TWI570242B - 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法 - Google Patents

用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI570242B
TWI570242B TW104144049A TW104144049A TWI570242B TW I570242 B TWI570242 B TW I570242B TW 104144049 A TW104144049 A TW 104144049A TW 104144049 A TW104144049 A TW 104144049A TW I570242 B TWI570242 B TW I570242B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
allele
primer
specific
wafer
nucleic acid
Prior art date
Application number
TW104144049A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201723189A (zh
Inventor
林上琪
Original Assignee
華聯生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 華聯生物科技股份有限公司 filed Critical 華聯生物科技股份有限公司
Priority to TW104144049A priority Critical patent/TWI570242B/zh
Priority to CN201610152665.3A priority patent/CN106916882B/zh
Priority to US15/162,907 priority patent/US10457989B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI570242B publication Critical patent/TWI570242B/zh
Publication of TW201723189A publication Critical patent/TW201723189A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Description

用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方 法
本發明提供一種雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法，特別係一種用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法。
人體的基因體包含各種遺傳變異，其中單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism，SNP)是常被發現的遺傳變異。單一核苷酸多型性上不同之核苷酸，可能會改變蛋白質的形狀，影響基因的調控反應，進而造成各種遺傳性疾病。
近年來，高通量的微陣列晶片技術已被廣泛的應用於個體差異性檢測、比較基因體相關分析、連鎖不平衡或藥物代謝基因相關等研究中。然而，高通量的微陣列晶片技術在進行晶片雜交的前處理步驟相當耗時，且晶片掃描後要得到上萬個SNP數據的判讀過程複雜，同時，該技術的儀器及耗材購置成本相當昂貴。而即時聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction)因具有較高的專一性、敏感度及準確度，但該技術需要針對個別SNP位點訂製之特殊修飾探針的製作成本昂貴，導致整體檢測技術之成本較高，不利用於大規模的SNP位點檢測。因此，目前現有技術缺乏一種有效、快速、較大規模之檢測單一核苷酸變異的技術。
有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a) 利用一對以上的引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)擴增(amplify)一待測核酸樣本以產生一擴增產物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入一螢光螯合染劑，且該螢光螯合染劑係為SYBR green核苷酸染料；以及(b)以一表面固定有辨識該等位基因特異性之探針(probe)的基因型鑑定晶片鑑定該擴增產物，其中該引子組包含至少四條等位基因特異性引子，至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的正股(sense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的反股(antisense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，並於該引子組之5’端加上一修飾標記。
本發明之又一目的在於提供一種用於以辨識修飾標記的基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a)利用一對以上的引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)擴增(amplify)一待測核酸樣本以產生一第一階段擴增產物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入一螢光螯合染劑，且該螢光螯合染劑係為SYBR green核苷酸染料；(b)利用5’端具有修飾標記的通用聚合酶鏈鎖反應引子(universal PCR primer)擴增該第一階段擴增產物以產生一第二階段擴增產物；以及(c)以一表面固定有辨識該等位基因特異性之探針(probe)的基因型鑑定晶片鑑定該擴增產物，其中引子組包含至少四條等位基因特異性引子，至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的正股(sense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的反股(antisense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補。
本發明之另一目的在於提供一種與SYBR Green核苷酸染料搭配使用的雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應之引子 對，包含：該引子對包含四條等位基因特異性引子，其中兩條等位基因特異性引子與一核酸樣本的正股(sense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的反股(antisense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補。在本發明之一實施例中，該引子對係應用於一基因型鑑定晶片。
在本發明之一實施例中，其中該引子對具有接近的熔解溫度(melting temperature，Tm)值。
在本發明之一實施例中，其中該修飾標記係為螢光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，DIG)或寡核酸序列。
