JPWO2007046158A1 - 核酸分析方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、プライマーあるいはプローブと試料とのハイブリダーゼーション効率を向上させることにより、微量核酸の安定的増幅と高感度な解析を可能にする。すなわち、本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第１配列と、他方の鎖に相補的な第２配列と、前記第１配列及び第２配列とを連結する第３配列とを有する第一プローブを少なくとも１種類以上、前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程と、少なくとも１種類の第二プローブを前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程とを有することを特徴とする核酸分析方法に関する。

Description

本発明は、微量核酸を感度よく解析するための核酸分析方法に関する。より詳しくは、鋳型となる二本鎖核酸の高次構造を部分的に壊すことにより、プライマーやプローブのハイブリダイゼーション効率を向上させ、微量核酸を感度よく解析することを特徴とする核酸分析方法に関する。

ポストシーケンス時代は、遺伝子の機能を追及する機能ゲノム研究が大きな柱として掲げられている。これらにはＤＮＡチップ（現在ではＤＮＡを基板上に整列（アレイ）させて固定化した『ＤＮＡアレイ』や、繊維集束型・糸巻き型など形態も様々に変化しており、ここでは総称として『ＤＮＡチップ』に統一して説明する。）やＳＮＰ解析、蛋白質相互作用を高速に解析する技術が利用される。また、これらから得られた情報を基にしたゲノム創薬も進んでいる。こういった状況の中で遺伝子の発現解析や変異解析はゲノム研究の大きな一端を占める。

『ＤＮＡチップ』は１０年ほど前に開発された、２０〜１００ｍｅｒのヌクレオチド・ｃＤＮＡまたはＢＡＣクローンＤＮＡなどが基板上に高密度に並べられたマイクロアレイである。ＤＮＡチップは、検体ＤＮＡやＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって塩基配列の決定や遺伝子変異・ＳＮＰの解析、遺伝子の発現量・コピー数の測定及びＤＮＡのメチル化解析といった試料核酸の多様な質的及び量的変化を調べることができる（非特許文献１参照）。また、極めて多数の遺伝子の発現を経時的に多くの時点で観察することを可能にした革命的な技術であり、調べたい遺伝子の有無や働き具合を簡単に確認することができるうえに、数千から数万におよぶ遺伝子の測定を網羅的に行うことができるため、研究を進めるうえでの重要な道具の一つとなっている。ＤＮＡチップを使うことにより、ゲノム構造解析の後を受けたゲノム機能解析が大いに進み、医療や創薬あるいは臓器再形成の研究などに変革が起こると考えられている。ヒトゲノムプロジェクトにより、塩基配列はわかっているが機能が未知の新しい遺伝子が次々と発見された。こうした新しい遺伝子の機能解析は、その塩基配列をリファレンスに含めることによって進展することが期待される。疾病に関連する遺伝子の研究では、従来は遺伝子を一つ一つ調べる方法しかなく、単一遺伝子疾患よりも圧倒的に多い多因子疾患関連遺伝子群の解析は非常に困難であった。しかしＤＮＡチップを利用して、今後は糖尿病やアルツハイマー病・循環器系疾患・リューマチなど、これまで研究の難しかった病気の原因遺伝子を網羅的に解明し、その発症のしくみを理解する研究が大きく進むものと考えられる。そして、これらの知見に基づいて従来に比べて飛躍的に効率の良い創薬が可能になり、短期間に優れた薬剤開発が可能となることが期待されている。

一塩基多型（ＳＮＰ）を解析することは、さまざまな疾患のリスクやその遺伝的背景を解明することにつながるといわれている（非特許文献２参照）。病原体の遺伝子をスキャンすることによって、薬剤耐性に関与する遺伝子を解明することも可能であり（非特許文献３参照）、将来は検出された病原体の薬剤耐性を治療開始前に知ることも可能になるといわれている。抗癌剤の開発においてもその薬剤をin vitroで作用させた際にどのような遺伝子が影響を受けるのか調べ、従来の薬剤を用いた場合と比較することによって、開発のスピードが加速されることが期待されている。

ＰＣＲ法は広く生物工学・農学・医学の諸分野で生命科学の基礎と応用に携わっている人たちにとって、速やかに且つ正確に蛋白質や遺伝子の情報が提供できる有力な実験技術の一つである。実験材料が微生物や動物・植物などと異なっていても研究の目的が同じであれば、同じＰＣＲ実験法を用いて研究を進めることが可能である。ＰＣＲの最大の特徴は、ゲノムＤＮＡのような複雑なＤＮＡからある特定の領域のみを増幅することにある。ＰＣＲは２種類のプライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する反応であるから、合成されるＤＮＡの領域はプライマーにより特定される領域であり、この領域のみが増幅される。プライマーは鋳型二本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖の特定領域の塩基配列を有しており、一方のプライマーの３’末端は他方のプライマーの方向を向いている。ＤＮＡポリメラーゼは、合成反応開始時にプライマーを必要とし、ｄＮＴＰｓの存在下で一定のｐＨ条件のもと、各プライマーの３’末端にｄＮＭＰを付加しながら伸長反応を進め、その結果増幅領域が対数的に増加していく。

ゲノムプロジェクトの進歩に伴い発展してきた多くの遺伝子解析技術（シーケンス法やＳＮＰ解析・変異解析・発現解析など）は、検出感度を確保するために、事前の遺伝子増幅を必要とすることが多い。ＰＣＲ法を用いることによって、これまで困難といわれていた事柄が容易に解決されることも多く、生命科学の基礎と応用にＰＣＲ法が果たす役割は大きい。
ＢＩＯテクノロジージャーナル, vol.5, No.4, 394-396 (2005) Wang DG, et al., Science, 280, 1077-82 (1998) Winzeler EA, et al., Science, 281, 1194-97 (1998)

一般にプローブと試料を特異的にハイブリダイズさせる工程を含む遺伝子解析では、プローブの量を試料量に対して大過剰に用意する必要がある。また固相上でハイブリダイゼーション反応を行う場合には、液相での反応と比べて著しく反応効率が劣るために、シグナルの検出が困難になる場合がある。また、遺伝子の変異解析では、事前にＰＣＲ等により遺伝子断片を増幅することが不可欠であるが、微量の核酸試料から安定的に遺伝子断片を増幅することは一般に困難である。

