのみな
らず、アッセイの感度を制限するが、それは偽の増幅産物が目的の増幅産物と競
合し、それによって目的の増幅産物の量を低減させるためである。例えば、ある
まれな標的配列のバックグラウンド値より高い検出可能な量となるまでの増幅に
38サイクルのPCRが必要で、反応液中の偽の増幅産物は35サイクルで検出可能と
なるとすれば、そのまれな標的配列は検出可能なレベルに達しないこととなる。
が、それはそれらが目的ではない増幅産物の指数関数的増殖を完全に相補的な標
的配列がなくとも開始できるからである。これらの「偽の増幅産物」はプライマ
ーの3'末端領域が、サンプル中に存在する標的とは無関係の、部分的に相補的な
配列と結合しうるために生ずる。「偽の増幅産物」はまた、1つのプライマー分
子が別のプライマー分子と結合し、その結果DNA合成が開始されること(プライマ
ーダイマー)からも生ずる。どちらの場合においても、結果として得られる伸長
産物は通常どおり指数関数的に増幅することができ、その結果、偽の増幅産物が
合成される。偽の増幅産物の生成は、目的の増幅産物の同定を困難にするのみな
らず、アッセイの感度を制限するが、それは偽の増幅産物が目的の増幅産物と競
合し、それによって目的の増幅産物の量を低減させるためである。例えば、ある
まれな標的配列のバックグラウンド値より高い検出可能な量となるまでの増幅に
38サイクルのPCRが必要で、反応液中の偽の増幅産物は35サイクルで検出可能と
なるとすれば、そのまれな標的配列は検出可能なレベルに達しないこととなる。
【０００８】
本発明はオリゴヌクレオチドプライマーの特異性を著しく改善する。
【０００９】
本発明の1態様は、標的核酸よりはるかに多量に存在する野生型の核酸の集団
中にあるヌクレオチド1個の置換を有する標的核酸を検出するアッセイの感度を
改善して、2〜3%未満のレベルの検出を可能とするものである。
中にあるヌクレオチド1個の置換を有する標的核酸を検出するアッセイの感度を
改善して、2〜3%未満のレベルの検出を可能とするものである。
【００１０】
本発明の別の1態様においては、プライマーダイマーを含む、偽の増幅産物の
形成を低減する。
形成を低減する。
【００１１】
本発明の別の1態様においては、本発明は核酸集団の一部分であって変異型で
あるものを野生型の部分と区別することができ、特にその部分が非常に小さいか
もしくは非常に大きい場合に区別することができる。
あるものを野生型の部分と区別することができ、特にその部分が非常に小さいか
もしくは非常に大きい場合に区別することができる。
【００１２】
本発明の別の1態様は、標的増幅反応の偽の増幅産物を産生しようとする傾向
を低減もしくは排除するものである。
を低減もしくは排除するものである。
【００１３】
本発明の別の1態様は、プローブもしくは非特異的な介在試薬を用いることな
く、増幅産物を蛍光性の部分を用いて標識して増幅反応をリアルタイムでモニタ
ーする方法を提供するものである。
く、増幅産物を蛍光性の部分を用いて標識して増幅反応をリアルタイムでモニタ
ーする方法を提供するものである。
【００１４】本発明の概要
本発明には核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが含まれている。
標的と結合していない場合には、本発明のプライマーは特定のタイプのヘアピン
構造を形成し、その構造ではプライマーの3'末端領域がそのプライマーの5'末端
領域とハイブリダイズして2重鎖のステムを形成する。プライマーの中央部分の
みが1重鎖で相補的標的との最初のハイブリダイゼーションに利用されるが、こ
のプロセスは時に「核形成(nucleation)」と呼ばれる。本発明はまた、このよう
なプライマーを用いる増幅方法およびアッセイ、ならびにそのようなアッセイを
行うためのキットをも含む。これらの方法およびアッセイは現行の方法およびア
ッセイを限定されたものとしている偽の増幅産物の合成を低減する。
標的と結合していない場合には、本発明のプライマーは特定のタイプのヘアピン
構造を形成し、その構造ではプライマーの3'末端領域がそのプライマーの5'末端
領域とハイブリダイズして2重鎖のステムを形成する。プライマーの中央部分の
みが1重鎖で相補的標的との最初のハイブリダイゼーションに利用されるが、こ
のプロセスは時に「核形成(nucleation)」と呼ばれる。本発明はまた、このよう
なプライマーを用いる増幅方法およびアッセイ、ならびにそのようなアッセイを
行うためのキットをも含む。これらの方法およびアッセイは現行の方法およびア
ッセイを限定されたものとしている偽の増幅産物の合成を低減する。
【００１５】
本発明のある種のプライマーは、大部分が野生型からなる集団中のヌクレオチ
ド1個の置換を有する変異型の存在を検出するために有用であり、そのような変
異型は通常は2〜3%で、現在はその検出は標識した検出プローブの使用、もしく
は3'末端ヌクレオチドが変異を起こしやすいヌクレオチドの位置でハイブリダイ
ズする直鎖状プライマーの使用によって行われている。本発明のループのあるプ
ライマーであれば、それは変異を起こしやすい位置のヌクレオチドを含む配列の
位置で標的とハイブリダイズし、非常に低いレベルの変異した鎖の検出が可能と
なる。
ド1個の置換を有する変異型の存在を検出するために有用であり、そのような変
異型は通常は2〜3%で、現在はその検出は標識した検出プローブの使用、もしく
は3'末端ヌクレオチドが変異を起こしやすいヌクレオチドの位置でハイブリダイ
ズする直鎖状プライマーの使用によって行われている。本発明のループのあるプ
ライマーであれば、それは変異を起こしやすい位置のヌクレオチドを含む配列の
位置で標的とハイブリダイズし、非常に低いレベルの変異した鎖の検出が可能と
なる。
【００１６】
本発明の増幅反応およびアッセイにおいて、本発明のヘアピンプライマーを少
なくとも1つ用いている。指数関数的増幅反応およびアッセイ(例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応法)はプライマーのペアを用い、それは時に「フォワード」および
「リバース」プライマーと呼ばれるが、そのうちの1つは一方の核酸鎖に対して
相補的であり、他の一方はその鎖の相補体に対して相補的である。増幅プライマ
ーのペアが用いられる場合には、本発明ではそのうちの一方もしくは双方が本発
明のヘアピンプライマーである。
なくとも1つ用いている。指数関数的増幅反応およびアッセイ(例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応法)はプライマーのペアを用い、それは時に「フォワード」および
「リバース」プライマーと呼ばれるが、そのうちの1つは一方の核酸鎖に対して
相補的であり、他の一方はその鎖の相補体に対して相補的である。増幅プライマ
ーのペアが用いられる場合には、本発明ではそのうちの一方もしくは双方が本発
明のヘアピンプライマーである。
【００１７】
本発明のアッセイ法には増幅産物を検出するためのいかなる検出方法も用いる
ことができる。そのような方法としては、ゲル電気泳動、介在色素、副溝結合色
素(minor groove binding dye)、蛍光偏光、マススペクトル、および標識した検
出プローブを挙げることができる。検出はエンドポイント、すなわち、増幅が完
了した際に行われるか、もしくはリアルタイム、すなわち、増幅プロセスの途上
で行われるものとすることができる。リアルタイムのプローブをベースとする検
出方法としては、5'ヌクレアーゼアッセイ法(Gelfandら, 1996; Livakら, 1996)
、および分子ビーコンアッセイ法(molecular beacon assay)(Tyagiら, 1996; Ty
agiら, 1997; Tyagiら, 1998)が挙げられる。あるいはまた、本発明のプライマ
ーは相互作用的な蛍光標識ペア、例えば2つのフルオロフォアもしくは1つのフル
オロフォアと1つの非蛍光性のクエンチャーなどで標識して、蛍光シグナルの変
化が伸長されたプライマーの存在を示し、従ってサンプル中のプライマーの標的
の存在を示すこととなるようにすることができる。標識物間の相互作用は、蛍光
共鳴エネルギー移動（fluorescense resonance energy transfer)(FRET)、接触(
touching)、もしくはその双方によって行われる。本発明の標識プライマーを用
いたアッセイ法はリアルタイムアッセイ、ならびにエンドポイントアッセイで用
いるものとすることができる。
ことができる。そのような方法としては、ゲル電気泳動、介在色素、副溝結合色
素(minor groove binding dye)、蛍光偏光、マススペクトル、および標識した検
出プローブを挙げることができる。検出はエンドポイント、すなわち、増幅が完
了した際に行われるか、もしくはリアルタイム、すなわち、増幅プロセスの途上
で行われるものとすることができる。リアルタイムのプローブをベースとする検
出方法としては、5'ヌクレアーゼアッセイ法(Gelfandら, 1996; Livakら, 1996)
、および分子ビーコンアッセイ法(molecular beacon assay)(Tyagiら, 1996; Ty
agiら, 1997; Tyagiら, 1998)が挙げられる。あるいはまた、本発明のプライマ
ーは相互作用的な蛍光標識ペア、例えば2つのフルオロフォアもしくは1つのフル
オロフォアと1つの非蛍光性のクエンチャーなどで標識して、蛍光シグナルの変
化が伸長されたプライマーの存在を示し、従ってサンプル中のプライマーの標的
の存在を示すこととなるようにすることができる。標識物間の相互作用は、蛍光
共鳴エネルギー移動（fluorescense resonance energy transfer)(FRET)、接触(
touching)、もしくはその双方によって行われる。本発明の標識プライマーを用
いたアッセイ法はリアルタイムアッセイ、ならびにエンドポイントアッセイで用
いるものとすることができる。
【００１８】
本発明のキットには、増幅用試薬、通常は少なくとも増幅用バッファーおよび
dNTP、ならびに一般的にはDNAポリメラーゼ、ならびに本発明のプライマーの少
なくとも1個を含んでいる。キットにはさらに別の試薬を含めることができ、そ
れは例えば検出試薬であり、およびアッセイ法を行うための説明書を含ませるこ
とができる。
dNTP、ならびに一般的にはDNAポリメラーゼ、ならびに本発明のプライマーの少
なくとも1個を含んでいる。キットにはさらに別の試薬を含めることができ、そ
れは例えば検出試薬であり、およびアッセイ法を行うための説明書を含ませるこ
とができる。
【００１９】発明の詳細な説明
本発明の重要な態様は、希少な配列の増幅に関して現在使われる増幅法および
アッセイよりも偽増幅産物を作製する傾向が低くかつ感度が高い標的の増幅法お
よびアッセイであり、例えば、野生型配列集団内の希少な突然変異型配列の検出
またはその逆が挙げられる。本発明に基づくアッセイは、一本鎖「ループ」およ
び二本鎖「ステム」を含んでなるヘアピンとして存在し得るプライマーを用いる
。図1を参照して説明すると、これらのプライマー1は3つの部分、すなわち5'ア
ーム配列2、中央ループ配列3、および5'アーム2と相補的である3'アーム配列4か
ら成る。ヘアピン1のループ3および3'アーム4は、標的5の一本鎖と相補的である
が、5'アーム2はプライマーをヘアピン形状分子に変換するように設計されてい
る。従って、本発明によるプライマーは、標的と相補的であるループおよび3'ア
ームの両方、ならびに3'アームとのハイブリダイゼーションを標的と競合する5'
アームを有する。ループ3の配列が標的5の相補体と結合すると、ヘアピン形状の
プライマー1がほどけて3'アーム4が標的とアニールする。これはプライマー1の
酵素による伸長のための基質を作製する。標的5は一本鎖であっても二本鎖であ
ってもよい。いずれの場合においても、通常の直鎖プライマーであってもよい第
二のプライマー6は、指数的増幅が可能であって二本鎖増幅産物7を生成する。本
発明によるプライマーは、ループと3'アームの両方が標的と相補的でなければ、
ほどけることもまたは解離することもないステムを有する。もし本発明によるプ
ライマーを、ループの長さでありかつループと完全に相補的である非標的モデル
に対して試験すれば、ステムは解離しない。
アッセイよりも偽増幅産物を作製する傾向が低くかつ感度が高い標的の増幅法お
よびアッセイであり、例えば、野生型配列集団内の希少な突然変異型配列の検出
またはその逆が挙げられる。本発明に基づくアッセイは、一本鎖「ループ」およ
び二本鎖「ステム」を含んでなるヘアピンとして存在し得るプライマーを用いる
。図1を参照して説明すると、これらのプライマー1は3つの部分、すなわち5'ア
ーム配列2、中央ループ配列3、および5'アーム2と相補的である3'アーム配列4か
ら成る。ヘアピン1のループ3および3'アーム4は、標的5の一本鎖と相補的である
が、5'アーム2はプライマーをヘアピン形状分子に変換するように設計されてい
る。従って、本発明によるプライマーは、標的と相補的であるループおよび3'ア
ームの両方、ならびに3'アームとのハイブリダイゼーションを標的と競合する5'
アームを有する。ループ3の配列が標的5の相補体と結合すると、ヘアピン形状の