在本發明之一實施例中，其中該基因型鑑定晶片係以晶片螢光掃描儀進行檢測。
在本發明之一實施例中，其中該核酸樣本係存在於選自於由血液、血清、血漿、體液及組織所組成群組。
在本發明之一實施例中，其中該引子組5’端進一步加上一密碼(barcode)序列，且該探針包含該密碼序列之互補序列。
因此，本發明提供一種用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，結合SYBR green核苷酸染料進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)，再以基因型鑑定晶片檢測放大產物。本發明方法所使用的正向(forward)與反向引子(reverse)皆以等位基因特異性位點為引子的3’端終點，不須使用特殊鹼基的引子，並能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，故本發明之方法係為不須使用特殊合成引子且引子設計簡單之應用於基因型鑑定晶片檢測的方法，並具有同時檢測多個等位基因特異性位點之優點。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技 藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖係為本發明之雙重等位基因特異性引子(double allele specific primer)設計之示意圖。
本發明提供一種於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，其係使用的正向(forward)與反向引子(reverse)皆以等位基因特異性位點為引子的3’端終點，不須使用特殊鹼基的引子，並能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，並且結合螯合試劑(interchelating agent)進行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應，再以單一核苷酸(single nucleotide polymorphism，SNP)晶片進行檢測。
定義
本文中所述之核酸係為DNA或RNA分子。
本文中所述之核苷酸係為核酸的基本組成單位。
實施例1 本發明之引子設計
本發明之用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法，分別進行等位基因特異性位點的第一階段擴增反應以及通用引子(universal primer)的第二階段擴增反應；再以一表面固定有辨識探針(probe)的微陣列晶片區別該等位基因特異性位點的放大產物。
本發明之方法主要之技術特徵在於雙重等位基因特異性引子之設計，相較於傳統聚合酶鏈鎖反應係利用正向引子與變異性位點一端的一條DNA模板鏈互補，反向引子與變異性位點另一端的另一條DNA模板鏈互補。本發明之方法所使用正向與反向引子皆以變異性位點為引子的3’端終點，不須使用特殊鹼基的引子，直接依等位基因特異性位點兩側的序 列進行設計。在本實施例中，本發明以5個SNP位點作為舉例，包含rs29232、rs401681、rs667282、rs2072590以及rs2131877，但不限於此。需注意的是，一起進行多重(multiplex)SNP聚合酶鏈鎖反應的引子需接近的熔解溫度(melting temperature，Tm)值，Tm公式=4(G+C)+2(A+T)。
以rs29232為例，如第一圖及表一所示，rs29232為A/G基因型變異，直接依該基因型變異之位點兩側的序列進行設計，正向引子(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)分別以變異性位點A或G為引子的3’端終點設計二條正向引子；反向引子(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)分別以變異性位點C或T為引子的3’端終點設計二條反向引子，分別使用二組引子對進行擴增反應(AT引子組及GC引子組)，不須使用特殊鹼基的引子。其餘SNP變異性位點引子對，rs401681以SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8表示；rs667282以SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12表示；rs2072590以SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：16表示；rs2131877以SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20。
關於第二階段擴增反應的通用引子，如表一所示，以5’端分別標記不同螢光(Cy3及Cy5)的AT通用引子(SEQ ID NO：21)及GC通用引子(SEQ ID NO：22)。
關於晶片上區別該SNP變異性位點的放大產物的辨識探針，本發明以5’端具有胺基(amine)修飾的辨識rs29232探針(SEQ ID NO：23)、rs401681探針(SEQ ID NO：24)、rs667282探針(SEQ ID NO：25)、rs2072590探針(SEQ ID NO：26)以及rs2131877探針(SEQ ID NO：27)固定於晶片上進行雜交(hybridization)反應，但不限於此。
關於用於晶片之擴增反應產物之標記方式，包含特殊修飾鹼基、特殊修飾引子以及化學修飾等方法，其中特殊修飾鹼基係為在擴增反應時，加入各種特殊修飾鹼基，例如：biotin-dCTP、Cy5-dCTP、aminoallyl-dCTP等，或使用末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase)將特殊鹼基加在擴增反應產物的3’端，例如直接使用以螢光修飾的dCTP進行第一階段的PCR擴增反應，便不需再進行第二階段的PCR擴增反應。特殊引子修飾係為在擴增反應時，加入各種特殊修飾引子進行擴增反應，例如在引子的5’端加上螢光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，DIG)或寡核酸序列修飾；化學修飾係為在純化擴增反應產物之後，以化學螢光(如Kreatech公司的ULSTM技術)將螢光分子直接加在擴增反應產物的鹼基上。
實施例2 SYBR green對等位基因特異性之辨識度的影響
本發明之以雙重等位基因特異性引子(double allele specific primers)的方法，結合螯合試劑(interchelating agent)進行第一階段擴增反應，可提升等位基因特異性的辨識度。
在本實施例中，本發明以SYBR green I(SYBR green I核苷酸染料，產品編號1988131，羅氏)作為螯合試劑，並且分別將SYBR green I進行：(1)25倍稀釋、(2)50倍稀釋、(3)100倍稀釋、(4)200倍稀釋、(5)400倍稀釋、(6)800倍稀釋、(7)1600倍稀釋、(8)3200倍稀釋、(9)6400倍稀釋。
在本實施例中，使用購自美國Coriell細胞存儲中心的DNA樣本，分別為NA12891及NA18526；以rs29232進行實驗，並經由資料庫 已知NA12891樣本的rs29232基因型為CC及NA18526樣本的rs29232基因型為TT。rs29232分別包含：含有各5μM SEQ ID NO：1及4的AT引子對混合液，以及含有各5μM SEQ ID NO：2及3的GC引子對混合液。
