JP6228674B2 - クランピングプローブ及び検出プローブを用いた多重標的核酸の検出方法 - Google Patents

Description

［１］本発明は、クランピングプローブ及び検出プローブを用いた標的核酸の検出方法に関するものであって、さらに詳しくは、標的核酸をリアルタイムで検出するための一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及び野生型遺伝子または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を含むプローブ混合体を用いて同時に多重標的核酸を検出する方法及びこれを用いたキットに関する。

発明の背景になる技術

［２］遺伝子（ｇｅｎｅ）は、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）と翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を通じて生命体の形質を発現し、またその形質を子孫に伝達する非常に重要な物質であって、Ａ（アデニン）・Ｃ（シトシン）・Ｇ（グアニン）・Ｔ（チミン）を基本単位とする塩基の配列からなっている。遺伝子の塩基配列は生命体の形質を決定し、このような遺伝子の塩基配列及び塩基多形性分析は、多くの生物学的情報を研究するのに非常に重要である。例えば、塩基多形性分析を通じて遺伝関連疾患の診断及び遺伝形質によるオーダーメードの薬の処方を可能とし、感染菌の診断及び薬剤耐性菌を判別することができ、その他にも生物体の種判別及び法医学など、数多くの分野において広範囲に応用が可能である。

［３］特に、１９８３年以後の韓国内死亡原因１位である癌疾患の場合、腫瘍遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）の変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ）の変異、脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）と染色体の異常（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）などの遺伝子異常が癌の発病と薬物の予後判断に直接的に関与するという事実が新たに明らかになり、これに対する研究が多様に行われている（Ｆｅａｒｓｏｎ ＥＲ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ．、１９９０、６１：７５９；Ｋ．Ｗ Ｋｉｎｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ．、１９９６、８７：１５９；Ｍａｎｕｅｌ Ｓｅｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ．、１９９７、８８：５９３；Ａｍａｄｏ ＲＧ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００８、２６：１６２６；Ｒａｐｏｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、８：４１３；Ｓｉｅｎａ Ｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２００９、１０１：１３０８）。

［４］このような理由により臨床的意味のある突然変異の検出は非常に重要であるため、分析しようとする目的または遺伝子の種類により診断のための多様な検出方法が報告され続けている（Ｔａｙｌｏｒ ＣＦ、Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、９２：９、２００４）。特に、体細胞突然変異の場合（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、突然変異遺伝子は腫瘍の種類により多量の野生型遺伝子の中にメガベースあたり０．１〜１００ベース程度の非常に低い頻度で存在する。また、分析サンプルに存在する突然変異癌細胞の数は、正常細胞に比べ顕著に少ないため、これの検出は非常に難しく、高度の検出技術を要する（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、６５：６６０、２００６；Ｔｒｏｖｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．、２０２：２４７、２００４）。

［５］上記のような極微量の突然変異検出のための代表的な方法としては、少量の突然変異遺伝子を選択的に増加させるために、突然変異に特異的なプライマーを用いて突然変異を特異的に増幅する対立形質特異的（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＰＣＲ方法（Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉａｇｎ ｍｏｌ ｐａｔｈｏｌ．、６：４９、１９９７）、スコーピオンリアルタイム対立形質特異的ＰＣＲ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、ＤｘＳ’ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ ａｎｄ ＡＲＭＳ）方法（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４：１４６６、２００９）、対立形質特異的（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー技術とＭＧＢ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）−プローブを用いて野生型遺伝子の増幅を抑制し、突然変異遺伝子のみを選択的に増幅後、タックマン（Ｔａｑｍａｎ）プローブを用いて突然変異が発生した位置を含むことなく、増幅産物を検出するＣＡＳＴ ＰＣＲ方法（Ｄｉｄｅｌｏｔ Ａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．、９２：２７５、２０１２）、臨界的変性温度（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｃ）を用いて突然変異の敏感度を増加させることができるコールド−ＰＣＲ（Ｃｏｌｄ−ＰＣＲ）方法（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ．、２２：１０２３、２００９）など、リアルタイムＰＣＲ技術に基盤を置いた多様な分析法がある。このような技術は、容易にかつ速く多様な診断に適用が可能であり、癌関連遺伝子の変異診断及び分析のために良い技術となっている（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８：１１７８、２００２）。

［６］しかし、上記の方法は、突然変異のみを選択的に増幅させるプライマーを設計しなければならず、臨界的変性温度を細かく合わせなければならないなどの実験デザインが難しく、対立形質特異的プライマーを用いた方法の場合、ミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）になると、偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）結果を引き起こす可能性もある。また、現在、最も大衆的に用いられているタックマン（Ｔａｑｍａｎ）及びスコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）プローブ法は、プローブの融解曲線分析を用いた同時多重分析が不可能であるため、１つのチューブで検出可能な遺伝子数は、リアルタイムＰＣＲ装備の検出可能な蛍光個数に依存するという問題点がある。

［７］最近、リアルタイムＰＣＲ技術を通じて体細胞突然変異の検出のための多様な分子診断技術が開発されたが、その効用性の側面から見たとき、大きな発展をなしておらず、高い敏感度と特異度を有し、短い時間で同時に多重定量をすることができる技術の開発が必要である。

［８］ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＰＮＡ）は、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンアミドを基本骨格とする核酸類似体であって、１９９１年にニールセンによって報告された（Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４（５０３７）：１４９７、１９９１）。ＰＮＡ骨格は、電気的に中性であるため、相補的塩基配列を有する標的核酸に対してＤＮＡプローブより高い特異度と選択性を有し、バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）のアルファ（α）とガンマ（γ）位置或いはリンカー部位に特定作用基を導入して細胞透過及び標的核酸との融解温度調節のような自由な物性調節が可能な特性を有している（Ｅｎｇｌｕｎｄ ＥＡ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、４６：１４１４、２００７；Ｓｔｅｆａｎｏ Ｓｆｏｒｚａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１６：２９０５、２０００；Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１１：１５３５．２０１１）。また、核酸分解酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）や蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）に分解されていない長所があるため、プローブを用いた分子診断方法に非常に有用である（Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５５６、１９９３；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：３、１９９４；Ｄｅｍｉｄｏｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４８：１３１０、１９９４）。このようなＰＮＡの長所を用いて１９９３年にＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）技術が開発された（Ｈｅｎｒｉｋ Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：５３３２、１９９３）。この技術は、ＰＮＡプローブを、増幅を望まない遺伝子と結合させてＰＣＲ増幅を抑制する技術であって、野生型遺伝子に相補的なＰＮＡプローブを用いると、ＰＣＲ反応のうち野生型遺伝子の増幅を選択的に抑制して野生型に比べて極少量存在する突然変異を速くかつ正確に検出することができる。

