JP2023551461A - 高い特異度の標的核酸増幅方法及びこれを利用した標的核酸増幅用組成物 - Google Patents

高い特異度の標的核酸増幅方法及びこれを利用した標的核酸増幅用組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、非常に低い濃度の標的核酸(target nucleic acid)を高い特異度で増幅することができる標的核酸増幅方法及びこれを用いた標的核酸増幅用組成物に関し、より詳細には、標的核酸が存在する場合、標的核酸と結合したガイドプローブと、前記ガイドプローブに結合して標的核酸を増幅することができる部分プライマーを介して高い特異度で標的核酸の増幅産物(amplicon)を生成する方法及び前記方法を実施するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR；polymerase chain reaction)用組成物に関する。本発明による標的核酸増幅方法は、ガイドプローブを利用してサンプル内に存在する混成化可能な全ての核酸に結合し、部分プライマーの標的核酸検出部位への結合を助けるため、非常に低い濃度で存在する標的核酸も増幅が可能であり、また、部分プライマーの配列特異性により、標的核酸以外の核酸は増幅速度に差が発生し、標的核酸を高い特異度で検出できる利点があるので、分子診断、出生前診断、早期診断、がん診断、遺伝関連診断、遺伝型質診断、感染菌の診断、薬剤耐性菌の判別、法医学、生物の種判別などに有用である。

Description

本発明は、非常に低い濃度の標的核酸(target nucleic acid)を高い特異度で増幅することができる標的核酸増幅方法及びこれを利用した標的核酸増幅用組成物に関するものであり、より詳細には、標的核酸が存在する場合、標的核酸と結合したガイドプローブ(guide probe)と前記ガイドプローブに結合して標的核酸を増幅できる部分プライマー(partial primer)を通じて高い特異度で標的核酸の増幅産物(amplicon)を生成する方法及び前記方法を実現するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR; polymerase chain reaction)用組成物に関する。
地球上のすべての生命体が持つ遺伝情報は、各個体が持つ固有の属性の根源となり、これは核酸(DNAまたはRNA)という物質にアデニン(A; adenine)、グアニン(G; guanine)、シトシン(C; cytosine)、チミン(T; thymine)、ウラシル(U; uracil)の塩基が配列された順序で記録される。したがって、これらの塩基の順序(塩基配列)を明らかにしたり、確認することは、生命体の属性を確認し、内在された代謝機構を理解するための過程となる。
最近、生命体の特定の塩基配列を検出または確認する方法を通じて生命体の存在有無またはその属性を確認する分子診断(molecular diagnostics)法が広く活用されている。医学的に活用される分子診断の代表的な例として、人間のがん発生と関連した遺伝子変異(mutation)を検出したり、人間に発生する可能性のある感染疾患の原因病原体を検出することがあり、その他食品に存在する有害微生物を検出する検査も分子診断に属する。
特定の塩基配列を特異的に確認するための分子診断の様々な手法のうち大半は、核酸ポリメラーゼ(DNA polymerase)を利用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR; polymerase chain reaction)を利用する。前記ポリメラーゼ連鎖反応は、特定の塩基配列部位を含む標的核酸(target nucleic acid)に特異的に混成化(hybridization)することができる1対のプライマー(primer)及び前記プライマーを出発体として標的核酸を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を起こす可能性がある耐熱性(thermo-stable)核酸ポリメラーゼを含む組成物、そして前記組成物に定められた温度を段階的かつ繰り返し付与することができる装置(thermal cycler)を介して行われる。また、前記ポリメラーゼ連鎖反応を通じた分子診断は、大量に形成された(増幅された)標的核酸内の特定の塩基配列をリアルタイムで検出するために核酸結合染料(nucleic acids-binding dye)またはプローブ(probe)を活用するが、これらをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(real-time PCR)と呼ぶ。
前記の分子診断において、人間のがん発生と関連した遺伝子変異を検出することは、高い感度(sensitivity)と高い特異度(specificity)を要求する。検出しようとする変異が体細胞突然変異(somatic mutation)に属するため、変異が起きていない(wild-type)正常DNAと混ざって非常に微量存在し、正常遺伝子と塩基配列の差が大きくない部位特異的変異(point mutation)あるいは塩基配列の変異が複雑に現れる挿入/削除変異(insertion/deletion)、遺伝子融合変異(gene fusion)などで目標変異を正確に認識しないと偽陽性(false-positive)を発生させることができるからである。
すなわち、腫瘍特異的な突然変異検出検査で重要に要求される事項は、(1)正常DNAの中に低い割合で存在する突然変異DNAを検出できる感度(sensitivity)と(2)正常DNAを突然変異DNAと誤判定する偽陽性(false-positive)比率をできるだけ下げることができる特異性(specificity)を持つことである。
腫瘍特異的な突然変異を検出する様々な検査法が開発・利用されており、代表的な方法として直接塩基配列決定法(direct sequencing)、対立遺伝子特異的増幅法(allele-specific PCR; AS-PCR)、多制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)、TaqManプローブ法、ARMS(amplification refractory mutation system)PCRなどがある。しかし、これらの方法は、感度と特異度において満足できる結果を示せなかった。直接塩基配列分析法は最も特異度が高く偽陽性の割合が低いが、20～30%以上の変異DNAが存在する場合にのみ検出が可能という欠点がある。一方、AS-PCRやRFLP、TaqManプローブ法などは感度は高いが特異度が低く、偽陽性の問題を常に抱えている。
最近では、PNA(peptide nucleic acid)媒介PCRクランプ法(Sun, X., et al., 2002. Nat Biotechnol, 20: 186-189), LNA(locked nucleic acid)媒介PCRクランプ法(Dominguez, P. L., et al., 2005. Oncogene, 24: 6830-6834), COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature PCR)(Li, J..、et al., 2008. Nat. Med, 14: 579-584)といった感度と特異度が大幅に改善された方法が開発されるなど、高い特異度の塩基配列分析能力が徐々に強調されている実情である。
ARMS-PCR法は、AS-PCRの欠点である特異度を向上させる対策として開発された方法で、AS-PCRと同じようにプライマーが鋳型の配列と完璧な相補配列で構成されなければPCRが行われないという原理に基づいているが(Newton, C. R..、et al., 1989. Nucl Acids Res, 17; 2503-2516)、特異性に優れた最適なプライマーを決定するためには、実験的な試行錯誤を経なければならないという欠点がある(Drenkard, E., et al., 2000. Plant Physiol. 124: 1483-1492)。
そこで、本発明者らは、非常に低い濃度で存在する標的核酸増幅の特異度(specificity)を飛躍的に増加させる方法を開発するために鋭意努力した結果、標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(Guide probe)、前記ガイドプローブの標的核酸の混成化部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)及び前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅することができる特異的プライマー(specific primer)を利用して増幅産物を生成する方法でPCRを行う場合、非常に低い濃度の標的核酸を高い特異度で検出することができることを確認し、本発明を完成させることができた。
本背景技術部分に記載された前記情報は、あくまでも本発明の背景に対する理解を深めるためのものであり、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって既に知られている先行技術を形成する情報を含まない場合がある。
本発明の目的は、非常に低い濃度の標的核酸を高い特異度で増幅する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、非常に低い濃度の標的核酸を高い特異度で増幅することができる標的核酸増幅用ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)組成物を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、(a)検体試料から分離された核酸をi)標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(guide probe)、
ii) 前記ガイドプローブの標的核酸混成化部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)、 および
iii) 前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅できる特異的プライマー(specific primer)と混合し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行する段階、および