此外，本發明分別使用不同廠牌的SYBR green擴增反應混合試劑包含：美國應用生命系統公司(Applied Biosystems，ABI)快速SYBR green擴增反應混合試劑(Fast SYBR Green master mix，產品編號4385612)；以及美商伯瑞股份有限公司(Bio-Rad)iQTM SYBR® Green擴增反應超級混合試劑(iQTM SYBR® Green Supermix，產品編號1708880)。
進行即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10μL，包含5μL SYBR green擴增反應混合試劑、2μL SYBR稀釋液、1μL引子對混合液、1.8μL水及0.2μL的gDNA(50ng/μL)樣本。即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應器(CFX Connect Real-Time PCR Detection System，Bio-Rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環，並重複此循環50次結束反應。
實驗結果所得之Ct值，經由公式△Ct=(AT引子對的Ct)-(GC引子對的Ct)計算，使用ABI快速SYBR green擴增反應混合試劑之結果如表二所示。因所使用的兩個樣本基因型為CC(NA12891)與TT(NA18526)，CC基因型樣本的qPCR結果之GC引子對的Ct會比AT引子對的Ct小，因此在公式計算結果會是正值，反之在TT基因型樣本的qPCR計算結果會是負值。數值絕對值越大，表示分辨效果越佳，在ABI SYBRgreen的100倍稀釋的兩個數值的絕對值都很大，表示在兩種基因型的分辨效果都很好，但在50倍稀釋只有CC基因型樣本(NA12891)絕對值數值很大，但TT基因型樣本(NA18526)的絕對值很小，表示在此配方中只有CC基因型的分辨效果較佳，但TT基因型的分辨效果不佳，故100倍稀釋濃度的SYBR green在ABI快速SYBR green擴增反應混合試劑的搭配效果最佳。使用Bio-Rad iQTM SYBR® Green擴增反應超級混合試劑之結果如表三 所示，800-1600倍稀釋濃度的SYBR green在Bio-Rad iQTM SYBR® Green擴增反應超級混合試劑的搭配效果最佳。其結果顯示雖不同擴增反應試劑所使用之最佳SYBR green濃度不同，但使用SYBR green確實可有效提升等位基因特異性之辨識度。
實施例3 其他螯合試劑對等位基因特異性之辨識度的影響
申請人以其他螯合試劑GelRed(GelRedTM核苷酸染料，產品編號89139-138，Biotium)作為螯合試劑，並且分別將GelRed進行：(1)100倍稀釋、(2)200倍稀釋、(3)400倍稀釋、(4)800倍稀釋、(5)1600倍稀釋、(6)3200倍稀釋、(7)6400倍稀釋、(8)水。
在本實施例中，使用購自美國Coriell細胞存儲中心的DNA樣本，分別為NA12891及NA18526；以rs29232進行實驗，並經由資料庫已知NA12891樣本的rs29232基因型為CC及NA18526樣本的rs29232基因型為TT。rs29232分別包含：含有各5μM SEQ ID NO：1及4的AT引子對混合液，以及含有各5μM SEQ ID NO：2及3的GC引子對混合液。
進行即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10 μL，包含5μL ABI快速SYBR green擴增反應混合試劑、2μL GelRed稀釋液、1μL引子對混合液、1.8μL水及0.2μL的gDNA(50ng/μL)樣本。即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應器(CFX Connect Real-Time PCR Detection System，Bio-Rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環，並重複此循環50次結束反應。
實驗結果所得之Ct值，經由公式△Ct=(AT引子對的Ct)-(GC引子對pair的Ct)計算，結果如表四所示，如同實施例2的判斷方式，且GelRed所有的測試結果都跟水差異不大，故GelRed對等位基因特異性的辨識度效果不佳，顯示非所有的螯合試劑都能提高SNP的辨識效果。
實施例4 多重(multiplex)SNP的辨識度
本發明確認使用SYBR green能有效提升等位基因特異性之辨識度後，進行多重(multiplex)SNP聚合酶鏈鎖反應以進一步確認本發明之方法對多重SNP的辨識效果。
在本實施例中，使用rs29232、rs401681、rs667582三種SNP進行檢測。其中AT引子對混合物包含：rs29232AT引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：1及4、rs401681 AT引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：6及7、rs667582 AT引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：10及11。GC引子對混合液包含：rs29232 GC引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：2及3、rs401681 GC引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：5及8、rs667582 GC引子對混合物包含各2.5μM的SEQ ID NO：9及12。
在本實施例中，使用購自美國Coriell細胞存儲中心的DNA樣本，分別為NA12891、NA18524、NA18526以及NA18558，並經由資料庫已知各樣本的基因型如表五所示。
進行即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10μL，包含5μL Bio-Rad iQTM SYBR® Green、0.67μL SYBR green 320倍稀釋液、2μL引子對混合液、2.83μL水及0.5μL的gDNA(50ng/μL)樣本。即時(Real-Time)聚合酶鏈鎖反應器(CFX Connect Real-Time PCR Detection System，Bio-Rad)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環，並重複此循環50次結束反應。
各樣本的實驗結果皆與已知基因型結果一致，證實本發明用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法應用於多重SNP亦具有極高的準確率。此外，實驗結果所得之Ct值，經由公式△Ct=(AT引子對的Ct)-(GC引子對的Ct)計算，結果如表六所示，SYBR green確實可有效提升等位基因特異性之辨識度，且使用多重SNP的辨識度效果佳。
實施例5 基因型鑑定晶片測試