［９］現在、ＰＮＡ ｃｌａｍｐｉｎｇ技術を応用した多様な技法が報告されている。以下、ＰＮＡ ｃｌａｍｐｉｎｇ技法を用いて遺伝子を選択的に増幅するための方法の特徴を簡略に叙述した。

［１０］ＰＮＡ−ＬＮＡ ｃｌａｍｐ（米国公開特許第２０１３−０００５５８９号；Ｙｏｓｈｉａｋｉ Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６５（１６）：７２７６、２００５）方法は、標的部位に対して野生型遺伝子の配列を有するＰＮＡクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）プローブと変異遺伝子の配列を有する検出用ＬＮＡタックマン（ｔａｑｍａｎ）プローブが競争的にハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するように量子の配列を設計して選択的な増幅と選択的な検出を行う方法である。しかし、この方法は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有したＤＮＡポリメラーゼが、蛍光子と消光子でレーベリングされた突然変異プローブを分解して蛍光を検出するタックマンプローブ方法を用い、従って、プローブの融解温度（Ｔｍ、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値を分析することができず、一つの蛍光で多重標的検出が不可能である。

［１１］ＰＮＡハイブプローブ（ｈｙｂ ｐｒｏｂｅ）（ＰＮＡ ａｓ ｂｏｔｈ ＰＣＲ ｃｌａｍｐ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒ ｐｒｏｂｅ；米国公開特許第２００８−０１７６２２６号）は、既存のロシュ社の（ｒｏｃｈｅ）ハイブプローブシステムで供与者（ｄｏｎｏｒ）プローブ部分をＰＮＡプローブに変えることでＰＮＡプローブを通じてクランピングと検出を同時に行うように設計された技術である。しかし、アンカー（ａｎｃｈｏｒ）プローブを含まなければならないという制限点を依然として有しているため、プローブの設計が難しく、長さが長いアンカープローブの使用は隣接した位置の変異に対する同時多重検出を不可能にするだけでなく、クランピングと検出を同時に行う１種のＰＮＡプローブを用いるため、ＰＮＡプローブの融解曲線分析を通じた同一のコドン内の多重突然変異遺伝型判別時に、ＰＮＡプローブと各突然変異遺伝型との間の融解温度の差が大きくないことから、分析が難しいという問題点がある。

［１２］ＰＮＡクランピング＆インターカレーター検出（ＰＮＡ Ｃｌａｍｐｉｎｇ ＆ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）方法は（Ｍａｋｉｔｏ Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、３６２：８６５、２００７）、野生型遺伝子をＰＮＡプローブ用いてクランピングし、突然変異型遺伝子のみ選択的に増幅後、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を用いて増幅産物を検出する方法であって、同時多重検出が不可能であり、野生型遺伝子が完全にクランピングされていない場合、偽陽性結果をもたらすなど、結果分析が難しい。

［１３］ＰＮＡ ＆ ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ（Ｊｉ Ｅｕｎ Ｏｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．、１２：４１８、２０１０）を用いた方法は、ＰＮＡプローブを用いて野生型遺伝子をクランピングした後、インターカレーターを用いて標識されていないＤＮＡプローブと突然変異遺伝子の融解曲線を分析する方法であって、特異的なリアルタイム増幅曲線の分析が不可能であり、敏感度が低く、同時多重検出の不可能であるという問題点がある。

解決しようとする課題

［１４］よって、本発明者は、上記のような問題を解決するために努力した結果、標的核酸をリアルタイムで検出するために、クランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）と同時に蛍光子及び消光子が含まれた蛍光検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）の混合体を用いて所望の遺伝子を選択的に高い敏感度で検出可能であることを確認し、隣接した突然変異の検出が容易であることを確認し、野生型遺伝子と標的核酸遺伝子の融解温度差を大きくして増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）及び融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）分析を用い、同時に多重標的核酸の検出及び定量だけでなく、遺伝型判別が可能であることを確認し、本発明を完成した。

［１５］また、標的核酸をリアルタイムで検出するため、立体構造の変化または電荷付与などを通じて、構造的に変形させた検出プローブ及びクランピングプローブで構成されたプローブ混合体を用いると、ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒ）及びセルフダイマー（ｓｅｌｆ ｄｉｍｅｒ）の結合エネルギー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ）が緩和され、単一塩基配列変異に対する特異度が増加し、極微量の標的核酸遺伝子の選択的増幅と検出が非常に容易であるという点を確認した。

［１６］本発明のプローブ混合体システムは、分子診断、出生前診断、早期診断、癌診断、遺伝関連診断、遺伝形質診断、感染菌の診断、薬剤耐性菌の判別、法医学、生物体の種判別など、多様な分子診断技術に用いることができる。

課題の解決手段

［１７］上記の目的を達成するために、本発明は、標的核酸をリアルタイムで検出するための、一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及び野生型遺伝子または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を含むプローブ混合体と、これを用いた同時多重的標的核酸の検出方法及び上記方法を用いた分子診断キットを提供する。

［１８］本発明のプローブ混合体は、同一ストランド上で競争的に混成化されるクランピングプローブ、及びリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）と消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合された一つ以上の検出プローブを用いた同時多重的標的核酸の検出方法を提供するか、または相補的なストランド上で混成化されるクランピングプローブ、及びリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）と消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合された一つ以上の検出プローブを用いた同時多重的標的核酸の検出方法を提供する。

［１９］本発明による標的核酸の検出方法を用いると、野生型遺伝子または望まない遺伝子増幅の抑制が可能であり、極微量の標的核酸遺伝子の選択的増幅と選択的検出を通じて試料内に含まれた単一塩基変異及び塩基の欠損または挿入による変異を効果的に検出することができ、多重の検出プローブと多重の増幅抑制プローブを用いてリアルタイム増幅曲線と融解曲線の同時分析が可能であって、同時多重的に標的核酸の検出及び定量だけでなく融解曲線分析を通じた遺伝型判別が可能である。また、高敏感度でターゲット検出が可能であるため、極少量のターゲット検出が必要な早期診断に非常に有用に用いられ得る。