(b)増幅産物の存在有無を判定する段階を含む標的核酸増幅方法を提供する。
本発明はまた、i) 標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(Guide probe); ii) 前記ガイドプローブの標的核酸混成化部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)；及びiii) 前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅することができる特異的プライマー(specific primer)を含む標的核酸増幅用PCR組成物を提供する。
図1は、本発明の一実施形態に必要な構成物であるガイドプローブ(guide probe)、部分プライマー(partial primer)、特異的プライマー(specific primer)及び構成物間の混成化関係を示す。
図2は、本発明を通じて標的核酸と非標的核酸の塩基配列の違いによる増幅効率の差を最大化する原理を示すもので、(a)は、本発明の部分プライマーが標的核酸と混成化する部分の長さが短いため、塩基配列の不一致(mismatch)による混成化効率の差が大きく、これにより、正常DNAと変異DNA間の増幅効率の差を最大化できることを示し、(b)は、通常のプライマーが標的核酸と混成化する部分の長さが長く、塩基配列不一致による混成化効率の差が小さく、これにより正常DNAと変異DNA間の区別が困難であることを示す。
図3は、本発明を通じて標的核酸と非標的核酸の塩基配列の違いによる増幅効率の差を引き出す過程を示すもので、(a)は、標的核酸の存在時に前記標的核酸の特定の部位と混成化するガイドプローブにより前記ガイドプローブの一部と混成化する部分プライマーが標的核酸の目標増幅部位に近接すると、部分プライマーの3'末端部位の一部が前記標的核酸の標的増幅部位の塩基配列と相補的であるため、混成化及び伸長増幅が起こることを示し、この時、ガイドプローブと標的核酸及びガイドプローブと部分プライマーの結合はTmが高いため、先に混成化することになる、部分プライマーと標的核酸の結合は相補的な配列長が短いためTmが低いため、後で混成化することになる、(b)は、前記標的核酸と一部の塩基配列が異なる非標的核酸の存在時、前記ガイドプローブが前記非標的核酸の特定の部位と混成化され、前記ガイドプローブの一部と混成化される部分プライマーが非標的核酸に近接しても、前記部分プライマーの3'末端部位の一部と前記非標的核酸の塩基配列間の相補性が低く、混成化及び伸長増幅が抑制されることを示す。
図4は、本発明の一実施例により特定の変異体を野生型と区別して検出する方法を示す概念図である。
図5は、本発明の一実施例により高い特異度でヒト遺伝体内のBRAF遺伝子のV600E変異(mutation)を検出した結果を示すもので、3'末端の一部がV600E変異の遺伝子型(genotype)と混成化するように製作された部分プライマーを利用する場合、V600E変異の存在時に高い増幅効率を示し、比較的低いCt値が算出される一方、野生型(wild-type)及び非標的変異体(V600A、V600D、V600G、V600K、V600M、V600R、K601E)が存在する場合は、低い増幅効率を示し、比較的高いCt値が算出され、結果としてCt値の比較を通じてV600E変異の存在有無を判断することができる。
図6は、本発明の一実施例により、高感度でヒト遺伝子内のKRAS遺伝子のG12C変異を検出した結果を示すもので、3'末端の一部がG12C変異の遺伝子型と混成化するように製作された部分プライマーを利用する場合、極少量(1%及び0.5%)のG12C突然変異が存在する場合、高い増幅効率が現れ、比較的低いCt値が算出される一方、野生型のみ存在する場合は増幅曲線が形成されず、結果としてCt値の比較を通じてG12C突然変異の有無を判断することができる。
図7は、本発明の一実施例により、ヒト遺伝子内のMET遺伝子のD1002N、D1002G、Y1003F、Y1003N、Y1003*(1)、Y1003*(2)変異を単一反応液内で検出した結果を示すもので、3'末端の一部がD1002N、D1002G、Y1003F、Y1003N、Y1003*(1)、Y1003*(2)変異遺伝型と混成化するように6種の部分プライマーをそれぞれ製作・混合して使用した場合、標的変異の存在時、高い増幅効率が現れ、比較的低いCt値が算出される一方、野生型だけが存在する場合は、低い増幅効率が現れ、比較的高いCt値が算出され、結果としてCt値の比較を通じて標的変異の有無を判断することができる。
図8は、本発明の誘導プローブに含まれるリンカーの例である。
図9は、本発明の一実施例により、ヒト遺伝体内のKRAS遺伝子のG12C変異を検出できる検出限界を測定した結果で、標的変異核酸が反応当たり約0.5%(20 copy)だけ存在しても検出できる水準の非常に高い感度と共に、特異性にも優れていることを確認した結果である。
発明の詳細な説明及び好ましい実施形態
他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
本発明では、非常に低い濃度の標的核酸をガイドプローブと部分プライマーを用いて検出できるかを確認しようとした。
すなわち、本発明の一実施例では、ヒトBRAF遺伝子のexon 15、codon 600に位置するGTG>GAG塩基配列変異であるV600E変異を特異的に増幅及び検出するために、BRAF遺伝子のcodon 600周辺部位に特異的に混成化できるガイドプローブ、V600E変異が起きたBRAF遺伝子のcodon 600及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー、前記部分プライマーと対(pair)を成して標的核酸を増幅できるようにBRAF遺伝子のexon 15塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマーを設計し、この時、前記ガイドプローブのC末端の一部塩基配列と前記部分プライマーの5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。
野生型核酸およびV600位置に存在する様々な変異体の存在下において前記V600Eを検出できるか、前記ガイドプローブ、部分プライマーおよび特異的プライマーを用いてPCRを実施した。
その結果、すべての標的核酸注入条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察されたが、他の条件に比べてV600E変異標的核酸が混合された条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇がより速く現れ、より低いCt値が算出されることを確認した(図5)。
したがって、本発明は、一観点から、(a)検体試料から分離された核酸をi)標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)することができるガイドプローブ(guide probe)、
ii) 前記ガイドプローブの標的核酸混成部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)、 および
iii) 前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅できる特異的プライマー(specific primer)と混合し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行する段階、および
(b)増幅産物の存在有無を判定する段階を含む標的核酸増幅方法に関する。
本発明において用語「標的核酸(target nucleic acid)」は、増幅(amplification)あるいは検出しようとする関心配列を含むあらゆる種類の核酸を意味する。前記標的核酸は、複数の種(species)、亜種(subspecies)、または変種(variant)由来の遺伝子塩基配列または同一種内の遺伝子変異を含み、これはgenomic DNAとmitochondrial DNA、viral DNAを含むすべての種類のDNAまたはmRNA、ribosomal RNA、non-coding RNA、tRNA、viral RNAなどを含むすべての種類のRNAを特徴とするが、これに限定されない。標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応のための条件下で、ガイドプローブ、部分プライマー(3'末端の一部)、特異的プライマーと混成化されることがある。
本発明において用語「混成化(hybridization)」は、相補的な塩基配列を持つ単鎖核酸同士の水素結合によって二本鎖核酸が形成されることを意味し、アニーリング(annealing)と同様の意味で使用される。ただ、さらに広い意味で、混成化は二つの一本鎖間の塩基配列が完全に相補的な場合(perfect match)と共に、例外的に一部の塩基配列が相補的でない場合(mismatch)まで含む。
本発明において用語「ガイドプローブ(guide probe)」は、標的核酸及び部分プライマーと同時に混成化することができ、部分プライマーの3'末端が標的核酸の標的塩基配列と混成化することができるようにすることを特徴とする。前記ガイドプローブは、標的核酸と混成化できるすべての素材(例えば、DNA、RNA、LNA(locked nucleic acid)、PNA(peptide nucleic acid)など)のいずれか一つまたは二つ以上の混合で製造することができる。
本発明において用語「部分プライマー(partial primer)」は、5'末端部位の一部がガイドプローブと混成化され、3'末端部位が標的核酸の標的塩基配列と混成化され、核酸ポリメラーゼ(nucleic acid polymerase)による合成伸長(extension)が行われることを特徴とする。
本発明の好ましい実施形態では、前記標的核酸、ガイドプローブ、部分プライマーは、相互に混成化(標的核酸とガイドプローブ、ガイドプローブと部分プライマー、部分プライマーと標的核酸)される。ガイドプローブが標的核酸の標的塩基配列の周辺に結合しながら、同時に混成化されている部分プライマーが前記標的塩基配列の周辺に位置するようにし、これにより部分プライマーの3'末端が前記標的塩基配列により容易に混成化され、核酸ポリメラーゼによる合成伸長及び標的核酸の標的部位増幅が開始される。
