WO2007046158A1 - 核酸分析方法 - Google Patents

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WO2007046158A1
WO2007046158A1 PCT/JP2006/304357 JP2006304357W WO2007046158A1 WO 2007046158 A1 WO2007046158 A1 WO 2007046158A1 JP 2006304357 W JP2006304357 W JP 2006304357W WO 2007046158 A1 WO2007046158 A1 WO 2007046158A1
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WO
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nucleic acid
probe
double
sequence
stranded nucleic
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Application number
PCT/JP2006/304357
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yukie Nakashima
Keiichi Nagai
Original Assignee
Hitachi, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method for analyzing a small amount of nucleic acid with high sensitivity. More specifically, it is possible to improve the hybridization efficiency of primers and probes by partially breaking the higher-order structure of the double-stranded nucleic acid that becomes a cage, and to analyze trace nucleic acids with high sensitivity.
  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method.
  • DNA chips currently “DNA arrays” in which DNA is aligned (arrayed) on a substrate and fixed
  • fiber-focusing type pincushion type”.
  • DNA chip SNP analysis
  • technology for analyzing protein interactions at high speed SNP analysis
  • genome drug discovery based on information obtained from these is also progressing.
  • gene expression analysis and mutation analysis constitute a major part of genome research.
  • a "DNA chip” is a microarray developed about 10 years ago, in which 20 to 100-mer nucleotide 'cDNA or BAC clone DNA and the like are arranged at high density on a substrate.
  • the DNA chip is based on hybridization of sample DNA and RNA, determination of the base sequence, gene mutation, SNP analysis, gene expression level, copy number measurement, and DNA methylation analysis.
  • Various qualitative and quantitative changes can be examined (see Non-Patent Document 1). It is a revolutionary technology that enables the observation of the expression of an extremely large number of genes at many points in time, so that the presence or state of the gene to be examined and how it works can be easily confirmed.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • PCR is widely used in biotechnology 'agriculture and medicine. For those who are involved in the basics and applications of life sciences, PCR is one of the leading experimental techniques that can provide protein and gene information quickly and accurately. One. If the research objectives are the same even if the experimental materials are different from those of microorganisms or animals' plants, it is possible to proceed with the research using the same PCR experiment method. The biggest feature of PCR is that it only amplifies specific regions with complex DNA strength such as genomic DNA. Since PCR is a reaction in which DNA is synthesized by DNA polymerase using two types of primers, the region of the synthesized DNA is a region specified by the primer, and only this region is amplified.
  • the primer has the base sequence of the specific region of each strand of the saddle-type double-stranded DNA, and the 3 ′ end of one primer faces the other primer.
  • DNA polymerase requires a primer at the start of the synthesis reaction. Under the constant pH conditions in the presence of dNTPs, DNA polymerase advances the extension reaction while adding dNMP to the 3 and ends of each primer. Increases logarithmically.
  • Many gene analysis technologies (sequencing methods, SNP analysis, 'mutation analysis', expression analysis, etc.) that have evolved with the progress of the genome project require prior gene amplification to ensure detection sensitivity. And often. By using the PCR method, the problems that have been said to be difficult can be easily solved, and the PCR method plays a major role in the basics and applications of life science.
  • Non-patent document 1 Sakai Technology Journal, vol.5, No.4, 394-396 (2005)
  • Non-patent document 2 Wang DG, et al., Science, 280, 1077-82 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Winzeler EA, et al., Science, 281, 1194-97 (1998)
  • An object of the present invention is to enable stable amplification of a small amount of nucleic acid and highly sensitive analysis by improving the hybridization efficiency between a primer or a probe and a sample.
  • a single-stranded oligo (DNA or RNA, PNA, chimeric oligo) complementary to a sequence other than the probe sequence that recognizes the detection target site of the sample nucleic acid is synthesized and added in excess to the sample nucleic acid. Heat to 94 ° C and cool to room temperature. The sample nucleic acid that has become single-stranded by heat denaturation tries to rewind back to the original double-stranded process in the course of reaching room temperature, but at this time, the complementary nucleic acid that had been excessively added has been added. Because single-stranded oligos hybridize first, they cannot return to full duplex.
  • the sample nucleic acid treated in this way becomes more unstable than a fully double-stranded nucleic acid.
  • This unstable sample nucleic acid is recognized on a substrate on which a probe sequence for recognizing the detection target site is fixed or the detection target site is recognized.
  • the present invention has been made on the basis of the above findings, and by combining an oligo sequence that binds to a site different from the probe and hybridizing it to the sample, the double-stranded structure or molecule of the sample nucleic acid is obtained. It destroys the inner structure and brings about the effect that the probe becomes hybridized with the sample nucleic acid.
  • the high pre-efficiency of the sample double-stranded nucleic acid and the detection probe can be improved, and more sensitive analysis can be performed.
  • the hybridization efficiency of a small amount of a cage sample and a primer is promoted, and gene amplification can be performed stably.
  • FIG. 1 is a positional relationship diagram of a saddle DNA sequence, a first probe, and a second probe for explaining the present invention.
  • FIG. 2 shows the hybridization acceleration effect (fluorescence detection result) according to the present invention.
  • FIG. 3 shows the structure of the first probe used in the present invention.
  • FIG. 4 shows the destabilizing effect of the vertical nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 5 shows the structure of the first probe used in the present invention.
  • FIG. 6 shows the structure of the first probe used in the present invention.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram showing a general DNA chip using a single-stranded sample nucleic acid.
  • FIG. 8 shows an example of the effect of the present invention in DNA chip analysis.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram showing a general DNA chip using a double-stranded sample nucleic acid.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram showing a DNA chip when the present invention is applied to a double-stranded sample nucleic acid.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of a bead chip.
  • FIG. 12 is a conceptual diagram showing how the first probe is fixed to glass beads.
  • FIG. 13 is a diagram showing the positional relationship between a cage DNA sequence, a first probe, and a second probe for explaining the present invention.
  • FIG. 14 shows the hybridization promotion effect (comparison of PCR product amount) according to the present invention.
  • FIG. 15 shows the effect of promoting PCR efficiency according to the present invention (calculated from the amount of PCR product).
  • FIG. 16 shows the PCR efficiency promoting effect (real-time PCR) according to the present invention.
  • FIG. 17 shows the PCR efficiency promoting effect (comparison of PCR product amount) according to the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing the positional relationship between a saddle-shaped DNA sequence, a first probe and a second probe for explaining the present invention.
  • FIG. 19 shows the hybridization promotion effect (luminescence detection result) according to the present invention.
  • the first probe designed to have a structure where the third sequence and the 3 'sequence are hybridized to each other near the center.
  • the present invention improves the hybridization efficiency of primers and probes by partially breaking the higher-order structure of a double-stranded nucleic acid that becomes a cage shape, and enables highly sensitive analysis of a small amount of nucleic acid. Nucleic acid analysis methods that make possible are provided.
  • the present invention provides a first sequence complementary to one strand of a double-stranded nucleic acid, a second sequence complementary to the other strand, the first sequence and the second sequence, A step of allowing the double-stranded nucleic acid to hybridize with a first probe having a third sequence linking the two, and a step of hybridizing at least one second probe to the double-stranded nucleic acid.
  • the third sequence constituting the first probe is preferably not less than lOmer and not more than lOOmer, and the double-stranded nucleic acid is preferably non-complementary to the misaligned sequence.
  • the binding region of the second probe on the double-stranded nucleic acid is Between the binding region of the first sequence and the second sequence or each terminal force within a region of 500 bases, in particular, the first sequence and the second sequence are each the second sequence on the double-stranded nucleic acid. It is preferable to hybridize the terminal force of the binding region of the probe at least 10 bases away! /.
  • the third sequence constituting the first probe may form a loop-shaped three-dimensional structure by intrachain bonding.
  • two or more types of the first probes are used, and two types of the first probes hybridized in the vicinity of the double-stranded nucleic acid form a complementary chain bond between the third sequences to form a ladder. It may form a three-dimensional structure.
  • the amount of the double-stranded nucleic acid can be determined by measuring the amount of hybridization of the second probe to the double-stranded nucleic acid.
  • the second probe can be labeled with a fluorescent substance, and the double-stranded nucleic acid can be quantified from the amount of fluorescence.
  • the second probe is labeled with any enzyme selected from alkaline phosphatase, peroxidase, j8 calactosidase, and luciferase, and from the amount of luminescence or color produced by the reaction of the enzyme with its substrate, The double-stranded nucleic acid can be quantified.
  • the second probe can be labeled with a radioisotope, and the double-stranded nucleic acid can be quantified from the radiation dose.
  • the method may further include a step of performing a complementary strand extension reaction from the second probe hybridized to the double-stranded nucleic acid.
  • At least one of the three bases present at the 3 'end of the first probe is such that the first probe does not function as a primer pair for the second probe. It is desirable to make the structure mismatched with the binding region on the double-stranded nucleic acid. It is desirable that the 3 ′ end force be designed to have a structure that does not allow complementary strand extension, or a sequence that is not complementary to the binding region on the double-stranded nucleic acid of the first probe should be added to the 3 ′ end.
  • the second probe is a solid phase (for example, a substrate of a DNA chip or a bead). Etc.) may be solid-phased.
  • the method of the present invention can be used to detect mutations and polymorphisms. That is, a step of simultaneously adding, to a sample nucleic acid predicted to have a mutation, a candidate site for the mutation, a second probe that hybridizes at its 3 ′ end, and the first probe to the nucleic acid sample; The step of performing the extension reaction of the second probe force that has been hybridized, and the resultant force of the extension reaction, can determine whether the sample nucleic acid has a mutation site.
  • the 3 'terminal side adjacent salt of the second probe It can be determined whether the group has a mutation.
  • the extension reaction may occur when at least two bases present at the 3 ′ end of the sample nucleic acid and the second probe are complementary. Also, prevent mismatches in the molecule of the second probe by introducing a mismatch into the second probe.
  • the second probe is a pair of an upstream primer for amplification and a downstream primer
  • the present invention includes a step of amplifying at least a partial region of the double-stranded nucleic acid with these primers. It may be a thing.
  • the first sequence and the second sequence must hybridize around the primer on the double-stranded nucleic acid, and the terminal force of the region on the double-stranded nucleic acid is within 500 bases each. I prefer to hybridize to the area.
  • a hybridization experiment between a single-stranded oligo serving as a probe and a vertical sample DNA will be described. It is necessary to amplify the target region of the vertical sample nucleic acid by PCR reaction before analysis.
  • one of the amplification primers is a phosphor (here FITC).