［20］図１は、プローブ混合体の模式図である。図１のａは、同一ストランド上で競争的に混成化するクランピングプローブ及び検出プローブを含むプローブ混合体の模式図であり、図１のｂは、相補的なストランド上で混成化するクランピングプローブ及び検出プローブを含む混合体の模式図である。 ［21］図２は、立体構造を付与したＰＮＡプローブのセルフダイマー融解温度の減少を示したグラフである。 ［22］図３は、クランピングプローブと逆平行（ａｎｔｉ ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする検出用ＰＮＡプローブ及び平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする検出用ＰＮＡプローブのヘテロダイマー融解温度を示したグラフである。 ［23］図４は、立体構造を付与した検出用ＰＮＡプローブと立体構造を付与したクランピングＰＮＡプローブのヘテロダイマー融解温度の減少を示したグラフである。 ［24］図５は、本発明のＰＮＡ混合体を用いたＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異であるＧ１２Ａ増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号１５）。 ［25］図６は、本発明のＰＮＡ混合体を用いたＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異であるＧ１２Ｓ増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号１６）。 ［26］図７は、本発明のＰＮＡ混合体を用いたＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異であるＧ１２Ｒ増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号１７）。 ［27］図８は、本発明のＰＮＡ混合体を用いたＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異であるＧ１２Ｃ増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号１８）。 ［28］図９は、本発明のＰＮＡ混合体を用いたＫ−ｒａｓ遺伝子突然変異であるＧ１３Ｄ増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号１９）。 ［29］図１０は、本発明のＰＮＡ混合体を用いた内部コントロール増幅曲線及び融解曲線を示したグラフである（配列番号２０）。 ［30］図１１は、野生型遺伝子の中に含まれているＧ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃターゲット濃度別に配列番号１６、１７、１８プローブの融解曲線信号を併合させたグラフである。一つの蛍光チャンネルで３種のＫ−ｒａｓ突然変異Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ遺伝子（配列番号１６、１７、１８）の融解曲線分析を通じて遺伝型を判別することができることを示す。 ［31］図１２は、検出用ｍｇｂ−タックマンプローブ−クランピング用ＰＮＡプローブを用いたＥＧＦＲ遺伝子突然変異であるＴ７９０Ｍの増幅曲線を示したグラフである。 ［32］図１３は、検出用プローブと完全に一致する突然変異遺伝子（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）、不一致する突然変異遺伝子（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）及び野生型遺伝子（Ｗｉｌｄ）の融解曲線グラフである。図１３（Ａ）の検出プローブの配列は配列番号３３であり、完全に一致する突然変異遺伝子はＧ１２Ｄであり、図１３（Ｂ）の検出プローブの配列は配列番号３４であり、完全に一致する突然変異遺伝子はＧ１２Ｖである。 ［33］図１４は、野生型遺伝型と突然変異遺伝型の混合の割合による検出敏感度を確認したグラフである。図１４（Ａ）は、突然変異遺伝子（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ）が１％含有したサンプルの突然変異検出敏感度に対するグラフであり、図１４（Ｂ）は、上記突然変異遺伝子が０．１％含有したサンプルの突然変異検出敏感度に対するグラフであり、図１４（Ｃ）は、上記突然変異遺伝子が０．０１％含有したサンプルの突然変異検出敏感度に対するグラフである。 ［34］図１５は、特異的な構造変化がないプローブを用いた融解曲線のグラフであって、検出用プローブとターゲットＤＮＡの融解曲線グラフである。 図１５（Ａ）の検出プローブの配列は配列番号３７であり、図１５（Ｂ）の検出プローブの配列は配列番号３８である。

発明を実施するための具体的な内容

［35］他の式で定義されていない限り、本明細書において用いられたすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野において熟練された専門家によって通常理解されることと同一の意味を有する。一般的に、本明細書において用いられた命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常用いられるものである。

［36］本発明は、野生型または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ、及びリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が結合された検出プローブを用いて同時多重的な標的核酸を検出する方法に関するものである。

［37］本発明の‘検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）’は、検出しようとする標的核酸遺伝子を選択的に検出することができるプローブを意味し、‘クランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）’は、野生型遺伝子または望まない遺伝子と相補的に結合してＰＣＲ反応間重合酵素の伸長反応を抑制することができるプローブを意味し、‘プローブ混合体’は、一つ以上の検出プローブ及びクランピングプローブで構成されたプローブシステムを意味する。

［38］本発明の‘標的核酸’は、検出しようとするすべての種類の核酸を意味し、突然変異遺伝子を含むかまたは含まないこともある。ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡとｍｉｔｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ、ｖｉｒａｌ ＤＮＡを含むすべての種類のＤＮＡまたはｍＲＮＡ、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｖｉｒａｌ ＲＮＡなどを含むすべての種類のＲＮＡを特徴とすることができるが、これに限定しない。混成化、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）または増幅条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたは混成化される。

［39］本発明の‘混成化’は、相補的な単一ストランド核酸が二重−ストランド核酸を形成することを意味する。混成化は、２個の核酸ストランド間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）発生するか、または一部不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても発生し得る。混成化に必要な相補性の程度は、特に温度のような混成化条件によって変わり得る。

［40］本発明の‘突然変異’は、野生型遺伝子塩基配列に変異が発生したものであって、単一塩基多形性（ＳＮＰ；ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）だけでなく、塩基の置換、結実または挿入されて変異が発生したことも含まれる。また、自然で発生し得る体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）と生殖細胞突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が含まれるが、人為的に塩基配列の変異を誘導した人工突然変異なども制限なしに含まれる。本発明の‘体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）’は、体細胞に発生する遺伝子突然変異であって‘体性突然変異’、‘体細胞変異’とも言う。体細胞変異は、信号伝達過程の脱調節などによって細胞の癌化を引き起こす主要原因として知られている。意味のある‘体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）としてはＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ２、ＨＥＲ２、ＢＣＬ−ＡＢＬ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、Ｃ−ＫＩＴ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡなどの各種癌関連遺伝子を例として挙げられる。本発明においては、体細胞遺伝子Ｋ−ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）の突然変異の場合に対する実施例を通じて本発明が作動することを確認して本発明を完成した。