標的核酸とガイドプローブ及びガイドプローブと部分プライマー間の混成は、互いに相補的な部分が部分プライマーと標的核酸に比べて長いためTmが高いため先に混成化され、部分プライマーと標的核酸は、比較的Tmが低いため後に混成化される。
本発明において、用語「特異的プライマー(specific primer)」は、前記ガイドプローブの助けを借りずに標的核酸に混成化され、核酸ポリメラーゼによる合成伸長が行われることを特徴とする。
本発明において、前記ガイドプローブで標的核酸と混成化する部位は、5'末端またはN末端に存在し、部分プライマーと混成化する部位は3'末端またはC末端に存在することを特徴とする。
本発明において、前記ガイドプローブは、標的核酸混成化部位と部分プライマー混成化部位の間にリンカーをさらに含むことを特徴とする。
本発明において、前記リンカーは、標的核酸混成化部位と部分プライマー混成化部位の間に存在し、二つの部位を連結する核酸塩基を含まない化合物であれば制限なく利用可能であり、好ましくはベータアラニン(β-Ala-OH、C3)、 アミノ酪酸(aminobutyric acid、C4)、アミノヘキサノ酸(aminohexanoic acid、 C6)、アミノラウリン酸(aminolauric acid、C12)、アセトアセトキシエチルアクリレート(acetoacetoxyethyl acrylate、AAEA(O-linker))、アミノエトキシエトキシエトキシ酢酸(2-[2-[2-[2-(amino)ethoxy]ethoxy]ethoxy]acetic acid、AEEEA)、AEEEEA、DL15及びL35で構成される群から選択される1種以上を特徴とするが、これらに限定されない。
本発明において、前記ガイドプローブ、部分プライマーおよび特異的プライマーは、オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、LNA(locked nucleic acid)およびPNA(peptide nucleic acid)のいずれかまたはこれらの混合物からなることを特徴とする。
本発明において、前記ガイドプローブは、標的核酸及び部分プライマーと混成化できる核酸であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、10ないし500の塩基配列の長さで製作されたPNAであってよく、さらに好ましくは、20ないし150の塩基配列の長さで製作されたPNAであることを特徴とする。
本発明において、前記ガイドプローブは、特異的プライマーが混成化する標的核酸の反対側の鎖に混成化することを特徴とする。
本発明において、前記部分プライマーは、ガイドプローブの標的核酸混成部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列の間に、1ないし100の塩基配列の長さで製作された一本鎖(single strand)オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)であるスペーサー(spacer)をさらに含むことを特徴とする。
本発明において前記スペーサーは、部分プライマーに含まれているガイドプローブに混成化する配列と標的核酸に混成化する配列を除いた配列を意味し、必要に応じて前記スペーサーに結合可能なプローブを利用して標的核酸塩基配列が変更されても同じプローブで検出を行うように機能することができる。
本発明において、前記スペーサーと前記ガイドプローブのリンカーは、ガイドプローブによって標的核酸の標的部位の周辺に位置する部分プライマーが標的部位に混成化する効率を調節する役割を果たすことができる。これは、ガイドプローブが前記標的部位と少し遠い位置の標的核酸に混成化される場合、前記スペーサーとリンカーの長さを増加させると、部分プライマーが標的部位に混成化されるのを助けることができることを意味する。
本発明において、前記部分プライマーの標的核酸検出部位と結合する配列は、3ないし15の塩基配列であることを特徴とする。
本発明において、前記増幅産物の長さは50bpないし1kbpであることを特徴とする。
本発明において、前記(b)段階の増幅産物の存在有無を判定する段階は、前記増幅産物に結合可能な核酸結合染料(nucleic acids-binding dye)またはプローブ(probe)を使用することを特徴とする。
本発明において、前記核酸結合染料は、インターカレーティング(intercalating)物質またはDNAマイナーグルーブ(minor groove)結合物質であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、エチジウムブロミド(Ethidium bromide)である、サイバーグリーン1(SYBR（登録商標） Green I)、サイバーグリーンゴールド(SYBR（登録商標）Gold)、エヴァグリーン(EvaGreen)、ヨプロ-1(YO-PRO-1)、サイトー(SYTO)、ベボ(BEBO)及びベクスト(BEXTO)で構成される群から選択されることを特徴とする。
本発明において、前記増幅産物に結合可能なプローブは、オリゴヌクレオチド、LNA、PNA及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする。
PNA(Peptide nucleic acid、ペプチド核酸)は、核酸塩基が糖リン酸骨格ではなくペプチド骨格に連結された類似DNAで、1991年にNielsenらによって初めて合成された。PNAは、LNA(Locked nucleic acid)またはMNA(Mopholino nucleic acid)など人工的に合成された遺伝子認識物質の一つで、基本骨格がポリアミド(polyamide)で構成されている。
PNAは、親和性(affinity)と選択性(selectivity)が非常に優れており、核酸分解酵素に対する安定性が高く、現存する制限酵素(restriction enzyme)で分解されない。また、熱/化学的な安定性が高く、長期保存が容易な利点がある。
PNAは、相補的な塩基配列の天然核酸との混成化(hybridization)反応を通じて二本鎖を形成する。長さが同じ場合、PNA/DNA二重鎖は、DNA/DNA二重鎖よりも、PNA/RNA二重鎖はDNA/RNA二重鎖よりも安定である。また、PNAは、単一塩基不一致(single base mismatch)のために二重鎖が不安定になる程度が大きいため、SNP(single nucleotide polymorphism)を検出する能力が天然核酸より優れている。
つまり、PNA-DNA結合力がDNA-DNA結合力より非常に優れており、1つのヌクレオチド不一致(nucleotide mismatch)でも融解温度(Tm)値が通常15~20℃程度異なる。このような結合力の違いを利用して、SNP(single-nucleotide polymorphism)やIn/Del(insertion/deletion)などの塩基配列の変化を検出することができるようになる。
本発明において、増幅産物に結合可能なプローブは、増幅産物内の任意の塩基配列および標的核酸塩基配列と部分的または全体的に相補的な塩基配列を有することを特徴とし、好ましくは両末端にレポーター(reporter)と消光子(quencher)が接続されていることを特徴とする。
本発明において前記プローブは、レポーターと消光子間の距離が近い時は信号発生が抑制され、レポーターと消光子間の距離が遠くなるにつれて信号の強度が増加する。一般的に、前記プローブが相補的な塩基配列と混成化したときに、レポーターと消光子間の距離が最も遠くなるため、信号発生または信号強度の増加を通じて特定の塩基配列を検出することができる。
本発明において、前記レポーターは、フルオレシン(fluorescein)、フルオレシンクロロトリアジニル(fluorescein chlorotriazinyl)、ローダミングリーン(rodamine green)、ローダミンレッド(rodamine red)、テトラメチルローダミン(tetramethylrhodamine)、FITC、オレゴングリーン(Oregon green)、Alexa Fluor、FAM、JOE、ROX、HEX、Texas Red、TET、TRITC、TAMRA、シアニン(Cyanine)系染料及びチアジカルボシアニン(thiadicarbocyanine)染料で構成される群から選択される1種以上の蛍光物質であることを特徴とする。
本発明において、前記消光子は、ダブシル(Dabcyl)、タムラ(TAMRA)、エクリプス(Eclipse)、DDQ、QSY、ブラックベリークエンチャー(Blackberry Quencher)、ブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher)、Qxl、アイオワブラック(Iowa black)FQ、アイオワブラックRQおよびIRDye QC-1で構成される群から選択される1つ以上であることを特徴とする。
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸ポリメラーゼによる増幅産物の検出は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(real-time PCR)を通じて行われ、この時、増幅産物の増加による増幅曲線(amplification curve)を取得してCt(cycle threshold)値を測定する方法で行うことができるが、これに限定されない。前記Ct値を利用する方式の場合、試料内の標的核酸に標的塩基配列が存在し、増幅産物が早く生成及び増加するほど、検出プローブによる信号発生量が早く増加し、thresholdに達するcycle数が減り、Ct値が少なく測定される原理を利用する。
本発明は別の観点から、i) 標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(guide probe)、ii)前記ガイドプローブの標的核酸混成化部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)、及びiii)前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅することができる特異的プライマー(specific primer)を含む標的核酸増幅用PCR組成物に関する。