  • the reaction vessel used was a PIERCE Reacti-Bind streptavidin-coated polystyrene 96-well plate. The bottom and side surfaces of the well are coated with streptavidin, and a detection probe modified on one side with piotin can be bound and fixed.
  • detection probe dissolved in 100 L PBS (modified with 5'-Piotin / 3, -TEXAS RED) 20 pmol was added per well, incubated at room temperature for 1 hour, and then washed with PBS .
  • FITC-modified sample DNA (PCR product) was heat-denatured at 95 ° C for 5 minutes, ice-cooled, and appropriately diluted with N2S hybridization buffer (PIERCE). was placed in a fixed well and incubated at 60 ° C for 1 hour. After that, washing with N2S hybridization buffer and PBS was performed, and the hybridization between the probe and the sample DNA was examined by detecting the fluorescence intensity.
  • An ARVO SX microplate reader from PerkinElmer was used for fluorescence detection.
  • the gene amplification primer and the detection probe may be selected from any fluorescent material depending on the plate reader and fluorescent filter used with the force modified with the fluorescent materials FITC and TEXAS RED. It can also be detected by counting with radioisotope labels or by measuring light with HRP or AP labels. Use them according to the situation.
  • exon 5 of TP53 gene is taken as an example.
  • This sequence information can be obtained from the NCBI database accession number NT_010718 (part of the sequence (SEQ ID NO: 1) is shown in Fig. 1).
  • the amplification region after the PCR amplification reaction is performed by applying primers of the design of 1 and 3 to the vertical double-stranded DNA consisting of 1-1 and 1-2, and is represented by 15.
  • a BI9700 Applied Biosystems
  • a thermal cycler was used as the temperature controller for the extension reaction.
  • a microchip electrophoresis analysis system SV1210 (Hitachi Electronics Engineering) was used for confirmation of PCR products. Oligo synthesis was outsourced to Sigma Dienosis.
  • the DNA polymerase used was a QIAGEN product, and the other reagents used were extremely common commercial products.
  • a vertical nucleic acid (human genome) was purchased from BIOCHAIN and used.
  • PCR reaction solution was analyzed using a microchip electrophoresis analysis system, and the target PCR product was confirmed.
  • the reverse primer 1-4 used here is fluorescently labeled at the 5 'end with FITC of 1-6, and thus PCR product 1-5 is also labeled.
  • Second probe 1-7 has its 3 'end fluorescently labeled with 1-8 TEXAS RED and the 5' end labeled with 1-9 Piotin, immobilized on an avidin-coated plate. Yes.
  • the PCR product 1-5 is trapped by the second probe 1-7, 1-5 is heat-denatured in advance. 1S
  • the first probe of the present invention is added simultaneously.
  • the first probe has a site that hybridizes to nucleic acid strands 1-2 (first sequence 1-10), a site that hybridizes to nucleic acid strands 1-1 (second sequence 1-11), and the 3 'end of 110. It consists of a third array 1-12 force designed to connect the 5 'ends of 1-11.
  • the sequence of 1-12 was GATCTGCGATCTAAGTAAG CTTGGC (SEQ ID NO: 2).
  • Figure 2 shows the force detected by the actual FITC fluorescence intensity. In addition to the first probe above, it is V ⁇ , in some cases a slight count such as 2-2 against the background 2-1 I was able to see the force of rising. In other words, PCR product 1-5 was highly efficient and powerful against the second probe 1-7. On the other hand, when an oligo having only the first sequence of the first probe was added, a count higher than 2-2 was obtained as in 2-3.
  • FIG. 4 is a general schematic diagram.
  • Pre-heat-denatured double-stranded PCR product consisting of strands 4-3 and strands 4-4 returns to a stable double-stranded (4-1) state that is usually difficult to keep denatured.
  • the above results show that the first probe 45 is partially hybridized to one strand of the double-stranded PCR product (strand 44 in the figure), so that strand 4 as shown in 42 Reassociation of 3 and chain 4 4 is partially hindered It was thought that this occurred because the second probe was hybridized with the PCR product.
  • first probe 3-2 consisting of 1st sequence 1-10, 2nd sequence 1-11, 3rd sequence 1-12 is applied to PCR product 15 as above, 2-4 In addition, even higher counts were obtained than 2-3, which was the result of applying only the first sequence. That is, both ends (1-10 and 1-11) of the first probe act on strands 1-1 and 1-2, respectively, and are more stable than when first probe 3-1 is acted on. It was thought that it was difficult to take a double-stranded structure.
  • the structure shown in Fig. 5 is conceivable. That is, the first probe consisting of the first sequence 5-3, the second sequence 5-4, the third sequence 5-5, as described above, for the vertical double-stranded nucleic acid consisting of 5-1 and 5-2, 1 'sequence 5-6 ⁇ 2' sequence 5-7 ⁇ 3 'first probe consisting of sequence 5-8 is applied simultaneously, and the vicinity of the center of said 3rd sequence and 3' sequence is 5-9 designed to have a structure that hybridizes with each other, and the first array 5-3, the second array 5-4, the third array 5-10, and the third array 5 — 10 can be considered as the first probe 5-11 designed to have a loop structure with intra-chain bonds.
  • first probes (3-2, 5-9, 511) may act simultaneously on two or more sites on the sample nucleic acid.
  • the first array 6-2 and the second array 6-3 of the first probe 6-1 are arranged so that the second probe 6-5 is sandwiched from the left and right, and the third array 6- It is also possible to take a structure that connects with 4.
  • the first and second sequences constituting the first probe are at least 10 bases, preferably 50 bases or more, so as not to interfere with the hybridization reaction of the second probe to the cage. Try to hybridize to a distant location.
  • the third sequence 1-12 ⁇ 5–5 ⁇ 6 4 and the third 'sequence 5-8 should be completely non-complementary to the truncated nucleic acid to be amplified. This depends on the peripheral sequence, not just the sequence. Its length is 1 Omer or more and 1 OOmer or less, preferably 50 mer or less.
  • the DNA chips sold on the market have been released by Affymetrix! /, The so-called “Affymetritas type” and the “Stanford type” invented by Patrick 'Brown et al. It is roughly divided into two.
  • the “Stanford type” is a simple chip that is prepared by dripping a prepared cDNA or synthetic oligo DNA onto a slide glass with a pin or the like. A single spot contains a large amount of cDNA (two Double-stranded DNA) and single-stranded oligo DNA, which is used as a probe (reference) to detect genes.
  • Ace Gene (registered trademark)” of DNA Chip Laboratories, “CodeLink (registered trademark)” of GE Healthcare, “IntelliGene (registered trademark)” of Takara Bio, etc. are similar to this.
  • “Affymetritas type” is a method in which a probe (single-stranded oligo DNA) is synthesized vertically on a substrate by optical lithography used in semiconductor technology. Examples include Affymetrix's “GeneChip (registered trademark)” and Agilent Technologies' microarray. In addition to the technology for fixing the probe on the substrate, Mitsubishi Rayon's “Genopal (registered trademark)” and TUM Gene's ECA chip (Electrochemical Array) are also included. In either case, the analysis results are affected by the hybridization efficiency of the single-stranded or double-stranded DNA that serves as the probe and the sample DNA. The present invention can also be applied to these.
  • FIG. 7 shows the result of verifying the hybridization efficiency using a general Stanford chip. 7-8 There are a total of 64 spots on the chip shaped as shown in Fig. 8, and each gene has its own probe fixed. Specifically, the second probe (single strand) 7-2 is fixed to the substrate 7-1 through a linker 7-3. 7-2 may have a fluorescent or other label 7-4 at the end.
  • a single-stranded sample nucleic acid as shown in 7-5 (with one end having a fluorescent substance or other label 7-6) is allowed to act, and the second probe 7-2 is applied according to the above protocol.
  • the hybridization reaction was performed, the results shown in Figure 8-1 were obtained.
  • sample 7-5 and second probe 7-2 are hybridized with respect to knockout 8-2, a signal like 8-3 is obtained, and sample 7-5 and second probe 7-2 are When not hybridized, the signal was 8-4.
  • the state of the hybridization reaction of 7-5 and 7-2 was thought to be 7-7.
  • the first probe 10-1 is preliminarily preliminarily applied to the double-stranded sample nucleic acid 9-1.
  • 10-1 shall have the structure of 3-2, 5-9, 5-11, 6-1 as described above.
  • the results shown in 8-6 were obtained, which was as sensitive as 8-1. Hot.
  • the sample nucleic acid had the same double-stranded structure as 9-1, it was considered that the sample nucleic acid was efficiently hybridized as in 10-2. — It was shown to be inferior to 7).
  • the sample nucleic acid needs to be converted into a single strand by alkali denaturation in advance, or further column purified.
  • these methods are complicated.
  • the present invention was applied, it was shown that the same effects as those obtained when the sample nucleic acid was made into a single strand can be obtained with the same ease as heat denaturation of the double-stranded sample nucleic acid.
  • labeling with a force radiation isotope using the end of the second probe labeled with a phosphor may be used.
  • a label may be used with an enzyme that develops color by reacting with a specific substrate (alkaline phosphatase peroxidase, 13 galactosidase, etc.).
  • a specific substrate alkaline phosphatase peroxidase, 13 galactosidase, etc.
  • the reaction is caused by reacting for several hours with the substrate -troblue tetrazolium (NBT) in 5-bromo 4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) solution. Color development was observed, and the effect of the present invention could be confirmed by measuring and comparing the intensity.
  • chemiluminescent substrate For example, measurement using luminescence by enzyme reaction is also possible.
  • the reaction is carried out on the surface of the glass beads, and the fixed beads are taken out one by one and arranged in the intended order. It can be performed.
  • the sample solution containing the fluorescently labeled target nucleic acid 11-5 is reciprocated by the syringe 11-6 in the device, whereby the target nucleic acid 115 is captured by the probe 11 2 on the bead 11 1.
  • KMUS N- (ll-N) is a crosslinker that has NHS ester and maleimide at both ends of thiol-terminated oligo DNA12-3 against APS (aminopropyltrimethoxysilane) coated 12-1 glass beads 11 1 -maleimidoundecanoyloxy) succinimide) 12-2 was immobilized by covalent bond to prepare probe-immobilized beads 11-7.
  • 24 types of second probes corresponding to the bases on the TP53 gene were prepared, and the beads on which these probes were immobilized were arranged one by one inside the capillary 11-3.
  • 10 mu L of sample solution (1 X 10- 10 M, 45 ° C, 4 X SSC- 0.