［41］本発明において検出プローブまたはクランピングプローブは、標的核酸に相補的に結合するすべての核酸及び核酸類似体であって、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群よりそれぞれ選択され得る。ＰＣＲのための重合酵素に一般的にヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）活性があってプローブの損傷が生ずる可能性もあるので、ヌクレアーゼに安定したＰＮＡのような合成核酸を用いることを奨励する。また、検出プローブは、目的標的核酸遺伝子を選択的に検出させる役目を行うので、当業界に知られた核酸の検出のためのプローブの使用が可能である。本発明において検出プローブがＰＮＡ以外の他の核酸類似体である場合も、標的核酸の検出が可能であるか否かを確認するために、ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎを検出プローブを用いて分析を行い、その結果、互いに異なるストランドで突然変異検出用ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎプローブと野生型クランピングＰＮＡプローブシステムが作動することをリアルタイム増幅曲線分析を通じて確認した（図１２）。

［42］本発明においては、好ましくはＰＮＡプローブを用い、ＰＮＡプローブは、人工合成ＤＮＡでターゲットＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に結合が可能であり、ヌクレアーゼに対して安定しているため、プローブを基盤とした融解曲線分析が可能である。また、ＤＮＡと結合後、重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の進行を邪魔する性質を有しているので、本発明においては、野生型遺伝子と完全な混成化をなすように製造したＰＮＡプローブは、ＰＮＡクランピングプローブとして用い、同時多重で標的核酸の検出のためにＰＮＡ検出プローブは、標的核酸遺伝子と完全な混成化をなすように製造した。

［43］また、本発明において、クランピングプローブ及び検出プローブは、プローブのＮ末端、Ｃ末端またはプローブ（合成核酸）骨格のアルファ、ベータ、ガンマ、リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）位置に天然アミノ酸の、及び合成アミノ酸の側鎖などの特定作用基を結合させて立体構造的変化を与えることができ、上記アミノ酸は、電荷を有していないか、または負電荷または正電荷を有することを特徴とすることができるが、これに限定されたものではなく、当業界に公知になったプローブ立体構造の変化及び電荷付与方法を用いることができる。

［44］本発明の上記検出プローブは、両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とリポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合することができ、インターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光物質を含むことができる。

［45］上記‘リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）’は、特定波長の光を吸収、放出して蛍光を発する物質であって、プローブに標識して標的核酸とプローブとの間の混成化がなされたかを確認することができる物質を意味し、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインクロロトリアジニル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ロダミングリーン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）、ロダミンレッド（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ）、テトラメチルロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ）、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ＴＥＴ、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系列染料及びチアジカルボシアニン（ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）染料で構成される群より選択される一つ以上であり得る。

［46］また、上記‘消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）’は、リポーターが発生させた光を吸収して蛍光強さを減少させる物質を意味し、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＴＡＭＲＡ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＤＱ、ＱＳＹ、ブラックベリークエンチャ（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ブラックホールクエンチャ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｑｘｌ、アイオワブラック（Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ）ＦＱ、アイオワブラックＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ−１群より選択される一つ以上であり得るが、これに限定されるものではなく、消光子は種類によって蛍光強さを減少する範囲が異なるので、これを考慮して用いることができる。

［47］本発明においては、標的核酸をリアルタイムで検出するための一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及び野生型遺伝子または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を含むプローブ混合体を用いて同時多重的標的核酸を検出した。

［48］本発明のプローブ混合体を用いた同時多重標的核酸の検出方法は、野生型遺伝子或いは望まない遺伝子と相補的に結合して重合酵素の伸長反応を抑制する一つまたは一つ以上のクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を用いて検出しようとする標的核酸遺伝子を選択的に増幅させ、標的核酸を特異的に検出するための一つまたは一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）を用いて多重標的核酸の有無または濃度を検出することを特徴とし、プローブ混合体を用いた標的核酸の検出は、リアルタイム増幅曲線及び融解曲線の同時分析が可能である。

［49］図１に示されたように、本発明のクランピングプローブ及び検出プローブは、同一ストランド上でターゲットＤＮＡと混成化するか（図１のａ）、またはクランピングプローブ及び検出プローブが相補的なストランドに混成化して（図１のｂ）、野生型遺伝子のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）及び標的核酸遺伝子の検出を同時に進行する方法である。すなわち、クランピングプローブが野生型遺伝子と完全な混成化（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）をなすと、野生型遺伝子の増幅を抑制させることができるため、極微量の標的核酸遺伝子の選択的増幅及び検出が可能であり、また、一つ以上の検出プローブを用いて同時多重的に標的核酸の検出が可能である。

［50］さらに具体的に、プローブ混合体を用いたターゲットＤＮＡの増幅過程において、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップにおいては、クランピングプローブと検出プローブが同一ストランドまたはそれぞれ互いに異なる相補的なストランドにアニーリングするようになり、リポーターと消光子を有している検出プローブは、検出しようとする標的核酸遺伝子に特異的に結合して増幅曲線信号（蛍光）を示すようになる。以後の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップにおいてクランピングプローブは、依然として野生型遺伝子或いは望まない遺伝子と混成化されており、野生型遺伝子或いは望まない遺伝子の増幅を抑制し、検出プローブは、標的核酸との伸長ステップの温度より低い融解温度で作製されたため、標的核酸と分離して増幅が進行される。

［51］このような増幅過程を通じてリアルタイムで増幅曲線を分析することができ、上記の増幅過程を通じて生成された増幅産物を用いて融解曲線分析が可能である。融解曲線分析ステップにおいて検出プローブは、低い温度で標的核酸遺伝子と混成化されて蛍光信号を示すが、温度が上がるにつれて標的核酸と分離して蛍光が消光される。

［52］ただし、本発明のプローブ混合体のうち、標的とするＤＮＡ鎖の互いに異なる方向で作動するように設計されたクランピングプローブ及び検出プローブは、ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒ）を形成する可能性が高いため、クランピングプローブまたは検出プローブのヘテロダイマー結合エネルギーを緩和させるために、検出プローブまたはクランピングプローブに立体構造の変化及び電荷付与などを通じた構造的変化を与えることが好ましい。このような変化を通じてプローブ間のヘテロダイマーまたはセルフダイマーの結合エネルギーを減少させることができ、これを通じてプローブの融解温度調節が容易になり、検出システムを完成することができた。