本発明における「試料」は、様々な試料を含み、好ましくは、本発明の方法を用いて生物試料(biological sample)を分析する。より好ましくは、ウイルス種(species)と混合された試料であったり、前記ウイルスに感染した個体(例えば、ヒト、哺乳類及び魚類など)の試料であってよく、植物、動物、ヒト、菌類、細菌及びウイルス起源の生物試料を分析することができる。哺乳類またはヒト由来の試料を分析する場合、前記試料は、特定の組織または臓器に由来する。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉または神経組織が含まれる。臓器の代表的な例としては、目、脳、肺、肝臓、脾臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺および内部血管が含まれる。分析される生物試料は、生物学的根源からの任意の細胞、組織、流体、または本発明によってよく分析される任意の他の媒体(medium)も含み、これには、ヒト、動物、ヒトまたは動物の消費のために製造された食品から得られた試料が含まれる。さらに、分析される生体試料は、体液資料を含み、これには血液、血清、血漿、リンパ液、母乳、尿、糞便、眼乳液、唾液、精液、脳抽出物(例えば、脳破砕物)、脊髄液、虫垂、脾臓および扁桃腺組織抽出物を含むが、これらに限定されない。
本発明は、別の観点から、前記組成物を含む標的核酸検出用キットに関する。
本発明において、前記キットは、バッファ(buffer)、DNAポリメラーゼ(DNA polymerase)、DNAポリメラーゼコファクター(DNA polymerase cofactor)及びデオキシリボヌクレオチド-5-トリポリリン酸(dNTP)などの標的核酸増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、また様々なオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)分子、逆転写酵素(reverse transcriptase)、様々な緩衝液及び試薬、及びDNAポリメラーゼ活性を阻害する抗体を含むことができる。また、前記キットの特定の反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者によって容易に決定することができる。典型的には、本発明の装置は、前述の構成成分を含む別途のパッケージまたはコンパートメント(compartment)で製作することができる。
一実施形態において、前記キットは、サンプルを保持する区画されたキャリア手段、試薬を含む容器、ガイドプローブおよびプライマーを含む容器、および前記増幅産物を検出するためのプローブを含む容器を含むことができる。
前記キャリア手段は、ボトル、チューブなど1つ以上の容器を含むのに適しており、各容器は、本発明の方法で使用される独立した構成要素を含む。本発明の明細書において、当該分野における通常の知識を有する者は、容器内の必要な製剤を容易に分配することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、もっぱら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないことは、通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１ ヒト遺伝子内のV600E変異が発生したBRAF遺伝子の増幅及び検出
1.1 プライマー及びプローブの製作
ヒトBRAF遺伝子は、体内シグナル伝達系で機能する成長シグナル伝達タンパク質キナーゼ(growth signal transduction protein kinase)を暗号化しており、BRAF遺伝子の特定の変異は、がん発生と関係していることが知られている(Zaman, A. et al., 2019. Cancers 11:1197.)。前記ヒトBRAF遺伝子のexon 15、codon 600に位置するGTG>GAG塩基配列変異をV600E変異と呼ぶ。
本発明の新規な標的核酸増幅方法を通じて前記BRAF遺伝子のV600E変異を特異的に増幅して検出するために、BRAF遺伝子のcodon 600周辺部位に特異的に混成化できるガイドプローブ1、V600E変異が起きたBRAF遺伝子のcodon 600及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー1、前記部分プライマー1と対(pair)を成して標的核酸を増幅できるようにBRAF遺伝子のexon 15塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマー1を設計し、この時、前記ガイドプローブ1のC末端の一部塩基配列と前記部分プライマー1の5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。また、設計されたガイドプローブ及びプライマーを通じて増幅される産物を検出できるように検出プローブ1を設計して製造した(PANAGENE Inc., South Korea)。各プライマー及びプローブの塩基配列を表1と表2に開示した。
Figure 2023551461000002
Figure 2023551461000003
前記部分プライマー1は、24塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示された塩基配列はガイドプローブ1の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示された塩基配列は、V600E変異が発生したBRAF遺伝子のcodon 600及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記ガイドプローブ1は、25塩基配列の長さのPNAで製作し、イタリック体で示された塩基配列は、BRAF遺伝子のcodon 600周辺部位の塩基配列と相補的であり、下線で示された塩基配列は、前記部分プライマー1の塩基配列の一部と相補的な特徴を持つ。また、前記ガイドプローブ1のN末端には[K(lysine)]が付着しており、前記BRAF遺伝子の配列と相補的な部位及び部分プライマー1の配列の一部と相補的な部位の間にメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)のL35 linkerが接続されるようにした。
前記検出プローブ1は、15塩基配列の長さのPNAで製作し、N末端には消光子(quencher)である[Dabcyl]が、C末端にはレポーター(reporter)である[FAM]がそれぞれ取り付けられており、PNAと[FAM]の間にはメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)の[O linker]及び[K(lysine)]が接続されるように製作した。前記検出プローブ1は、相補的な塩基配列を持つ増幅産物に混成化されるとき、前記消光子とレポーターが最も遠い距離になり、このときレポーターからの信号(蛍光)値が最大となり、前記信号を測定することで増幅産物を検出することができる。
前記部分プライマー1は、BRAF遺伝子内の標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列の長さが10に過ぎないため、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で単独で前記標的部位に混成化することが難しく、ただ、前記標的部位の周辺に混成化するガイドプローブ1が存在する場合、前記ガイドプローブ1の塩基配列の一部と部分プライマー1の塩基配列の一部が混成化して容易に前記標的部位に混成化することができる。
前記部分プライマー1は、BRAF遺伝子の標的核酸塩基配列と混成化可能な塩基配列の長さが10に過ぎず、これは標的核酸と混成化可能な塩基配列の長さが18～30の通常のプライマーより短い。したがって、もし部分プライマー1と前記標的核酸混成化部位の間に1つ以上の相補的でない(mismatch)塩基配列が存在する場合、前記相補的でない塩基配列が混成化効率に及ぼす影響が通常のプライマーより大きくなり、結果として通常のプライマーより塩基配列の微細な変化をよりよく検出することができる。
1.2 増幅産物の生成及び確認
約10,000個(copy)の野生型(wild-type)BRAF遺伝子標的核酸が存在する条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600E変異したBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600A(codon 600 GTG>GCG)変異したBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600D(codon 600 GTG>GAT)変異が起こったBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600G(codon 600 GTG>GGG)変異が起こったBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600K(codon 600 GTG>AAG)変異したBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600M(codon 600 GTG>ATG)変異したBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のV600R(codon 600 GTG>AGG)変異したBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型BRAF遺伝子標的核酸と約500個のK601E(codon 601 AAA>GAA)変異が起こったBRAF遺伝子標的核酸が混合された条件で前記意図した増幅産物を形成するように、20 pmoleのガイドプローブ1と10 pmoleの部分プライマー1、4 pmoleの特異的プライマー1、3 pmoleの検出プローブ1を含むポリメラーゼ連鎖反応用組成物を製造した。
前記ポリメラーゼ連鎖反応用組成物には、通常、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される核酸ポリメラーゼ(DNA polymerase)と共に、緩衝液(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリポリリン酸塩(dNTP)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