  • the first probe itself reacts with one of the second probes (forward primer 13 and reverse primer 1-4) so that it does not act as a primer, so that the 5th end 13 of the first sequence 13-1 — Changed 5 to 5 '- ⁇ els' to be a mismatch to the sequence 5'- G_CA-3'. Further, the 3 ′ end 13-4 of the second sequence 13-2 was changed to 3′- £ ⁇ -5 ′ so as to be a mismatch with the sequence 3′- £ ⁇ £ -5 ′.
  • the same effect can be obtained by binding a non-complementary sequence to the binding region of the ⁇ -type nucleic acid at the 3 ′ end of the first probe, or by modifying or replacing the hydroxyl group at the 3 ′ end with another functional group. can get.
  • the real-time PCR method is a method for quantitatively evaluating a PCR product by integrating a thermal cycler and a spectrophotometer, eliminating the labor of electrophoresis.
  • a method for quantifying PCR products a method using SYB R Green that specifically interacts with the interstices of the double-stranded DNA helix is simple and widely used. Due to the nature of the PCR reaction, up to twice the amount of PCR product can be obtained with additional cycles. In other words, when the conditions of PCR, such as initial template amount and primer concentration, are the same when observing PCR in real time, the number of cycles to rise should be faster as the final PCR product amount increases. Therefore, it was considered that an increase in the amount of PCR product due to the effect of the present invention (that is, an increase in PCR efficiency! Should be observed in real time PCR as well.
  • the first probe had an effect on the hybridization efficiency of the first primer of PCR as in the case described above.
  • the first probe which is 2 to 5 times the concentration of the primer (second probe)
  • the first probe used in the above experiment is designed outside the PCR primer set (second probe) and does not exert a force-promoting effect on the first primer hybridization reaction. If designed in this way, it is expected that all subsequent citral reactions will act to promote the high pre-reaction of the primer set.
  • the first probe may act so as to hybridize to two or more sites with respect to the vertical nucleic acid.
  • the first probe having the structure shown in 3-2 or 5-9-5-5-11-6-1 can also be used when the first probe is allowed to act on the vertical nucleic acid at two or more sites.
  • PCR using a thermal cycler has been described. However, only one primer is used, and complementary complement synthesis of only one strand of a vertical double-stranded nucleic acid is performed by the same operation. A strand synthesis reaction is possible, and an extension product can be amplified.
  • NASBA method and rolling site method can be used universally in amplification methods that include the reaction of hybridizing primers to priminder sites and performing complementary strand synthesis reactions using enzymatic reactions such as polymerase. .
  • the pyrophosphate produced at that time is converted to ATP, and light is emitted using the luciferin-luciferase reaction.
  • the base type can be determined within a few minutes. This simple method is effective for detecting point mutations generally observed in cancer tissue cells, insertion or deletion of one to several bases, or single nucleotide polymorphism (SNP). The procedure is shown below.
  • a gene sequence to be analyzed is amplified by a PCR method or the like.
  • purify the target PCR product by enzymatic cleanup to remove primers and dNTPs during the PCR reaction. That is, 15 ⁇ L of the solution after PCR reaction is 0.7 ⁇ L of shrimp alkaline phosphatase at a concentration of lunit / ⁇ L, 0.06 L of lOunit / ⁇ L exonucleasel, and 0.3 ⁇ L of 10 X PCR buffer (Amersham Pharmacia) Mix 3.94 ⁇ L of sterile water. 3 Incubate the enzyme reaction at 7 ° C for 40 minutes, then inactivate the enzyme by heating at 80 ° C for 15 minutes.
  • a bioluminescent kit that converts the pyrophosphate to ATP and detects ATP using firefly luciferase: TS akakibara, et al, Analytical Biochemistry, 268, 94—101 ( 1999)), add lO ⁇ u L, mix by pipetting, and measure with a luminometer. This makes it possible to easily detect whether or not an extension reaction has occurred as the luminescence intensity depending on the amount of pyrophosphate.
  • Double-stranded saddle DNA (TP53 gene exon 5) in the range including 1-1 and 1-2 shown in FIG. 18 was amplified by PCR. It is known that the central base 18-1 of the 3 bases constituting the codon 175 of this gene in the nucleic acid chain 11 1 has also changed the standard C force to the mutant T in many cancers.
  • the second probe sequence for detecting this mutation is 18-2, and its 3 ′ end 18-3 becomes G or A corresponding to C or T! /. 18-4 so that the second probe does not have a structure that causes intramolecular hybridization to hold. A mismatch was inserted and the base was originally changed from C to G.
  • FIG. 19 shows the dependence of the second probe elongation (expressed in signal intensity) and concentration upon and without the case.
  • the first probe act such ⁇ so as primers themselves react with the second probe 18 2, 'the end 13 5 originally sequence 5' 5 of the first array 13- 1 - G_CA- 3 Changed to 5 '-; iC: r-3' so that it becomes a miss-match for '.
  • the 3 ′ end 13-4 of the second sequence 13-2 was changed to 3′-GAC-5 so as to be mismatched with the sequence 3′-CAG-5.