本発明は、プライマーあるいはプローブと試料とのハイブリダーゼーション効率を向上させることにより、微量核酸の安定的増幅と高感度な解析を可能にすることを課題とする。

試料核酸の検出対象部位を認識するプローブ配列以外の配列に相補的な一本鎖オリゴ（ＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＰＮＡ，キメラオリゴ）を合成し、これを試料核酸に対して過剰になるよう加え、９４℃で加熱した後に室温まで冷却する。熱変性によって一本鎖になった試料核酸は、室温に至る過程で再び元の二本鎖に巻き戻ろうとするが、このときに、あらかじめ過剰に添加しておいた相補的な一本鎖オリゴが先にハイブリダイズするために、完全な二本鎖に戻ることができない。このように処理された試料核酸は、完全二本鎖核酸よりも不安定になる。この不安定な試料核酸を、検出対象部位を認識するプローブ配列が固定された基板上に、あるいは検出対象部位を認識するプローブ配列を含む溶液中に添加し、ハイブリダイゼーションを行う。すると、あらかじめ不安定化された試料核酸は、不安定化していない完全二本鎖核酸よりもスムースにプローブとハイブリダイズすることとなる。

本発明は、以上の知見に基づいてなされたものであり、プローブとは異なる部位に結合するオリゴ配列をあらかじめ試料にハイブリダイズさせることで、試料核酸の二本鎖構造あるいは分子内構造を破壊して『プローブが試料核酸とハイブリダイズしやすくなる』効果をもたらすものである。

本発明により、ハイブリダイゼーション反応を利用した遺伝子変異解析や発現解析において、試料二本鎖核酸と検出用プローブのハイブリ効率が改善され、より高感度の解析を行うことができる。あるいはポリメラーゼによる伸長反応を伴う核酸断片増幅において、微量の鋳型試料とプライマーのハイブリダイゼーション効率が促進され、安定して遺伝子増幅を行うことができる。

図１は、本発明を説明するための鋳型ＤＮＡ配列と第一プローブ及び第二プローブの位置関係図である。 図２は、本発明によるハイブリダーゼーション促進効果（蛍光検出結果）を示す。 図３は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。 図４は、本発明による鋳型核酸の不安定化効果を示す。 図５は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。 図６は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。 図７は、一本鎖試料核酸を用いる一般的なＤＮＡチップを表す概念図である。 図８は、ＤＮＡチップ解析における本発明の効果の一例を示す。 図９は、二本鎖試料核酸を用いる一般的なＤＮＡチップを表す概念図である。 図１０は、二本鎖試料核酸に本発明を適用した場合のＤＮＡチップを表す概念図である。 図１１は、ビーズチップの模式図である。 図１２は、ガラスビーズへの第一プローブ固定の様子を表す概念図である。 図１３は、本発明を説明するための鋳型ＤＮＡ配列と第一プローブ及び第二プローブの位置関係図である。 図１４は、本発明によるハイブリダーゼーション促進効果（ＰＣＲ産物量の比較）を示す。 図１５は、本発明によるＰＣＲ効率促進効果（ＰＣＲ産物量から計算）を示す。 図１６は、本発明によるＰＣＲ効率促進効果（リアルタイムＰＣＲ）を示す。 図１７は、本発明によるＰＣＲ効率促進効果（ＰＣＲ産物量の比較）を示す。 図１８は、本発明を説明するための鋳型ＤＮＡ配列と第一プローブ及び第二プローブの位置関係図である。 図１９は、本発明によるハイブリダーゼーション促進効果（発光検出結果）を示す。

符号の説明

１−１、１−２…鋳型二本鎖ＤＮＡ
１−３、１−４…プライマー
１−５…ＰＣＲ産物（増幅領域）
１−６…標識ＦＩＴＣ
１−７…第二プローブ
１−８…標識ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ
１−９…標識ビオチン
１−１０…第１配列
１−１１…第２配列
１−１２…第３配列
２−１…蛍光強度（バックグラウンド）
２−２…蛍光強度 何も添加せず
２−３…蛍光強度 第一配列のみを添加
２−４…蛍光強度 第一プローブのみ添加
３−１…第１配列
３−２…第一プローブ
４−１…安定な二本鎖状態
４−２…再会合が部分的に妨げられた状態
４−３、４−４…二本鎖ＰＣＲ産物を構成する鎖
４−５…第一プローブ
５−１、５−２…鋳型二本鎖核酸を構成する鎖
５−３…第１配列
５−４…第２配列
５−５…第３配列
５−６…第１’配列
５−７…第２’配列
５−８…第３’配列
５−９…第３配列と第３’配列の中央付近が互いにハイブリダイズするような構造をとるようデザインされた第一プローブ
５−１０…ループ構造をとる第３配列
５−１１…第３配列がループ構造をとる第一プローブ
６−１…第一プローブ
６−２…第１配列
６−３…第２配列
６−４…第３配列
７−１…基板
７−２…第二プローブ（一本鎖）
７−３…リンカー
７−４…標識
７−５…一本鎖試料核酸
７−６…標識
７−７…一本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダイゼーション反応の様子
７−８…スタンフォード型ＤＮＡチップ
８−１…ＤＮＡチップによる検出結果（試料が一本鎖核酸の場合）
８−２…バックグラウンド
８−３…ハイブリした場合のシグナル
８−４…ハイブリしない場合のシグナル
８−５…ＤＮＡチップによる検出結果（二本鎖核酸を変性させて試料とした場合）
８−６…ＤＮＡチップによる検出結果（二本鎖核酸試料に本発明を適用した場合）
９−１…二本鎖試料核酸
９−２…再会合
９−３…二本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダイゼーション反応の様子
１０−１…第一プローブ
１０−２…二本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダイゼーション反応の様子（本発明を適用した場合）
１１−１…ガラスビーズ
１１−２…第二プローブ
１１−３…キャピラリー
１１−４…キャピラリーに一列に配列したガラスビーズ
１１−５…蛍光標識されたターゲット核酸
１１−６…シリンジ
１１−７…プローブ固定化ビーズ
１２−１…ＡＰＳコート
１２−２…クロスリンカーＫＭＵＳ
１２−３…プローブ配列
１３−１…第１配列
１３−２…第２配列
１３−３…第３配列
１３−４…第２配列の３’末端
１３−５…第１配列の５’末端
１４−１…ＰＣＲ産物量（第一プローブ添加）
１４−２…ＰＣＲ産物量（コントロール：第一プローブ添加なし）
１５−１…ＰＣＲ効率（第一プローブ濃度３．４ｐｍｏｌ）
１５−２…ＰＣＲ効率（第一プローブ濃度６．８ｐｍｏｌ）
１５−３…ＰＣＲ効率（第一プローブ濃度１０．２ｐｍｏｌ）
１５−４…ＰＣＲ効率（コントロール：第一プローブ添加なし）
１６−１…リアルタイムＰＣＲの結果（コントロール：第一プローブ添加なし）
１６−２…リアルタイムＰＣＲの結果（第一プローブ添加）
１７−１…ＰＣＲ産物濃度（第一プローブ添加しない通常のＰＣＲ反応）
１７−２…ＰＣＲ産物濃度（第一プローブ添加）
１８−１…ＴＰ５３遺伝子のコドン１７５番を成す３塩基の中央の塩基
１８−２…第二プローブ配列
１８−３…第二プローブ配列の３’末端
１８−４…第二プローブ配列内に挿入したミスマッチ塩基
１９−１…ＢＡＭＰＥＲ法の結果（第二プローブのみ添加）
１９−２…ＢＡＭＰＥＲ法の結果（第一プローブ及び第二プローブ添加）
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００５−３０６１６２号の明細書に記載された内容を包含する。