［53］本発明の一実施例においては、融解温度差を確認するために、負電荷を有するＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）またはＤ−グルタミン酸（Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、電荷を有さないＬ−アラニン（Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ）またはＤ−アラニン（Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ）、正電荷を有するＬ−リシン（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）またはＤ−リシン（Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ）の側鎖をＰＮＡのガンマ位置に導入し、Ｌ−リシン（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）をリンカー位置に導入したＰＮＡプローブを合成した（表１）。

［54］融解曲線分析方法を用いて各変形されたＰＮＡプローブの特性を分析した結果、ＰＮＡバックボーンのガンマ位置にグルタミン酸またはリシンの側鎖を結合させた配列番号４〜７または１１〜１４のＰＮＡプローブは、配列番号１のＰＮＡプローブと比較したとき、セルフダイマーの融解温度が小くなることを確認することができ（図２）、配列番号２３クランピング用プローブとヘテロダイマーを形成し、逆平行（ａｎｔｉ ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする配列番号１〜７検出用ＰＮＡプローブ、ならびに平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする配列番号８〜１６検出用プローブを比較したとき、逆平行結合時にヘテロダイマーを形成するが、平行結合時にヘテロダイマーを形成しないということを確認することができた（図３）。

［55］また、配列番号２１クランピング用プローブ、Ｌ−グルタミン酸を結合させた配列番号２２クランピング用プローブを、配列番号１５〜１９検出用ＰＮＡプローブとヘテロダイマーを形成関係を比較したとき、Ｌ−グルタミン酸を結合させた配列番号２２クランピングプローブを用いると、変形されていない配列番号２１クランピング用プローブを用いるときよりヘテロダイマー融解温度が大きく減少することを確認することができる（図４）。

［56］ＰＮＡ骨格のガンマ位置にＤ−グルタミン酸を結合させて構造的変化（立体構造及び電荷変異）を与えた配列番号３、５、及び７のＰＮＡプローブは、配列番号１のＰＮＡプローブと比較したとき、ターゲットＤＮＡと単一塩基不一致ＤＮＡの融解温度差（ΔＴｍ）が大きく増加することを確認し（表４）、本発明の構造を変形させたＰＮＡプローブは、単一塩基配列変異に対する特異度を増加させて野生型遺伝子と標的核酸遺伝子との融解温度差を２０℃以上の差が生じるようにするため、リアルタイム増幅曲線の非特異結合に対する改善と融解曲線分析時に示され得る問題点を減少させることができる。

［57］一般的に、複数の標的核酸を同時的に検出するために、従来のリアルタイムＰＣＲを用いた増幅曲線分析方法は、試料内の標的核酸を検出するにおいて蛍光物質を用いるため、二つ以上の標的核酸を検出するためには、ターゲット数ほどの蛍光物質を有したプローブの必要であるという問題があって多重検出が制限的であるが、本発明の同時多重的標的核酸の検出方法は、プローブ混合体を用いて増幅曲線及び融解曲線分析を同時に行うことができるため、一つの蛍光物質を用いて多重ターゲットの検出が可能であることを特徴とする。

［58］また、本発明のプローブ混合体を用いた同時多重的検出方法は、増幅曲線及び融解曲線の同時分析に限定されたものではなく、増幅曲線と融解曲線を別途に分析するかまたは順次的に分析することができ、必要に応じて増幅曲線分析または融解曲線分析のみを行って標的核酸を検出することができる。特に、定量分析が必要でない場合は、増幅曲線分析を省略し、融解曲線分析のみ行っても標的核酸の有無または遺伝子型を区別することができる。

［59］本発明の同時多重的標的核酸の検出方法は、具体的に、（ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させてリアルタイム増幅曲線を得るステップ；（ｂ）上記増幅過程の後、温度を変化させつつ増幅産物と検出プローブとの間の融解曲線を得るステップ；及び（ｃ）上記得られるリアルタイム増幅曲線及び融解曲線を別途に分析するか、あるいは順次的または同時に分析するステップを含む。

［60］上記（ａ）ステップのクランピングプローブ及び検出プローブは、検出しようとする標的核酸の数により多様に調節が可能であり、上記融解曲線を得るステップで増幅産物の濃度による融解温度値の偏差を減少させるために、融解曲線を得るステップの前に、リアルタイム増幅曲線を得るステップとは別に５サイクル以上のＰＣＲサイクルを追加することができ、好ましくは５乃至２０サイクルを追加することができる。

［61］また、本発明の検出方法は、（ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させてリアルタイム増幅曲線を得るステップ；（ｂ）上記得られるリアルタイム増幅曲線を分析するステップを含む同時多重的標的核酸の検出方法を用いるか、あるいは（ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させるステップ；（ｂ）温度を変化させつつ上記混成化された産物を融解させて融解曲線を得るステップ；及び（ｃ）上記得られる融解曲線を分析するステップを含む同時多重的標的核酸の検出方法を用いることができる。

［62］本発明において、上記の増幅曲線または融解曲線を得るステップは、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて行い、増幅曲線の分析は、Ｃｔ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して分析することを特徴とすることができる。試料内に標的核酸が存在するか、または試料に含まれた標的核酸の量が多ければ、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに到逹するｃｙｃｌｅ数が少なくなり、Ｃｔ値が少なく測定されるため、標的核酸の有無を確認することができ、初期の標的核酸の量も測定することができる。

［63］また、融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）分析は、一般的にリアルタイムＰＣＲの過程が終わった後に最後に進行される過程であって、サンプルの温度を３０乃至５５℃程度に下げた後に、９５℃まで秒当たり０．５乃至１℃ずつ増加させつつ蛍光のシグナルの大きさを測定し、温度が上がるにつれて検出プローブと標的核酸（検出プローブと相補的に結合可能な標的核酸の片方のストランド）が分離すると、蛍光が消光されて蛍光シグナルが急に落ちるようになるので、メルティングピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）を通じて標的核酸の有無を確認することができる。

［64］本発明の同時多重的標的核酸の検出方法は、１０ｎｇ以下の核酸サンプル試料に０．０１％、０．１％乃至１００％の割合で含まれた標的核酸を検出することができることを特徴とすることができる。