プライマー1がほどけて3'アーム4が標的とアニールする。これはプライマー1の
酵素による伸長のための基質を作製する。標的5は一本鎖であっても二本鎖であ
ってもよい。いずれの場合においても、通常の直鎖プライマーであってもよい第
二のプライマー6は、指数的増幅が可能であって二本鎖増幅産物7を生成する。本
発明によるプライマーは、ループと3'アームの両方が標的と相補的でなければ、
ほどけることもまたは解離することもないステムを有する。もし本発明によるプ
ライマーを、ループの長さでありかつループと完全に相補的である非標的モデル
に対して試験すれば、ステムは解離しない。
【００２０】
少なくとも5'アームの一部分が目的の標的と少なくとも部分的に相補的である
特別なケースがある。以下に記載の設計判定基準に従い、1または数個の標的と
相補的な5'アームの3'末端ヌクレオチドを有するプライマーを設計することがで
きる。以下の実施例4はこの状況を例示する。5'アーム全体が標的と相補的であ
る場合はまれである。
特別なケースがある。以下に記載の設計判定基準に従い、1または数個の標的と
相補的な5'アームの3'末端ヌクレオチドを有するプライマーを設計することがで
きる。以下の実施例4はこの状況を例示する。5'アーム全体が標的と相補的であ
る場合はまれである。
【００２１】
プライマーの3'部分が二本鎖状態であるので、プライマーダイマー形成または
3'末端のミスプライミングによる偽増幅産物の作製は大幅に阻止される。もしサ
ンプルがループ3の配列と相補的でない1個のヌクレオチドだけ標的5と異なる核
酸を含有すれば、ループはその核酸と結合できないので、3'アーム4は核酸とア
ニールしてDNA合成を開始することができない。結局、標的分子（例えば、野生
型もしくは突然変異型DNA鋳型分子、または野生型もしくは突然変異型RNA鋳型分
子）がサンプル中に存在すると増幅産物合成は起こるが、標的配列と1個のヌク
レオチド置換だけ異なる分子が存在すると増幅産物合成は起こらないし、または
非常にまれな場合にプライマーがミスマッチした鋳型とたまたま結合して増幅産
物合成を開始することがあっても増幅産物合成は著しく遅延するであろう。
3'末端のミスプライミングによる偽増幅産物の作製は大幅に阻止される。もしサ
ンプルがループ3の配列と相補的でない1個のヌクレオチドだけ標的5と異なる核
酸を含有すれば、ループはその核酸と結合できないので、3'アーム4は核酸とア
ニールしてDNA合成を開始することができない。結局、標的分子（例えば、野生
型もしくは突然変異型DNA鋳型分子、または野生型もしくは突然変異型RNA鋳型分
子）がサンプル中に存在すると増幅産物合成は起こるが、標的配列と1個のヌク
レオチド置換だけ異なる分子が存在すると増幅産物合成は起こらないし、または
非常にまれな場合にプライマーがミスマッチした鋳型とたまたま結合して増幅産
物合成を開始することがあっても増幅産物合成は著しく遅延するであろう。
【００２２】
図1を参照すると、示された実施形態においては、プライマーの2つの末端ヌク
レオチドは相補的であってステム部分を形成する。本発明者らはこれらを「アー
ム」と呼称する。これはまた、図5に示した実施形態でもその通りである。これ
は本発明者らが好ましいとする構成であり、以下の複数の実施例で利用される。
しかし、非相補的なヌクレオチドがステム内に含まれてステムの強度を低下しう
るか、または非相補的なステムの末端ヌクレオチド、例えば、一本鎖オーバーハ
ングとして含まれる場合は、本発明の範囲内にある。後者は偽プライミングの危
険があるので、どのオーバーハングも他の核酸配列と核形成（nucleation）して
分枝点移動の開始点を与える能力のないものでなければならない。本発明による
プライマーにおいて核形成は、ループ配列の標的とのアニーリングによる。本出
願および添付の請求の範囲に使われる「ステム」ならびに「相補的な3'および5'
アーム配列」は十分広く、上記変異型を包含すると理解されるであろう。
レオチドは相補的であってステム部分を形成する。本発明者らはこれらを「アー
ム」と呼称する。これはまた、図5に示した実施形態でもその通りである。これ
は本発明者らが好ましいとする構成であり、以下の複数の実施例で利用される。
しかし、非相補的なヌクレオチドがステム内に含まれてステムの強度を低下しう
るか、または非相補的なステムの末端ヌクレオチド、例えば、一本鎖オーバーハ
ングとして含まれる場合は、本発明の範囲内にある。後者は偽プライミングの危
険があるので、どのオーバーハングも他の核酸配列と核形成（nucleation）して
分枝点移動の開始点を与える能力のないものでなければならない。本発明による
プライマーにおいて核形成は、ループ配列の標的とのアニーリングによる。本出
願および添付の請求の範囲に使われる「ステム」ならびに「相補的な3'および5'
アーム配列」は十分広く、上記変異型を包含すると理解されるであろう。
【００２３】
5'アームが意図する標的と完全に非相補的であっても、プライマーを含有する
オリゴヌクレオチドをコピーして合成される増幅産物はプライマーの完全な相補
体を含有しうることは理解されるであろう。これは、合成の第一回目に達成した
偽増幅産物の抑制などの識別の有効性を低下させ得る。最初の効果を増幅全体に
維持するために、本発明によるプライマーのある特定の好ましい実施形態は、ル
ープと5'アームとの間に「ターミネーターヌクレオチド」を装入することが挙げ
られる。本明細書に使われる「ターミネーターヌクレオチド」は、DNA合成中の
ポリメラーゼによる伸長を停止するヌクレオチドである。ターミネーターヌクレ
オチドは、例えば、4-メチルインドールβ-デオキシヌクレオシド（Moranら, 19
96）であってもよい。5'アームとループの間にターミネーターヌクレオチドを挿
入すると、5'アームのコピーが防止される。
オリゴヌクレオチドをコピーして合成される増幅産物はプライマーの完全な相補
体を含有しうることは理解されるであろう。これは、合成の第一回目に達成した
偽増幅産物の抑制などの識別の有効性を低下させ得る。最初の効果を増幅全体に
維持するために、本発明によるプライマーのある特定の好ましい実施形態は、ル
ープと5'アームとの間に「ターミネーターヌクレオチド」を装入することが挙げ
られる。本明細書に使われる「ターミネーターヌクレオチド」は、DNA合成中の
ポリメラーゼによる伸長を停止するヌクレオチドである。ターミネーターヌクレ
オチドは、例えば、4-メチルインドールβ-デオキシヌクレオシド（Moranら, 19
96）であってもよい。5'アームとループの間にターミネーターヌクレオチドを挿
入すると、5'アームのコピーが防止される。
【００２４】
本発明のヘアピンプライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド、ペプチド核酸（PNA）、他の改変したヌクレオチド、またはこれらの組合わ
せを含有してもよい。改変したヌクレオチドは、例えば、2'-O-メチルリボヌク
レオチドまたはニトロピロールに基づくヌクレオチドが挙げられる。改変したヌ
クレオチド間連結はまた、例えば、ホスホロチオエートが挙げられる。5'アーム
中の改変したヌクレオチドを利用すると、ステム強度を調節する方法が与えられ
る。特定の適用に対してそのような改変を用いることの他の利点は、当業者には
明らかであろう。特に、改変したヌクレオチドから構築した本発明によるヘアピ
ンプライマーは、そのプライマーをデオキシリボヌクレオチドから構築した場合
より強いハイブリッドを形成しうるので、より容易にアクセスしうる構造化標的
配列（メッセンジャーRNAで生じるもののような）が可能になる。
ド、ペプチド核酸（PNA）、他の改変したヌクレオチド、またはこれらの組合わ
せを含有してもよい。改変したヌクレオチドは、例えば、2'-O-メチルリボヌク
レオチドまたはニトロピロールに基づくヌクレオチドが挙げられる。改変したヌ
クレオチド間連結はまた、例えば、ホスホロチオエートが挙げられる。5'アーム
中の改変したヌクレオチドを利用すると、ステム強度を調節する方法が与えられ
る。特定の適用に対してそのような改変を用いることの他の利点は、当業者には
明らかであろう。特に、改変したヌクレオチドから構築した本発明によるヘアピ
ンプライマーは、そのプライマーをデオキシリボヌクレオチドから構築した場合
より強いハイブリッドを形成しうるので、より容易にアクセスしうる構造化標的
配列（メッセンジャーRNAで生じるもののような）が可能になる。
【００２５】
本発明によるプライマーのある特定の実施形態は、単一ヌクレオチド置換に対
して高度の識別性がある。これらの実施形態においては、ループが置換を受け易
い標的ヌクレオチドを含有する標的領域と相補的である。本発明ではそのヌクレ
オチドをループの中央部近くに配置する。さらに本発明では、単一ミスマッチの
影響を最大限にするため、ループをできるだけ短く、すなわち、5〜9個のヌクレ
オチド長で作製する。
して高度の識別性がある。これらの実施形態においては、ループが置換を受け易
い標的ヌクレオチドを含有する標的領域と相補的である。本発明ではそのヌクレ
オチドをループの中央部近くに配置する。さらに本発明では、単一ミスマッチの
影響を最大限にするため、ループをできるだけ短く、すなわち、5〜9個のヌクレ
オチド長で作製する。
【００２６】
本発明のヘアピンプライマーは蛍光による増幅反応のモニタリングを可能にす
る。これらのプライマーを相互作用性蛍光部分を用いておよび他の標識を用いて
標識し、遊離のプライマーが標識部分とは相互作用し得るが、二本鎖増幅産物と
結合したプライマーの標識とは相互作用しないようにすることができる。検出に
利用できる相互作用の1つは蛍光エネルギー移動であり、遊離のプライマーの蛍
光をクエンチ（quench）するが、増幅産物と結合しているプライマーの蛍光はク
エンチしない。その結果、増幅反応の経過を蛍光測定によってモニターしうる。
特に有用なのは接触（touching）によるクエンチの相互作用であり、DABCYL、DA
BMI、DABSYLまたはメチルレッドなどの非蛍光のクエンチ分子を使い、フルオロ
フォア（fluorophore）が蛍光発色するのを防止し、遊離の浮遊プライマーを暗
色にする。(a)本発明によるヘアピンプライマーは非常に特異的であって偽増幅
産物を作製することはほとんど考えられず、また(b)本発明によるヘアピンプラ
イマーの特定のヘアピン形状はそれらがお互いに相互作用してプライマーダイマ
ーを形成する確率を著しく低下させるので、本発明によるヘアピンプライマーを
利用する反応における蛍光シグナルの発生は、意図した増幅産物が合成されたこ
との優れた指標となる。さらに、増幅産物のリアルタイム検出中に発生する蛍光
シグナルにより、サンプルに含まれる標的配列の初期数を正確に定量することが
できる。これは当業界の現行技術を超える改善である。現行技術においては、増
幅反応をモニターするためにハイブリダイゼーションプローブを使わねばならな
いか、または他の増幅産物標識方法を用いるときはそれらの方法が目的の増幅産
物から偽増幅産物を識別するのに十分に特異的ではなかった（Nazarenkoら,1997
；Wittwerら,1997）。
る。これらのプライマーを相互作用性蛍光部分を用いておよび他の標識を用いて
標識し、遊離のプライマーが標識部分とは相互作用し得るが、二本鎖増幅産物と
結合したプライマーの標識とは相互作用しないようにすることができる。検出に
利用できる相互作用の1つは蛍光エネルギー移動であり、遊離のプライマーの蛍
光をクエンチ（quench）するが、増幅産物と結合しているプライマーの蛍光はク
エンチしない。その結果、増幅反応の経過を蛍光測定によってモニターしうる。
特に有用なのは接触（touching）によるクエンチの相互作用であり、DABCYL、DA
BMI、DABSYLまたはメチルレッドなどの非蛍光のクエンチ分子を使い、フルオロ
フォア（fluorophore）が蛍光発色するのを防止し、遊離の浮遊プライマーを暗
色にする。(a)本発明によるヘアピンプライマーは非常に特異的であって偽増幅
産物を作製することはほとんど考えられず、また(b)本発明によるヘアピンプラ
イマーの特定のヘアピン形状はそれらがお互いに相互作用してプライマーダイマ
ーを形成する確率を著しく低下させるので、本発明によるヘアピンプライマーを
利用する反応における蛍光シグナルの発生は、意図した増幅産物が合成されたこ
との優れた指標となる。さらに、増幅産物のリアルタイム検出中に発生する蛍光
シグナルにより、サンプルに含まれる標的配列の初期数を正確に定量することが
できる。これは当業界の現行技術を超える改善である。現行技術においては、増
幅反応をモニターするためにハイブリダイゼーションプローブを使わねばならな
いか、または他の増幅産物標識方法を用いるときはそれらの方法が目的の増幅産
物から偽増幅産物を識別するのに十分に特異的ではなかった（Nazarenkoら,1997
；Wittwerら,1997）。
【００２７】
本発明のヘアピンプライマーを用いる利点は予想されなかったものである。普
通、プライマーのプライミング領域のヘアピンの存在は、プライマーのプライミ
ング能力を低下させて有害であると考えられていた。そのような教示の例は、ポ
リメラーゼ連鎖反応用プライマーを設計するために使われるコンピュータープロ
グラムに見られ、それらでは、アルゴリズムが自己相補的な（ヘアピンを形成す