  • a method for detecting pyrophosphate it is converted into ATP as described above, and in addition to a method for detecting luminescence as an energy source of luciferin-luciferase reaction, formazan is subjected to various general chemical reactions. Ny, hydrogen peroxide, superoxide, carbon dioxide, L-phenylalanine, sulfate ion, etc., and using a detector or making a visual judgment (see JP 2003-174900) Applicable. Alternatively, the amount of the substance that fluoresces when the metal ion that has been acting as a quencher is deprived by the binding action with the metal ion of pyrophosphate generated by the extension reaction with the mutation-specific primer is detected. This method can also be applied to a method that uses a machine or makes visual judgments.
  • Other common base mutation analysis methods include the single base extension method, the Invader (registered trademark) method (Therd Wave TechnoLogies) 'MassArray TM method (Sequenom)' AS P-PCR method (TOYOBO) ⁇ UCAN method (TaKaRa) ⁇ STA method (TRIMGEN Mutector (registered trademark) kit) ⁇ PCR-PHFA method (Roche ⁇ Diagnostic; K-ras codon 12 mutation Detection kit), but all include the step of hybridizing the probe designed to be complementary to the mutated base to the sample DNA.
  • SEQ ID NO: 1 Part of exon 5 of TP53 gene shown in FIGS. 1, 13, and 18

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Abstract

　本発明は、プライマーあるいはプローブと試料とのハイブリダーゼーション効率を向上させることにより、微量核酸の安定的増幅と高感度な解析を可能にする。すなわち、本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第１配列と、他方の鎖に相補的な第２配列と、前記第１配列及び第２配列とを連結する第３配列とを有する第一プローブを少なくとも１種類以上、前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程と、少なくとも１種類の第二プローブを前記二本鎖核酸にハイブリダイズさせる工程とを有することを特徴とする核酸分析方法に関する。

Description

明 細 書
核酸分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、微量核酸を感度よく解析するための核酸分析方法に関する。より詳しく は、铸型となる二本鎖核酸の高次構造を部分的に壊すことにより、プライマーやプロ ーブのハイブリダィゼーシヨン効率を向上させ、微量核酸を感度よく解析することを特 徴とする核酸分析方法に関する。
背景技術
[0002] ポストシーケンス時代は、遺伝子の機能を追及する機能ゲノム研究が大きな柱とし て掲げられて 、る。これらには DNAチップ（現在では DNAを基板上に整列（アレイ） させて固定ィ匕した『DNAアレイ』や、繊維集束型 '糸巻き型など形態も様々に変化し ており、ここでは総称として『DNAチップ』に統一して説明する。）や SNP解析、蛋白 質相互作用を高速に解析する技術が利用される。また、これらから得られた情報を基 にしたゲノム創薬も進んで 、る。こう!/、つた状況の中で遺伝子の発現解析や変異解 析はゲノム研究の大きな一端を占める。
[0003] 『DNAチップ』は 10年ほど前に開発された、 20〜100merのヌクレオチド 'cDNA または BACクローン DNAなどが基板上に高密度に並べられたマイクロアレイである 。 DNAチップは、検体 DNAや RNAとのハイブリダィゼーシヨンによって塩基配列の 決定や遺伝子変異 · SNPの解析、遺伝子の発現量 ·コピー数の測定及び DNAのメ チル化解析と ヽつた試料核酸の多様な質的及び量的変化を調べることができる (非 特許文献 1参照)。また、極めて多数の遺伝子の発現を経時的に多くの時点で観察 することを可能にした革命的な技術であり、調べたい遺伝子の有無や働き具合を簡 単に確認することができるうえに、数千力も数万におよぶ遺伝子の測定を網羅的に 行うことができるため、研究を進めるうえでの重要な道具の一つとなっている。 DNA チップを使うことにより、ゲノム構造解析の後を受けたゲノム機能解析が大いに進み、 医療や創薬あるいは臓器再形成の研究などに変革が起こると考えられている。ヒトゲ ノムプロジェクトにより、塩基配列はわ力つているが機能が未知の新しい遺伝子が次 々と発見された。こうした新しい遺伝子の機能解析は、その塩基配列をリファレンスに 含めることによって進展することが期待される。疾病に関連する遺伝子の研究では、 従来は遺伝子を一つ一つ調べる方法しかなぐ単一遺伝子疾患よりも圧倒的に多い 多因子疾患関連遺伝子群の解析は非常に困難であった。し力 DNAチップを利用 して、今後は糖尿病やアルツハイマー病 '循環器系疾患'リューマチなど、これまで研 究の難し力つた病気の原因遺伝子を網羅的に解明し、その発症のしくみを理解する 研究が大きく進むものと考えられる。そして、これらの知見に基づいて従来に比べて 飛躍的に効率の良い創薬が可能になり、短期間に優れた薬剤開発が可能となること が期待されている。
[0004] 一塩基多型（SNP)を解析することは、さまざまな疾患のリスクやその遺伝的背景を 解明することにつながるといわれている（非特許文献 2参照)。病原体の遺伝子をスキ ヤンすることによって、薬剤耐性に関与する遺伝子を解明することも可能であり（非特 許文献 3参照）、将来は検出された病原体の薬剤耐性を治療開始前に知ることも可 能になるといわれている。抗癌剤の開発においてもその薬剤を in vitroで作用させた 際にどのような遺伝子が影響を受けるの力調べ、従来の薬剤を用いた場合と比較す ることによって、開発のスピードが加速されることが期待されて 、る。
[0005] PCR法は広く生物工学 '農学 ·医学の諸分野で生命科学の基礎と応用に携わって いる人たちにとって、速やかに且つ正確に蛋白質や遺伝子の情報が提供できる有力 な実験技術の一つである。実験材料が微生物や動物'植物などと異なっていても研 究の目的が同じであれば、同じ PCR実験法を用いて研究を進めることが可能である 。 PCRの最大の特徴は、ゲノム DNAのような複雑な DNA力 ある特定の領域のみ を増幅することにある。 PCRは 2種類のプライマーを用いて、 DNAポリメラーゼにより DNAを合成する反応であるから、合成される DNAの領域はプライマーにより特定さ れる領域であり、この領域のみが増幅される。プライマーは铸型ニ本鎖 DNAのそれ ぞれの鎖の特定領域の塩基配列を有しており、一方のプライマーの 3'末端は他方 のプライマーの方向を向いている。 DNAポリメラーゼは、合成反応開始時にプライマ 一を必要とし、 dNTPsの存在下で一定の pH条件のもと、各プライマーの 3，末端に d NMPを付加しながら伸長反応を進め、その結果増幅領域が対数的に増カロしていく。 [0006] ゲノムプロジェクトの進歩に伴 、発展してきた多くの遺伝子解析技術 (シーケンス法 や SNP解析'変異解析'発現解析など）は、検出感度を確保するために、事前の遺 伝子増幅を必要とすることが多い。 PCR法を用いることによって、これまで困難といわ れていた事柄が容易に解決されることも多ぐ生命科学の基礎と応用に PCR法が果 たす役割は大きい。
非特許文献 1 : ΒΙΟテクノロジージャーナル， vol.5, No.4, 394-396 (2005) 非特許文献 2 : Wang DG, et al.， Science, 280, 1077-82 (1998)
非特許文献 3 :Winzeler EA, et al.， Science, 281, 1194-97 (1998)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 一般にプローブと試料を特異的にハイブリダィズさせる工程を含む遺伝子解析で は、プローブの量を試料量に対して大過剰に用意する必要がある。また固相上でハ イブリダィゼーシヨン反応を行う場合には、液相での反応と比べて著しく反応効率が 劣るために、シグナノレの検出が困難になる場合がある。また、遺伝子の変異解析で は、事前に PCR等により遺伝子断片を増幅することが不可欠である力 微量の核酸 試料力 安定的に遺伝子断片を増幅することは一般に困難である。
[0008] 本発明は、プライマーあるいはプローブと試料とのハイブリダ一ゼーシヨン効率を向 上させることにより、微量核酸の安定的増幅と高感度な解析を可能にすることを課題 とする。
課題を解決するための手段
[0009] 試料核酸の検出対象部位を認識するプローブ配列以外の配列に相補的な一本鎖 オリゴ (DNAあるいは RNA、 PNA,キメラオリゴ）を合成し、これを試料核酸に対して 過剰になるよう加え、 94°Cで加熱した後に室温まで冷却する。熱変性によって一本 鎖になった試料核酸は、室温に至る過程で再び元の二本鎖に巻き戻ろうとするが、こ のときに、あら力じめ過剰に添加しておいた相補的な一本鎖オリゴが先にハイブリダ ィズするために、完全な二本鎖に戻ることができない。このように処理された試料核酸 は、完全二本鎖核酸よりも不安定になる。この不安定な試料核酸を、検出対象部位 を認識するプローブ配列が固定された基板上に、あるいは検出対象部位を認識する プローブ配列を含む溶液中に添カ卩し、ノ、イブリダィゼーシヨンを行う。すると、あらかじ め不安定化された試料核酸は、不安定ィ匕していない完全二本鎖核酸よりもスムース にプローブとハイブリダィズすることとなる。
[0010] 本発明は、以上の知見に基づいてなされたものであり、プローブとは異なる部位に 結合するオリゴ配列をあら力じめ試料にハイブリダィズさせることで、試料核酸の二本 鎖構造あるいは分子内構造を破壊して『プローブが試料核酸とハイブリダィズしゃす くなる』効果をもたらすものである。
発明の効果
[0011] 本発明により、ハイブリダィゼーシヨン反応を利用した遺伝子変異解析や発現解析 において、試料二本鎖核酸と検出用プローブのハイプリ効率が改善され、より高感度 の解析を行うことができる。あるいはポリメラーゼによる伸長反応を伴う核酸断片増幅 にお 、て、微量の铸型試料とプライマーのハイブリダィゼーシヨン効率が促進され、 安定して遺伝子増幅を行うことができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]図 1は、本発明を説明するための铸型 DNA配列と第一プローブ及び第二プロ ーブの位置関係図である。
[図 2]図 2は、本発明によるハイブリダ一ゼーシヨン促進効果 (蛍光検出結果)を示す
[図 3]図 3は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。
[図 4]図 4は、本発明による铸型核酸の不安定化効果を示す。
[図 5]図 5は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。
[図 6]図 6は、本発明に用いる第一プローブの構造を示す。