本發明之用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法，在本實施例中使用rs29232、rs401681、rs667582、 rs2072590、rs2131877五種SNP進行進行檢測，分別進行SNP變異性位點的第一階段擴增反應(使用SEQ ID NO：1至20)以及通用引子的第二階段擴增反應(使用SEQ ID NO：21及22)；再以表面固定有辨識探針(SEQ ID NO：23至27)的微陣列晶片區別該SNP變異性位點的放大產物。
其中，AT引子對混合物包含：各1.5μM的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：19。GC引子對混合液包含：各1.5μM的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：20。
在本實施例中，使用購自美國Coriell細胞存儲中心的DNA樣本，分別為NA12891、NA18524、NA18526以及NA18559，並經由資料庫已知各樣本的基因型如表七所示。
首先，進行第一階段擴增反應，反應總體積為10μL，包含5μL ABI快速SYBR green擴增反應混合試劑、1.5μL SYBR green 100倍稀釋液、1.5μL引子對混合液及2μL的gDNA(50ng/μL)樣本。聚合酶連鎖反應使用熱循環反應器(GeneAmp® PCR System 9700，ABI)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環，並重複此循環16次，最後降至4℃結束反應。
接著，進行第二階段擴增反應，反應總體積為30μL，包含10μL第一階段擴增反應產物、10μL ABI快速SYBR green擴增反應混合試 劑、1μL通用引子(10μM)、9μL水；其中AT通用引子(SEQ ID NO：21)及GC通用引子(SEQ ID NO：22)分別於兩個反應中進行，代號分別為A及B。聚合酶連鎖反應使用熱循環反應器(GeneAmp® PCR System 9700，ABI)進行，其反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，10秒、70℃，30秒為一循環，並重複此循環30次，最後降至4℃結束反應。將相同樣本之A及B反應產物混合後進行以下晶片雜交步驟。
將第二階段反應物加入100μL雜交緩衝液(4.27M四甲基氯化铵溶液(Tetramethylammonium chloride solution)、0.9%EMPIGEN BB洗滌液、100mM Tris緩衝液(pH 8.0))及50μL甲醯胺(formamide)混合均勻，以80℃加熱5分鐘，在於4℃冷卻5分種。將冷卻後的產物注入至表面固定有辨識探針(SEQ ID NO：23至27)的晶片，將該晶片以2rpm轉速於45℃烘箱反應至隔夜。之後進行晶片清洗步驟，再以42℃洗滌液I(2X SSPE緩衝液，含0.1%SDS)於80rpm轉速之震盪器上震盪清洗3分鐘；以42℃洗滌液II(0.1X SSPE緩衝液，含0.1%SDS)於80rpm轉速之震盪器上震盪清洗3分鐘；以室溫洗滌液III(0.1X SSPE緩衝液)於80rpm轉速之震盪器上震盪清洗5分鐘；將晶片以離心機旋乾。最後以一晶片螢光掃描儀進行晶片掃描步驟，本發明使用具有兩支固態激光雷射波長635nm(PMT 750V)及532nm(PMT 600V)的LuxScanTM 10k/A晶片掃描儀(CapitalBio)進行掃描。再以Genepix 4.0(Axon Laboratory)進行晶片影像分析。
經由AT(訊號強度-背景強度)/GC(訊號強度-背景強度)計算出log2比率(ratio)值，如果為G或C同型合子(homozygote)基因型，數值會是負值；如果為A或T同型合子(homozygote)基因型數值會是正值；如果是異形合子(heterozygote)數值會界於兩種同型合子中間。如表八所示，各樣本的實驗結果皆與已知基因型結果一致，證實本發明用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應方法應用於多重SNP亦具有極高的準確率。顯示本發明之用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶 鏈鎖反應方法能有效分辨單管擴增反應中的多種SNP產物。
此外，本發明亦可在SNP變異性位點引子組之5’端加上一修飾標記直接進行第一階段擴增反應，不需再進行第二階段擴增反應，或者在產物無任何修飾的情況下，也可以類似表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)方法偵測是否有產物雜交在晶片表面。
更進一步地，當單一SNP的基因型超過兩種基因型時，如表九所示，可將等位基因特異性引子的5’端再加上密碼(barcode)序列，以及表面固定包含密碼(barcode)互補序列的辨識探針，擴增反應依實施例五之方法進行，最後晶片的雜交結果可看見該SNP會有兩種訊號結果(如表九A類及B類)，A類辨識探針可辨識第一密碼序列，B類辨識探針可辨識第二密碼序列。計算A類訊號的紅綠螢光強度log2比率(ratio)，判斷樣本是否含有A或G，或是計算B類訊號的紅綠螢光強度log2比率，判斷檢體是否含有T或C。
綜上所述，本發明提供一種用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性引子(double allele specific primers)的方法，該方法使用的正向 (forward)與反向引子(reverse)皆以等位基因特異性位點為引子的3’端終點，不須使用特殊鹼基的引子，並能容易的直接依等位基因特異性位點兩旁的序列進行設計，並且結合螯合試劑(interchelating agent)進行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應。該方法能有效將目前市面上SNP晶片將擴增產物注入晶片進行雜交的前處理步驟之時間減少至5小時，並能減少合成特殊鹼基引子所需之昂貴成本，且具有同時檢測多個等位基因特異性位點之優點，故本發明之方法係為一有效、快速、低成本、較大規模之檢測SNP變異的技術。
<110> 華聯生物科技股份有限公司
<120> 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶反應的方法
<130> 104B0436-I1
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 1
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 2
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 4
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 5
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 6
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 7
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 8
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 9