本発明は、鋳型となる二本鎖核酸の高次構造を部分的に壊すことにより、プライマーやプローブのハイブリダイゼーション効率を向上させ、微量核酸の高感度な解析を可能にする核酸分析方法を提供する。

具体的には、本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第１配列と、他方の鎖に相補的な第２配列と、前記第１配列及び第２配列とを連結する第３配列とを有する第一プローブを、前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程と、少なくとも１種類の第二プローブを前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程とを有する。

本発明において、前記第一プローブを構成する第３配列は１０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下であることが好ましく、前記二本鎖核酸のいずれの配列とも非相補である。

また、前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域は、前記二本鎖核酸上の前記第１配列及び前記第２配列の結合領域の間あるいは各末端からそれぞれ500塩基以内の領域に位置し、特に前記第１配列及び第２配列が、それぞれ前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域の末端から少なくとも１０塩基以上離れた位置にハイブリダイズすることが好ましい。

前記第一プローブを構成する第３配列は鎖内結合によりループ状の立体構造を形成するものであってもよい。

また、前記第一プローブは２種以上用いられ、前記二本鎖核酸の近傍にハイブリダイズした２種類の第一プローブが、その第３配列間で相補鎖結合を形成して梯子状の立体構造を形成するものであってもよい。

本発明の方法において、前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション量を計測すれば、前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。

例えば、前記第二プローブを蛍光体で標識し、その蛍光量から前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。あるいは、前記第二プローブをアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βカラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼから選択されるいずれかの酵素で標識し、当該酵素とその基質との反応で生じる発光あるいは発色の量から、前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。あるいはまた、前記第二プローブを放射性同位体で標識し、その放射線量から前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。

ある実施態様において、前記二本鎖核酸にハイブリダイズした前記第二プローブからの相補鎖伸長反応を行う工程をさらにしていてもよい。

前記方法において、前記第一プローブは、第二プローブに対するプライマーペアとして機能しないよう、その３’末端に存在する３塩基の少なくとも１塩基が、前記第一プローブの二本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造にすることが望ましい。その３’末端から相補鎖伸長をしない構造に設計するか、その３’末端に、前記第一プローブの二本鎖核酸上の結合領域とは相補でない配列を付加することが望ましい。

あるいは、前記第一プローブの３’末端からの相補鎖伸長を抑止するために、その３’末端の水酸基を修飾又は別の官能基で置換しておいてもよい。

本発明の方法において、第二プローブは固相（例えば、ＤＮＡチップの基板やビーズ等）上に固相化されているものであってもよい。本発明の技術を応用したＤＮＡチップやビーズアレイを用いることにより、遺伝子解析の感度を飛躍的に向上させることができる。

本発明の方法は、変異や多型の検出に利用できる。すなわち、変異を有することが予測される試料核酸に対し、前記変異の候補部位とその３’末端でハイブリダイズする第二プローブと前記第一プローブとを前記核酸試料に同時に添加する工程と、ハイブリダイズした前記第二プローブからの伸長反応を行う工程と、前記伸長反応の結果から前記試料核酸が変異部位を有するか否かを判定することができる。

例えば、ＢＡＭＰＥＲ法等を適用して、第二プローブから一塩基伸長反応を行い、この際導入される塩基種を識別することにより、前記第二プローブの３’末端側隣接塩基が変異を有するか否かを判定することができる。

この場合、前記伸長反応は、前記試料核酸と前記第二プローブの３’末端に存在する少なくとも２塩基が相補的な場合に起こるようにしてもよい。また、第二プローブにミスマッチを導入することにより、第二プローブの分子内ハイブリダイゼーションを防止してもよい。

別な態様において、前記第二プローブは１対の増幅用上流プライマー及び下流プライマーであり、本発明はこれらプライマーにより前記二本鎖核酸の少なくとも一部の領域を増幅する工程を有するものであってもよい。この場合、前記第１配列及び前記第２配列は二本鎖核酸上の前記プライマー周辺にハイブリダイズするものでなくてはならず、前記二本鎖核酸上の前記領域の末端からそれぞれ５００塩基以内の領域にハイブリダイズすることが好ましい。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

まず、本発明の実施例に用いる一般的な反応操作について説明する。

プローブとなる一本鎖オリゴと、鋳型試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション実験について説明する。鋳型試料核酸は解析前にＰＣＲ反応によりターゲット領域を増幅しておく必要がある。本実施例では、増幅用プライマーの一方を蛍光体（ここではＦＩＴＣ）で標識した。反応容器にはＰＩＥＲＣＥ社のＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプロアビジンコート済みポリスチレン９６ウェルプレートを用いた。このウェルの底面及び側面はストレプトアビジンでコーティングされており、片側をビオチンで修飾した検出用プローブを結合固定することができる。具体的には１００μＬのＰＢＳに溶解した検出用プローブ（５’-ビオチン/３’-ＴＥＸＡＳ ＲＥＤで修飾）２０ｐｍｏｌを１ウェルあたりに添加し、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。

前記ＦＩＴＣ修飾した試料ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を９５℃で５分間熱変性した後に氷冷し、Ｎ２Ｓハイブリダイゼーションバッファー（ＰＩＥＲＣＥ社）で適当に希釈したものを、前記プローブを固定したウェルに入れ、６０℃で一時間インキュベートした。その後Ｎ２ＳハイブリダイゼーションバッファーとＰＢＳで洗浄し、蛍光強度を検出することによりプローブと試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを調べた。蛍光検出にはパーキンエルマー社のＡＲＶＯ ＳＸマイクロプレートリーダーを使用した。本実施例では、遺伝子増幅用プライマー及び検出用プローブは蛍光体ＦＩＴＣ及びＴＥＸＡＳ ＲＥＤで修飾したが、使用するプレートリーダーと蛍光フィルターによっていかなる蛍光体を選択してもよい。また、ラジオアイソトープ標識によるカウント測定や、ＨＲＰやＡＰ標識による発光測定でも検出は可能であり、状況に応じて使い分ければよい。