る）配列を持つ推定プライマー配列を拒絶する（例えば、Haasら, 1998；および
Rychlikら, 1989）。
通、プライマーのプライミング領域のヘアピンの存在は、プライマーのプライミ
ング能力を低下させて有害であると考えられていた。そのような教示の例は、ポ
リメラーゼ連鎖反応用プライマーを設計するために使われるコンピュータープロ
グラムに見られ、それらでは、アルゴリズムが自己相補的な（ヘアピンを形成す
る）配列を持つ推定プライマー配列を拒絶する（例えば、Haasら, 1998；および
Rychlikら, 1989）。
【００２８】
本発明のヘアピンプライマーを用いて増幅反応における偽増幅産物合成の問題
を解決することができる。普通のプライマー、すなわち、標的相補性領域が直鎖
であるプライマーは偽増幅産物を産生しがちであり、その理由は、それらの3'末
端が、無関係なDNAのまたは他のプライマーの部分的に相補的な配列と結合してD
NA合成を開始し、目的ではないDNAポリメラーゼ用鋳型を産生するからである。
次いでこれらの鋳型は、通常通り増幅され、偽陽性シグナルを生じる。しかし、
本発明によるヘアピンプライマーの3'末端の配列は5'末端の配列とハイブリダイ
ズしており、従ってそのループ配列が最初に標的配列にアニーリングしなければ
ほとんど全く標的配列と結合することはない。ループ配列が標的配列の一部分と
結合して形成されたハイブリッドは、次いで、分枝点移動によって長くなり、3'
アーム配列は標的配列の残部と結合する。このプロセスは、標的配列が完全にル
ープ配列と相補的でなければ、決して起こり得ないかまたは非常にまれである。
部分的に相補的な配列がこの一連の事象に加わることはほとんど全くなくかつプ
ライミングは起こらない。それ故に、非常にまれな場合を除いて、プライミング
は標的鎖に完全に相補的な部位にだけ起こる。
を解決することができる。普通のプライマー、すなわち、標的相補性領域が直鎖
であるプライマーは偽増幅産物を産生しがちであり、その理由は、それらの3'末
端が、無関係なDNAのまたは他のプライマーの部分的に相補的な配列と結合してD
NA合成を開始し、目的ではないDNAポリメラーゼ用鋳型を産生するからである。
次いでこれらの鋳型は、通常通り増幅され、偽陽性シグナルを生じる。しかし、
本発明によるヘアピンプライマーの3'末端の配列は5'末端の配列とハイブリダイ
ズしており、従ってそのループ配列が最初に標的配列にアニーリングしなければ
ほとんど全く標的配列と結合することはない。ループ配列が標的配列の一部分と
結合して形成されたハイブリッドは、次いで、分枝点移動によって長くなり、3'
アーム配列は標的配列の残部と結合する。このプロセスは、標的配列が完全にル
ープ配列と相補的でなければ、決して起こり得ないかまたは非常にまれである。
部分的に相補的な配列がこの一連の事象に加わることはほとんど全くなくかつプ
ライミングは起こらない。それ故に、非常にまれな場合を除いて、プライミング
は標的鎖に完全に相補的な部位にだけ起こる。
【００２９】
本発明のヘアピンプライマーは、プライマーを利用する多数の核酸増幅プロセ
スに利用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ストランド置換増幅
（SDA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、転写介在増幅（TMA）、およびローリ
ングサイクル増幅（RCA）が挙げられる。高い特異性とその結果としての低いミ
スプライミングにより、完全に相補的な標的以外の配列からのシグナルは、著し
くかつ検出できる程度で遅延する。この遅延は、サーマルサイクリング増幅では
より遅い閾値サイクル数として；また等温増幅ではより遅い検出シグナル発生ま
での時間として現れる。
スに利用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ストランド置換増幅
（SDA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、転写介在増幅（TMA）、およびローリ
ングサイクル増幅（RCA）が挙げられる。高い特異性とその結果としての低いミ
スプライミングにより、完全に相補的な標的以外の配列からのシグナルは、著し
くかつ検出できる程度で遅延する。この遅延は、サーマルサイクリング増幅では
より遅い閾値サイクル数として；また等温増幅ではより遅い検出シグナル発生ま
での時間として現れる。
【００３０】
本発明のヘアピンプライマーを利用する核酸増幅アッセイは、反応終了時に増
幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動などの通常の方法によって検出するよ
うに設計してもよいし、または産物を増幅中にリアルタイムで通常の検出方法を
使って検出してもよい。インターカレーション色素の使用およびプローブに基づ
く方法などの様々なリアルタイム検出法を利用してもよいし（Zubritsky, 1999
によるレビューあり）、または標識したヘアピンプライマーの蛍光それ自身を、
以下の実施例３に記載したように利用してもよい。
幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動などの通常の方法によって検出するよ
うに設計してもよいし、または産物を増幅中にリアルタイムで通常の検出方法を
使って検出してもよい。インターカレーション色素の使用およびプローブに基づ
く方法などの様々なリアルタイム検出法を利用してもよいし（Zubritsky, 1999
によるレビューあり）、または標識したヘアピンプライマーの蛍光それ自身を、
以下の実施例３に記載したように利用してもよい。
【００３１】
突然変異型であるサンプル中の突然変異型および野生型配列の割合を決定する
ために、DNAを含むサンプルの一部分を第１の反応で本発明の野生型特異的プラ
イマーを使って増幅し、DNAを含むサンプルの第２の部分を本発明による突然変
異型特異的プライマーを使って第２の反応で増幅する。もし増幅がサーマルサイ
クリングであれば、両反応の閾値サイクル数の差が元来のサンプル中の突然変異
型および野生型配列の相対比率を示す。差が大きいほど、突然変異型の分率は小
さい。もし増幅が等温であれば、検出シグナルが生じるのに必要な時間の差が相
対比率を示す。
ために、DNAを含むサンプルの一部分を第１の反応で本発明の野生型特異的プラ
イマーを使って増幅し、DNAを含むサンプルの第２の部分を本発明による突然変
異型特異的プライマーを使って第２の反応で増幅する。もし増幅がサーマルサイ
クリングであれば、両反応の閾値サイクル数の差が元来のサンプル中の突然変異
型および野生型配列の相対比率を示す。差が大きいほど、突然変異型の分率は小
さい。もし増幅が等温であれば、検出シグナルが生じるのに必要な時間の差が相
対比率を示す。
【００３２】
本発明によるヘアピンプライマーは、最初にプライミング配列である目的の標
的に相補的な部分、すなわち、ループ３および3'アーム４（図１）を通常の方法
で設計して調製できる。この目的のために、多数の設計プログラムが利用可能で
ありかつ文献に報じられている。例えば、Haasら（1998）、Rychlikら（1989）
、Hillierら（1991）、Liら（1997）およびProutskiら（1996）を参照すること
。一般的にこれらのプログラムは、15〜20個のヌクレオチド長の、場合によって
はそれより若干長いプライマー配列を提供する。次に、5'アーム２（図１）を3'
アーム４（図１）に相補的なオリゴヌクレオチド配列として設計し、ループ３用
に５〜９個のヌクレオチド（短いプライミング配列用に５個のヌクレオチドおよ
び19個以上のヌクレオチドのプライミング配列用に９個のヌクレオチド）を残す
。しかし、もし単一ヌクレオチド変化に対する識別が必要でなければ、ループ長
は数個のヌクレオチドだけ増加し（実施例４）、13個のヌクレオチド長のループ
をもつプライマーであってもよい。
的に相補的な部分、すなわち、ループ３および3'アーム４（図１）を通常の方法
で設計して調製できる。この目的のために、多数の設計プログラムが利用可能で
ありかつ文献に報じられている。例えば、Haasら（1998）、Rychlikら（1989）
、Hillierら（1991）、Liら（1997）およびProutskiら（1996）を参照すること
。一般的にこれらのプログラムは、15〜20個のヌクレオチド長の、場合によって
はそれより若干長いプライマー配列を提供する。次に、5'アーム２（図１）を3'
アーム４（図１）に相補的なオリゴヌクレオチド配列として設計し、ループ３用
に５〜９個のヌクレオチド（短いプライミング配列用に５個のヌクレオチドおよ
び19個以上のヌクレオチドのプライミング配列用に９個のヌクレオチド）を残す
。しかし、もし単一ヌクレオチド変化に対する識別が必要でなければ、ループ長
は数個のヌクレオチドだけ増加し（実施例４）、13個のヌクレオチド長のループ
をもつプライマーであってもよい。
【００３３】
完全に相補的なDNA配列からDNA合成を開始し得るが、単一ヌクレオチド置換を
含有する配列から開始することのない本発明によるプライマーを設計するには、
プライマーの特異性を最大限にする必要がある。一般的に、プライマーが小さい
ほど、プライミングはより特異的である。しかし、ある特定の長さより小さいプ
ライマーは相補的配列と結合しないので、DNA合成をプライミングできないであ
ろう。本発明のヘアピンプライマーは、そのステムの効果によって高い特異性を
達成する。ヘアピンステムの3'アームの配列およびヘアピンループの配列は、目
的の（完全に相補的な）標的配列に相補的であるが、ヘアピンステムの5'アーム
配列は目的の標的配列と結合しない。しかし、ヘアピンプライマーの伸長産物で
あるテンプレート分子をコピーして作製された増幅産物は、全ヘアピンプライマ
ー配列の完全な相補体を含有し、従って、ヘアピンプライマーの5'アーム配列、
ならびにループ配列および3'アーム配列は、その後の増幅ラウンドにおいてこれ
らの増幅産物と結合するであろう。従って、初期プライミング事象は増幅の特異
性を決定するのに非常に重要である。ヘアピンプライマーのステムが長い（また
は強い）ほど、テンプレートとのアニーリングはより特異的であり、従ってプラ
イミング反応はより特異的であろう。しかし、より長いステムを作ることはまた
、プライマーの全長も増加するので、プライマーの特異性は低下する。これらの
２つの設計判定基準をそれぞれ独立して最適化すると、ステム長に逆の影響を与
える。従って、最大の識別を達成し得るステムに対する最適長さがある。ステム
配列は突然変異部位周囲の標的配列により決定されるので、最適長さは標的配列
の同一性に依存するであろう。ステムの最適長さは、通常５〜12個のデオキシリ
ボヌクレオチドの間にあり、これは本発明の好ましい範囲である。下限はGCリッ
チ配列に対してであり、上限はATリッチ配列に対してである。DNAフォールディ
ングプログラムを使ってプライマーのヘアピン構造を設計し、またそれらの安定
性を予測することができる（SerraおよびTurner, 1995）。
含有する配列から開始することのない本発明によるプライマーを設計するには、
プライマーの特異性を最大限にする必要がある。一般的に、プライマーが小さい
ほど、プライミングはより特異的である。しかし、ある特定の長さより小さいプ
ライマーは相補的配列と結合しないので、DNA合成をプライミングできないであ
ろう。本発明のヘアピンプライマーは、そのステムの効果によって高い特異性を
達成する。ヘアピンステムの3'アームの配列およびヘアピンループの配列は、目
的の（完全に相補的な）標的配列に相補的であるが、ヘアピンステムの5'アーム
配列は目的の標的配列と結合しない。しかし、ヘアピンプライマーの伸長産物で
あるテンプレート分子をコピーして作製された増幅産物は、全ヘアピンプライマ
ー配列の完全な相補体を含有し、従って、ヘアピンプライマーの5'アーム配列、
ならびにループ配列および3'アーム配列は、その後の増幅ラウンドにおいてこれ
らの増幅産物と結合するであろう。従って、初期プライミング事象は増幅の特異
性を決定するのに非常に重要である。ヘアピンプライマーのステムが長い（また
は強い）ほど、テンプレートとのアニーリングはより特異的であり、従ってプラ
イミング反応はより特異的であろう。しかし、より長いステムを作ることはまた
、プライマーの全長も増加するので、プライマーの特異性は低下する。これらの
２つの設計判定基準をそれぞれ独立して最適化すると、ステム長に逆の影響を与
える。従って、最大の識別を達成し得るステムに対する最適長さがある。ステム
配列は突然変異部位周囲の標的配列により決定されるので、最適長さは標的配列
の同一性に依存するであろう。ステムの最適長さは、通常５〜12個のデオキシリ
ボヌクレオチドの間にあり、これは本発明の好ましい範囲である。下限はGCリッ
チ配列に対してであり、上限はATリッチ配列に対してである。DNAフォールディ
ングプログラムを使ってプライマーのヘアピン構造を設計し、またそれらの安定
性を予測することができる（SerraおよびTurner, 1995）。
【００３４】
ヘアピンプライマーと標的配列間の最初の接触は、3'アームが5'アームと結合
していて標的配列との最初のハイブリダイゼーションに利用できないので、ヘア