[図 7]図 7は、一本鎖試料核酸を用いる一般的な DNAチップを表す概念図である。
[図 8]図 8は、 DNAチップ解析における本発明の効果の一例を示す。
[図 9]図 9は、二本鎖試料核酸を用いる一般的な DNAチップを表す概念図である。
[図 10]図 10は、二本鎖試料核酸に本発明を適用した場合の DNAチップを表す概念 図である。
[図 11]図 11は、ビーズチップの模式図である。 [図 12]図 12は、ガラスビーズへの第一プローブ固定の様子を表す概念図である。
[図 13]図 13は、本発明を説明するための铸型 DNA配列と第一プローブ及び第二プ ローブの位置関係図である。
[図 14]図 14は、本発明によるハイブリダ一ゼーシヨン促進効果 (PCR産物量の比較） を示す。
[図 15]図 15は、本発明による PCR効率促進効果 (PCR産物量から計算）を示す。
[図 16]図 16は、本発明による PCR効率促進効果 (リアルタイム PCR)を示す。
[図 17]図 17は、本発明による PCR効率促進効果 (PCR産物量の比較)を示す。
[図 18]図 18は、本発明を説明するための铸型 DNA配列と第一プローブ及び第二プ ローブの位置関係図である。
[図 19]図 19は、本発明によるハイブリダ一ゼーシヨン促進効果 (発光検出結果)を示 す。
符号の説明
1- 1、 1 2…铸型二本鎖 DNA
1- 3、 1 4···プライマー
1- 5·· •PCR産物 (増幅領域）
1- 6·· '標識 FITC
1- ■7·· -第二プローブ
1- 8·· '標識 TEXAS RED
1- 9·· '標識ピオチン
1- 10 …第 1配列
1- 11 …第 2配列
1- 12 …第 3配列
2- 1·· '蛍光強度 (バックグラウンド）
2- 2·· '蛍光強度 何も添加せず
2- 3·· '蛍光強度 第一配列のみを添カロ
2- 4·· '蛍光強度 第一プローブのみ添加
3- 1·· -第 1配列 3 2···第一プローブ
4— 1···安定な二本鎖状態
4 2···再会合が部分的に妨げられた状態
4 3、 4 4···二本鎖 PCR産物を構成する鎖
4 5…第一プローブ
5— 1、 5— 2···铸型ニ本鎖核酸を構成する鎖
5— 3···第 1配列
5— 4···第 2配列
5— 5···第 3配列
5— 6…第 1'配列
5— 7…第 2'配列
5— 8···第 3'配列
5— 9…第 3配列と第 3 '配列の中央付近が互いにハイブリダィズするような構造をとる ようデザインされた第一プローブ
5-10·· 'ループ構造をとる第 3配列
5- 11· "第 3配列がループ構造をとる第一プローブ
6— 1…第一プローブ
6— 2···第 1配列
6— 3···第 2配列
6— 4···第 3配列
7 - 1…基板
7 2···第二プローブ (一本鎖）
7— 3···リンカ一
7 - 4…標識
7— 5···—本鎖試料核酸
7— 6…標識
7— 7· ··—本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダィゼーシヨン反応の様子 7-8·· 'スタンフォード型 DNAチップ 8-1· · 'DNAチップによる検出結果 (試料が一本鎖核酸の場合）
8— 2···バックグラウンド
8-3·· 'ノヽイブリした場合のシグナル
8-4·· -ノヽイブリしなレ、場合のシグナル
8— 5 DNAチップによる検出結果（二本鎖核酸を変性させて試料とした場合）
8— 6 · · 'DNAチップによる検出結果（二本鎖核酸試料に本発明を適用した場合） 9一 1…二本鎖試料核酸
9一 2···再会合
9一 3…二本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダィゼーシヨン反応の様子 10— 1···第一プローブ
10-2···二本鎖試料核酸と第二プローブのハイブリダィゼーシヨン反応の様子 (本発 明を適用した場合）
11 — 1· ,·ガラスビーズ
11 -2· ··第二プローブ
11 -3· ··キヤビラリ一
11 -4· ··キヤビラリ一に一列に配列したガラスビ
11 -5· ··蛍光標識されたターゲット核酸
11 -6· "シリンジ
11 ··プローブ固定化ビーズ
12 -1·· •APSコート
12 — 2·' '·クロスリンカ一 KMUS
12 — 3·' ··プローブ配列
13 — 1·' -第 1配列
13 -2··第 2配列
13 -3··第 3配列
13 -4·· '·第 2配列の 3，末端
13 -5·· '第 1配列の 5，末端
14- -1·· •PCR産物量 (第一プローブ添加） 14- 2· · 'PCR産物量（コントロール：第一プローブ添加なし）
15— l 'PCR効率（第一プローブ濃度 3. 4pmol)
15— 2· · 'PCR効率（第一プローブ濃度 6. 8pmol)
15— 3· · 'PCR効率（第一プローブ濃度 10. 2pmol)
15 - 4· · 'PCR効率（コントロール：第一プローブ添加なし）
16 - 1· "リアルタイム PCRの結果（コントロール：第一プローブ添加なし）
16 - 2· "リアルタイム PCRの結果（第一プローブ添加）
17- 1· · 'PCR産物濃度 (第一プローブ添加しな!、通常の PCR反応）
17- 2· · 'PCR産物濃度 (第一プローブ添加）
18 - 1· · ·ΤΡ53遺伝子のコドン 175番を成す 3塩基の中央の塩基
18 - 2· ··第二プローブ配列
18— 3· ··第二プローブ配列の 3，末端
18 - 4· "第二プローブ配列内に挿入したミスマッチ塩基
19 - 1· · 'BAMPER法の結果（第二プローブのみ添加）
19 - 2· · 'BAMPER法の結果（第一プローブ及び第二プローブ添加）
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2005— 306162号の明細書に記載 された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明は、铸型となる二本鎖核酸の高次構造を部分的に壊すことにより、プライマ 一やプローブのハイブリダィゼーシヨン効率を向上させ、微量核酸の高感度な解析を 可能にする核酸分析方法を提供する。
[0015] 具体的には、本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第 1配列と、他方の鎖 に相補的な第 2配列と、前記第 1配列及び第 2配列とを連結する第 3配列とを有する 第一プローブを、前記二本鎖核酸にノ、イブリダィズさせる工程と、少なくとも 1種類の 第二プローブを前記二本鎖核酸にハイブリダィズさせる工程とを有する。
[0016] 本発明において、前記第一プローブを構成する第 3配列は lOmer以上 lOOmer以 下であることが好ましぐ前記二本鎖核酸の 、ずれの配列とも非相補である。
[0017] また、前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域は、前記二本鎖核酸上の前 記第 1配列及び前記第 2配列の結合領域の間あるいは各末端力 それぞれ 500塩基 以内の領域に位置し、特に前記第 1配列及び第 2配列が、それぞれ前記二本鎖核 酸上の第二プローブの結合領域の末端力も少なくとも 10塩基以上離れた位置にハ イブリダィズすることが好まし!/、。
[0018] 前記第一プローブを構成する第 3配列は鎖内結合によりループ状の立体構造を形 成するものであってもよ 、。
[0019] また、前記第一プローブは 2種以上用いられ、前記二本鎖核酸の近傍にハイブリダ ィズした 2種類の第一プローブが、その第 3配列間で相補鎖結合を形成して梯子状 の立体構造を形成するものであってもよ 、。
[0020] 本発明の方法において、前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダィゼーシ ヨン量を計測すれば、前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。
[0021] 例えば、前記第二プローブを蛍光体で標識し、その蛍光量から前記二本鎖核酸の 定量を行うことができる。あるいは、前記第二プローブをアルカリフォスファターゼ、ぺ ルォキシダーゼ、 j8カラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼカも選択されるいずれかの 酵素で標識し、当該酵素とその基質との反応で生じる発光あるいは発色の量から、 前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。あるいはまた、前記第二プローブを放射 性同位体で標識し、その放射線量から前記二本鎖核酸の定量を行うことができる。
[0022] ある実施態様において、前記二本鎖核酸にハイブリダィズした前記第二プローブか らの相補鎖伸長反応を行う工程をさらにして 、てもよ 、。
[0023] 前記方法にお!、て、前記第一プローブは、第二プローブに対するプライマーペアと して機能しないよう、その 3'末端に存在する 3塩基の少なくとも 1塩基が、前記第一プ ローブの二本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造にすることが望まし い。その 3'末端力 相補鎖伸長をしない構造に設計するか、その 3'末端に、前記第 一プローブの二本鎖核酸上の結合領域とは相補でない配列を付加することが望まし い。
[0024] あるいは、前記第一プローブの 3'末端からの相補鎖伸長を抑止するために、その 3
，末端の水酸基を修飾又は別の官能基で置換してお!、てもよ ヽ。
[0025] 本発明の方法にお!、て、第二プローブは固相（例えば、 DNAチップの基板やビー ズ等）上に固相化されているものであってもよい。本発明の技術を応用した DN Aチッ プゃビーズアレイを用いることにより、遺伝子解析の感度を飛躍的に向上させること ができる。
[0026] 本発明の方法は、変異や多型の検出に利用できる。すなわち、変異を有することが 予測される試料核酸に対し、前記変異の候補部位とその 3'末端でハイブリダィズす る第二プローブと前記第一プローブとを前記核酸試料に同時に添加する工程と、ハ イブリダィズした前記第二プローブ力 の伸長反応を行う工程と、前記伸長反応の結 果力 前記試料核酸が変異部位を有する力否かを判定することができる。
[0027] 例えば、 BAMPER法等を適用して、第二プローブ力 一塩基伸長反応を行 、、こ の際導入される塩基種を識別することにより、前記第二プローブの 3'末端側隣接塩 基が変異を有するか否かを判定することができる。
[0028] この場合、前記伸長反応は、前記試料核酸と前記第二プローブの 3'末端に存在 する少なくとも 2塩基が相補的な場合に起こるようにしてもよい。また、第二プローブ にミスマッチを導入することにより、第二プローブの分子内ハイブリダィゼーシヨンを防 止してちょい。
[0029] 別な態様において、前記第二プローブは 1対の増幅用上流プライマー及び下流プ ライマーであり、本発明はこれらプライマーにより前記二本鎖核酸の少なくとも一部の 領域を増幅する工程を有するものであってもよい。この場合、前記第 1配列及び前記 第 2配列は二本鎖核酸上の前記プライマー周辺にハイブリダィズするものでなくては ならず、前記二本鎖核酸上の前記領域の末端力 それぞれ 500塩基以内の領域に ハイブリダィズすることが好まし 、。
実施例
[0030] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
[0031] まず、本発明の実施例に用いる一般的な反応操作について説明する。
[0032] プローブとなる一本鎖オリゴと、铸型試料 DNAとのハイブリダィゼーシヨン実験につ いて説明する。铸型試料核酸は解析前に PCR反応によりターゲット領域を増幅して おく必要がある。本実施例では、増幅用プライマーの一方を蛍光体 (ここでは FITC) で標識した。反応容器には PIERCE社の Reacti— Bindストレプロアビジンコート済 みポリスチレン 96ゥエルプレートを用いた。このゥエルの底面及び側面はストレプトァ ビジンでコーティングされており、片側をピオチンで修飾した検出用プローブを結合 固定することができる。具体的には 100 Lの PBSに溶解した検出用プローブ（5' - ピオチン /3， -TEXAS REDで修飾） 20pmolを 1ゥエルあたりに添加し、室温で 1時 間インキュベートした後、 PBSで洗浄した。