〔実施例１〕 ＰＣＲ反応への本発明の適用
ここではＴＰ５３遺伝子のエキソン５を例にして説明する。本配列情報はＮＣＢＩデータベースのアクセッションナンバーＮＴ_０１０７１８から得ることができる（配列の一部（配列番号１）は図１に記載した）。１−１及び１−２から成る鋳型二本鎖ＤＮＡに対して、１−３及び１−４のデザインのプライマーを作用させてＰＣＲ増幅反応を行った後の増幅領域は１−５で表される。伸長反応用の温調器にはサーマルサイクラーであるＡＢＩ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲ産物の確認にはマイクロチップ電気泳動解析システムＳＶ１２１０（日立電子エンジニアリング）を使用した。オリゴ合成はシグマジェノシスに委託した。ＤＮＡポリメラーゼはＱＩＡＧＥＮ社製品を、その他使用した試薬は極一般的な市販品を使用した。鋳型核酸（ヒトゲノム）はＢＩＯＣＨＡＩＮ社より購入して使用した。

以下は一般的なＰＣＲ法の手順である。９６ウェルプレートに１×１０^-２０ｍｏｌ/μＬに調製したゲノム試料１μＬを加え、氷上に置いた。２.５ｕｎｉｔ/μＬのＴａｑ．ＤＮＡポリメラーゼを０.２μＬ、２.５ｍＭのｄＮＴＰｓを４μＬ、２５ｐｍｏｌ/μＬのプライマーセット各０.８μＬを混合し、各ウェルあたり１００μＬとなるように滅菌水で調製した。上記各容量は同じ比率で変更することが可能で、たとえばＰＣＲは５０μＬスケールでもよい。粘着シートでシーリングし、サーマルサイクラーにセットした。二本鎖ゲノムを変性させるため、９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサーマルサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動解析システムで解析し、目的のＰＣＲ産物を確認した。

ここで使用したリバースプライマー１−４はその５’端を１−６のＦＩＴＣで蛍光標識されており、したがってＰＣＲ産物１−５も標識されている。第二プローブ１−７はその３’端を１−８のＴＥＸＡＳ ＲＥＤで蛍光標識し、さらに５’端を１−９のビオチンで標識しており、アビジンでコーティングされたプレート上に固定されている。この第二プローブ１−７によってＰＣＲ産物１−５をトラップする際に、１−５はあらかじめ熱変性されているが、このとき本発明の第一プローブを同時に添加しておく。第一プローブは核酸鎖１−２にハイブリダイズする部位（第１配列１−１０）と、核酸鎖１−１にハイブリダイズする部位（第２配列１−１１）と、１−１０の３’端と１−１１の５’端を結合するようにデザインされた第３配列１−１２から成る。１−１２の配列はＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号２）とした。

図２は実際のＦＩＴＣ蛍光強度を検出したものであるが、上記第一プローブを加えていない場合にはバックグラウンド２−１に対しての２−２のようにわずかなカウントの上昇しかみられなかった。つまりＰＣＲ産物１−５は第二プローブ１−７に対してあまり高効率でハイブリダイズしなかった。これに対して第一プローブの第１配列のみからなるオリゴを添加した場合には、２−３のように２−２よりも高いカウントが得られていた。

この結果を一般的な模式図である図４を用いて説明する。あらかじめ熱変性された二本鎖ＰＣＲ産物（鎖４−３と鎖４−４から成る）は、通常は変性状態を保ち続けるのが難しく、安定な二本鎖（４−１）の状態に戻りがちであるのに対して、上記の結果は第一プローブ４−５が二本鎖ＰＣＲ産物の一方の鎖（図では鎖４−４）に部分的にハイブリダイズしたために４−２に示すように鎖４−３と鎖４−４の再会合が部分的に妨げられ、第二プローブがＰＣＲ産物にハイブリダイズしやすくなって起こったものと考えられた。第１配列１−１０・第２配列１−１１・第３配列１−１２から成る第一プローブ３−２を前記と同様にＰＣＲ産物１−５に作用させた場合には、２−４のように、第一配列のみを作用させた結果である２−３よりもさらなる高カウントが得られた。即ち、第一プローブの両端（１−１０と１−１１）が鎖１−１と鎖１−２にそれぞれ作用して、第一プローブ３−１を作用させた場合よりもさらに安定な二本鎖構造をとり難くなったものと考えられた。

同様の作用をもたらす第一プローブの構造としては、図５に示すようなものが考えられる。即ち５−１と５−２から成る鋳型二本鎖核酸に対して前記と同様に第１配列５−３・第２配列５−４・第３配列５−５から成る第一プローブと、第１’配列５−６・第２’配列５−７・第３’配列５−８から成る第一プローブ’を同時に作用させる場合であり、前記第３配列と第３’配列の中央付近が互いにハイブリダイズするような構造をとるようデザインされた５−９の如きものや、第１配列５−３・第２配列５−４・第３配列５−１０から成り、前記第３配列５−１０が鎖内結合によってループ構造をとるようにデザインされた第一プローブ５−１１の如きものが考えられる。これら第一プローブ（３−２、５−９、５−１１）は、試料核酸に対して２箇所以上同時に作用させてもよい。あるいは図６に示したように第二プローブ６−５を左右から挟みこむように第一プローブ６−１の第１配列６−２と第２配列６−３を配置し、第３配列６−４で結合するような構造をとることも考えられる。

これら第一プローブを構成する第１配列及び第２配列は、第二プローブの鋳型へのハイブリダイゼーション反応を妨げることがないよう、少なくとも１０塩基以上、望ましくは５０塩基以上離れた位置にハイブリダイズするようにする。第３配列１−１２・５−５・６−４及び第３’配列５−８はハイブリさせようとする鋳型核酸と完全に非相補であるようにする。これは前記配列に限定するものではなく、周辺配列に依存する。その長さは１０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下で、望ましくは５０ｍｅｒ以下である。