［65］本発明において‘試料’は、多様な試料を含み、好ましくは、本発明の方法を用いて生物試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）を分析する。植物、動物、ヒト、菌類、バクテリア及びウイルス起源の生物試料が分析され得る。哺乳類またはヒト起源の試料を分析する場合、上記試料は、特定組織または器官から来由され得る。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉または神経組織が含まれる。器官の代表的な例としては、目、脳、肺、肝、脾臓、骨髓、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵膓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。分析される生物試料は、生物学的根源から出たいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、または本発明によってよく分析され得るいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これはヒト、動物、ヒトまたは動物の消費のために製造された飲食から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は、体液試料を含み、これは血液、血清、血漿、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球流液、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髓液、虫垂、脾臓及び扁桃腺組織抽出物が含まれるが、これに限定されるものではない。

［66］試料の標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、上記分子は、二重ストランドまたは単一ストランド形体であり得る。初期物質として核酸が二重ストランドでる場合、二つのストランドを単一ストランドに、または部分的な単一−ストランド形態に製造することが好ましい。ストランドを分離することと知られた方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリオキサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質を含むが、これに限定されるものではない。例えば、ストランド分離は８０乃至１０５℃の温度で熱処理して達成されることができる。上述した処理の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１に開示されている。

［67］本発明の一実施例において、標的核酸同時多重検出のための標的核酸は、代表的な体細胞突然変異遺伝子であるＫ−ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子を用いて実験を行い、表５のそれぞれの細胞株から遺伝子を分離して野生型遺伝子に各突然変異遺伝子を１００％、１０％、１％、０％含有されるようにサンプルを作製した（表６）。

［68］上記の野生型遺伝子に含まれた５種の突然変異遺伝子の同時多重検出が可能であることを確認するために、表１の配列番号１５乃至１９をＰＮＡ検出プローブに、配列番号２２をＰＮＡクランピングプローブに、配列番号２０を内部コントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ；野生型遺伝子と相補的に結合）に用い、実施例４−１の方法でＰＮＡプローブＰＣＲプライマー反応混合液を製造して同時多重遺伝型分析のためのリアルタイムＰＣＲ反応及び融解曲線分析を行った。

［69］本発明の方法で野生型及びＫ−ｒａｓ突然変異のリアルタイム増幅曲線及び融解曲線を分析した結果、図５乃至１１に示されたように、野生型に含まれている１％のＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄを同時多重的に検出することができるだけでなく、突然変異遺伝型及び定量も可能であることを確認した。

［70］また、図５乃至１０の増幅曲線を分析した結果、野生型１００％である場合、本発明のＰＮＡクランピングプローブにより野生型遺伝子の増幅が抑制されることを確認することができ、各突然変異検出プローブの融解温度差を用いて少数の蛍光でも多様な突然変異を同時に検出することができることを確認した（図１１及び表８）。

［71］すなわち、本発明の同時多重的標的核酸の検出方法は、クランピングプローブ及び検出プローブに構造的な変化を与えてプローブ間のセルフダイマーまたはヘテロダイマーの融解温度を減少させ、単一塩基変異に対する特異度を増加させることで、生体試料に含まれた極微量の多様な標的核酸を同時多重的に検出し、遺伝型の判別及び定量が可能であることを確認した。

［72］本発明は、他の観点において、本発明の同時多重的標的核酸の検出方法を用い、クランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体を含む標的核酸同時多重検出用キットに関するものである。

［73］本発明において、上記キットは、試料に１乃至１００％の割合で含まれた多様な標的核酸を同時に検出することができ、標的核酸の定量または遺伝型を分析するのに用いることができる。

［74］本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡ重合酵素補助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）を行うのに必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットはまた多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、ならびにＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。

［75］また、キットは、特定反応で用いられる試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得する当業者によって容易く決定され得る。典型的に、本発明のキットは、上記に言及された構成成分を含む別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で作製される。

［77］以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。

［78］［相補的なストランド上で混成化するクランピングプローブ及び検出プローブを含むプローブ混合体システム］

［80］突然変異の検出に用いられたＰＮＡプローブ及びターゲットＤＮＡオリゴマーの合成
［81］１−１：ＰＮＡプローブの作製
［82］本発明の立体構造の変化及び電荷付与を通じた構造的変化を与えた検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及びクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）で構成されたＰＮＡ混合体を用いた突然変異の検出方法の具現及び作動可能性を確認するために、表１のように、ＰＮＡプローブ骨格のガンマ位置に負電荷を有するＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）またはＤ−グルタミン酸（Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、電荷を有さないＬ−アラニン（Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ）またはＤ−アラニン（Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ）、正電荷を有するＬ−リシン（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）またはＤ−リシン（Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ）を結合させたＰＮＡプローブを合成した。

［86］（表１のＰＮＡ配列のうち、数字標識はＰＮＡ配列の一部をＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、Ｄ−ｌｙｓｉｎｅに変形させたものであって、表２参照）

［90］ＰＮＡプローブは、韓国登録特許第４６４、２６１号に記載された方法によりＰＮＡオリゴマーをベンゾチアゾールスルホニル（Ｂｔｓ：Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）基で保護されたＰＮＡ単量体と機能化されたレジンから固体相合成法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）で合成した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、９：３２９１、２００７）。この方法以外にも知られている９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ：９−ｆｌｏｕｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）またはｔ−Ｂｏｃ（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法を用いてＰＮＡを合成することができ（Ｋｉｍ Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５９：５７６７、１９９４；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５１：６１７９、１９９５）、リポーター物質及び消光物質は当業界に広く公知になった方法によりＰＮＡプローブに標識した。

［91］また、配列番号１乃至７、１５乃至１９ＰＮＡプローブは、検出プローブであって、突然変異を検出することができるように製造し、配列番号８乃至１４のＰＮＡプローブは、平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）結合検出プローブで作製した。

［92］１−２：ＤＮＡオリゴマーの作製
［93］上記表１で作製したＰＮＡプローブの特性を分析するために、ＰＮＡプローブと結合をなすターゲットＤＮＡオリゴマー（表３）は、（株）バイオニア（韓国）で合成依頼して用いた。

［97］表１の配列番号１乃至１４に該当するＰＮＡプローブと表３の配列番号２４（＞５−ｕｐ ０Ｃ）は、完全な混成化をなし、配列番号２５（１−ｕｐ ｗｉｌｄ）とは不完全な混成化（単一塩基不一致）をなすように作製した。