ピンプライマーのループによってなされる。もし標的が完全に相補的であると認
識されると、3'アームは5'アームから解離して標的と結合する。しかし、標的配
列がループ配列と完全に相補的でなければ、最初の接触は短命でプライマーは標
的配列から解離する。完全に相補的な標的配列とミスマッチ標的配列との間を識
別する能力は、ループ長が減少するほど増加する。しかし、非常に短いループは
標的とアニーリングするには短すぎるであろう。５〜９個のデオキシリボヌクレ
オチドのループが最適である。
していて標的配列との最初のハイブリダイゼーションに利用できないので、ヘア
ピンプライマーのループによってなされる。もし標的が完全に相補的であると認
識されると、3'アームは5'アームから解離して標的と結合する。しかし、標的配
列がループ配列と完全に相補的でなければ、最初の接触は短命でプライマーは標
的配列から解離する。完全に相補的な標的配列とミスマッチ標的配列との間を識
別する能力は、ループ長が減少するほど増加する。しかし、非常に短いループは
標的とアニーリングするには短すぎるであろう。５〜９個のデオキシリボヌクレ
オチドのループが最適である。
【００３５】
上記の最初に設計したプライマーを、目的のアッセイにおいて完全に相補的な
標的分子を用いて、および目的のアッセイにおいて１個のヌクレオチドが異なる
のみである分子を用いて試験することができる。このような試験を以下の実施例
１に記載した。試験の目的はアッセイに要求される特異性の程度が達成されてい
るかどうかを確認することである。本発明によるプライマーは、相補的な標的の
プライミングが、ヌクレオチドミスマッチをもつ配列のプライミングより少なく
とも1000倍効率的であり、好ましくは5000倍効率的である。本発明者らは広範な
最適化なしに10,000倍効率的である本発明によるプライマーを作っている。もし
最初に設計したプライマーが、使用される増幅方法またはアッセイにおいて十分
な特異性を有しない場合は、ステムの強度を増加すべきである。これは、例えば
、（プライミング配列の長さを維持する）あるヌクレオチドを加えて5'アーム配
列の長さを増加してもよい。長さを変える代わりの方法は、5'アームにおいて改
変したヌクレオチドを置換することである。他の代わりの方法でかつ好ましい実
施形態の一つは、ループと5'アームの間にターミネーターヌクレオチドを加える
ことである。ターミネーターヌクレオチドは、例えば、4-メチルインドールβ-
デオキシヌクレオシド（Moranら,1996）であってもよい。ターミネーターヌクレ
オチドを使うことにより、作製された増幅産物はプライマーの5'アームと相補的
な配列を含まない。これにより、第１ラウンドまたはサイクルに続く合成ラウン
ドにおいて最初の特異性が維持され、それによって全体の特異性が増加する。も
しプライマーが、その完全に相補的な標的を増幅しない場合には、そのループ長
さを増加すべきである。当業者であれば、記載の方法で容易にプライマーを最適
化し得るであろう。
標的分子を用いて、および目的のアッセイにおいて１個のヌクレオチドが異なる
のみである分子を用いて試験することができる。このような試験を以下の実施例
１に記載した。試験の目的はアッセイに要求される特異性の程度が達成されてい
るかどうかを確認することである。本発明によるプライマーは、相補的な標的の
プライミングが、ヌクレオチドミスマッチをもつ配列のプライミングより少なく
とも1000倍効率的であり、好ましくは5000倍効率的である。本発明者らは広範な
最適化なしに10,000倍効率的である本発明によるプライマーを作っている。もし
最初に設計したプライマーが、使用される増幅方法またはアッセイにおいて十分
な特異性を有しない場合は、ステムの強度を増加すべきである。これは、例えば
、（プライミング配列の長さを維持する）あるヌクレオチドを加えて5'アーム配
列の長さを増加してもよい。長さを変える代わりの方法は、5'アームにおいて改
変したヌクレオチドを置換することである。他の代わりの方法でかつ好ましい実
施形態の一つは、ループと5'アームの間にターミネーターヌクレオチドを加える
ことである。ターミネーターヌクレオチドは、例えば、4-メチルインドールβ-
デオキシヌクレオシド（Moranら,1996）であってもよい。ターミネーターヌクレ
オチドを使うことにより、作製された増幅産物はプライマーの5'アームと相補的
な配列を含まない。これにより、第１ラウンドまたはサイクルに続く合成ラウン
ドにおいて最初の特異性が維持され、それによって全体の特異性が増加する。も
しプライマーが、その完全に相補的な標的を増幅しない場合には、そのループ長
さを増加すべきである。当業者であれば、記載の方法で容易にプライマーを最適
化し得るであろう。
【００３６】
増幅中のアニーリング工程の温度は、プライミングの特異性に影響する非常に
重要なパラメーターである。ポリメラーゼ連鎖反応において、特異性を最大化す
るためにこの温度を調節し得る。この調節は、等温である増幅方法ではできない
。アニーリング温度が高いほど、特異性は高い。これは本発明のヘアピンプライ
マーについても成立する。ループ配列と3'アーム配列とを組合せた長さは、ヘア
ピンプライマーとサンプル中に存在する標的配列とのアニーリングにより形成さ
れる最初のプローブ標的ハイブリッドが、増幅反応のアニーリング温度より若干
高い温度で解離するように選択する。最大の識別を与える正確なアニーリング温
度は、体系的にアニーリング温度を変え、識別の程度を確認することにより、ま
たはアニーリング工程の温度を一定の範囲内で変化させ得るグラジエントサーマ
ルサイクラーを用いてこれらの測定を実施することにより実験的に見出すことが
できる。
重要なパラメーターである。ポリメラーゼ連鎖反応において、特異性を最大化す
るためにこの温度を調節し得る。この調節は、等温である増幅方法ではできない
。アニーリング温度が高いほど、特異性は高い。これは本発明のヘアピンプライ
マーについても成立する。ループ配列と3'アーム配列とを組合せた長さは、ヘア
ピンプライマーとサンプル中に存在する標的配列とのアニーリングにより形成さ
れる最初のプローブ標的ハイブリッドが、増幅反応のアニーリング温度より若干
高い温度で解離するように選択する。最大の識別を与える正確なアニーリング温
度は、体系的にアニーリング温度を変え、識別の程度を確認することにより、ま
たはアニーリング工程の温度を一定の範囲内で変化させ得るグラジエントサーマ
ルサイクラーを用いてこれらの測定を実施することにより実験的に見出すことが
できる。
【００３７】
本発明のプライマーは、それらが増幅産物中に取り込まれたことを蛍光により
モニターできるように、相互作用的な標識部分を用いて標識できる。増幅産物中
に取り込まれたプライマーの蛍光は取り込まれていないものと非常に異なる。こ
れにより、さらに分析をすることなく増幅産物を同定できる。さらに、相互作用
的な標識部分を使用すると、合成される増幅産物のリアルタイム検出を実施する
ことにより、最初の標的分子数を正確に定量することができる。
モニターできるように、相互作用的な標識部分を用いて標識できる。増幅産物中
に取り込まれたプライマーの蛍光は取り込まれていないものと非常に異なる。こ
れにより、さらに分析をすることなく増幅産物を同定できる。さらに、相互作用
的な標識部分を使用すると、合成される増幅産物のリアルタイム検出を実施する
ことにより、最初の標的分子数を正確に定量することができる。
【００３８】
本発明者らは、「分子ビーコン」と呼ばれるヘアピン形状プローブに対し、相
互作用的なフルオロフォアおよびクエンチャー（ならびに他の標識部分）を選択
しかつ結合する最適な方法を記載した（TyagiおよびKramer, 1996；Tyagiら,199
7；Tyagiら,1998）。分子ビーコンを用いるアッセイにおいてより高いシグナル-
バックグラウンド比を得るには、フルオロフォアおよびクエンチャーがこれらの
プローブのヘアピン状態ではお互いに非常に近く、そしてかつ標的結合状態では
お互いに離れていることが望ましい。本発明によるヘアピンプライマーに対して
も両標識の同様な結合様式が理想的である。しかし、分子ビーコンにおいては、
クエンチャー部分DABCYLは通常3'-ヒドロキシル基に結合していて、DNAポリメラ
ーゼが存在する場合にはプローブの3'末端における伸長をブロックする。しかし
、ヘアピンプライマー（テンプレート鎖のコピー合成を開始することを目的とす
るもの）においては、伸長が起こるために非ブロックの3'-ヒドロキシル基が必
要である。このため、3'-ヒドロキシル位置への標識の結合は不可能である。本
発明者らは、標識を結合する他の方法を探索した。第１の方法においては、フル
オロフォアを分子ビーコンの場合のようにプライマーの5'アームの5'末端に結合
させる；しかし、クエンチャーは3'アーム内の内部位置に結合させる。フルオロ
フォアおよびクエンチャーをお互いに近く運ぶアーム内のクエンチャーの位置は
、3'末端から約４〜６ヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、クエ
ンチャーを、それらの位置の１つでチミジンヌクレオチドに（それが可能な配列
であれば）結合させる。結合は、チミジン環から出ている6-炭素スペーサーを有
しかつ第一級アミノ基末端をもつチミジン誘導体を用いて達成する。クエンチャ
ーをこの第一級アミノ基に、TyagiおよびKramer（1996）が記載した方法を用い
てコンジュゲートできる。あるいは、スペーサーおよびクエンチャーを含有する
チミジンホスホロアミダイトを自動DNA合成中に使用して、後合成ステップの必
要性を省く。実施例３はそのようなプライマーを記載する。第２の方法において
は、クエンチャーを担持するチミジン残基もプライマーの3'末端に配置してもよ
い。得られる分子は、3'-ヒドロキシル部分が伸長に利用可能であり、かつ非常
によく消光される（２つの標識部分はお互いに近接していてかつお互いに相互作
用しない）ので良いプライマーとなる。
互作用的なフルオロフォアおよびクエンチャー（ならびに他の標識部分）を選択
しかつ結合する最適な方法を記載した（TyagiおよびKramer, 1996；Tyagiら,199
7；Tyagiら,1998）。分子ビーコンを用いるアッセイにおいてより高いシグナル-
バックグラウンド比を得るには、フルオロフォアおよびクエンチャーがこれらの
プローブのヘアピン状態ではお互いに非常に近く、そしてかつ標的結合状態では
お互いに離れていることが望ましい。本発明によるヘアピンプライマーに対して
も両標識の同様な結合様式が理想的である。しかし、分子ビーコンにおいては、
クエンチャー部分DABCYLは通常3'-ヒドロキシル基に結合していて、DNAポリメラ
ーゼが存在する場合にはプローブの3'末端における伸長をブロックする。しかし
、ヘアピンプライマー（テンプレート鎖のコピー合成を開始することを目的とす
るもの）においては、伸長が起こるために非ブロックの3'-ヒドロキシル基が必
要である。このため、3'-ヒドロキシル位置への標識の結合は不可能である。本
発明者らは、標識を結合する他の方法を探索した。第１の方法においては、フル
オロフォアを分子ビーコンの場合のようにプライマーの5'アームの5'末端に結合
させる；しかし、クエンチャーは3'アーム内の内部位置に結合させる。フルオロ
フォアおよびクエンチャーをお互いに近く運ぶアーム内のクエンチャーの位置は
、3'末端から約４〜６ヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、クエ
ンチャーを、それらの位置の１つでチミジンヌクレオチドに（それが可能な配列
であれば）結合させる。結合は、チミジン環から出ている6-炭素スペーサーを有
しかつ第一級アミノ基末端をもつチミジン誘導体を用いて達成する。クエンチャ
ーをこの第一級アミノ基に、TyagiおよびKramer（1996）が記載した方法を用い
てコンジュゲートできる。あるいは、スペーサーおよびクエンチャーを含有する
チミジンホスホロアミダイトを自動DNA合成中に使用して、後合成ステップの必
要性を省く。実施例３はそのようなプライマーを記載する。第２の方法において
は、クエンチャーを担持するチミジン残基もプライマーの3'末端に配置してもよ
い。得られる分子は、3'-ヒドロキシル部分が伸長に利用可能であり、かつ非常
によく消光される（２つの標識部分はお互いに近接していてかつお互いに相互作
用しない）ので良いプライマーとなる。
【００３９】
これらのプライマーは、異なる色範囲で蛍光を放射する様々なフルオロフォア
を用いて標識することができる。複数のこれらの異なる色のヘアピンプライマー
を同じ反応混合物中に使って異なる標的配列のコピーを同時に作製してもよく、
増幅産物のそれぞれのタイプはそれ自身の特徴的な色を蛍光発色するであろう（
そのヘアピンプライマーと連結したフルオロフォアの同一性によって確認する）
。Tyagiら（1998）が記載した方法を使って、これらのプライマーのフルオロフ
ォアの標識および適当なクエンチングを実施することができる。
を用いて標識することができる。複数のこれらの異なる色のヘアピンプライマー
を同じ反応混合物中に使って異なる標的配列のコピーを同時に作製してもよく、
増幅産物のそれぞれのタイプはそれ自身の特徴的な色を蛍光発色するであろう（