ポリメラーゼ連鎖反応のための温度調節は、一般的なthermal cyclerを通じて行われ、initial denaturation[95℃、5分]の後、15 cycleの第1段階であるdenaturation[95℃、20秒] - annealing[63℃、20秒] - extension[72℃、20秒]を経て、50 cycleの第2段階であるdenaturation[95℃、20秒] - measure[50℃、30秒] - annealing & extension[60℃、1分]で行った。前記第2段階のmeasure stepで、毎cycleごとにFAM channelの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
その結果、すべての標的核酸注入条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察されたが、他の条件に比べてV600E変異標的核酸が混合された条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇がより速く現れ、より低いCt値が算出された。 すなわち、V600E変異標的核酸が混合された条件において平均22.5のCt値が観察された一方、野生型のみ存在する場合、あるいは非標的変異(V600A、V600D、V600G、V600K、V600M、V600R、K601E)標的核酸が混合された条件では、平均29以上のCt値が観察され、結果的にCt値の差を通じてV600E変異のみを特異的に確認することができた(図5)。
実施例２ ヒト遺伝子内のG12C変異が発生したKRAS遺伝子の高感度増幅及び検出
2.1 プライマー及びプローブの製作
ヒトKRAS遺伝子は、体内シグナル伝達系で機能するGTPベースのスイッチ(switch)タンパク質を暗号化しており、KRAS遺伝子の特定の変異は、がん発生と関係していると言われている(Waters, A. M. and Der, C. J. 2018. Cold Spring Harb. Perspect. Med.8:a031435.)。前記ヒトKRAS遺伝子のexon 2、codon 12に位置するGGT>TGT塩基配列の変異をG12C変異と呼ぶ。
本発明の新規な標的核酸増幅方法を通じて前記KRAS遺伝子のG12C変異を特異的に増幅して検出するために、KRAS遺伝子のcodon 12周辺部位に特異的に混成化できるガイドプローブ2、G12C変異が起きたKRAS遺伝子のcodon 12及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー2、前記部分プライマー2と対(pair)を成して標的核酸を増幅できるようにKRAS遺伝子のexon 2塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマー2を設計し、この時、前記ガイドプローブ2のC末端の一部塩基配列と前記部分プライマー2の5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。また、設計されたガイドプローブ及びプライマーを通じて増幅される産物を検出できるように検出プローブ2を設計して製造した(PANAGENE Inc., South Korea)。各プライマー及びプローブの塩基配列を表3と表4に開示した。
Figure 2023551461000004
Figure 2023551461000005
前記部分プライマー2は、18塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列は、ガイドプローブ2の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列は、G12C変異が発生したKRAS遺伝子のcodon 12及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記ガイドプローブ2は、24塩基配列の長さのPNAで製作し、イタリック体で示された塩基配列は、KRAS遺伝子のcodon 12周辺部位の塩基配列と相補的であり、下線で示された塩基配列は、前記部分プライマー2の塩基配列の一部と相補的な特徴を持つ。また、前記ガイドプローブ2のN末端には、[K(lysine)]が付着しており、前記KRAS遺伝子の配列と相補的な部位及び部分プライマー2の配列の一部と相補的な部位の間にメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)のL35 linkerが接続されるようにした。
前記検出プローブ2は、12塩基配列の長さのPNAで製作し、N末端には消光子(quencher)である[Dabcyl]が、C末端にはレポーター(reporter)である[FAM]がそれぞれ取り付けられており、PNAと[FAM]の間にはメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)の[O linker]及び[K(lysine)]が接続されるように製作した。前記検出プローブ2は、相補的な塩基配列を持つ増幅産物に混成化されるとき、前記消光子とレポーターが最も遠い距離になり、このときレポーターからの信号(蛍光)値が最大となり、前記信号を測定することで増幅産物を検出することができる。
前記部分プライマー2は、KRAS遺伝子内の標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列の長さが8に過ぎず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で単独で前記標的部位に混成化することが難しく、ただ、前記標的部位の周辺に混成化するガイドプローブ2が存在する場合、前記ガイドプローブ2の塩基配列の一部と部分プライマー2の塩基配列の一部が混成化して容易に前記標的部位に混成化することができる。
前記部分プライマー2は、KRAS遺伝子の標的核酸塩基配列と混成化可能な塩基配列の長さが8に過ぎず、これは標的核酸と混成化可能な塩基配列の長さが18～30個の通常のプライマーより短い。したがって、もし部分プライマー2と前記標的核酸混成化部位の間に1つ以上の相補的でない(mismatch)塩基配列が存在する場合、前記相補的でない塩基配列が混成化効率に及ぼす影響が通常のプライマーより大きくなり、結果として通常のプライマーより塩基配列の微細な変化をよりよく検出することができる。
2.2 増幅産物の生成と確認
約10,000個(copy)の野生型(wild-type)KRAS遺伝子標的核酸が存在する条件、または約10,000個の野生型KRAS遺伝子標的核酸と約100個のG12C変異が起きたKRAS遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型KRAS遺伝子標的核酸と約50個のG12C変異が起きたKRAS遺伝子標的核酸が混合された条件で、前記意図した増幅産物を形成するように、20 pmoleのガイドプローブ2と10 pmoleの部分プライマー2、4 pmoleの特異的プライマー2、3 pmoleの検出プローブ2を含むポリメラーゼ連鎖反応用組成物を製造した。
前記ポリメラーゼ連鎖反応用組成物には、通常、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される核酸ポリメラーゼ(DNA polymerase)と共に、緩衝液(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリポリリン酸塩(dNTP)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
ポリメラーゼ連鎖反応のための温度調節は一般的なthermal cyclerを通じて行われ、initial denaturation[95℃、5分]の後、15 cycleの第1段階であるdenaturation[95℃、20秒] - annealing[63℃、20秒] - extension[72℃、20秒]を経て、35 cycleの第2段階であるdenaturation[95℃、10秒] - measure[50℃、10秒] - denaturation[95℃、20秒] - annealing[58℃、20秒] - extension[72℃、20秒]で行った。前記第2段階のmeasure stepで毎cycleごとにFAM channelの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
その結果、G12C変異が発生したKRAS標的核酸が混合されたすべての条件で増幅曲線上の蛍光信号の上昇が明確に観察される一方、野生型KRAS標的核酸のみが存在する条件では増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察されないか、非常に弱く観察された。すなわち、G12C変異標的核酸が約100個または約50個混合された条件でそれぞれ平均12.4および平均13.6のCt値が観察される一方、野生型のみ存在する条件ではCt値が算出されず(ND; not determined)、結果的にCt値の差を通じて非常に微量に存在するG12C変異を特異的に確認することができた(図6)。
実施例３ ヒト遺伝子内のD1002N、D1002G、Y1003F、Y1003N、Y1003*変異が発生したMET遺伝子の増幅及び検出
3.1 プライマー及びプローブの製作
ヒトMET遺伝子は、c-Met遺伝子とも呼ばれ、体内シグナル伝達系で機能する肝細胞成長因子受容体(hepatocyte growth factor receptor)を暗号化しており、MET遺伝子の特定の変異及び発現調節障害はがん発生と関係していることが知られている(Sierra, J. R. and Tsao, M.-S. 2011. Ther. Adv. Med. Oncol. 3:S21-S35.)。前記ヒトMET遺伝子のexon 14、codon 1002に位置するGAC>AAC塩基配列変異をD1002N変異として、exon 14 codon 1002に位置するGAC>GGC塩基配列変異をD1002G変異として、exon 14 codon 1003に位置するTAC>TTC塩基配列変異をTTC配列変異をY1003F変異、exon 14 codon 1003に位置するTAC>AAC配列変異をY1003N変異、exon 14 codon 1003に位置するTAC>TAGまたはTAC>TAA配列変異をそれぞれY1003*(1)とY1003*(2)変異と呼ぶ。