［99］融解曲線分析を用いたＰＮＡプローブ特性分析
［100］実施例１−１で製造したＰＮＡプローブのセルフダイマー、ヘテロダイマーの形成及び特異度に関して分析するために、上記の表１のＰＮＡプローブ０．５μＭ、表３のＤＮＡオリゴマー０．５μＭとＰＣＲ増幅溶液（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を入れて混合した後、リアルタイム遺伝子増幅機（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ、ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド、米国）を用いて９５℃で５分間変性ステップを経た後、３０℃まで下げた後に５分間混成化させた後、３０℃から９５℃まで０．５℃ずつ上昇させつつ、蛍光を測定する融解曲線分析を行った。

［101］その結果、グルタミン酸乃至はリシンを結合させた配列番号４、５、６、７プローブとグルタミン酸乃至はリシンを結合させた平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）をする配列番号１１、１２、１３、１４プローブは、配列番号１のＰＮＡプローブと比較したとき、セルフダイマーの融解温度が小くなることを確認し、一例として配列番号１と４を比較した結果を図２に示した。

［102］配列番号２３クランピング用プローブとヘテロダイマーを形成し、逆平行（ａｎｔｉ ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする配列番号１〜７検出用ＰＮＡプローブ、ならびに平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）結合をする配列番号８〜１６検出用プローブを比較したとき、逆平行結合時にヘテロダイマーを形成するが、平行結合時にヘテロダイマーを形成しないということを確認し、一例として配列番号１と２３、８と２３のヘテロダイマー形成を比較した結果を図３に示した。

［103］配列番号１５〜１９検出用ＰＮＡプローブとヘテロダイマーを形成する配列番号２１クランピング用プローブとＬ−グルタミン酸を結合させた配列番号２２クランピング用プローブを比較したとき、Ｌ−グルタミン酸を結合させた配列番号２２クランピング用プローブを用いると、変形されていない配列番号２１クランピング用プローブを用いるときよりヘテロダイマー融解温度が大きく減少することを確認した。一例として配列番号１５と２１、１５と２２のヘテロダイマー形成を比較した結果を図４に示し、配列番号２２クランピングプローブを用いると、配列番号２１クランピングプローブを用いるときよりヘテロダイマー融解温度が約１０℃減少（Ｔｍ：７５．５℃→６５．５℃）することを確認することができる。

［107］また、ＰＮＡ骨格のガンマ位置にＤ−グルタミン酸を結合させて構造的変化（立体構造及び電荷変異）を与えた配列番号３、５、及び７のＰＮＡプローブは、配列番号１のＰＮＡプローブと比較したとき、ターゲットＤＮＡと単一塩基不一致ＤＮＡの融解温度差（ΔＴｍ）が大きく増加することを確認した（表４）。このように、本発明の構造を変形させたＰＮＡプローブは、単一塩基配列変異に対する特異度を増加させて野生型遺伝子と突然変異遺伝子の融解温度差が２０℃以上となるため、融解曲線及び増幅曲線分析時、非特異信号の発生を解決することができる。

［109］体細胞突然変異の同時多重検出のための標的核酸及びプライマーの作製
［110］体細胞突然変異の同時多重検出のための標的核酸は、代表的な体細胞突然変異遺伝子であるＫ−ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子を用いて実験を行った。韓国細胞株銀行からＫ−ｒａｓコドン１２及び１３の野生型細胞株１種（ＨｅＬａ）及び突然変異細胞株５種（ＳＷ−１１１６、Ａ５４９、ＳＷ４８、ＭＩＡ ＰａＣａ２、ＬｏＶｏ）の分譲を受けた（表５）。

［114］分譲を受けた細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に１０％熱−不活性化牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）と１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｋｏｒｅａ）が添加された培地を用いて３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）が維持される培養器で培養した。培養された細胞株は、ＬａｂｏｐａｓｓＴＭティッシュミニキット（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）を用いてキットで提供したマニュアルに基づいてＤＮＡを抽出して標的核酸を確保した。上記で確保された野生型遺伝子に各突然変異遺伝子を１００％、１０％、１％、０％含有されるようにサンプルを作製した（表６）。

［121］また、表５のＫ−ｒａｓ遺伝子の抑制と検出を同時多重で具現するためのプライマーを（株）バイオニア（韓国）で合成依頼して用いた（表７）。

［123］リアルタイムＰＣＲ反応及び融解曲線を用いた同時多重遺伝型分析
［124］４−１：体細胞突然変異の同時多重検出のためのＰＮＡプローブ及びＰＣＲプライマー混合液の作製
［125］体細胞突然変異の同時多重検出のために、表１の配列番号１５ＰＮＡプローブ１３．５μＭ、配列番号１６〜１８のＰＮＡプローブ１８μＭ、配列番号１９のＰＮＡプローブ９μＭ、配列番号２０のＰＮＡプローブ１８μＭ、配列番号２２のＰＮＡプローブ４．５μＭの濃度になるように稀釈させたＰＮＡプローブを同一の量で混合してＰＮＡプローブ混合液を製造した。次に、配列番号２６の正方向プライマー１．５μＭ、配列番号２７の逆方向プライマー２０μＭ濃度になるように稀釈させた後、各プライマーを同一の量で混合した。

［126］上記配列番号１５〜１９は、突然変異検出用プローブ、配列番号２０は内部コントロール、配列番号２２はクランピングプローブとして用いた。

［127］ＰＮＡプローブ混合液及びプライマー混合液を６：４の割合で混合して、５種の体細胞突然変異を同時検出及び変異遺伝型分析が可能なＰＮＡプローブＰＣＲプローブ反応混合液を製造した。

［128］４−２：同時多重遺伝型分析のためのリアルタイムＰＣＲ反応及び融解曲線分析
［129］実施例４−１で製造したＰＮＡプローブＰＣＲプライマー混合液１０μｌ、ＰＣＲ増幅溶液（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）１０μｌを混合した後、実施例３で作製された（表５、表６）各標的核酸を５μｌずつ添加後、リアルタイムＰＣＲ反応を行った（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ、ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド、米国）。ＰＣＲサイクルは、９５℃で１５分間反応後、９５℃１０秒、７６℃７秒、５３℃２０秒、７２℃２０秒の反応過程を４５ｃｙｃｌｅ繰り返し、蛍光検出は５３℃で測定し、この後、蛍光測定なしに９５℃１０秒、７６℃７秒、５３℃２０秒、７２℃２０秒の反応過程を１０サイクル繰り返してＰＣＲ反応を完了した。ＰＣＲサイクルの完了後、９５℃で５分間変性ステップを経た後、４８℃まで下げた後に５分間混成化させた後、４８℃から９５℃まで０．５℃ずつ上昇させて蛍光を測定する融解曲線分析を行った。