そのヘアピンプライマーと連結したフルオロフォアの同一性によって確認する）
。Tyagiら（1998）が記載した方法を使って、これらのプライマーのフルオロフ
ォアの標識および適当なクエンチングを実施することができる。
【００４０】実施例１
本発明者らは、遺伝子内に存在すると循環器疾患のリスクが高まる、ヒトのメ
チレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼに対する遺伝子の点突然変異（この突然変
異は「C677T突然変異」と呼ばれる）である単一ヌクレオチド置換を検出するた
めの標的増幅アッセイを設計した。本発明者らはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
を増幅プロセスとして選択した。突然変異の位置を含む遺伝子の配列を認識する
ために、一対のフォワードヘアピンプライマーを設計した。これらのプライマー
はそれぞれ、3つの部分、すなわち5'アーム、中央ループ、および5'アームと相
補的である3'アームから構成された。3'アームおよびループにより作られた配列
は標的配列（C677T突然変異の部位を包含した）と相補的であった。両ヘアピン
プライマーは、ループ内の１つのヌクレオチドを除くと、同一物であった。一方
のプライマーは野生型標的配列と相補的であり、他方のプライマーは突然変異型
標的配列と相補的であった。野生型特異的プライマーの配列は5'-GATGAAAGGAGCC
GATTTCATC-3'であり、突然変異型特異的プライマーは、5'-GATGAAAGGAGTCGATTTC ATC -3'であって、ここで下線は同じ配列を示し、それぞれの配列の太字(それぞ
れ5'側から12番目のCとT)は、C677T突然変異部位に生じうる変異型ヌクレオチド
の１つに完全に相補的であるヌクレオチドを示す。これらのフォワードプライマ
ーのそれぞれを、別々の反応において、共通のリバースプライマー（通常の直鎖
プライマー）と組み合わせて使い、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子の小セグメントを増幅した。２種類のポリメラーゼ連鎖反応の一方は野生型テ
ンプレートを用いて開始し、他方のポリメラーゼ連鎖反応は突然変異型テンプレ
ートを用いて開始し、それぞれの反応の進行は、得られる増幅産物をインターカ
レーション色素であるSYBRグリーンを用いて蛍光発色させてリアルタイムでモニ
ターした。また対照として、本発明者らは、ヘアピンプライマーの代わりに、C6
77T突然変異部位の外側が標的配列である通常のフォワードプライマーを使った
。この「ニュートラル」フォワードプライマーは、野生型増幅産物および突然変
異型増幅産物の合成を同じ速度で行う。
チレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼに対する遺伝子の点突然変異（この突然変
異は「C677T突然変異」と呼ばれる）である単一ヌクレオチド置換を検出するた
めの標的増幅アッセイを設計した。本発明者らはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
を増幅プロセスとして選択した。突然変異の位置を含む遺伝子の配列を認識する
ために、一対のフォワードヘアピンプライマーを設計した。これらのプライマー
はそれぞれ、3つの部分、すなわち5'アーム、中央ループ、および5'アームと相
補的である3'アームから構成された。3'アームおよびループにより作られた配列
は標的配列（C677T突然変異の部位を包含した）と相補的であった。両ヘアピン
プライマーは、ループ内の１つのヌクレオチドを除くと、同一物であった。一方
のプライマーは野生型標的配列と相補的であり、他方のプライマーは突然変異型
標的配列と相補的であった。野生型特異的プライマーの配列は5'-GATGAAAGGAGCC
GATTTCATC-3'であり、突然変異型特異的プライマーは、5'-GATGAAAGGAGTCGATTTC ATC -3'であって、ここで下線は同じ配列を示し、それぞれの配列の太字(それぞ
れ5'側から12番目のCとT)は、C677T突然変異部位に生じうる変異型ヌクレオチド
の１つに完全に相補的であるヌクレオチドを示す。これらのフォワードプライマ
ーのそれぞれを、別々の反応において、共通のリバースプライマー（通常の直鎖
プライマー）と組み合わせて使い、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子の小セグメントを増幅した。２種類のポリメラーゼ連鎖反応の一方は野生型テ
ンプレートを用いて開始し、他方のポリメラーゼ連鎖反応は突然変異型テンプレ
ートを用いて開始し、それぞれの反応の進行は、得られる増幅産物をインターカ
レーション色素であるSYBRグリーンを用いて蛍光発色させてリアルタイムでモニ
ターした。また対照として、本発明者らは、ヘアピンプライマーの代わりに、C6
77T突然変異部位の外側が標的配列である通常のフォワードプライマーを使った
。この「ニュートラル」フォワードプライマーは、野生型増幅産物および突然変
異型増幅産物の合成を同じ速度で行う。
【００４１】
アッセイの条件は次の通りであった；それぞれの反応物50μlは、20,000個の
テンプレートDNA分子（突然変異型または野生型）、0.1μMの野生型特異的フォ
ワードヘアピンプライマー（または0.5μMのC677T突然変異部位の外側に標的配
列がある通常のフォワードプライマー）、0.5μMの通常のリバースプライマー、
dATP 0.25mM、dCTP 0.25mM、dGTP 0.25mM、dUTP 0.50mM、AmpliTaq Gold DNAポ
リメラーゼ（Perkin-Elmer）2.5単位、KCl 50mM、MgCl2 3.5mM、1 X SYBRグリー
ン（Molecular Probes, Inc.）、およびTris-HCl(pH 8.3) 10mMを含有した。40
サイクルの増幅（94℃変性を30秒間、55℃アニーリングを60秒間、72℃重合を30
秒間）を、Applied Biosystems 7700プリズム分光蛍光サーマルサイクラー中で
、密封したチューブに入れて実施した。緑色蛍光を、各サイクルのアニーリング
工程中、リアルタイムでモニターした。蛍光を、各増幅に対するPCRサイクル数
の関数として図２に示したが、曲線21は直鎖フォワードプライマーおよび20,000
分子の野生型テンプレートを含有し；曲線22は直鎖フォワードプライマーおよび
20,000分子の突然変異型テンプレートを含有し；曲線23は野生型特異的ヘアピン
プライマーおよび20,000分子の野生型テンプレートを含有し；そして曲線24は野
生型特異的ヘアピンプライマーおよび20,000分子の突然変異型テンプレートを含
有する。
テンプレートDNA分子（突然変異型または野生型）、0.1μMの野生型特異的フォ
ワードヘアピンプライマー（または0.5μMのC677T突然変異部位の外側に標的配
列がある通常のフォワードプライマー）、0.5μMの通常のリバースプライマー、
dATP 0.25mM、dCTP 0.25mM、dGTP 0.25mM、dUTP 0.50mM、AmpliTaq Gold DNAポ
リメラーゼ（Perkin-Elmer）2.5単位、KCl 50mM、MgCl2 3.5mM、1 X SYBRグリー
ン（Molecular Probes, Inc.）、およびTris-HCl(pH 8.3) 10mMを含有した。40
サイクルの増幅（94℃変性を30秒間、55℃アニーリングを60秒間、72℃重合を30
秒間）を、Applied Biosystems 7700プリズム分光蛍光サーマルサイクラー中で
、密封したチューブに入れて実施した。緑色蛍光を、各サイクルのアニーリング
工程中、リアルタイムでモニターした。蛍光を、各増幅に対するPCRサイクル数
の関数として図２に示したが、曲線21は直鎖フォワードプライマーおよび20,000
分子の野生型テンプレートを含有し；曲線22は直鎖フォワードプライマーおよび
20,000分子の突然変異型テンプレートを含有し；曲線23は野生型特異的ヘアピン
プライマーおよび20,000分子の野生型テンプレートを含有し；そして曲線24は野
生型特異的ヘアピンプライマーおよび20,000分子の突然変異型テンプレートを含
有する。
【００４２】
実施した４種類の反応のそれぞれにおける蛍光増加を図２に示した。それぞれ
の反応がポジティブになるサーマルサイクルである「閾値サイクル」（すなわち
、蛍光シグナルが蛍光バックグラウンドの標準偏差の10倍強くなるサーマルサイ
クル）は反応の最初に存在していたテンプレート分子数を示す。通常のまたはニ
ュートラルプライマーをフォワードプライマーとして（ヘアピンプライマーの１
つの代わりに）使用すると、20,000分子の野生型テンプレートが最初に存在した
かまたは20,000分子の突然変異型テンプレートが最初に存在したかに関わらず、
同じ閾値サイクル（サーマルサイクル16）が観察され、反応が同じ数のテンプレ
ート分子によって開始したことを示した（曲線21、22）。しかし、野生型特異的
ヘアピンプライマーを使用すると、20,000分子の野生型テンプレートを用いて開
始した反応は20サイクル後にポジティブとなった（曲線23）が、20,000分子の突
然変異型テンプレートのみを用いて開始した反応は31サイクル後にポジティブと
なった（曲線24）。増幅産物の数はサーマルサイクル毎に２倍になるので、それ
ぞれの反応に対して観察された閾値サイクルの11サイクル差は、「遅延した」反
応は「より速い」反応の1/2,000で開始したことを示す。しかし、これらの２つ
の反応は実際には同じ数のテンプレート分子で開始した。見かけの遅延は、突然
変異型テンプレートを使って反応を開始したときの野生型特異的プライマーの増
幅産物合成のプライミングにおける効率は、野生型テンプレートを使って反応を
開始したときの1/2000であったことを示した。これらの結果は、ヘアピンプライ
マーを含有するアッセイは、野生型標的分子の1/2000の量で存在する突然変異型
標的分子を検出できることを意味する。同じテンプレートおよび同じヘアピンプ
ライマーを利用した他の実験において（および異なるテンプレートならびに適当
な野生型特異的および突然変異型特異的ヘアピンプライマーを利用した実験にお
いても）、14サーマルサイクルもの閾値サイクル差が観察されている。これらの
結果はヘアピンプライマーを含有するアッセイを使って、野生型標的分子の1/10
,000の量で存在する突然変異型標的分子を検出できることを実証する。
の反応がポジティブになるサーマルサイクルである「閾値サイクル」（すなわち
、蛍光シグナルが蛍光バックグラウンドの標準偏差の10倍強くなるサーマルサイ
クル）は反応の最初に存在していたテンプレート分子数を示す。通常のまたはニ
ュートラルプライマーをフォワードプライマーとして（ヘアピンプライマーの１
つの代わりに）使用すると、20,000分子の野生型テンプレートが最初に存在した
かまたは20,000分子の突然変異型テンプレートが最初に存在したかに関わらず、
同じ閾値サイクル（サーマルサイクル16）が観察され、反応が同じ数のテンプレ
ート分子によって開始したことを示した（曲線21、22）。しかし、野生型特異的
ヘアピンプライマーを使用すると、20,000分子の野生型テンプレートを用いて開
始した反応は20サイクル後にポジティブとなった（曲線23）が、20,000分子の突
然変異型テンプレートのみを用いて開始した反応は31サイクル後にポジティブと
なった（曲線24）。増幅産物の数はサーマルサイクル毎に２倍になるので、それ
ぞれの反応に対して観察された閾値サイクルの11サイクル差は、「遅延した」反
応は「より速い」反応の1/2,000で開始したことを示す。しかし、これらの２つ
の反応は実際には同じ数のテンプレート分子で開始した。見かけの遅延は、突然
変異型テンプレートを使って反応を開始したときの野生型特異的プライマーの増
幅産物合成のプライミングにおける効率は、野生型テンプレートを使って反応を
開始したときの1/2000であったことを示した。これらの結果は、ヘアピンプライ
マーを含有するアッセイは、野生型標的分子の1/2000の量で存在する突然変異型
標的分子を検出できることを意味する。同じテンプレートおよび同じヘアピンプ
ライマーを利用した他の実験において（および異なるテンプレートならびに適当
な野生型特異的および突然変異型特異的ヘアピンプライマーを利用した実験にお
いても）、14サーマルサイクルもの閾値サイクル差が観察されている。これらの
結果はヘアピンプライマーを含有するアッセイを使って、野生型標的分子の1/10
,000の量で存在する突然変異型標的分子を検出できることを実証する。
【００４３】実施例２
多数の野生型標的を含む集団中でのごく少数の変異型標的の検出における、本
発明のヘアピンプライマーの有用性を示すために、変異型鋳型と野生型鋳型の混
合物により開始される一連のポリメラーゼ連鎖反応を行った。これらの混合物に
おける変異型鋳型の割合を、０、0.1、1.0、50.0、99.0、99.9、100％まで、鋳
型DNAの総濃度を常に一定(20,000分子)として変化させた。これらの各混合物を
、第１の反応においては野生型特異的ヘアピンプライマーを用いて、第２の反応