本発明の新規な標的核酸増幅方法により、前記MET遺伝子のD1002N、D1002G、Y1003F、Y1003N、Y1003*(1)、Y1003*(2)変異を一つの反応液組成で特異的に増幅して検出するために、MET遺伝子のcodon 1002及びcodon 1003周辺部位に特異的に混成化することができるガイドプローブ3、D1002N変異が起こったMET遺伝子のcodon 1002及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー3、D1002G変異が起こったMET遺伝子のcodon 1002及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー4、Y1003F変異が起こったMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー5、Y1003N変異が起こったMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー6、Y1003*(1)変異が起こったMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー7、Y1003*(2)変異が起こったMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー8、前記部分プライマー3、4、5、6、7、8と対(pair)を成して標的核酸を増幅できるようにMET遺伝子のexon 14周辺の塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマー3を設計し、この時、前記ガイドプローブ3のC末端の一部塩基配列と前記部分プライマー3、4、5、6、7、8の5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。また、設計されたガイドプローブ及びプライマーを通して増幅される産物を検出できるように検出プローブ3を設計して製造した(PANAGENE Inc., South Korea)。各プライマー及びプローブの塩基配列を表5と表6に開示した。
Figure 2023551461000006
Figure 2023551461000007
前記部分プライマー3は、23塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はD1002N変異が発生したMET遺伝子のcodon 1002及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー4は、22塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はD1002G変異が発生したMET遺伝子のcodon 1002及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー5は、23塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はY1003F変異が発生したMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー6は、23塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はY1003N変異が発生したMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー7は、23塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はY1003*(1)変異が発生したMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー8は、23塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ3の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はY1003*(2)変異が発生したMET遺伝子のcodon 1003及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記ガイドプローブ3は、25塩基配列の長さのPNAで製作し、イタリック体で示された塩基配列はMET遺伝子のcodon 1002及びcodon 1003周辺部位の塩基配列と相補的であり、下線で示された塩基配列は前記部分プライマー3、4、5、6、7、8の塩基配列の一部と相補的な特徴を持つ。また、前記ガイドプローブ3のN末端には[K(lysine)]が付着しており、前記MET遺伝子配列と相補的な部位及び部分プライマー3、4、5、6、7、8の塩基配列の一部と相補的な部位の間にメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)のL35 linkerが接続されるようにした。
前記検出プローブ3は、11塩基配列の長さのPNAで製作し、N末端には消光子(quencher)である[Dabcyl]が、C末端にはレポーター(reporter)である[FAM]がそれぞれ取り付けられており、PNAと[FAM]の間にはメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)の[O linker]及び[K(lysine)]が接続されるように製作した。前記検出プローブ3は、相補的な塩基配列を持つ増幅産物に混成化されるとき、前記消光子とレポーターが最も遠い距離になり、このときレポーターからの信号(蛍光)値が最大となり、前記信号を測定することで増幅産物を検出することができる。
前記部分プライマー3、4、5、6、7、8は、MET遺伝子内の標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列の長さが8ないし9に過ぎず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で単独で前記標的部位に混成化されることが困難であり、ただ、前記標的部位の周辺に混成化されるガイドプローブ3が存在する場合、前記ガイドプローブ3の塩基配列の一部と部分プライマー3、4、5、6、7、8の塩基配列の一部が混成化され、容易に前記標的部位に混成化することができる。
前記部分プライマー3、4、5、6、7、8は、MET遺伝子の標的核酸塩基配列と混成化可能な塩基配列の長さが8～9に過ぎず、これは標的核酸と混成化可能な塩基配列の長さが18～30個の通常のプライマーより短い。したがって、もし部分プライマー3、4、5、6、7、8と前記標的核酸混成化部位の間に1つ以上の相補的でない(mismatch)塩基配列が存在する場合、前記相補的でない塩基配列が混成化効率に及ぼす影響が通常のプライマーより大きくなり、結果として通常のプライマーより塩基配列の微細な変化をよりよく検出することができる。
3.2 増幅産物の生成及び確認
約10,000個(copy)の野生型(wild-type)MET遺伝子標的核酸が存在する条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のD1002N変異が起こったMET遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のD1002G変異したMET遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のY1003F変異が起こったMET遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のY1003N変異が起こったMET遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のY1003*(1)変異が起こったMET遺伝子標的核酸が混合された条件、または約10,000個の野生型MET遺伝子標的核酸と約500個のY1003*(2)変異が起こったMET遺伝子標的核酸が混合された条件で前記意図した増幅産物を形成するように30 pmoleのガイドプローブ3と8 pmoleの部分プライマー3、4 pmoleの部分プライマー4、4 pmoleの部分プライマー5、4 pmoleの部分プライマー6、4 pmoleの部分プライマー7、4 pmoleの部分プライマー8、3 pmoleの特異的プライマー3、2 pmoleの検出プローブ3を含むポリメラーゼ連鎖反応用組成物を製造した。
前記ポリメラーゼ連鎖反応用組成物には、通常、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される核酸ポリメラーゼ(DNA polymerase)と共に、緩衝液(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリポリリン酸塩(dNTP)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
ポリメラーゼ連鎖反応のための温度調節は、一般的なthermal cyclerを通じて行われ、initial denaturation[95℃、5分]の後、15 cycleの第1段階であるdenaturation[95℃、20秒] - annealing[63℃、20秒] - extension[72℃、20秒]を経て、35 cycleの第2段階であるdenaturation[95℃、10秒] - measure[50℃、10秒] - denaturation[95℃、20秒] - annealing[58℃、20秒] - extension[72℃、20秒]で行った。前記第2段階のmeasure stepで毎cycleごとにFAM channelの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
その結果、すべての標的核酸注入条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察されたが、野生型MET遺伝子標的核酸のみを注入した条件に比べて、D1002N、D1002G、Y1003F、Y1003N、Y1003*(1)、Y1003*(2)変異標的核酸が混合されたそれぞれの条件において増幅曲線上の蛍光信号の上昇がより速く現れ、より低いCt値が算出された。すなわち、D1002N変異標的核酸が混合された条件で平均19.9のCt値が、D1002G変異標的核酸が混合された条件で平均18.6のCt値が、Y1003F変異標的核酸が混合された条件で平均21.2のCt値が、Y1003N変異標的核酸が混合された条件で平均17.5のCt値が、Y1003*(1)変異標的核酸が混合された条件で平均17.5のCt値が、Y1003*(2)変異標的核酸が混合された条件で平均20.6のCt値が観察された一方、野生型標的核酸だけが存在する条件では平均28.0のCt値が観察され、結果としてCt値の差を利用して検出しようとしたすべての変異体を一つの反応液組成を通じて特異的に確認することができた(図7)。