[0033] 前記 FITC修飾した試料 DNA (PCR産物）を 95°Cで 5分間熱変性した後に氷冷し 、 N2Sハイブリダィゼーシヨンバッファー（PIERCE社）で適当に希釈したものを、前 記プローブを固定したゥエルに入れ、 60°Cで一時間インキュベートした。その後 N2S ハイブリダィゼーシヨンバッファーと PBSで洗浄し、蛍光強度を検出することによりプ ローブと試料 DNAとのハイブリダィゼーシヨンを調べた。蛍光検出にはパーキンエル マー社の ARVO SXマイクロプレートリーダーを使用した。本実施例では、遺伝子 増幅用プライマー及び検出用プローブは蛍光体 FITC及び TEXAS REDで修飾し た力 使用するプレートリーダーと蛍光フィルターによっていかなる蛍光体を選択して もよい。また、ラジオアイソトープ標識によるカウント測定や、 HRPや AP標識による発 光測定でも検出は可能であり、状況に応じて使 、分ければょ 、。
[0034] 〔実施例 1〕 PCR反応への本発明の適用
ここでは TP53遺伝子のェキソン 5を例にして説明する。本配列情報は NCBIデー タベースのァクセッションナンバー NT_010718から得ることができる（配列の一部（ 配列番号 1)は図 1に記載した)。 1—1及び 1—2から成る铸型ニ本鎖 DNAに対して 、 1 3及び 1 4のデザインのプライマーを作用させて PCR増幅反応を行った後の 増幅領域は 1 5で表される。伸長反応用の温調器にはサーマルサイクラ一である A BI9700 (Applied Biosystems)を使用した。 PCR産物の確認にはマイクロチップ 電気泳動解析システム SV1210 (日立電子エンジニアリング)を使用した。オリゴ合成 はシグマジエノシスに委託した。 DNAポリメラーゼは QIAGEN社製品を、その他使 用した試薬は極一般的な市販品を使用した。铸型核酸 (ヒトゲノム）は BIOCHAIN 社より購入して使用した。
[0035] 以下は一般的な PCR法の手順である。 96ゥエルプレートに 1 X 10"2°mol/ μ Lに調 製したゲノム試料 1 μ Lを加え、氷上に置いた。 2.5unit/ μ Lの Taq. DNAポリメラー ゼを 0.2 μ L、 2.5mMの dNTPsを 4 μ L、 25pmol/ μ Lのプライマーセット各 0.8 μ L を混合し、各ゥヱルあたり 100 Lとなるように滅菌水で調製した。上記各容量は同じ 比率で変更することが可能で、たとえば PCRは 50 Lスケールでもよい。粘着シート でシーリングし、サーマルサイクラ一にセットした。二本鎖ゲノムを変性させるため、 94 °Cで 2分間加熱した後、 94°Cで 30秒間、 50°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間のサーマル サイクルを 35回繰り返した。 PCR反応液をマイクロチップ電気泳動解析システムで解 祈し、 目的の PCR産物を確認した。
[0036] ここで使用したリバースプライマー 1—4はその 5'端を 1—6の FITCで蛍光標識さ れており、したがって PCR産物 1—5も標識されている。第二プローブ 1—7はその 3' 端を 1—8の TEXAS REDで蛍光標識し、さらに 5 '端を 1—9のピオチンで標識して おり、アビジンでコーティングされたプレート上に固定されている。この第二プローブ 1 — 7によって PCR産物 1— 5をトラップする際に、 1— 5はあらかじめ熱変性されて 、る 1S このとき本発明の第一プローブを同時に添加しておく。第一プローブは核酸鎖 1 — 2にハイブリダィズする部位 (第 1配列 1— 10)と、核酸鎖 1— 1にハイブリダィズす る部位 (第 2配列 1— 11)と、 1 10の 3 '端と 1— 11の 5 '端を結合するようにデザイン された第 3配列 1—12力ら成る。 1—12の配列は GATCTGCGATCTAAGTAAG CTTGGC (配列番号 2)とした。
[0037] 図 2は実際の FITC蛍光強度を検出したものである力 上記第一プローブを加えて Vヽな 、場合にはバックグラウンド 2— 1に対しての 2— 2のようにわずかなカウントの上 昇しかみられな力つた。つまり PCR産物 1—5は第二プローブ 1—7に対してあまり高 効率でノ、イブリダィズしな力つた。これに対して第一プローブの第 1配列のみ力もなる オリゴを添加した場合には、 2— 3のように 2— 2よりも高 、カウントが得られて 、た。
[0038] この結果を一般的な模式図である図 4を用いて説明する。あらかじめ熱変性された 二本鎖 PCR産物 (鎖 4— 3と鎖 4— 4から成る）は、通常は変性状態を保ち続けるのが 難しぐ安定な二本鎖 (4—1)の状態に戻りがちであるのに対して、上記の結果は第 一プローブ 4 5が二本鎖 PCR産物の一方の鎖（図では鎖 4 4)に部分的にハイブ リダィズしたために 4 2に示すように鎖 4 3と鎖 4 4の再会合が部分的に妨げら れ、第二プローブが PCR産物にハイブリダィズしゃすくなって起こったものと考えられ た。第 1配列 1— 10·第 2配列 1— 11 ·第 3配列 1— 12から成る第一プローブ 3— 2を 前記と同様に PCR産物 1 5に作用させた場合には、 2— 4のように、第一配列のみ を作用させた結果である 2— 3よりもさらなる高カウントが得られた。即ち、第一プロ一 ブの両端（1— 10と 1 - 11)が鎖 1— 1と鎖 1— 2にそれぞれ作用して、第一プローブ 3 —1を作用させた場合よりもさらに安定な二本鎖構造をとり難くなつたものと考えられ た。
[0039] 同様の作用をもたらす第一プローブの構造としては、図 5に示すようなものが考えら れる。即ち 5—1と 5— 2から成る铸型ニ本鎖核酸に対して前記と同様に第 1配列 5— 3 ·第 2配列 5— 4·第 3配列 5— 5から成る第一プローブと、第 1 '配列 5— 6 ·第 2'配列 5— 7 ·第 3 '配列 5— 8から成る第一プローブ，を同時に作用させる場合であり、前記 第 3配列と第 3'配列の中央付近が互いにハイブリダィズするような構造をとるようデザ インされた 5— 9の如きものや、第 1配列 5— 3 ·第 2配列 5—4·第 3配列 5— 10から成 り、前記第 3配列 5— 10が鎖内結合によってループ構造をとるようにデザインされた 第一プローブ 5— 11の如きものが考えられる。これら第一プローブ（3— 2、 5- 9, 5 11)は、試料核酸に対して 2箇所以上同時に作用させてもよい。あるいは図 6に示 したように第二プローブ 6— 5を左右から挟みこむように第一プローブ 6— 1の第 1配 列 6— 2と第 2配列 6— 3を配置し、第 3配列 6— 4で結合するような構造をとることも考 えられる。
[0040] これら第一プローブを構成する第 1配列及び第 2配列は、第二プローブの铸型への ハイブリダィゼーシヨン反応を妨げることがないよう、少なくとも 10塩基以上、望ましく は 50塩基以上離れた位置にハイブリダィズするようにする。第 3配列 1— 12· 5— 5 · 6 4及び第 3 '配列 5— 8はハイプリさせようとする铸型核酸と完全に非相補であるよう にする。これは前記配列に限定するものではなぐ周辺配列に依存する。その長さは 1 Omer以上 1 OOmer以下で、望ましくは 50mer以下である。
[0041] 〔実施例 2〕 DN Aチップへの本発明の適用
巿販されて 、る DNAチップは、 Affymetrix社が発売した!/、わゆる"ァフィメトリタス 型"と、スタンフォード大学のパトリック 'ブラウンらが考案した"スタンフォード型"の二 つに大別される。 "スタンフォード型"はあらカゝじめ用意した cDNAや合成オリゴ DNA などを細 、ピンなどでスライドガラスに滴下して作るシンプルなチップで、一つのスポ ットの中には大量の cDNA (二本鎖 DNA)や一本鎖オリゴ DNAが含まれており、こ れがプローブ（リファレンス）となって遺伝子を検出する。 DNAチップ研究所の「Ace Gene (登録商標）」や GE Healthcare社の「CodeLink (登録商標）」、タカラバイオ 社の「IntelliGene (登録商標）」などがこれに類する。 "ァフィメトリタス型"では半導体 技術に用いられる光リソグラフィ一により、プローブ（一本鎖オリゴ DNA)を基板上で 垂直に合成するものである。 Affymetrix社の「GeneChip (登録商標）」やアジレント •テクノロジーズ社のマイクロアレイなどが挙げられる。プローブを基板上に固定する 技術以外にも、三菱レイヨン社の「Genopal (登録商標）」や TUMジーン社の ECAチ ップ（Electrochemical Array)などが挙げられる。いずれもプローブとなる一本鎖 あるいは二本鎖の DNAと、試料 DNAのハイブリダィズ効率により解析結果は影響を 受ける。これらにも本発明を応用することが可能である。
[0042] 図 7に一般的なスタンフォード型チップによりハイブリダィゼーシヨン効率を検証した 結果を示す。 7— 8に示したような形状のチップ上にスポットが計 64個あり、各遺伝子 に固有のプローブがそれぞれ固定されて 、る。具体的には基板 7 - 1に対して 7— 2 の第二プローブ（一本鎖）がリンカ一 7— 3を介して固定されている。 7— 2は末端に蛍 光その他の標識 7— 4を有する場合もある。
[0043] これに対して 7— 5に示すような一本鎖試料核酸 (一方の末端が蛍光体その他の標 識 7— 6を有する）を作用させ、前記プロトコルにしたがって第二プローブ 7— 2とハイ ブリダィゼーシヨン反応を行った場合に図 8 - 1に示すような結果となって 、た。ノック グラウンド 8— 2に対して、試料 7— 5と第二プローブ 7— 2がハイブリダィズした場合は 8— 3のようなシグナルが得られており、試料 7— 5と第二プローブ 7— 2がハイブリダィ ズしなかった場合は 8—4のようなシグナルであった。このとき 7— 5と 7— 2のハイブリ ダイゼーシヨン反応の様子は 7— 7の如きであると考えられた。
[0044] 同様な実験を図 9 1に示すような二本鎖試料核酸 (一方の末端が蛍光体その他 の標識 7— 6を有する）を試料として行った。このようなケースでは事前に 9— 1を加熱 あるいはアルカリ処理によって変性させておくが，安定な二本鎖試料核酸は 9 2の ように再会合の能力が高ぐ結果として 8— 1のようにバックグラウンドとシグナルのタリ ァなコントラストは得られず、 8— 5の如きであった。この原因は 9— 3に示すように、 7 7の場合ほど第二プローブ 7— 2と铸型 9 1のハイブリダィゼーシヨン効率が高く な力つたためと考えられた。ハイプリ効率を高めようとして二本鎖試料核酸 9 1の添 加量を多くすると、その末端にある標識 7— 6によるノ ックグラウンドが大きくなつてし まい、有効な S/N比の上昇は認められなかった。
同様に二本鎖核酸を試料とする場合に、本発明を適用した場合 (8— 6)について 述べる。前記二本鎖試料核酸 9—1に対してあら力じめ第一プローブ 10— 1をノヽイブ リダィズさせておく。このとき 10— 1は先のとおり 3— 2あるいは 5— 9、 5— 11、 6—1の いずれかの構造をとるものとする。前記プロトコルにしたがって第二プローブ 7— 2と ノ、イブリダィゼーシヨン反応を行った場合に、 8— 6に示すような結果が得られており、 これは 8— 1と同程度の感度であつた。即ち試料とした核酸が 9— 1と同じ二本鎖構造 であったにもかかわらず 10— 2の如く効率よくハイブリダィズしたものと考えられ、その 効率は試料核酸が一本鎖である場合 (7— 7)に比べて遜色ないことが示された。一 般的に固相上でプローブと試料核酸のハイブリダィゼーシヨン反応を行 ヽた 、場合 には、試料核酸は事前にアルカリ変性による一本鎖化が必要であったり、さらにカラ ム精製を必要としたりするがこれらの手法は煩雑である。あるいは熱変性により試料 核酸の二本鎖構造をほぐしておく場合も考えられるが、先記のように安定な構造へと 巻き戻ろうとする力が大き 、ために、そのままでプローブとの効率よ 、反応を起こそう とするのは困難である。しかし本発明を適用すれば、二本鎖試料核酸を熱変性する のと同様の手軽さで、試料核酸を一本鎖化した場合と同等の効果が得られることが 示された。本実施例では、第二プローブの末端を蛍光体により標識したものを用いた 力 放射線同位体による標識を用いても良い。また、特定の基質と反応させることに より発色する酵素（アルカリフォスファターゼゃペルォキシダーゼ、 13ガラクトシダーゼ など）により標識を用いても良い。たとえばアルカリフォスファターゼで標識した場合に は、基質である-トロブルーテトラゾリゥム（NBT)と 5—ブロモ 4—クロ口一 3—イン ドリルリン酸 (BCIP)液中で数時間反応させると紫色の発色が観察され、その強度を 測定'比較することにより本発明の効果を確認できた。また、化学発光基質を用いれ ば酵素反応による発光を用いた計測も可能である。