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 10
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 11
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 12
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 13
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 14
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 15
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 16
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 17
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 18
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 19
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 22
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 24
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 25
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 26
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 27

Claims (10)

  1. 一種用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a)利用一對以上的引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)擴增(amplify)一待測核酸樣本以產生一擴增產物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入一螢光螯合染劑，且該螢光螯合染劑係為SYBR green核苷酸染料；以及(b)以一表面固定有辨識該等位基因特異性之探針(probe)的基因型鑑定晶片鑑定該擴增產物，其中該引子組包含至少四條等位基因特異性引子，其至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的正股(sense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的反股(antisense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，並於該引子組之5’端加上一修飾標記。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(a)的引子組具有接近的熔解溫度(melting temperature，Tm)值。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該待測核酸樣本係存在於選自於由血液、血清、血漿、體液及組織所組成群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因型鑑定晶片係以晶片螢光掃描儀進行檢測。
  5. 一種用於以辨識修飾標記的基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈鎖反應的方法，包含：(a)利用一對以上的引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)擴增(amplify)一待測核酸樣本以產生一第一階 段擴增產物，其中該聚合酶鏈鎖反應中加入一螢光螯合染劑，且該螢光螯合染劑係為SYBR green核苷酸染料；(b)利用5’端具有修飾標記的通用聚合酶鏈鎖反應引子(universal PCR primer)擴增該第一階段擴增產物以產生一第二階段擴增產物；以及(c)以一表面固定有辨識該等位基因特異性之探針(probe)的基因型鑑定晶片該擴增產物，其中引子組包含至少四條等位基因特異性引子，其至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的正股(sense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補，以及至少兩條等位基因特異性引子與該核酸樣本的反股(antisense strand)結合，且該等位基因特異性引子3’端終點與等位基因特異性位點互補。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該步驟(a)的引子組具有接近的熔解溫度(melting temperature，Tm)值。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該修飾標記係為螢光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，DIG)或寡核酸序列。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該待測核酸樣本係存在於選自於由血液、血清、血漿、體液及組織所組成群組。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該引子組5’端進一步加上一密碼(barcode)序列，且該探針包含該密碼序列之互補序列。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該基因型鑑定晶片係以晶片螢光掃描儀進行檢測。
TW104144049A 2015-12-28 2015-12-28 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法 TWI570242B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104144049A TWI570242B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法
CN201610152665.3A CN106916882B (zh) 2015-12-28 2016-03-17 用于辨识核苷酸基因多型性的基因型鉴定芯片的双重等位基因特异性聚合酶链锁反应的方法
US15/162,907 US10457989B2 (en) 2015-12-28 2016-05-24 Method of double allele specific PCR for SNP microarray

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104144049A TWI570242B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI570242B true TWI570242B (zh) 2017-02-11