〔実施例２〕 ＤＮＡチップへの本発明の適用
市販されているＤＮＡチップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社が発売したいわゆる“アフィメトリクス型”と、スタンフォード大学のパトリック・ブラウンらが考案した“スタンフォード型”の二つに大別される。“スタンフォード型”はあらかじめ用意したｃＤＮＡや合成オリゴＤＮＡなどを細いピンなどでスライドガラスに滴下して作るシンプルなチップで、一つのスポットの中には大量のｃＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）や一本鎖オリゴＤＮＡが含まれており、これがプローブ（リファレンス）となって遺伝子を検出する。ＤＮＡチップ研究所の「ＡｃｅＧｅｎｅ（登録商標）」やＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の「ＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）」、タカラバイオ社の「ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（登録商標）」などがこれに類する。“アフィメトリクス型”では半導体技術に用いられる光リソグラフィーにより、プローブ（一本鎖オリゴＤＮＡ）を基板上で垂直に合成するものである。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）」やアジレント・テクノロジーズ社のマイクロアレイなどが挙げられる。プローブを基板上に固定する技術以外にも、三菱レイヨン社の「Ｇｅｎｏｐａｌ（登録商標）」やＴＵＭジーン社のＥＣＡチップ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｒｒａｙ）などが挙げられる。いずれもプローブとなる一本鎖あるいは二本鎖のＤＮＡと、試料ＤＮＡのハイブリダイズ効率により解析結果は影響を受ける。これらにも本発明を応用することが可能である。

図７に一般的なスタンフォード型チップによりハイブリダイゼーション効率を検証した結果を示す。７−８に示したような形状のチップ上にスポットが計６４個あり、各遺伝子に固有のプローブがそれぞれ固定されている。具体的には基板７−１に対して７−２の第二プローブ（一本鎖）がリンカー７−３を介して固定されている。７−２は末端に蛍光その他の標識７−４を有する場合もある。

これに対して７−５に示すような一本鎖試料核酸（一方の末端が蛍光体その他の標識７−６を有する）を作用させ、前記プロトコルにしたがって第二プローブ７−２とハイブリダイゼーション反応を行った場合に図８−１に示すような結果となっていた。バックグラウンド８−２に対して、試料７−５と第二プローブ７−２がハイブリダイズした場合は８−３のようなシグナルが得られており、試料７−５と第二プローブ７−２がハイブリダイズしなかった場合は８−４のようなシグナルであった。このとき７−５と７−２のハイブリダイゼーション反応の様子は７−７の如きであると考えられた。

同様な実験を図９−１に示すような二本鎖試料核酸（一方の末端が蛍光体その他の標識７−６を有する）を試料として行った。このようなケースでは事前に９−１を加熱あるいはアルカリ処理によって変性させておくが，安定な二本鎖試料核酸は９−２のように再会合の能力が高く、結果として８−１のようにバックグラウンドとシグナルのクリアなコントラストは得られず、８−５の如きであった。この原因は９−３に示すように、７−７の場合ほど第二プローブ７−２と鋳型９−１のハイブリダイゼーション効率が高くなかったためと考えられた。ハイブリ効率を高めようとして二本鎖試料核酸９−１の添加量を多くすると、その末端にある標識７−６によるバックグラウンドが大きくなってしまい、有効なＳ/Ｎ比の上昇は認められなかった。

同様に二本鎖核酸を試料とする場合に、本発明を適用した場合（８−６）について述べる。前記二本鎖試料核酸９−１に対してあらかじめ第一プローブ１０−１をハイブリダイズさせておく。このとき１０−１は先のとおり３−２あるいは５−９、５−１１、６−１のいずれかの構造をとるものとする。前記プロトコルにしたがって第二プローブ７−２とハイブリダイゼーション反応を行った場合に、８−６に示すような結果が得られており、これは８−１と同程度の感度であった。即ち試料とした核酸が９−１と同じ二本鎖構造であったにもかかわらず１０−２の如く効率よくハイブリダイズしたものと考えられ、その効率は試料核酸が一本鎖である場合（７−７）に比べて遜色ないことが示された。一般的に固相上でプローブと試料核酸のハイブリダイゼーション反応を行いたい場合には、試料核酸は事前にアルカリ変性による一本鎖化が必要であったり、さらにカラム精製を必要としたりするがこれらの手法は煩雑である。あるいは熱変性により試料核酸の二本鎖構造をほぐしておく場合も考えられるが、先記のように安定な構造へと巻き戻ろうとする力が大きいために、そのままでプローブとの効率よい反応を起こそうとするのは困難である。しかし本発明を適用すれば、二本鎖試料核酸を熱変性するのと同様の手軽さで、試料核酸を一本鎖化した場合と同等の効果が得られることが示された。本実施例では、第二プローブの末端を蛍光体により標識したものを用いたが、放射線同位体による標識を用いても良い。また、特定の基質と反応させることにより発色する酵素（アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼなど）により標識を用いても良い。たとえばアルカリフォスファターゼで標識した場合には、基質であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させると紫色の発色が観察され、その強度を測定・比較することにより本発明の効果を確認できた。また、化学発光基質を用いれば酵素反応による発光を用いた計測も可能である。

〔実施例３〕 ビーズチップへの本発明の適用
平板状のＤＮＡチップは一般的に使用されており、様々な用途に用いられている。しかし、特に医用・診断用途にはさらに高い感度と短時間での計測が求められる。検査項目数に関しては、網羅的な解析ではないためせいぜい１００種に対応できればよいが、検査項目の組み合わせの変更が容易であることが望ましい。またサンプル間のコンタミネーションを防ぐため、使い捨て可能であることも要件の一つである。これらの要件を満たすべく開発されたのが『ビーズチップ』である。これは、約１００ミクロンのガラスビーズ１１−１に前記第二プローブ１１−２を固定し、ほぼ同サイズのキャピラリー１１−３あるいはマイクロチップ中の溝に一列に配列した構成をとる。第二プローブの種類毎にガラスビーズ表面への固定化反応を行い、そこから固定化ビーズを一つずつ取り出し、意図した順序に並べてデバイスを作製するため、ビーズの順列によりプローブ種の識別を行うことができる。蛍光標識されたターゲット核酸１１−５を含むサンプル溶液をデバイス中でシリンジ１１−６により往復送液することで、ターゲット核酸１１−５がビーズ１１−１上のプローブ１１−２に捕捉される。通常の平板状のＤＮＡチップを用いた場合には、ターゲットＤＮＡが拡散によりプローブＤＮＡまで到達する時間が必要で、そのため反応に長い時間を必要とするが、このビーズチップの場合には、サンプル溶液の流れが乱流になり、実効的な拡散が非常に早くなっているため、早い反応及び検出が可能になっている（小原賢信，『ＤＮＡチップ実験まるわかり』羊土社，１２４−１２７（２００４））。