実施例４ ヒト遺伝子内のG12C変異が発生したKRAS遺伝子の検出限界の確認
4.1 プライマー及びプローブの製作
本発明の新規な標的核酸増幅方法により、ヒトKRAS遺伝子のexon 2、codon 12に位置するG12C変異(GGT>TGT塩基配列変異)を特異的に増幅して検出するためにTGT塩基配列の変異)を特異的に増幅して検出するために、KRAS遺伝子のcodon 12周辺部位に特異的に混成化できるガイドプローブ4、G12C変異が起きたKRAS遺伝子のcodon 12及び周辺部位に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー2、前記部分プライマー2と対(pair)を成して標的核酸を増幅できるようにKRAS遺伝子のexon 2塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマー2を設計し、この時、前記ガイドプローブ4のC末端の一部塩基配列と前記部分プライマー2の5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。また、設計されたガイドプローブ及びプライマーを通して増幅される産物を検出できるように検出プローブ2を設計して製造した(PANAGENE Inc., South Korea)。
一方、KRAS遺伝子のG12C変異の存在有無に関係なく、試料内のKRAS遺伝子を特異的に増幅して検出するために、KRAS遺伝子のexon 6に特異的に混成化できるガイドプローブ5、KRAS遺伝子のexon 6に3'末端の一部が特異的に混成化できる部分プライマー9、前記部分プライマー9と対を成して標的核酸を増幅できるように、KRAS遺伝子のexon 6塩基配列の一部と混成化できる特異的プライマー4を設計し、この時、前記ガイドプローブ5のC末端の一部塩基配列と前記部分プライマー9の5'末端の一部塩基配列が混成化できるようにした。また、設計されたガイドプローブ及びプライマーを通じて増幅される産物を検出できるように検出プローブ4を設計して製造した(PANAGENE Inc., South Korea)。各プライマー及びプローブの塩基配列を表7と表8に開示した。
Figure 2023551461000008
Figure 2023551461000009
前記部分プライマー2は、18塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列はガイドプローブ4の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列は、G12C変異が発生したKRAS遺伝子のcodon 12及び周辺部位の塩基配列と相補的な特性を持つ。
前記部分プライマー9は、19塩基配列の長さの単鎖オリゴヌクレオチドで製作し、下線で示した塩基配列は、ガイドプローブ5の塩基配列の一部と相補的であり、イタリック体で示した塩基配列はKRAS遺伝子のexon 6塩基配列の一部と相補的な特性を持つ。
前記ガイドプローブ4は、24塩基配列の長さのPNAで製作し、イタリック体で示された塩基配列は、KRAS遺伝子のcodon 12周辺部位の塩基配列と相補的であり、下線で示された塩基配列は前記部分プライマー2の塩基配列の一部と相補的な特徴を持つ。また、前記ガイドプローブ4のN末端には[K(lysine)]が取り付けられており、前記KRAS遺伝子の配列と相補的な部位及び部分プライマー2の塩基配列の一部と相補的な部位の間にメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)のL35 linkerが接続されるようにした。
前記ガイドプローブ5は、25塩基配列の長さのPNAで製作し、イタリック体で示された塩基配列は、KRAS遺伝子のexon 6塩基配列の一部と相補的であり、下線で示された塩基配列は前記部分プライマー9の塩基配列の一部と相補的な特徴を持つ。また、前記ガイドプローブ5のN末端には[K(lysine)]が付着しており、前記KRAS遺伝子の配列と相補的な部位及び部分プライマー9の塩基配列の一部と相補的な部位の間にメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)のL35 linkerが接続されるようにした。
前記検出プローブ2は、12塩基配列の長さのPNAで製作し、N末端には消光子(quencher)である[Dabcyl]が、C末端にはレポーター(reporter)である[FAM]がそれぞれ取り付けられ、PNAと[FAM]の間には、メーカー(PANAGENE Inc., South Korea)の[O linker]及び[K(lysine)]が接続されるように製作した。
前記検出プローブ4は、13塩基配列の長さのPNAで製作し、N末端には消光子である[Dabcyl]が、C末端にはレポーターである[HEX]がそれぞれ取り付けられ、PNAと[HEX]の間にはメーカー(PANAGENE Inc., South Korea)の[O linker]と[K(lysine)]が接続されるように製作した。
前記検出プローブ2と検出プローブ4は、相補的な塩基配列を持つそれぞれの増幅産物に混成化されるとき、前記消光子とレポーターが最も遠い距離になり、このときレポーターからの信号(蛍光)値が最大となり、前記信号を測定することにより、それぞれの増幅産物を検出することができる。
前記部分プライマー2は、KRAS遺伝子内の標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列の長さが8に過ぎず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で単独で前記標的部位に混成化することが難しく、ただ、前記標的部位の周辺に混成化するガイドプローブ4が存在する場合、前記ガイドプローブ4の塩基配列の一部と部分プライマー2の塩基配列の一部が混成化して容易に前記標的部位に混成化することができる。
前記部分プライマー2は、KRAS遺伝子の標的核酸塩基配列と混成化可能な塩基配列の長さが8に過ぎず、これは標的核酸と混成化可能な塩基配列の長さが18～30個の通常のプライマーより短い。したがって、もし部分プライマー2と前記標的核酸混成化部位の間に1つ以上の相補的でない(mismatch)塩基配列が存在すれば、前記相補的でない塩基配列が混成化効率に及ぼす影響が通常のプライマーより大きくなり、結果として通常のプライマーより塩基配列の微細な変化をよりよく検出することができる。
前記部分プライマー9は、KRAS遺伝子内の標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列の長さが9に過ぎず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で単独で前記標的部位に混成化することが難しく、ただ、前記標的部位の周辺に混成化するガイドプローブ5が存在する場合、前記ガイドプローブ5の塩基配列の一部と部分プライマー9の塩基配列の一部が混成化して容易に前記標的部位に混成化することができる。
前記部分プライマー9の3'末端は、KRAS遺伝子のexon 6塩基配列の一部と混成化し、これはKRAS遺伝子のG12C変異の存在有無に関係なく起こる可能性があるので、このような特性を考慮して前記部分プライマー9による増幅を対照区(control)として活用することができる。
つまり、もし試料内のKRAS遺伝子のG12C変異が存在しない場合、前記部分プライマー2による増幅(Target増幅)は抑制される一方、前記部分プライマー9による増幅(Control増幅)は円滑に現れ、二つの増幅曲線の計算されたCt値間の差(ΔCt)が大きく現れる一方、試料内にKRAS遺伝子のG12C変異が存在する場合、前記部分プライマー2と部分プライマー9を通じた増幅が円滑に行われ、二つの増幅曲線を通じて計算されたCt値の差が小さく現れるので、これを利用してG12C変異の存在有無を簡単に判断することができる。
4.2 増幅産物の生成及び確認
約4,000個(copy)の野生型(wild-type)KRAS遺伝子標的核酸が存在する条件、または野生型KRAS遺伝子標的核酸とG12C変異したKRAS遺伝子標的核酸がそれぞれ0:100(100％G12C)、50:50(50％G12C)、90:10(10％G12C)、96:4(4％G12C)、98:2(2％G12C)、99:1(1％G12C)、99.5:0.5(0.5% G12C)の割合で混合され、前記野生型KRAS遺伝子標的核酸とG12C変異が起こったKRAS遺伝子標的核酸の個数の合計が約4,000個(copy)となるようにした条件、または野生型KRAS遺伝子標的核酸と非標的変異であるG12A(codon 12がGGT>GCTに変化)、G12D(codon 12がGGT>GATに変化)、G12R(codon 12がGGT>CGTに変化)、G12S(codon 12がGGT>AGTに変化)、G12V(codon 12がGGT>GTTに変化)、G13S(codon 12がGGT>GTTに変化GTTに変化)、G13C(codon 13がGGC>TGCに変化)、G13D(codon 13がGGC>GACに変化)が起きたKRAS遺伝子標的核酸がそれぞれ90：10(10% G12A、10% G12D、10% G12R、10% G12S、10% G12V、10% G13C、10% G13D)の割合で混合されて個数の合計が約4,000個(copy)になるようにした条件で、前記の意図した増幅産物を形成するように30 pmoleのガイドプローブ4と15 pmoleのガイドプローブ5、25 pmoleの部分プライマー2、7 pmoleの部分プライマー9、3 pmoleの特異的プライマー2、2 pmoleの特異的プライマー4、3 pmoleの検出プローブ2、3 pmoleの検出プローブ4を含むポリメラーゼ連鎖反応用組成物を製造した。