TW201723189A TW201723189A (zh) 2017-07-01

Family

ID=58608520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104144049A TWI570242B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10457989B2 (zh)
CN (1) CN106916882B (zh)
TW (1) TWI570242B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102265417B1 (ko) * 2020-05-06 2021-06-15 김성현 단일염기다형성 다중 분석용 프라이머

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101619352A (zh) * 2009-01-23 2010-01-06 中南大学 一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104372A1 (en) * 1996-12-23 2003-06-05 Pyrosequencing Ab. Allele specific primer extension
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
CN1896284B (zh) * 2006-06-30 2013-09-11 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
US9856525B2 (en) * 2013-03-15 2018-01-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with associated targets
WO2015058194A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Allele specific pcr assay for detection of nucleotide variants
CN104894242A (zh) * 2015-05-12 2015-09-09 上海赛安生物医药科技有限公司 Mthfr基因多态性检测引物体系及其试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101619352A (zh) * 2009-01-23 2010-01-06 中南大学 一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Papp AC et al., "Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves", Biotechniques 34:1068-1072(May 2003). 謝瑞煒，以即時聚合酶鏈鎖反應篩檢單一核苷酸變異方法之研發，國立交通大學生物科技研究所碩士論文，2001年 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106916882A (zh) 2017-07-04
US10457989B2 (en) 2019-10-29
TW201723189A (zh) 2017-07-01
US20170183729A1 (en) 2017-06-29
CN106916882B (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1759011B1 (en) Detection of chromosomal disorders
JP4989493B2 (ja) 分子内プローブによる核酸配列の検出方法
US20170051343A1 (en) Strand exchange hairpin primers that give high allelic discrimination
JP2007530026A (ja) 核酸配列決定
US20160208240A1 (en) Ngs workflow
Bannai et al. Single-nucleotide-polymorphism genotyping for whole-genome-amplified samples using automated fluorescence correlation spectroscopy
CN111996244B (zh) 一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用
AU2015273186A1 (en) Improved NGS workflow
JPWO2007055255A1 (ja) 複数の識別用核酸配列を増幅する方法
TWI570242B (zh) 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法
JP5319148B2 (ja) 標的核酸中の変異の検出方法及びアレイ
CN114277108A (zh) 用于snp位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法
WO2002046393A1 (fr) Procede d&#39;identification de polymorphisme nucleotidique
JP4406366B2 (ja) 多型配列部位を有する核酸の識別方法
JP3499795B2 (ja) 遺伝子解析法
EP4155418A1 (en) Single nucleic acid for real-time detection for snp analysis of apoe gene and detection method using the same
JP6389473B2 (ja) 高解像能融解の較正の改善
US20230098408A1 (en) Single nucleic acid for real-time detection for snp analysis of apoe gene and detection method using the same
JP2018088883A (ja) 上皮成長因子受容体遺伝子変異の検出方法
KR20180033911A (ko) 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법
EP1207209A2 (en) Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms
JP4395363B2 (ja) 核酸検出方法
Otani et al. Clinical application of cytokine-related gene polymorphism analysis using a newly developed DNA chip in critically ill patients
WO2009098998A1 (ja) 核酸検出方法及び核酸検出用キット
JP2023551461A (ja) 高い特異度の標的核酸増幅方法及びこれを利用した標的核酸増幅用組成物