実際にはＡＰＳ（aminopropyltrimethoxysilane）コート１２−１のガラスビーズ１１−１に対して、チオール末端修飾オリゴＤＮＡ１２−３をＮＨＳエステルとマレイミドを両端に持つクロスリンカーであるＫＭＵＳ（N-(11-maleimidoundecanoyloxy)succinimide）１２−２を介して共有結合で固定し、プローブ固定化ビーズ１１−７を作製した。ここではＴＰ５３遺伝子上の塩基に対応する第二プローブ２４種を用意して、これらのプローブを固定したビーズを順に一つずつキャピラリー１１−３の内部に配列した。次いで、１０μＬのサンプル溶液（１×１０^-１０Ｍ、４５℃、４×ＳＳＣ-０．１％ＳＤＳ溶液ＦＩＴＣ標識）に対して１０分間送液しながら反応（ハイブリダイゼーション）させ、０．２×ＳＳＣ-０．０３％ＳＤＳ→０．０５×ＳＳＣ→水の順で洗浄した後、蛍光計測を行った。

試料として前記７−５・９−１を用い、エキソン５に対応するビーズへのハイブリダイゼーション実験を試みた場合には〔実施例２〕と同様の結果が得られた。即ち、一本鎖核酸７−５と二本鎖核酸９−１を試料とした場合のハイブリ効率（ここでは蛍光強度により検出）を比較した場合には７−５が勝っていた。さらに二本鎖核酸９−１に第一プローブ１０−１を事前にハイブリダイズさせたものを鋳型とした場合の蛍光強度は７−５を試料とした場合と同程度であった。

〔実施例４〕 第一プローブへのミスマッチの導入
上記効果はＰＣＲ反応のような特定の遺伝子領域の増幅を目的とする場合にも適用される。本実施例では、図１３に示す遺伝子配列（ＴＰ５３遺伝子エキソン５：配列番号１）を使用した場合について説明する。１−１及び１−２から成る鋳型二本鎖ＤＮＡに対して、１−３及び１−４のデザインのプライマー（第二プローブ）を作用させることにより１−５で表される領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応は〔実施例１〕と同様の条件で行った。このとき鋳型ＤＮＡ量が１×１０^-２２ ｍｏｌでプライマー量が３．４ ｐｍｏｌ/反応の時、同時に第１配列１３−１・第２配列１３−２・第３配列１３−３（ＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号２））から成る第一プローブを６．８ｐｍｏｌ添加した場合としなかった場合の結果を比較した。

第一プローブはそれ自身が第二プローブ（フォワードプライマー１−３及びリバースプライマー１−４）の一方と反応してプライマーとして作用しないよう、第１配列１３−１の５’末端１３−５を、本来配列５’-ＧＣＡ-３’に対してミスマッチとなるように５’-ＴＣＴ-３’に変更した。さらに第２配列１３−２の３’末端１３−４を、本来配列３’-ＣＡＧ-５’に対してミスマッチとなるように３’-ＧＡＣ-５’に変更した。同様の効果は、第一プローブの３’末端に鋳型核酸の結合領域とは非相補な配列を結合したり、３’末端の水酸基を修飾又は別の官能基で置換することによっても得られる。

このとき１４−１に示すように、ＰＣＲ反応において第一プローブを添加した場合に、コントロール１４−２（第一プローブを添加していない）よりも多くのＰＣＲ産物が得られていた。第一プローブは第二プローブの外側下流域に位置するために、ＰＣＲサイクル反応の２回目以降にはその効果はほとんど期待できない。よって１回目のサイクル反応の前に第二プローブがハイブリダイズする時に、その作用を促進するように働いたものと考えられた。鋳型ＤＮＡ量が１×１０^-２２ ｍｏｌの時、第一プローブ量を１．７ ｐｍｏｌ・３．４ ｐｍｏｌ・６．８ ｐｍｏｌ・１０．５ ｐｍｏｌに変化させてＰＣＲを行った際のＰＣＲ効率の変化を図１５に示す。ＰＣＲサイクル数(ｎ)・鋳型量（Ｎ_０）・ＰＣＲ産物量（Ｎ_ｆ）・ＰＣＲ効率（１+Ｙ）の関係は指数増幅領域において『Ｎ_ｆ=Ｎ_０×（１+Ｙ）^ｎ』で表されるが、第一プローブ濃度が３．４・６．８・１０．２ ｐｍｏｌの時（それぞれ１５−１・１５−２・１５−３）に、ＰＣＲ効率はコントロール（第一プローブ添加なし）１５−４に比べて有意に変化していた。

リアルタイムＰＣＲ法はサーマルサイクラーと分光光度計を一体にし、電気泳動の手間を省き、ＰＣＲ生産物を定量的に評価するための方法である。ＰＣＲ生産物を定量する方法としては、二本鎖ＤＮＡの螺旋の隙間に特異的にインターカレートするＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使う方法が簡便で汎用されている。ＰＣＲ反応はその性質から、サイクルが一回増えると最大で２倍のＰＣＲ産物量が得られる。即ちリアルタイムでＰＣＲの様子を観察した場合に、初期鋳型量やプライマー濃度などの諸条件が同じであれば、最終的なＰＣＲ産物量が多くなるほど立ち上がりのサイクル数は早くなるはずである。そこで本発明の効果によるＰＣＲ産物量の増加（即ちＰＣＲ効率の増加）をリアルタイムＰＣＲでも同様に観察できるはずであると考えた。

鋳型ＤＮＡ量が１×１０^-２２ ｍｏｌに第一プローブ量が６．８ ｐｍｏｌ/反応となるように添加した場合のリアルタイムＰＣＲでの結果を図１６に示す。コントロール（第一プローブ添加なし）１６−１の場合には平均４７.４５回目のサイクル数で立ち上がり始めるのに対して、第一プローブを添加した場合（１６−２）には平均４５.７４回目のサイクル数で立ち上がり始めていた。標準サンプルの初期鋳型量と立ち上がりサイクル数の関係から、１６−２の場合の鋳型濃度を逆算して求めると約２×１０^-２２ ｍｏｌに相当しており、これは真の鋳型量である１×１０^-２２ ｍｏｌの２倍に相当していた。このことから第一プローブは上記の場合と同様にＰＣＲの１回目のプライマーのハイブリダイゼーション効率に影響を与えているものと考えられた。具体的にはプライマー（第二プローブ）の２〜５倍濃度の第一プローブが、熱変性後の鋳型二本鎖ＤＮＡにプライマーよりも先にハイブリダイズしてその高次構造を破壊し、結果としてプライマーがハイブリダイズしやすくなったものと考えられた。