前記ポリメラーゼ連鎖反応用組成物には、通常、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される核酸ポリメラーゼ(DNA polymerase)と共に、緩衝液(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリポリリン酸塩(dNTP)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
ポリメラーゼ連鎖反応のための温度調節は、一般的なthermal cyclerを通じて行われ、initial denaturation[95℃、5分]の後、15 cycleの第1段階であるdenaturation[95℃、20秒] - annealing[63℃、20秒] - extension[72℃、20秒]を経て、35 cycleの第2段階であるdenaturation[95℃、10秒] - measure[50℃、10秒] - denaturation[95℃、20秒] - annealing[58℃、20秒] - extension[72℃、20秒]で行った。前記第2段階のmeasure stepで毎cycleごとにFAM及びHEX channelの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
FAM channelから導出された増幅曲線からCt値を算出し、「Target部位増幅Ct」と呼び、HEX channelから導出された増幅曲線からCt値を算出して「Control部位増幅Ct」と呼び、前記Control部位増幅CtからTarget部位増幅Ctを差し引いてΔCt値を求めた結果、G12C変異体が注入された条件と野生型または非標的変異体が注入された条件との間に明確なΔCt値の差が確認された。
すなわち、前記ΔCt値が-5以上の場合「G12C変異陽性」、前記ΔCt値が-5未満の場合「G12C変異陰性」と判定した結果、100％G12C、50％G12C、10％G12C、4％G12C、2％G12C、1％G12Cが注入された全ての反応でG12C変異陽性と判定され、0.5％G12Cが注入された8回の反応のうち6回でG12C変異陽性と判定された。一方、野生型注入条件及び非標的変異体が注入された条件は全てG12C変異陰性と判定された。以上の結果から、標的変異核酸が反応当たり約20～40個(copy)だけ存在しても検出できる水準の高い感度と一緒に特異性も優れていることが確認された(図9)。
本発明による標的核酸増幅方法は、ガイドプローブを利用してサンプル内に存在する混成化可能な全ての核酸に結合し、部分プライマーの標的核酸検出部位への結合を助けるため、非常に低い濃度で存在する標的核酸も増幅が可能であり、また、部分プライマーの配列特異性により、標的核酸以外の核酸は増幅速度に差が発生し、標的核酸を高い特異度で検出できる利点があるため、分子診断、出生前診断、早期診断、がん診断、遺伝関連診断、遺伝型質診断、感染菌の診断、薬剤耐性菌の判別、法医学、生物の種判別などに有用である。
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。

Claims (18)

  1. 以下の段階を含む標的核酸増幅方法。
    (a) 検体試料から分離された核酸を
    i) 標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(guide probe)、
    ii) 前記ガイドプローブの標的核酸混成部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)、 および
    iii) 前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅できる特異的プライマー(specific primer)
    と混合し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行する段階、ならびに
    (b)増幅産物の存在有無を判定する段階。
  2. 前記ガイドプローブで標的核酸と混成化する部位は、5'末端またはN末端に存在し、部分プライマーと混成化する部位は、3'末端またはC末端に存在することを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  3. 前記ガイドプローブは、標的核酸混成化部位と部分プライマー混成化部位の間にリンカーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  4. 前記リンカーは、β-アラニン(β-Ala-OH、C3)、アミノ酪酸(aminobutyric acid、C4)、アミノヘキサノ酸(aminohexanoic acid、C6)、アミノラウリン酸(aminolauric acid、C12)、アセトアセトキシエチルアクリレート(acetoacetoxyethyl acrylate、AAEA(O-linker))、アミノエトキシエトキシ酢酸(2-[2-[2-[2-(amino)ethoxy]ethoxy]ethoxy]acetic acid、AEEEA)、AEEEEA、DL15及びL35で構成される群から選択される1種以上であることを特徴とする 請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  5. 前記ガイドプローブ、部分プライマー及び特異的プライマーは、オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、LNA(locked nucleic acid)及びPNA(peptide nucleic acid)のいずれか1つまたはこれらの混合物で構成されることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  6. 前記ガイドプローブは、10～500の塩基配列の長さで製作されたPNAであることを特徴とする請求項５に記載の標的核酸増幅方法。
  7. 前記ガイドプローブは、20～150の塩基配列の長さで製作されたPNAであることを特徴とする請求項６に記載の標的核酸増幅方法。
  8. 前記ガイドプローブは、特異的プライマーが混成化する標的核酸の反対側の鎖に混成化することを特徴とする 請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  9. 前記部分プライマーは、ガイドプローブの標的核酸混成部位以外の部位と結合する配列と標的核酸検出部位と結合する配列の間に、1～100の塩基配列の長さで製作された一本鎖(single strand)オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)であるスペーサー(spacer)をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  10. 前記部分プライマーの標的核酸検出部位と結合する配列は、3～15の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  11. 前記増幅産物の長さは、50bp～1kbpであることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  12. 前記(b)段階の増幅産物の存在有無を判定する段階は、前記増幅産物に結合可能な核酸結合色素(nucleic acids-binding dye)またはプローブ(probe)を使用することを特徴とする請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
  13. 前記核酸結合染料は、エチジウム臭化物(Ethidium bromide)、サイバーグリーン1(SYBR（登録商標） Green I)、サイバーグリーンゴールド(SYBR（登録商標）Gold)、エヴァグリーン(EvaGreen)、ヨプロ-1(YO-PRO-1)、サイト(SYTO)、ベボ(BEBO)及びベクスト(BEXTO)で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の標的核酸増幅方法。
  14. 前記増幅産物に結合可能なプローブは、オリゴヌクレオチド、LNA、PNA及びそれらの混合物で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の標的核酸増幅方法。
  15. 前記増幅産物に結合可能なプローブは、両末端にレポーター(reporter)と消光子(quencher)が接続されていることを特徴とする請求項１４に記載の標的核酸増幅方法。
  16. 前記レポーターは、フルオレシン(fluorescein)、フルオレシンクロロトリアジニル(fluorescein chlorotriazinyl)、ローダミングリーン(rodamine green)、ローダミンレッド(rodamine red)、テトラメチルローダミン(tetramethylrhodamine)、FITC、オレゴングリーン(Oregon green)、Alexa Fluor、FAM、JOE、ROX、HEX、テキサスレッド(Texas Red)、TET、TRITC、TAMRA、シアニン(Cyanine)系染料及びチアジカルボシアニン(thiadicarbocyanine)染料で構成される群から選択される一つ以上の蛍光物質であることを特徴とする請求項１５に記載の標的核酸増幅方法。
  17. 前記消光子は、ダブシル(Dabcyl)、タムラ(TAMRA)、エクリプス(Eclipse)、DDQ、QSY、ブラックベリークエンチャー(Blackberry Quencher)、ブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher)、Qxl、アイオワブラック(Iowa black)FQ、アイオワブラックRQ及びIRDye QC-1で構成される群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項１５に記載の標的核酸増幅方法。
  18. i) 標的核酸の検出部位以外の部位と混成化(hybridization)できるガイドプローブ(guide probe)、
    ii) 前記ガイドプローブの標的核酸混成部位以外の部位と結合する配列及び標的核酸検出部位と結合する配列を含む部分プライマー(partial primer)、および
    iii) 前記部分プライマーと対を成して標的核酸を増幅できる特異的プライマー(specific primer)
    を含む標的核酸増幅用PCR組成物。
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