[0046] 〔実施例 3〕 ビーズチップへの本発明の適用
平板状の DNAチップは一般的に使用されており、様々な用途に用 、られて 、る。 しかし、特に医用 ·診断用途にはさらに高い感度と短時間での計測が求められる。検 查項目数に関しては、網羅的な解析ではな 、ためせ!/ヽぜぃ 100種に対応できれば よいが、検査項目の組み合わせの変更が容易であることが望ましい。またサンプル間 のコンタミネーシヨンを防ぐため、使い捨て可能であることも要件の一つである。これら の要件を満たすべく開発されたのが『ビーズチップ』である。これは、約 100ミクロンの ガラスビーズ 11 1に前記第二プローブ 11 2を固定し、ほぼ同サイズのキヤビラリ 一 11—3あるいはマイクロチップ中の溝に一列に配列した構成をとる。第二プローブ の種類毎にガラスビーズ表面への固定ィ匕反応を行い、そこから固定ィ匕ビーズを一つ ずつ取り出し、意図した順序に並べてデバイスを作製するため、ビーズの順列により プローブ種の識別を行うことができる。蛍光標識されたターゲット核酸 11 - 5を含む サンプル溶液をデバイス中でシリンジ 11— 6により往復送液することで、ターゲット核 酸 11 5がビーズ 11 1上のプローブ 11 2に捕捉される。通常の平板状の DNA チップを用いた場合には、ターゲット DNAが拡散によりプローブ DNAまで到達する 時間が必要で、そのため反応に長い時間を必要とする力 このビーズチップの場合 には、サンプル溶液の流れが乱流になり、実効的な拡散が非常に早くなつているた め、早い反応及び検出が可能になっている（小原賢信，『DNAチップ実験まるわ力り 』羊土社， 124—127 (2004) )。
[0047] 実際には APS (aminopropyltrimethoxysilane)コート 12— 1のガラスビーズ 11 1に 対して、チオール末端修飾オリゴ DNA12— 3を NHSエステルとマレイミドを両端に 持つクロスリンカ一である KMUS (N-(ll-maleimidoundecanoyloxy)succinimide) 12 —2を介して共有結合で固定し、プローブ固定ィ匕ビーズ 11— 7を作製した。ここでは TP53遺伝子上の塩基に対応する第二プローブ 24種を用意して、これらのプローブ を固定したビーズを順に一つずつキヤピラリー 11— 3の内部に配列した。次いで、 10 μ Lのサンプル溶液（1 X 10— 10M、 45°C、 4 X SSC- 0. 1%SDS溶液 FITC標識）に 対して 10分間送液しながら反応（ノヽイブリダィゼーシヨン）させ、 0. 2 X SSC-0. 03 %SDS→0. 05 X SSC→水の順で洗浄した後、蛍光計測を行った。
[0048] 試料として前記 7— 5 · 9— 1を用い、ェキソン 5に対応するビーズへのハイブリダィゼ ーシヨン実験を試みた場合には〔実施例 2〕と同様の結果が得られた。即ち、一本鎖 核酸 7— 5と二本鎖核酸 9 1を試料とした場合のハイプリ効率 (ここでは蛍光強度に より検出）を比較した場合には 7— 5が勝っていた。さらに二本鎖核酸 9—1に第一プ ローブ 10—1を事前にハイブリダィズさせたものを铸型とした場合の蛍光強度は 7— 5を試料とした場合と同程度であった。
[0049] 〔実施例 4〕 第一プローブへのミスマッチの導入
上記効果は PCR反応のような特定の遺伝子領域の増幅を目的とする場合にも適 用される。本実施例では、図 13に示す遺伝子配列 (TP53遺伝子ェキソン 5 :配列番 号 1)を使用した場合にっ 、て説明する。 1 - 1及び 1― 2から成る铸型ニ本鎖 DNA に対して、 1 3及び 1 4のデザインのプライマー（第二プローブ）を作用させること により 1 5で表される領域を PCR増幅した。 PCR反応は〔実施例 1〕と同様の条件で 行った。このとき铸型 DNA量が 1 X 10— 22 molでプライマー量が 3. 4 pmol/反応の 時、同時に第 1配列 13— 1 ·第 2配列 13— 2 ·第 3配列 13— 3 (GATCTGCGATCT AAGTAAGCTTGGC (配列番号 2) )から成る第一プローブを 6. 8pmol添カ卩した 場合としなカゝつた場合の結果を比較した。
[0050] 第一プローブはそれ自身が第二プローブ（フォワードプライマー 1 3及びリバース プライマー 1― 4)の一方と反応してプライマーとして作用しな 、よう、第 1配列 13— 1 の 5，末端 13— 5を、本来配列 5'- G_CA- 3'に対してミスマッチとなるように 5 '-^els'に変更した。さらに第 2配列 13— 2の 3'末端 13— 4を、本来配列 3'-£Α£-5'に 対してミスマッチとなるように 3' -£Α£-5'に変更した。同様の効果は、第一プローブ の 3'末端に铸型核酸の結合領域とは非相補な配列を結合したり、 3'末端の水酸基 を修飾又は別の官能基で置換することによつても得られる。
[0051] このとき 14— 1に示すように、 PCR反応において第一プローブを添加した場合に、 コントロール 14— 2 (第一プローブを添カ卩して 、な 、）よりも多くの PCR産物が得られ ていた。第一プローブは第二プローブの外側下流域に位置するために、 PCRサイク ル反応の 2回目以降にはその効果はほとんど期待できない。よって 1回目のサイクル 反応の前に第二プローブカ 、イブリダィズする時に、その作用を促進するように働い たものと考えられた。铸型 DNA量が 1 X 10—22 molの時、第一プローブ量を 1. 7 pm ο1· 3. 4 pmol- 6. 8 pmol' 10. 5 pmolに変化させて PCRを行った際の PCR効率 の変化を図 15に示す。 PCRサイクル数 (η)·铸型量 (N ) 'PCR産物量 (Ν ) 'PCR効
0 f
率（1+Y)の関係は指数増幅領域において『N =N X (1+Y)n』で表されるが、第一プ
f 0
ローブ濃度が 3. 4- 6. 8 · 10. 2 pmolの時（それぞれ 15— 1 · 15— 2· 15— 3)に、 P
CR効率はコントロール (第一プローブ添加なし） 15— 4に比べて有意に変化してい た。
[0052] リアルタイム PCR法はサーマルサイクラ一と分光光度計を一体にし、電気泳動の手 間を省き、 PCR生産物を定量的に評価するための方法である。 PCR生産物を定量 する方法としては、二本鎖 DNAの螺旋の隙間に特異的にインター力レートする SYB R Greenを使う方法が簡便で汎用されている。 PCR反応はその性質から、サイクル がー回増えると最大で 2倍の PCR産物量が得られる。即ちリアルタイムで PCRの様 子を観察した場合に、初期铸型量やプライマー濃度などの諸条件が同じであれば、 最終的な PCR産物量が多くなるほど立ち上がりのサイクル数は早くなるはずである。 そこで本発明の効果による PCR産物量の増加（即ち PCR効率の増力！])をリアルタイ ム PCRでも同様に観察できるはずであると考えた。
[0053] 铸型 DNA量が 1 X 10— 22 molに第一プローブ量が 6. 8 pmol/反応となるように添 加した場合のリアルタイム PCRでの結果を図 16に示す。コントロール (第一プローブ 添加なし） 16— 1の場合には平均 47.45回目のサイクル数で立ち上がり始めるのに 対して、第一プローブを添加した場合（16— 2)には平均 45.74回目のサイクル数で 立ち上がり始めていた。標準サンプルの初期铸型量と立ち上がりサイクル数の関係 から、 16— 2の場合の铸型濃度を逆算して求めると約 2 X 10—22 molに相当しており 、これは真の铸型量である 1 X 10— 22 molの 2倍に相当していた。このことから第一プ ローブは上記の場合と同様に PCRの 1回目のプライマーのハイブリダィゼーシヨン効 率に影響を与えているものと考えられた。具体的にはプライマー（第二プローブ)の 2 〜5倍濃度の第一プローブが、熱変性後の铸型ニ本鎖 DNAにプライマーよりも先に ハイブリダィズしてその高次構造を破壊し、結果としてプライマーがハイブリダィズし やすくなつたものと考えられた。
[0054] 第一プローブを PCR反応に添加する際には、図 17に示すような効果も得られた。
即ち第一プローブを添加しない通常の PCR反応を行った場合（17—1)に比べて、 第一プローブを添加した場合では 17— 2のように、より少ないプライマー濃度でより 多くの PCR産物が得られた。上記実験に使用した第一プローブは PCRプライマー組 (第二プローブ)の外側に設計されており、 1回目のプライマーのハイブリダィゼーショ ン反応にし力促進効果を発揮しないが、プライマー組の内側に設計すれば後続のサ イタル反応全てにぉ 、てプライマー組のハイプリ反応を促進するように作用すること が期待される。また、第一プローブは铸型核酸に対して二箇所以上にハイブリダィズ するように作用させてもよい。第一プローブを铸型核酸に対して二箇所以上作用させ る場合にも前記 3 - 2や 5 - 9 - 5 - 11 - 6 - 1に示すような構造の第一プローブを使用 できる。
[0055] 本実施例では、サーマルサイクラ一を用いた PCRを説明したが、プライマーが片方 だけで、铸型ニ本鎖核酸に対して片方の鎖のみに対する相補鎖合成でも同様な操 作で相補鎖合成反応が可能で、伸長産物を増幅できる。 NASBA法やローリングサ イタル法など、プライミンダサイトに対してプライマーをハイブリダィズさせる反応を含 み、ポリメラーゼ等の酵素反応を利用して相補鎖合成反応を行わせる増幅法に汎用 的に使える利点がある。あるいは、大腸菌 DNAポリメラーゼ Iないしその部分酵素で あるタレノーフラグメント等の酵素を用いて等温 (たとえば 37°C—定)で伸長反応を行 う場合や、 ICAN法 (TaKaRa社)や LAMP法（栄研化学）などの等温増幅法にお!、 ても、铸型と第一プローブを事前にハイブリダィズさせておくことにより対応できる。
[0056] 〔実施例 5〕 変異解析 (BAMPER法)への本発明の適用
個々の検体で見られる塩基変異を解析するのに適した手法として、 BAMPER (Bio luminometnc Assay coupled with Modined Probe Extension Reactions)法 (uuo-hua Zhou, et al., Nucleic Acid Research, 29, e93 (2001))があり、実用化に向けた研究が 行われている（Y Nakashima, et al., Clinical Chemistry, 50, 8, 1417-1420 (2004)) 0 これは生物発光を利用した塩基変異解析技術であり、変異型に対応した 2〜4種類 のプローブ（3 '末端がそれぞれ Α· G - C -T)を用いて伸長反応を行うと、検出部位の 塩基型に一致するプローブを用いた場合にのみ伸長反応が進行する。その際に生 成するピロリン酸を ATPに変換し、ルシフェリン ·ルシフェラーゼ反応を利用して発光 させる。この発光を測定すると数分間で塩基型を判定することができる。この簡便な 方法は一般に癌組織細胞中で観察される点変異や、一から数塩基の挿入あるいは 欠失、あるいは一塩基多型（SNP)の検出に有効である。以下に手順を示す。