第一プローブをＰＣＲ反応に添加する際には、図１７に示すような効果も得られた。即ち第一プローブを添加しない通常のＰＣＲ反応を行った場合（１７−１）に比べて、第一プローブを添加した場合では１７−２のように、より少ないプライマー濃度でより多くのＰＣＲ産物が得られた。上記実験に使用した第一プローブはＰＣＲプライマー組（第二プローブ）の外側に設計されており、１回目のプライマーのハイブリダイゼーション反応にしか促進効果を発揮しないが、プライマー組の内側に設計すれば後続のサイクル反応全てにおいてプライマー組のハイブリ反応を促進するように作用することが期待される。また、第一プローブは鋳型核酸に対して二箇所以上にハイブリダイズするように作用させてもよい。第一プローブを鋳型核酸に対して二箇所以上作用させる場合にも前記３−２や５−９・５−１１・６−１に示すような構造の第一プローブを使用できる。

本実施例では、サーマルサイクラーを用いたＰＣＲを説明したが、プライマーが片方だけで、鋳型二本鎖核酸に対して片方の鎖のみに対する相補鎖合成でも同様な操作で相補鎖合成反応が可能で、伸長産物を増幅できる。ＮＡＳＢＡ法やローリングサイクル法など、プライミングサイトに対してプライマーをハイブリダイズさせる反応を含み、ポリメラーゼ等の酵素反応を利用して相補鎖合成反応を行わせる増幅法に汎用的に使える利点がある。あるいは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩないしその部分酵素であるクレノーフラグメント等の酵素を用いて等温（たとえば３７℃一定）で伸長反応を行う場合や、ＩＣＡＮ法（ＴａＫａＲａ社）やＬＡＭＰ法（栄研化学）などの等温増幅法においても、鋳型と第一プローブを事前にハイブリダイズさせておくことにより対応できる。

〔実施例５〕 変異解析（ＢＡＭＰＥＲ法）への本発明の適用
個々の検体で見られる塩基変異を解析するのに適した手法として、ＢＡＭＰＥＲ（Bioluminometric Assay coupled with Modified Probe Extension Reactions）法（Guo-hua Zhou, et al., Nucleic Acid Research, 29, e93 (2001)）があり、実用化に向けた研究が行われている（Y Nakashima, et al., Clinical Chemistry, 50, 8, 1417-1420 (2004)）。これは生物発光を利用した塩基変異解析技術であり、変異型に対応した２〜４種類のプローブ（３’末端がそれぞれＡ・Ｇ・Ｃ・Ｔ）を用いて伸長反応を行うと、検出部位の塩基型に一致するプローブを用いた場合にのみ伸長反応が進行する。その際に生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用して発光させる。この発光を測定すると数分間で塩基型を判定することができる。この簡便な方法は一般に癌組織細胞中で観察される点変異や、一から数塩基の挿入あるいは欠失、あるいは一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効である。以下に手順を示す。

まず解析対象とする遺伝子配列をＰＣＲ法等により増幅させておく。次にＰＣＲ反応時のプライマーやｄＮＴＰｓを除去するため酵素的なクリーンアップで目的ＰＣＲ産物を精製する。即ちＰＣＲ反応後の溶液１５μＬに１ｕｎｉｔ/μＬの濃度のｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを０.７μＬ、 １０ｕｎｉｔ/μＬのｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩを０.０６μＬ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品）を０.３μＬ、滅菌水３.９４μＬを混合する。３７℃で４０分間インキュベートによる酵素反応を行った後、８０℃で１５分間加熱により酵素を失活させる。この反応液を９６ウェルＰＣＲプレート（白色）に３μＬ分注する。変異特異的なプローブ（５ｐｍｏｌ/μＬ）を１μＬ添加する。あらかじめ５ ｕｎｉｔ/μＬ のＴａｑ．ＤＮＡポリメラーゼ０.０２７５μＬと、５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ピロリン酸はあらかじめ除去しておく）０.０４μＬを混合し、１.０μＬとなるように滅菌水で調製した溶液を１.０μＬ加える。ミネラルオイルを４μＬ重層する。９４℃１０秒間と６０℃１０秒間のサイクルを５回行った後、２５℃まで冷却する。あらかじめ室温にしておいた発光試薬（ピロリン酸をＡＴＰに変換し、ＡＴＰをホタル由来ルシフェラーゼを使用して検出する生物発光キット：T Sakakibara, et al., Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999) 参照）を１０μＬずつ加え、ピペッティングにより混合し、ルミノメーターで測定する。これにより伸長反応が起きたかどうかをピロリン酸の量に依存する発光強度として容易に検出できる。

上記ＢＡＭＰＥＲ法に本発明を適用した場合について説明する。図１８に示す１−１及び１−２を含む範囲の二本鎖鋳型ＤＮＡ（ＴＰ５３遺伝子エキソン５）をＰＣＲにより増幅した。核酸鎖１−１においてこの遺伝子のコドン１７５番を成す３塩基の中央の塩基１８−１は、多くの癌で標準型Ｃから変異型Ｔに変化していることが知られている。この変異を検出するための第二プローブ配列が１８−２であり、その３’末端１８−３は前記ＣあるいはＴに対応するようにＧあるいはＡとなっている。第二プローブが分子内ハイブリダイゼーションを起こしてホールディングする構造をとることがないように１８−４にミスマッチを挿入しており、本来塩基ＣからＧに変更した。この第二プローブ１８−２を用いて変異１８−１を検出する際に、同時に第１配列１３−１・第２配列１３−２・第３配列１３−３から成る第一プローブを添加した場合としなかった場合の第二プローブ伸長度（シグナル強度で表される）と濃度依存性を表したのが図１９である。このとき第一プローブはそれ自身が第二プローブ１８−２と反応してプライマーとして作用しないように、第１配列１３−１の５’末端１３−５を、本来配列５’-ＧＣＡ-３’に対してミスマッチとなるように５’-ＴＣＴ-３’に変更した。さらに第２配列１３−２の３’末端１３−４は、本来配列３’-ＣＡＧ-５’に対してミスマッチとなるように３’-ＧＡＣ-５’に変更した。

１９−１で示したように第二プローブのみを６０℃で反応させた時、１〜６ｐｍｏｌの範囲で濃度依存的に検出シグナルも上昇した。それに対し第一プローブ共存させた場合（１９−２）にはより低い濃度域で、第二プローブのみによる最高のシグナル（６ｐｍｏｌのときコントロールの１５倍のシグナル）よりも大きなシグナル強度（〜１７倍）を示し、２〜８ｐｍｏｌの間それを維持することができた。すなわち第二プローブは第一プローブと共存させたことにより、熱変性後の鋳型二本鎖の再会合を妨げた結果として第二プローブのハイブリ効率が高められ、それのみによる測定時よりも少ない濃度で変異１８−１の測定が可能になったものと考えられた。第一プローブには前記３−２や５−９・５−１１・６−１に示すような構造が適用される。