では対応する変異型特異的プライマーを用いて増幅した。これらのプライマーは
単一のヌクレオチドが異なるものであった。反応条件は実施例１について記述さ
れた条件と同じであった。各鋳型混合物について得られた閾値サイクル数は図３
にプロットされており、図中で曲線32は野生型特異的プライマーを含む反応で得
られた結果を示し、曲線31は変異型特異的プライマーを含む反応で得られた結果
を示す。この結果は、純粋な野生型鋳型によって、野生型特異的プライマーにつ
いては閾値サイクル数が低くなり、変異型特異的プライマーについては閾値サイ
クル数が高くなることを示す。純粋な変異型鋳型については逆となるのが事実で
ある。得られる閾値サイクル数の差は純粋な鋳型に関して最大であるが、一方の
鋳型の型の割合が増えて他方の鋳型の型が減ると差は減少した。99.9％の野生型
鋳型を含む集団中の、わずか0.1％の変異型鋳型であっても純粋な野生型鋳型と
区別することができた。図４は、図３に示された実験において得られたデータを
標準曲線の作成に用いる方法を示すが、この方法では２種類の異なる増幅反応(
ここでは各サンプルについて行ったポリメラーゼ連鎖反応であり、一方の反応に
おいては野生型特異的ヘアピンプライマーを用い、他方の反応では対応する変異
型特異的ヘアピンプライマーを用いた)において測定された閾値サイクル数(TC)
の差を、サンプル中に存在する変異型および野生型標的の集団における変異型標
的の割合に対してプロットしている。この差は、野生型特異的ヘアピンプライマ
ーを含む反応から得られた閾値サイクル数から、変異型特異的ヘアピンプライマ
ーを含む反応から得られた閾値サイクル数を引くことにより得られる。曲線41は
、既知のサンプルを用いて得たものであり、未知のサンプル中に存在する変異型
鋳型の割合を測定するための標準として利用できる。これらの結果は、本発明の
エアピンプライマーが、１個のヌクレオチド置換によりもたらされる最少の残基
による疾患の診断に好適であることを示す。
発明のヘアピンプライマーの有用性を示すために、変異型鋳型と野生型鋳型の混
合物により開始される一連のポリメラーゼ連鎖反応を行った。これらの混合物に
おける変異型鋳型の割合を、０、0.1、1.0、50.0、99.0、99.9、100％まで、鋳
型DNAの総濃度を常に一定(20,000分子)として変化させた。これらの各混合物を
、第１の反応においては野生型特異的ヘアピンプライマーを用いて、第２の反応
では対応する変異型特異的プライマーを用いて増幅した。これらのプライマーは
単一のヌクレオチドが異なるものであった。反応条件は実施例１について記述さ
れた条件と同じであった。各鋳型混合物について得られた閾値サイクル数は図３
にプロットされており、図中で曲線32は野生型特異的プライマーを含む反応で得
られた結果を示し、曲線31は変異型特異的プライマーを含む反応で得られた結果
を示す。この結果は、純粋な野生型鋳型によって、野生型特異的プライマーにつ
いては閾値サイクル数が低くなり、変異型特異的プライマーについては閾値サイ
クル数が高くなることを示す。純粋な変異型鋳型については逆となるのが事実で
ある。得られる閾値サイクル数の差は純粋な鋳型に関して最大であるが、一方の
鋳型の型の割合が増えて他方の鋳型の型が減ると差は減少した。99.9％の野生型
鋳型を含む集団中の、わずか0.1％の変異型鋳型であっても純粋な野生型鋳型と
区別することができた。図４は、図３に示された実験において得られたデータを
標準曲線の作成に用いる方法を示すが、この方法では２種類の異なる増幅反応(
ここでは各サンプルについて行ったポリメラーゼ連鎖反応であり、一方の反応に
おいては野生型特異的ヘアピンプライマーを用い、他方の反応では対応する変異
型特異的ヘアピンプライマーを用いた)において測定された閾値サイクル数(TC)
の差を、サンプル中に存在する変異型および野生型標的の集団における変異型標
的の割合に対してプロットしている。この差は、野生型特異的ヘアピンプライマ
ーを含む反応から得られた閾値サイクル数から、変異型特異的ヘアピンプライマ
ーを含む反応から得られた閾値サイクル数を引くことにより得られる。曲線41は
、既知のサンプルを用いて得たものであり、未知のサンプル中に存在する変異型
鋳型の割合を測定するための標準として利用できる。これらの結果は、本発明の
エアピンプライマーが、１個のヌクレオチド置換によりもたらされる最少の残基
による疾患の診断に好適であることを示す。
【００４４】実施例３
本発明のヘアピンプライマーが、増幅産物中へ取り込まれる際にプライマーの
蛍光が増加するように標識できることを示すために、本発明者らは、図５に示す
配列を有するヘアピンプライマー51を合成した。このプライマーは長さが８ヌク
レオチドのループ配列と長さ７ヌクレオチドのステム配列であり、合わせて長さ
15ヌクレオチドの標的と相補的な配列となっている。DABCYLクエンチャー部分52
が、該オリゴヌクレオチドの3'末端から５番目のヌクレオチド(チミジンヌクレ
オチド)に、ヘキサアルキルスペーサー53を介して共有結合により連結され、ま
たフルオレセイン部分54は、ヘキサアルキルスペーサー55を介してオリゴヌクレ
オチドの5'末端に連結されている。TyagiおよびKramer(1996)により記述された
方法を用いて、このプライマーを構築した。このプライマー中のフルオロフォア
54の蛍光が、プライマーを標的核酸の不在下でインキュベートした場合にクエン
チされることが判明した。このプライマーを完全に相補的な標的の存在下でイン
キュベートした場合には、その蛍光が実質的に増大する。このプライマーを、イ
ンターカレート蛍光色素であるSYBR Greenを入れなかった以外は実施例１に記載
の条件と同じ条件下で行った２種類のポリメラーゼ連鎖反応に利用した。第１の
反応は、ヘアピンプライマーのループ配列および3'アーム配列に完全に相補的で
ある標的配列を含む20,000個の鋳型分子を用いて開始し、一方で第２の反応には
鋳型DNAを含めなかった。ポリメラーゼ連鎖反応の各アニーリング段階の間、フ
ルオレセインの蛍光強度をリアルタイムでモニターし、両方の反応に関して、実
行された熱サイクルの回数の関数として結果を図６にプロットした。この結果は
、曲線61に示す鋳型DNAにより開始された反応混合物の蛍光が、ポリメラーゼ連
鎖反応が直線期になると劇的に増加した。しかしながら、曲線62で示す、鋳型DN
Aを全く含まない反応での蛍光はポリメラーゼ連鎖反応の過程全体を通して低い
ままであった。増幅過程の終了時に２種類の反応混合物の蛍光強度を比較すると
、それらの蛍光には差があり、鋳型DNAの不在下で開始された反応物は、鋳型DNA
にとともに開始された反応物と、紫外線ランプで反応チューブを単に発光させる
ことにより容易に識別することができた。本発明者らはまた、上記とは異なる標
識スキームを用いた本発明のヘアピンプライマーを合成し、得られた標識ヘアピ
ンプライマーを試験した。この別の標識スキームでは、プライマーの3'末端は、
デオキシリボース部分の3'ヒドロキシル基に連結されるのではなく、ヌクレオチ
ドに連結されたヘキサアルキルスペーサーを介してフルオレセイン部分に共有結
合により連結されたチミジンヌクレオチドとした。このプライマーは5'-DABCYL
部分を有していた。プライマーは良好にクエンチされ、増幅産物中に取り込まれ
た場合にプライマーの蛍光が回復した。フルオレセイン部分が3'ヌクレオチドに
結合しているにもかかわらず、このプライマーは、増幅反応においてDNAポリメ
ラーゼとのインキュベーションにより通常のプライマー同様に伸長された。
蛍光が増加するように標識できることを示すために、本発明者らは、図５に示す
配列を有するヘアピンプライマー51を合成した。このプライマーは長さが８ヌク
レオチドのループ配列と長さ７ヌクレオチドのステム配列であり、合わせて長さ
15ヌクレオチドの標的と相補的な配列となっている。DABCYLクエンチャー部分52
が、該オリゴヌクレオチドの3'末端から５番目のヌクレオチド(チミジンヌクレ
オチド)に、ヘキサアルキルスペーサー53を介して共有結合により連結され、ま
たフルオレセイン部分54は、ヘキサアルキルスペーサー55を介してオリゴヌクレ
オチドの5'末端に連結されている。TyagiおよびKramer(1996)により記述された
方法を用いて、このプライマーを構築した。このプライマー中のフルオロフォア
54の蛍光が、プライマーを標的核酸の不在下でインキュベートした場合にクエン
チされることが判明した。このプライマーを完全に相補的な標的の存在下でイン
キュベートした場合には、その蛍光が実質的に増大する。このプライマーを、イ
ンターカレート蛍光色素であるSYBR Greenを入れなかった以外は実施例１に記載
の条件と同じ条件下で行った２種類のポリメラーゼ連鎖反応に利用した。第１の
反応は、ヘアピンプライマーのループ配列および3'アーム配列に完全に相補的で
ある標的配列を含む20,000個の鋳型分子を用いて開始し、一方で第２の反応には
鋳型DNAを含めなかった。ポリメラーゼ連鎖反応の各アニーリング段階の間、フ
ルオレセインの蛍光強度をリアルタイムでモニターし、両方の反応に関して、実
行された熱サイクルの回数の関数として結果を図６にプロットした。この結果は
、曲線61に示す鋳型DNAにより開始された反応混合物の蛍光が、ポリメラーゼ連
鎖反応が直線期になると劇的に増加した。しかしながら、曲線62で示す、鋳型DN
Aを全く含まない反応での蛍光はポリメラーゼ連鎖反応の過程全体を通して低い
ままであった。増幅過程の終了時に２種類の反応混合物の蛍光強度を比較すると
、それらの蛍光には差があり、鋳型DNAの不在下で開始された反応物は、鋳型DNA
にとともに開始された反応物と、紫外線ランプで反応チューブを単に発光させる
ことにより容易に識別することができた。本発明者らはまた、上記とは異なる標
識スキームを用いた本発明のヘアピンプライマーを合成し、得られた標識ヘアピ
ンプライマーを試験した。この別の標識スキームでは、プライマーの3'末端は、
デオキシリボース部分の3'ヒドロキシル基に連結されるのではなく、ヌクレオチ
ドに連結されたヘキサアルキルスペーサーを介してフルオレセイン部分に共有結
合により連結されたチミジンヌクレオチドとした。このプライマーは5'-DABCYL
部分を有していた。プライマーは良好にクエンチされ、増幅産物中に取り込まれ
た場合にプライマーの蛍光が回復した。フルオレセイン部分が3'ヌクレオチドに
結合しているにもかかわらず、このプライマーは、増幅反応においてDNAポリメ
ラーゼとのインキュベーションにより通常のプライマー同様に伸長された。
【００４５】実施例４
本発明のヘアピンプライマーが、増幅反応の間に偽の増幅産物が合成されると
いう問題を解決することを示すために、本発明者らは、一組の従来技術の直線状
プライマーであって、いずれの鋳型DNAも存在しないで開始される増幅反応にお
いて用いられた場合には通常は偽増幅産物を産生するプライマーを使用した。こ
れらのプライマーの配列を用いて、従来技術のプライマーが結合するように設計
されたのと同じ標的配列に関して、本発明のヘアピンプライマーを設計し、構築
した。続いて本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応において従来技術のプライマ
ーの代わりに対応するヘアピンプライマーを使用すると、ヘアピンプライマーは
、標的鋳型DNAの存在下で開始された反応では期待される増幅産物を産生したが
、鋳型DNAの不在下で開始された反応では、(従来技術プライマーを含んだ反応と
は異なり)偽増幅産物を産生しなかった。第１の従来技術プライマーの配列は5'-
GGCCGGTGGTCGCCGCG-3'であり、第２の従来技術のプライマーの配列は5'-ACGTGAC
AGACCGCCGGGC-3'である。対応する第１のヘアピンプライマーの配列は5'-CGCGGC CGGTGGTCGCCGCG-3'であり、対応する第２のヘアピンプライマーの配列は5'-GCCC GG ACGTGACAGACCGCCGGGC-3'であり、下線部はヘアピンのアームを示す。これらの
プライマーは、ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosi
s)のRNAポリメラーゼ遺伝子の領域を増幅するために設計された。
いう問題を解決することを示すために、本発明者らは、一組の従来技術の直線状
プライマーであって、いずれの鋳型DNAも存在しないで開始される増幅反応にお
いて用いられた場合には通常は偽増幅産物を産生するプライマーを使用した。こ
れらのプライマーの配列を用いて、従来技術のプライマーが結合するように設計
されたのと同じ標的配列に関して、本発明のヘアピンプライマーを設計し、構築
した。続いて本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応において従来技術のプライマ
ーの代わりに対応するヘアピンプライマーを使用すると、ヘアピンプライマーは
、標的鋳型DNAの存在下で開始された反応では期待される増幅産物を産生したが
、鋳型DNAの不在下で開始された反応では、(従来技術プライマーを含んだ反応と
は異なり)偽増幅産物を産生しなかった。第１の従来技術プライマーの配列は5'-
GGCCGGTGGTCGCCGCG-3'であり、第２の従来技術のプライマーの配列は5'-ACGTGAC