[0057] まず解析対象とする遺伝子配列を PCR法等により増幅させておく。次に PCR反応 時のプライマーや dNTPsを除去するため酵素的なクリーンアップで目的 PCR産物を 精製する。即ち PCR反応後の溶液 15 μ Lに lunit/ μ Lの濃度の shrimp alkaline phosphataseを 0.7 μ L、 lOunit/ μ Lの exonucleaselを 0.06 L、 10 X PCR b uffer (Amersham Pharmacia社製品）を 0.3 μ L、滅菌水 3.94 μ Lを混合する。 3 7°Cで 40分間インキュベートによる酵素反応を行つた後、 80°Cで 15分間加熱により 酵素を失活させる。この反応液を 96ゥエル PCRプレート（白色）に 3 μ L分注する。変 異特異的なプローブ（5pmol/ L)を 1 L添カ卩する。あらかじめ 5 unit/ μ Lの Taq . DNAポリメラーゼ 0.0275 Lと、 5mM dNTPs (ピロリン酸はあらかじめ除去して おく） 0.04 Lを混合し、 1.0 Lとなるように滅菌水で調製した溶液を 1.0 Lカ卩える 。ミネラルオイルを 4 L重層する。 94°C10秒間と 60°C10秒間のサイクルを 5回行つ た後、 25°Cまで冷却する。あら力じめ室温にしておいた発光試薬 (ピロリン酸を ATP に変換し、 ATPをホタル由来ルシフェラーゼを使用して検出する生物発光キット: T S akakibara, et al, Analytical Biochemistry, 268, 94—101 (1999)参照）を lO ^u Lずつ 加え、ピペッティングにより混合し、ルミノメーターで測定する。これにより伸長反応が 起きたかどうかをピロリン酸の量に依存する発光強度として容易に検出できる。
[0058] 上記 BAMPER法に本発明を適用した場合について説明する。図 18に示す 1—1 及び 1— 2を含む範囲の二本鎖铸型 DNA(TP53遺伝子ェキソン 5)を PCRにより増 幅した。核酸鎖 1 1においてこの遺伝子のコドン 175番を成す 3塩基の中央の塩基 18— 1は、多くの癌で標準型 C力も変異型 Tに変化していることが知られている。この 変異を検出するための第二プローブ配列が 18— 2であり、その 3'末端 18— 3は前記 Cあるいは Tに対応するように Gあるいは Aとなって!/、る。第二プローブが分子内ハイ ブリダィゼーシヨンを起こしてホールディングする構造をとることがないように 18— 4に ミスマッチを挿入しており、本来塩基 Cから Gに変更した。この第二プローブ 18— 2を 用いて変異 18— 1を検出する際に、同時に第 1配列 13— 1 ·第 2配列 13— 2·第 3配 列 13— 3から成る第一プローブを添加した場合としなかった場合の第二プローブ伸 長度 (シグナル強度で表される）と濃度依存性を表したのが図 19である。このとき第 一プローブはそれ自身が第二プローブ 18 2と反応してプライマーとして作用しな ヽ ように、第 1配列 13— 1の 5'末端 13— 5を、本来配列 5' - G_CA- 3'に対してミスマツ チとなるように 5' -;iC:r-3'に変更した。さらに第 2配列 13— 2の 3'末端 13— 4は、 本来配列 3 ' -CAG-5，に対してミスマッチとなるように 3 ' -GAC-5，に変更した。
[0059] 19 1で示したように第二プローブのみを 60°Cで反応させた時、 l〜6pmolの範 囲で濃度依存的に検出シグナルも上昇した。それに対し第一プローブ共存させた場 合（19 2)にはより低い濃度域で、第二プローブのみによる最高のシグナル (6pmo 1のときコントロールの 15倍のシグナル）よりも大きなシグナル強度（〜17倍）を示し、 2 〜8pmolの間それを維持することができた。すなわち第二プローブは第一プローブと 共存させたことにより、熱変性後の铸型ニ本鎖の再会合を妨げた結果として第二プロ ーブのハイプリ効率が高められ、それのみによる測定時よりも少ない濃度で変異 18 1の測定が可能になったものと考えられた。第一プローブには前記 3— 2や 5— 9 · 5 - 11 - 6- 1に示すような構造が適用される。
[0060] ピロリン酸の検出法としては上記のようにー且 ATPに変換し、ルシフェリン ·ルシフ ラーゼ反応のエネルギー源としその発光を検出する方法以外にも、一般的な種々 の化学反応を経てホルマザンゃ過酸化水素 ·スーパーォキシド ·二酸化炭素 · L-フエ 二ルァラニン ·硫酸イオンなどに変換し、検出機を用いて、あるいは目視により判断す る方法 (特開 2003— 174900号参照）などにも適用が可能である。あるいは変異特 異的なプライマーによる伸長反応に伴って発生したピロリン酸が有する金属イオンと の結合作用により、消光材として作用していた金属イオンが奪われることにより蛍光を 発する物質の量を、検出機を用いて、あるいは目視により判断する方法にも適用が 可能である。
[0061] そのほか一般的な塩基変異解析方法としては 1塩基伸長法や、 Invader (登録商 標）法（Therd Wave TechnoLogies社） 'MassArray™法（Sequenom社） 'AS P- PCR法（TOYOBO社） · UCAN法（TaKaRa社） · STA法（TRIMGEN社の Mu tector (登録商標）キット） · PCR- PHFA法（ロッシュ ·ダイァグノスティック社； K- ras コドン 12変異検出キット)などがあるが、何れも 3'末端が変異塩基に相補となるように デザインされたプローブを試料 DNAにハイブリダィズさせる工程を含んで!/、る。一般 にプローブと試料を特異的にハイブリダィズさせる工程を含む遺伝子解析を行う場合 には、プローブの量を試料量に対して大過剰に用意する必要がある。固相上でハイ ブリダィゼーシヨン反応を行おうとする場合には、液相での反応と比べて著しく反応 効率が劣るために、シグナルの検出が困難になる場合がある力 これらについても本 発明が適用される。 UCAN法や STA法のような等温反応においても、上記 ICAN法 や LAMP法と同様に、事前に铸型試料に対して干渉オリゴをハイブリダィズさせてお けばよい。
[0062] 本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0063] 医療分野では罹患とその進行により患部に発生する点突然変異などを代表とする 遺伝子変異の解析がさかんに行われるようになつている。情報の蓄積に伴い、特定 の遺伝子の特定の箇所に発生する特定の塩基の変化と病状進行度合の関係なども 明らかにされつつある。これら変異の解析あるいは特定の疾患に関連する遺伝子の 発現解析を行う際に汎用される DNAチップ技術において、少ない試料核酸を検出 用プローブと効率よく反応させようとする際に本発明は適用される。あるいは前記検 查を感度よく効率よく行うためには PCR法などによる特定遺伝子断片の増幅が必須 であり、本発明のような微量の DNA力 検査用の遺伝子断片を安定して増幅するこ とができる意義は大きぐ医療産業上きわめて有用と考えられる。
配列表フリーテキスト
[0064] 配列番号 1 図 1、 13、 18に示す TP53遺伝子のェキソン 5の一部
配列番号 2 第 3配列（ 1 12)および（ 13— 3)

Claims

請求の範囲
[1] 二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な第 1配列と、他方の鎖に相補的な第 2配列と、 前記第 1配列及び第 2配列とを連結する第 3配列とを有する第一プローブを、前記二 本鎖核酸にハイブリダィズさせる工程と、少なくとも 1種類の第二プローブを前記二本 鎖核酸にハイブリダィズさせる工程とを有することを特徴とする核酸分析方法。
[2] 前記第一プローブを構成する第 3配列が lOmer以上 lOOmer以下であり、前記二 本鎖核酸の 、ずれの配列とも非相補であることを特徴とする、請求項 1に記載の核酸 分析方法。
[3] 前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合領域が、前記二本鎖核酸上の前記第 1 配列及び前記第 2配列の結合領域の間に位置することを特徴とする、請求項 1又は 2 に記載の核酸分析方法。
[4] 前記第 1配列及び第 2配列が、それぞれ前記二本鎖核酸上の第二プローブの結合 領域の末端カゝら少なくとも 10塩基以上離れた位置にハイブリダィズすることを特徴と する、請求項 3に記載の核酸分析方法。
[5] 前記第一プローブを構成する第 3配列が鎖内結合によりループ状の立体構造を形 成することを特徴とする、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の核酸分析方法。
[6] 前記第一プローブを 2種以上用いた核酸分析方法であって、前記二本鎖核酸の近 傍にハイブリダィズした 2種類の第一プローブが、その第 3配列間で相補鎖結合を形 成することを特徴とする、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の核酸分析方法。
[7] 前記第二プローブの二本鎖核酸へのハイブリダィゼーシヨン量を計測することによ り、前記二本鎖核酸の定量を行うことを特徴とする、請求項 1〜6のいずれか 1項に記 載の核酸分析方法。
[8] 前記第二プローブが蛍光体又は放射性同位体で標識されており、その蛍光量又 は放射線量で前記第二プローブの二本鎖核酸へのノ、イブリダィゼーシヨン量を測定 するか、あるいは、
前記第二プローブがアルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、 j8カラクトシダー ゼ、及びルシフェラーゼカも選択されるいずれかの酵素で標識されており、前記酵素 とその基質との反応で生じる発光あるいは発色によって前記第二プローブの二本鎖 核酸へのハイブリダィゼーシヨン量を測定することを特徴とする、請求項 7に記載の核 酸分析方法。
[9] 前記二本鎖核酸にハイブリダィズした前記第二プローブ力 の相補鎖伸長反応を 行う工程をさらに有することを特徴とする、請求項 1〜6の 、ずれか 1項に記載の核酸 分析方法。
[10] 前記第一プローブがその 3'末端からの相補鎖伸長をしない構造であることを特徴 とする、請求項 9に記載の核酸分析方法。
[11] 前記第一プローブの 3'末端に存在する 3塩基の少なくとも 1塩基が、前記第一プロ 一ブのニ本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造であることを特徴とす る、請求項 9に記載の核酸分析方法。
[12] 前記第一プローブの 3'末端に、前記第一プローブの二本鎖核酸上の結合領域と は相補でな 、配列が付加されて 、ることを特徴とする、請求項 9に記載の核酸分析 方法。
[13] 前記第一プローブの 3'末端に存在する 3塩基の少なくとも 1塩基の水酸基が、修飾 又は別の官能基で置換されていることを特徴とする、請求項 9に記載の核酸分析方 法。
[14] 前記第二プローブが固相に固定ィ匕されていることを特徴とする、請求項 9に記載の 核酸分析方法。
[15] 変異を有することが予測される二本鎖核酸を含む核酸試料に、前記変異の候補部 位とその 3'末端でハイブリダィズする第二プローブと前記第一プローブとを同時に添 加する工程と、ハイブリダィズした前記第一及び第二プローブからの伸長反応を行う 工程と、前記伸長反応の結果から前記二本鎖核酸が変異部位を有するか否かを判 定する工程を有する、請求項 9に記載の核酸分析方法。
[16] 前記第二プローブからの伸長反応が一塩基伸長反応であり、その際導入される塩 基種を識別することにより、前記第二プローブの 3'末端側隣接塩基が変異を有する か否かを判定することを特徴とする、請求項 15に記載の核酸分析方法。
[17] 前記伸長反応が、前記二本鎖核酸と前記第一プローブの 3'末端に存在する少な くとも 2塩基が相補的な場合に起こることを特徴とする、請求項 15又は 16に記載の核 酸分析方法。
[18] 前記第二プローブが、前記二本鎖核酸上の結合領域とミスマッチになるような構造 を有することを特徴とする、請求項 15〜 17のいずれか 1項に記載の核酸分析方法。
[19] 前記第二プローブが増幅用上流プライマー及び下流プライマーであって、これによ り前記二本鎖核酸の少なくとも一部の領域を増幅する工程を含み、且つ、前記第 1 配列及び前記第 2配列が前記二本鎖核酸上の前記プライマーによる増幅領域を含 む周辺配列に対してハイブリダィズすることを特徴とする、請求項 1に記載の核酸分 析方法。
[20] 前記第 1配列及び前記第 2配列は、前記二本鎖核酸上の前記領域の末端からそ れぞれ 500塩基以内の領域にハイブリダィズすることを特徴とする、請求項 19に記 載の核酸分析方法。
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