ピロリン酸の検出法としては上記のように一旦ＡＴＰに変換し、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応のエネルギー源としその発光を検出する方法以外にも、一般的な種々の化学反応を経てホルマザンや過酸化水素・スーパーオキシド・二酸化炭素・Ｌ-フェニルアラニン・硫酸イオンなどに変換し、検出機を用いて、あるいは目視により判断する方法（特開２００３−１７４９００号参照）などにも適用が可能である。あるいは変異特異的なプライマーによる伸長反応に伴って発生したピロリン酸が有する金属イオンとの結合作用により、消光材として作用していた金属イオンが奪われることにより蛍光を発する物質の量を、検出機を用いて、あるいは目視により判断する方法にも適用が可能である。

そのほか一般的な塩基変異解析方法としては１塩基伸長法や、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法（Ｔｈｅｒｄ Ｗａｖｅ ＴｅｃｈｎｏＬｏｇｉｅｓ社）・ＭａｓｓＡｒｒａｙ^ＴＭ法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）・ＡＳＰ-ＰＣＲ法（ＴＯＹＯＢＯ社）・ＵＣＡＮ法（ＴａＫａＲａ社）・ＳＴＡ法（ＴＲＩＭＧＥＮ社のＭｕｔｅｃｔｏｒ（登録商標）キット）・ＰＣＲ-ＰＨＦＡ法（ロッシュ・ダイアグノスティック社；Ｋ-ｒａｓコドン１２変異検出キット）などがあるが、何れも３’末端が変異塩基に相補となるようにデザインされたプローブを試料ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程を含んでいる。一般にプローブと試料を特異的にハイブリダイズさせる工程を含む遺伝子解析を行う場合には、プローブの量を試料量に対して大過剰に用意する必要がある。固相上でハイブリダイゼーション反応を行おうとする場合には、液相での反応と比べて著しく反応効率が劣るために、シグナルの検出が困難になる場合があるが、これらについても本発明が適用される。ＵＣＡＮ法やＳＴＡ法のような等温反応においても、上記ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法と同様に、事前に鋳型試料に対して干渉オリゴをハイブリダイズさせておけばよい。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

医療分野では罹患とその進行により患部に発生する点突然変異などを代表とする遺伝子変異の解析がさかんに行われるようになっている。情報の蓄積に伴い、特定の遺伝子の特定の箇所に発生する特定の塩基の変化と病状進行度合の関係なども明らかにされつつある。これら変異の解析あるいは特定の疾患に関連する遺伝子の発現解析を行う際に汎用されるＤＮＡチップ技術において、少ない試料核酸を検出用プローブと効率よく反応させようとする際に本発明は適用される。あるいは前記検査を感度よく効率よく行うためにはＰＣＲ法などによる特定遺伝子断片の増幅が必須であり、本発明のような微量のＤＮＡから検査用の遺伝子断片を安定して増幅することができる意義は大きく、医療産業上きわめて有用と考えられる。

配列番号１−図１、１３、１８に示すＴＰ５３遺伝子のエキソン５の一部
配列番号２−第３配列（１−１２）および（１３−３）

Claims (20)

1. 二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第１配列と、他方の鎖に相補的な第２配列と、前記第１配列及び第２配列とを連結する第３配列とを有する第一プローブを、前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程と、少なくとも１種類の第二プローブを前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程とを有することを特徴とする核酸分析方法。
2. 前記第一プローブを構成する第３配列が１０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下であり、前記二本鎖核酸のいずれの配列とも非相補であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
3. 前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域が、前記二本鎖核酸上の前記第１配列及び前記第２配列の結合領域の間に位置することを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸分析方法。
4. 前記第１配列及び第２配列が、それぞれ前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域の末端から少なくとも１０塩基以上離れた位置にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分析方法。
5. 前記第一プローブを構成する第３配列が鎖内結合によりループ状の立体構造を形成することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
6. 前記第一プローブを２種以上用いた核酸分析方法であって、前記二本鎖核酸の近傍にハイブリダイズした２種類の第一プローブが、その第３配列間で相補鎖結合を形成することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
7. 前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション量を計測することにより、前記二本鎖核酸の定量を行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
8. 前記第二プローブが蛍光体又は放射性同位体で標識されており、その蛍光量又は放射線量で前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション量を測定するか、あるいは、
   前記第二プローブがアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βカラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼから選択されるいずれかの酵素で標識されており、前記酵素とその基質との反応で生じる発光あるいは発色によって前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション量を測定することを特徴とする、請求項７に記載の核酸分析方法。
9. 前記二本鎖核酸にハイブリダイズした前記第二プローブからの相補鎖伸長反応を行う工程をさらに有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
10. 前記第一プローブがその３’末端からの相補鎖伸長をしない構造であることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分析方法。
11. 前記第一プローブの３’末端に存在する３塩基の少なくとも１塩基が、前記第一プローブの二本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造であることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分析方法。
12. 前記第一プローブの３’末端に、前記第一プローブの二本鎖核酸上の結合領域とは相補でない配列が付加されていることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分析方法。
13. 前記第一プローブの３’末端に存在する３塩基の少なくとも１塩基の水酸基が、修飾又は別の官能基で置換されていることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分析方法。
14. 前記第二プローブが固相に固定化されていることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分析方法。
15. 変異を有することが予測される二本鎖核酸を含む核酸試料に、前記変異の候補部位とその３’末端でハイブリダイズする第二プローブと前記第一プローブとを同時に添加する工程と、ハイブリダイズした前記第一及び第二プローブからの伸長反応を行う工程と、前記伸長反応の結果から前記二本鎖核酸が変異部位を有するか否かを判定する工程を有する、請求項９に記載の核酸分析方法。
16. 前記第二プローブからの伸長反応が一塩基伸長反応であり、その際導入される塩基種を識別することにより、前記第二プローブの３’末端側隣接塩基が変異を有するか否かを判定することを特徴とする、請求項１５に記載の核酸分析方法。
17. 前記伸長反応が、前記二本鎖核酸と前記第一プローブの３’末端に存在する少なくとも２塩基が相補的な場合に起こることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の核酸分析方法。
18. 前記第二プローブが、前記二本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造を有することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
19. 前記第二プローブが増幅用上流プライマー及び下流プライマーであって、これにより前記二本鎖核酸の少なくとも一部の領域を増幅する工程を含み、且つ、前記第１配列及び前記第２配列が前記二本鎖核酸上の前記プライマーによる増幅領域を含む周辺配列に対してハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分析方法。
20. 前記第１配列及び前記第２配列は、前記二本鎖核酸上の前記領域の末端からそれぞれ５００塩基以内の領域にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１９に記載の核酸分析方法。

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