AGACCGCCGGGC-3'である。対応する第１のヘアピンプライマーの配列は5'-CGCGGC CGGTGGTCGCCGCG-3'であり、対応する第２のヘアピンプライマーの配列は5'-GCCC GG ACGTGACAGACCGCCGGGC-3'であり、下線部はヘアピンのアームを示す。これらの
プライマーは、ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosi
s)のRNAポリメラーゼ遺伝子の領域を増幅するために設計された。
【００４６】
第１および第２のヘアピンプライマーの設計は、２つの設計上のポイントの例
である。第１のヘアピンプライマーに関しては、本発明者らは、長さ８ヌクレオ
チドのループと長さ６ヌクレオチドのステムが、第１の従来技術のプライマーの
5'末端にわずか３個のヌクレオチドを付加することにより得られることに注目し
た。これは、偶然の相補性により、この特定の例においてのみ可能であった。第
１の従来技術のプライマーの5'末端に存在する３個のヌクレオチドが、5'アーム
中の３個のヌクレオチドであることに注意されたい。第２のヘアピンプライマー
では、5'アームは６個の付加されたヌクレオチドを含む。しかしながら、この例
では、ループの長さは13ヌクレオチドであり、５〜12ヌクレオチドの好ましい範
囲外のものである。この例では、本発明者らは１ヌクレオチド置換を識別する実
験を行わなかった。４種類のポリメラーゼ連鎖反応を行った。このうちの２種が
従来技術のプライマーを含み、２種がヘアピンプライマーを含んでいた。反応の
各組の一方は標的鋳型DNAの存在下で開始され、反応の各組のもう一方はいずれ
の鋳型DNAも含んでいなかった。これらの反応の進行を、蛍光インターカレート
色素であるSYBR Greenを用いて、増幅反応の過程で産生されたあらゆる増幅産物
を標識してモニターした。増幅反応の過程の間に観察された蛍光強度の変化を図
７に示す。この結果は、第１と第２の従来技術のプライマーおよび20,000個の鋳
型分子を含んだ反応(曲線71)では、16回の熱サイクルが完了した後にポジティブ
となり、従来技術のプライマーを含むが鋳型DNAを含まない反応(曲線73)では、2
9回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなったことを示す。これは、反応
の過程で偽増幅産物が産生されたことを示している。続いて、これらの増幅産物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では正規
の増幅産物が形成されたが、第２の反応では予想外のサイズの偽増幅産物が産生
されたことが示された。偽増幅産物はプライマーのダイマーと思われる。しかし
ながら、第１および第２のヘアピンプライマーを従来技術のプライマーの代わり
に用いたところ、20,000個の標的鋳型分子ととともに開始した反応(曲線72)では
17回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなり、いずれの鋳型分子も含まな
い反応(曲線74)ではポジティブにはならなかった。続いて、これらの増幅産物を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では期待通
りの増幅産物が形成されたが、第２の反応ではいずれの増幅産物も形成されなか
ったことが確認された。これらの結果は、本発明のヘアピンプライマーが、増幅
反応の間に偽増幅産物が合成される問題を解決するために有用であることを確証
するものである。ヘアピンプライマーが偽増幅産物の合成を抑制する理由は、ル
ープ中の配列のみがプライマー−鋳型ハイブリッドの開始に利用できるため、ま
たヘアピンループ中のハイブリダイゼーション配列の存在により、プライマーと
標的核酸間の相互作用が、従来の直線状プライマーが標的核酸にハイブリダイズ
する場合に生じる相互作用よりも遙かに特異性が高いためである。さらに、ヘア
ピンプライマーの構造は、プライマーのアーム中に存在する配列がプライマーの
標的核酸への最初のハイブリダイゼーションに参加しないようになっている。そ
の帰結として、増幅反応の間の、プライマー同士の結合(従来の直線状プライマ
ーを用いた場合に生じ得る、所望ではない増幅し得るプライマーダイマーを生成
され得る結合)が、ヘアピンプライマーを用いた場合には遙かに生じにくくなる
。
である。第１のヘアピンプライマーに関しては、本発明者らは、長さ８ヌクレオ
チドのループと長さ６ヌクレオチドのステムが、第１の従来技術のプライマーの
5'末端にわずか３個のヌクレオチドを付加することにより得られることに注目し
た。これは、偶然の相補性により、この特定の例においてのみ可能であった。第
１の従来技術のプライマーの5'末端に存在する３個のヌクレオチドが、5'アーム
中の３個のヌクレオチドであることに注意されたい。第２のヘアピンプライマー
では、5'アームは６個の付加されたヌクレオチドを含む。しかしながら、この例
では、ループの長さは13ヌクレオチドであり、５〜12ヌクレオチドの好ましい範
囲外のものである。この例では、本発明者らは１ヌクレオチド置換を識別する実
験を行わなかった。４種類のポリメラーゼ連鎖反応を行った。このうちの２種が
従来技術のプライマーを含み、２種がヘアピンプライマーを含んでいた。反応の
各組の一方は標的鋳型DNAの存在下で開始され、反応の各組のもう一方はいずれ
の鋳型DNAも含んでいなかった。これらの反応の進行を、蛍光インターカレート
色素であるSYBR Greenを用いて、増幅反応の過程で産生されたあらゆる増幅産物
を標識してモニターした。増幅反応の過程の間に観察された蛍光強度の変化を図
７に示す。この結果は、第１と第２の従来技術のプライマーおよび20,000個の鋳
型分子を含んだ反応(曲線71)では、16回の熱サイクルが完了した後にポジティブ
となり、従来技術のプライマーを含むが鋳型DNAを含まない反応(曲線73)では、2
9回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなったことを示す。これは、反応
の過程で偽増幅産物が産生されたことを示している。続いて、これらの増幅産物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では正規
の増幅産物が形成されたが、第２の反応では予想外のサイズの偽増幅産物が産生
されたことが示された。偽増幅産物はプライマーのダイマーと思われる。しかし
ながら、第１および第２のヘアピンプライマーを従来技術のプライマーの代わり
に用いたところ、20,000個の標的鋳型分子ととともに開始した反応(曲線72)では
17回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなり、いずれの鋳型分子も含まな
い反応(曲線74)ではポジティブにはならなかった。続いて、これらの増幅産物を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では期待通
りの増幅産物が形成されたが、第２の反応ではいずれの増幅産物も形成されなか
ったことが確認された。これらの結果は、本発明のヘアピンプライマーが、増幅
反応の間に偽増幅産物が合成される問題を解決するために有用であることを確証
するものである。ヘアピンプライマーが偽増幅産物の合成を抑制する理由は、ル
ープ中の配列のみがプライマー−鋳型ハイブリッドの開始に利用できるため、ま
たヘアピンループ中のハイブリダイゼーション配列の存在により、プライマーと
標的核酸間の相互作用が、従来の直線状プライマーが標的核酸にハイブリダイズ
する場合に生じる相互作用よりも遙かに特異性が高いためである。さらに、ヘア
ピンプライマーの構造は、プライマーのアーム中に存在する配列がプライマーの
標的核酸への最初のハイブリダイゼーションに参加しないようになっている。そ
の帰結として、増幅反応の間の、プライマー同士の結合(従来の直線状プライマ
ーを用いた場合に生じ得る、所望ではない増幅し得るプライマーダイマーを生成
され得る結合)が、ヘアピンプライマーを用いた場合には遙かに生じにくくなる
。
【００４７】参考文献
Gelfandら、(1996) 米国特許第5,487,972号.
Haas, S., Vingron, M., Poustka, A.およびWiemann, S. (1998) 「大スケー
ルでの配列決定のためのプライマーの設計」(Primer design for large scale s
equencing). Nucleic Acids Res. 26, 3006-3012. Lengauer, C., Kinzler, K. W.およびVogelstein, B. (1998) 「ヒト癌におけ
る遺伝的不安定性」(Genetic instabilities in human cancers). Nature 396,
643-649. Livakら、(1996) 米国特許第5,538,848号. Monia, B. P., Johnston, J. F., Ecker, D. J., Zounes, M. A., Lima, W. F
.およびFreier, S. M. (1992) 「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる変異型
Ha-ras mRNA発現の選択的阻害」(Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA
expression by antisense oligonucleotides). J. Biol. Chem. 267, 19954-19
962. Moranら、(1996) Nucleic Acids Res. 24, 2044-2052. Nazarenko, I. A., Bhatnagar, S. K.およびHohman, R. J. (1997) 「エネル
ギー転移に基づくDNAの増幅および検出のための閉鎖管フォーマット」(A closed
tube format for amplification and detection of DNA based on energy tran
sfer). Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521. Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers,
C., Kalsheker, N., Smith, J. C.およびMarkham, A. F. (1989) 「DNAにおけ
る任意の点変異の分析；増幅抵抗性変異系」(Analysis of any point mutation
in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)). Nucleic Ac
ids Res. 17, 2503-2516. Serra, M. J.およびTurner, D. H. (1995) 「RNAの熱力学的特性の予測」(Pre
dicting thermodynamic properties of RNA). Methods Enzymol. 259, 242-261. Tyagi, S.およびKramer, F. R. (1996) 「分子ビーコン：ハイブリダイゼーシ
ョンの際に発光するプローブ」(Molecular beacons: probes that fluoresce up
on hybridization). Nat. Biotechnol. 14, 303-308. Tyagiら、(1997) PCT国際公開公報WO97/39008. Tyagi, S., Bratu, D. P.およびKramer, F. R. (1998) 対立遺伝子の識別のた
めの複数色の分子ビーコン(Multicolor molecular beacons for allele discrim
ination). Nat. Biotechnol. 16, 49-53. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A.,およびRasmussen, R. P. (1
997) 高速サイクルDNA増幅の連続的蛍光モニタリング(Continuous fluorescence
monitoring of rapid cycle DNA amplification). Biotechniques 22, 134-138
. Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K.およびWallace, R. B. (1989) 「鎌状
赤血球性貧血症の診断のためのβ-グロビンゲノムDNAの対立遺伝子特異性な酵素
的増幅」(Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic
DNA for diagnosis of sickle cell anemia). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
2757-2560. Zubritsky, E. (1999) 「ピン止めPCR法」(Pinning down PCR). Anal. Chem.
71, 191A-195A.
ルでの配列決定のためのプライマーの設計」(Primer design for large scale s
equencing). Nucleic Acids Res. 26, 3006-3012. Lengauer, C., Kinzler, K. W.およびVogelstein, B. (1998) 「ヒト癌におけ
る遺伝的不安定性」(Genetic instabilities in human cancers). Nature 396,
643-649. Livakら、(1996) 米国特許第5,538,848号. Monia, B. P., Johnston, J. F., Ecker, D. J., Zounes, M. A., Lima, W. F
.およびFreier, S. M. (1992) 「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる変異型
Ha-ras mRNA発現の選択的阻害」(Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA
expression by antisense oligonucleotides). J. Biol. Chem. 267, 19954-19
962. Moranら、(1996) Nucleic Acids Res. 24, 2044-2052. Nazarenko, I. A., Bhatnagar, S. K.およびHohman, R. J. (1997) 「エネル
ギー転移に基づくDNAの増幅および検出のための閉鎖管フォーマット」(A closed
tube format for amplification and detection of DNA based on energy tran
sfer). Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521. Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers,
C., Kalsheker, N., Smith, J. C.およびMarkham, A. F. (1989) 「DNAにおけ
る任意の点変異の分析；増幅抵抗性変異系」(Analysis of any point mutation
in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)). Nucleic Ac
ids Res. 17, 2503-2516. Serra, M. J.およびTurner, D. H. (1995) 「RNAの熱力学的特性の予測」(Pre
dicting thermodynamic properties of RNA). Methods Enzymol. 259, 242-261. Tyagi, S.およびKramer, F. R. (1996) 「分子ビーコン：ハイブリダイゼーシ
ョンの際に発光するプローブ」(Molecular beacons: probes that fluoresce up
on hybridization). Nat. Biotechnol. 14, 303-308. Tyagiら、(1997) PCT国際公開公報WO97/39008. Tyagi, S., Bratu, D. P.およびKramer, F. R. (1998) 対立遺伝子の識別のた
めの複数色の分子ビーコン(Multicolor molecular beacons for allele discrim
ination). Nat. Biotechnol. 16, 49-53. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A.,およびRasmussen, R. P. (1
997) 高速サイクルDNA増幅の連続的蛍光モニタリング(Continuous fluorescence
monitoring of rapid cycle DNA amplification). Biotechniques 22, 134-138
. Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K.およびWallace, R. B. (1989) 「鎌状
赤血球性貧血症の診断のためのβ-グロビンゲノムDNAの対立遺伝子特異性な酵素
的増幅」(Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic
DNA for diagnosis of sickle cell anemia). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
2757-2560. Zubritsky, E. (1999) 「ピン止めPCR法」(Pinning down PCR). Anal. Chem.
71, 191A-195A.
【図１】
図１は本発明のヘアピンプライマーが単一ヌクレオチド置換の検出に用いられ
る様式を図示したものである。
る様式を図示したものである。
【図２】
図２は単一ヌクレオチド置換を検出する、本発明のポリメラーゼ連鎖反応法(P
CR)の蛍光強度の変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
CR)の蛍光強度の変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
【図３】
図３は、本発明のプライマー、それは変異型特異的プライマーもしくは野生型
特異的プライマーのいずれかであるが、それが用いられる場合に、変異型および
野生型配列の双方(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオチド1個の置換の
み異なっている)を含有する分子の混合物中に存在する、変異型標的の比率の関
数としてどのようにPCR閾サイクル数が変化するかを示している。
特異的プライマーのいずれかであるが、それが用いられる場合に、変異型および
野生型配列の双方(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオチド1個の置換の
み異なっている)を含有する分子の混合物中に存在する、変異型標的の比率の関
数としてどのようにPCR閾サイクル数が変化するかを示している。
【図４】
図４は、2つの異なるポリメラーゼ連鎖反応(1つの反応は本発明の野生型特異
的プライマーを含有するものであり、もう一方の反応は本発明の変異型特異的プ
ライマーを含有するものである)で測定された閾サイクル数を、変異型と野生型
の配列を含有している分子の集団(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオ
チド1個の置換のみ異なっている)中の変異型標的の相対的な量を測定するために
用いることを可能にする標準曲線を示す。
的プライマーを含有するものであり、もう一方の反応は本発明の変異型特異的プ
ライマーを含有するものである)で測定された閾サイクル数を、変異型と野生型
の配列を含有している分子の集団(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオ
チド1個の置換のみ異なっている)中の変異型標的の相対的な量を測定するために
用いることを可能にする標準曲線を示す。
【図５】
図５は、本発明の標識プライマー中のヌクレオチド配列およびフルオロフォア
とクエンチャー部分の結合様式を示す。
とクエンチャー部分の結合様式を示す。
【図６】
図６は、本発明の標識プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の蛍光強度の
変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
【図７】
図７は、本発明のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の蛍光強度の変化
を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 クラマー，フレッド，アール．
アメリカ合衆国 10463 ニューヨーク州，
ニューヨーク，ウェスト 231スト スト
リート 561
(72)発明者 ヴァーティキアン，ロバート
アメリカ合衆国 10033 ニューヨーク州，
ニューヨーク，ウェスト 177ス ストリ
ート 809，アパートメント ６エイチ
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 HA11
4B063 QA01 QA13 QQ42 QR08 QR31
QR62 QS03 QS24 QS34 QX02
Claims (41)
- 【請求項１】 DNAポリメラーゼによる伸長のためのヘアピンオリゴヌクレ
オチドプライマーであって、相補的3'および5'アーム配列によって形成されたス
テム、該アーム配列を分離させている一重鎖ループ配列を含み、該3'アーム配列
および該ループ配列は双方とも、標的核酸鎖の選択されたプライミング領域に対
して完全に相補的であり、該ループの長さを有し該ループ配列に完全に相補的な
モデル非標的配列に対する該ループ配列のハイブリダイゼーションが該ステムの
解離を引き起こさない、ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項２】 さらに3'および5'アーム配列に付着させた相互作用的な蛍光
標識部分を含み、それによって、二重鎖核酸中へのプライマーの取り込みが、該
標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項１記載のプライマ
ー。 - 【請求項３】 相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォアおよび非蛍光性
クエンチャーを含んでいる、請求項２記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項４】 ループ配列が5個から9個のヌクレオチドの長さであって、相
補的3'および5'アーム配列が5個から12個のヌクレオチドの長さのステムを形成
する、請求項１記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項５】 プライミング領域が変異を起こしやすい単一のヌクレオチド
を含有し、ループ配列が該ヌクレオチドを含有する該プライミング領域の一部分
と相補的である、請求項４記載のペアピンプライマー。 - 【請求項６】 プライマーがループ配列と5'アーム配列との間にターミネー
ターヌクレオチドを含有する、請求項４記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項７】 改変されたヌクレオチド、改変されたヌクレオチド間結合、
もしくはその双方を含んでいる、請求項４記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項８】 3'および5'アーム配列に結合した相互作用的な蛍光標識部分
をさらに含み、それによってプライマーの2重鎖核酸への取り込みが、該標識部
分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項４記載のヘアピンプライ
マー。 - 【請求項９】 相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォアおよび非蛍光性
クエンチャーを含んでいる、請求項６記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項１０】 改変されたヌクレオチド、改変されたヌクレオチド間結合
、もしくはその双方を含んでいる、請求項１記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項１１】 プライマーがループ配列および5'アーム配列の間にターミ
ネーターヌクレオチドを含有している、請求項１記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項１２】 プライミング領域が変異を起こしやすい単一のヌクレオチ
ドを含み、ループ配列が該ヌクレオチドを含んでいる該プライミング領域の部分
に対して相補的である、請求項１記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項１３】 3'および5'アーム配列に結合した相互作用的な蛍光標識部
分をさらに含み、それによってプライマーの二重鎖核酸への取り込みが、該標識
部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項１２記載のヘアピンプ
ライマー。 - 【請求項１４】 相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォアおよび非蛍光
性クエンチャーを含んでいる、請求項１３記載のヘアピンプライマー。 - 【請求項１５】 5'末端および3'末端領域を有する、DNAポリメラーゼによ
る伸長のための直鎖状オリゴヌクレオチドプライマーにおける、該3'末端領域に
対して相補的なヌクレオチド配列を該5'末端に付加してステムとループを含むヘ
アピン構造を形成することを含む改良であって、該ループと同じ長さを有し該ル
ープに対して完全に相補的なモデルオリゴヌクレオチドとの該ループのハイブリ
ダイゼーションが該ステムの解離を生じさせないヘアピン構造である、改良。 - 【請求項１６】 ループが5個から9個のヌクレオチドの長さであり、ステム
が5個から12個のヌクレオチドの長さである、請求項１５記載の改良。 - 【請求項１７】 3'末端領域に対して相補的なヌクレオチド配列を付加する
前に5'末端に対するターミネーターヌクレオチドを付加することをさらに含む、
請求項１５記載の改良。 - 【請求項１８】 5'末端および3'末端領域を有する、DNAポリメラーゼによ
るオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を含む核酸増幅のためのプロセスにおい
て、該3'末端領域に対して相補的なヌクレオチド配列を該5'末端に付加してステ
ムとループを含むヘアピン構造を形成することを含む改良であって、該ループと
同じ長さを有し該ループに対して完全に相補的なモデルオリゴヌクレオチドとの
該ループのハイブリダイゼーションが該ステムの解離を生じさせないヘアピン構
造であるこ、改良。 - 【請求項１９】 ループが5個から9個のヌクレオチドの長さであり、ステム
が5個から12個のヌクレオチドの長さである、請求項１８記載の改良。 - 【請求項２０】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も1つの、DNAポリメラーゼによる伸長を含む核酸増幅プロセス。 - 【請求項２１】 該プロセスがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ストランド置
換反応(SDA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写介在増幅(TMA)、およびローリ
ングサイクル増幅(RCA)からなる群から選択されたものである、請求項２０記載
のプロセス。 - 【請求項２２】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つが増幅プライ
マーのペアを含む、請求項２１のプロセス。 - 【請求項２３】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つがループと5'
アームとの間にターミネーターヌクレオチドを含んでいる、請求項２１記載のプ
ロセス。 - 【請求項２４】 少なくとも1つはフルオロフォアである相互作用的な標識
を有する別個の検出用プローブを用いる、意図する増幅産物のリアルタイムでの
検出を含む、請求項２０記載のプロセス。 - 【請求項２５】 少なくとも1つのプライマーが、3'および5'アーム配列に
結合した相互作用的な蛍光標識部分をさらに含み、それによって該プライマーの
二重鎖核酸への取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変
える、リアルタイムでの検出を含む請求項２０記載のプロセス。 - 【請求項２６】 相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォアおよび非蛍光
性クエンチャーを含んでいる、請求項２５記載のプロセス。 - 【請求項２７】 ループ配列が5個から9個のヌクレオチドの長さであって、
相補的3'および5'アーム配列が5個から12個のヌクレオチドの長さのステムを形
成する、請求項２０記載のプロセス。 - 【請求項２８】 プライミング領域が変異を起こしやすい単一のヌクレオチ
ドを含み、ループ配列が該ヌクレオチドを含んでいる該プライミング領域の部分
に対して相補的である、請求項２７記載のプロセス。 - 【請求項２９】 プライマーが改変されたヌクレオチド、改変されたヌクレ
オチド間結合、もしくはその双方を含んでいる、請求項２７記載のプロセス。 - 【請求項３０】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つがループと5'
アームとの間にターミネーターヌクレオチドを含んでいる、請求項２０記載のプ
ロセス。 - 【請求項３１】 プライミング領域が変異を起こしやすい単一のヌクレオチ
ドを含有し、ループ配列が該ヌクレオチドを含有する該プライミング領域の一部
分と相補的である、請求項２０記載のプロセス。 - 【請求項３２】 プライマーがさらに3'および5'アーム配列に結合した相互
作用的な蛍光標識部分をさらに含み、それによって該プライマーの二重鎖核酸へ
の取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項
３１記載のプロセス。 - 【請求項３３】 相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォアおよび非蛍光
性クエンチャーを含んでいる、請求項３２記載のプロセス。 - 【請求項３４】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も1つがプライマーのペアに含まれている、請求項２０記載のプロセス。 - 【請求項３５】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つが5個から9個
のヌクレオチドの長さのループ配列を有し、および、相補的3'および5'アーム配
列が5個から12個のヌクレオチドの長さのステムを形成する、請求項３４記載の
プロセス。 - 【請求項３６】 増幅バッファー、dNTP、請求項１記載のプライマーの少な
くとも1つ、および該増幅を行うための説明書を含んでいる、標的核酸配列の増
幅を行うための試薬のキット。 - 【請求項３７】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つが、第1のプラ
イマー、および該第1のプライマーとはループ配列の単一のヌクレオチドのみが
異なる第2のプライマーを含んでいる、請求項３６記載の試薬のキット。 - 【請求項３８】 第1および第2プライマーの各々の中のループ配列が5個か
ら9個のヌクレオチドの長さで、相補的3'および5'アーム配列が5個から12個のヌ
クレオチドの長さであるステムを形成する、請求項３７記載の試薬のキット。 - 【請求項３９】 第1および第2プライマーの各々が3'および5'アーム配列に
結合した相互作用的な蛍光標識部分を含んでおり、それによって該プライマーの
各々の二重鎖核酸への取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可
能に変える、請求項３７記載の試薬のキット。 - 【請求項４０】 プライマーの少なくとも1つの中のループ配列が5個から9
個のヌクレオチドの長さで、相補的3'および5'アーム配列が5個から12個のヌク
レオチドの長さのステムを形成する、請求項３６記載の試薬のキット。 - 【請求項４１】 請求項１記載のプライマーの少なくとも1つがループと5'
アームの間にターミネーターヌクレオチドを含んでいる、請求項３６記載の試薬
のキット。
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