［130］各標的核酸に対する増幅曲線と融解曲線の結果は、図５乃至１０に示し、遺伝型分析のための各ＰＮＡプローブとそれに当たる標的核酸の融解曲線分析値は表８に示した。また、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃに対する単一チャンネル融解曲線併合結果は図１１に示した。

［134］野生型及びＫ−ｒａｓ突然変異融解曲線を分析した結果、野生型に含まれている１％のＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄが同時多重的に検出が可能であることを確認した。

［135］また、Ｋ−ｒａｓ野生型遺伝子と相補的な配列番号２０検出用プローブの増幅曲線分析を通じて本発明の構造的に変化させたＰＮＡクランピングプローブによる野生型遺伝子の増幅が抑制されることを確認することができると同時に、ＰＣＲ反応有効性に対する判断根拠となることを確認した。

［137］ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎ検出−ＰＮＡクランピングを通じた体細胞突然変異の検出
［138］本発明の検出プローブがＰＮＡ以外の他の核酸類似体である場合も、体細胞突然変異の検出が可能であるか否かを確認するためにＭＧＢ−ｔａｑｍａｎを検出プローブで用いてＥＧＦＲ遺伝子突然変異を検出した。

［139］５−１：体細胞突然変異標的核酸の作製
［140］韓国細胞株銀行から野生型細胞株であるＡ５４９を、ＡＴＣＣからＥＧＦＲ遺伝子突然変異細胞株であるＨ１９７５の分譲を受けて標的核酸を作製した（表９）。

［144］標的核酸の作製及び確保は、実施例３と同一の方法で行い、野生型遺伝子に各突然変異遺伝子を１００％、１０％、１％、０％含有されるようにサンプルを作製した。

［145］５−２：体細胞突然変異の同時多重検出のためのＰＮＡプローブ及びＰＣＲプライマー混合液の作製
［146］突然変異検出のためのプライマー（配列番号２８、２９）は、（株）バイオニア（韓国）で合成依頼して用い（表１０）、ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎ突然変異検出用プローブ（配列番号３０）は、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）に合成依頼して用いた（表１１）。ＰＮＡクランピングプローブは実施例１に明示された方法と同一の方法で合成された。

［153］突然変異検出用ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎプローブ−野生型クランピング用ＰＮＡプローブシステムが互いに異なるストランドで検出とクランピングが可能であるか否かを確認するために、全体２５μｌのボリュームに正方向プライマー（配列番号２８）１．６μＭ、逆方向プライマー（配列番号２９）０．４μＭ、ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号３０）０．８μＭ、ＰＮＡクランピングプローブ（配列番号３１）４μＭ、実施例４で明示されたＰＣＲ増幅溶液１０μｌ、実施例５−１で作製された各標的核酸５μｌを添加後、リアルタイムＰＣＲ反応を行った（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ、ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド、米国）。

［154］ＰＣＲサイクルは、９５℃で１５分間反応後、９５℃１０秒、６０℃２０秒、７２℃２０秒の反応過程を４５ｃｙｃｌｅ繰り返し、蛍光は６０℃で測定した。その結果、互いに異なるストランドで突然変異検出用ＭＧＢ−ｔａｑｍａｎプローブ−野生型クランピング用ＰＮＡプローブシステムが作動することをリアルタイム増幅曲線分析を通じて確認し、結果は図１２に示した。

［155］［同一ストランド上で競争的に混成化するクランピングプローブ及び検出プローブを含むプローブ混合体システム］

［157］突然変異検出のために用いられたＰＮＡプローブの準備及び特性分析
［158］６−１：ＰＮＡプローブの作製
［159］ＰＮＡプローブ及びＰＮＡの立体構造及び電荷付与を通じて構造的変化を与えた検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及びクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）で構成されたＰＮＡ混合体を用いて突然変異検出のために表１２のようにＰＮＡプローブを合成した。

［163］（表１２のＰＮＡ配列中で数字標識はＰＮＡ配列の一部をＤ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、に変形させたものであって、表１３参照）

［167］Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝型検出のための検出プローブは、変形されていないプローブ及びＰＮＡプローブ骨格のガンマ位置に負電荷を有するＤ−グルタミン酸の側鎖を結合して用いた。また、野生型クランピングプローブは、野生型遺伝子と検出プローブが競争的に結合できるように同一方向で作製した。

［168］６−２：融解曲線分析を用いたＰＮＡプローブの特異性分析
［169］表１２で製造したＰＮＡプローブ配列とＤＮＡターゲットとの間の結合特異性は、検出ＰＮＡプローブ１０μＭと野生型クランピングＰＮＡプローブ４μＭ、ターゲットＤＮＡ及びＰＣＲ増幅溶液（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を混合してＰＣＲ反応後、融解曲線分析を通じてＰＮＡプローブの特異性を分析した。ＰＣＲ反応は、リアルタイム遺伝子増幅機（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ、ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド、米国）を用いた。その結果、ＰＮＡプローブ配列と混合したターゲットの配列一致率により融解曲線が明確に区分されるプローブを確認した。配列番号３３、３４ ３７、３８検出プローブでターゲットＤＮＡの塩基配列別選別能に優れたグラフを確認した（図１３、１４、１５）。検出プローブと塩基配列が完全に一致するターゲットと不一致するターゲットとの間に発生するＴｍ分析結果の例示は表１４に示した。

［174］体細胞突然変異の検出のための標的核酸及びプライマーの作製
［175］標的核酸の作製及び確保は、実施例３と同一の方法で行い、野生型遺伝子に各突然変異遺伝子を１％、０．１％、０．０１％、０％含有されるようにサンプルを作製した（表１５）。

［179］また、表１５のＫ−ｒａｓ遺伝子の検出のためのプライマーは、表１６のようにデザインし、（株）バイオニア（韓国）で合成依頼して用いた。

［184］リアルタイムＰＣＲ反応及び融解曲線を用いた同時多重遺伝型分析方法の検出敏感度の向上
［185］８−１：体細胞突然変異の同時多重検出及び検出敏感度の向上のためのＰＮＡプローブ及びＰＣＲプライマー混合液の作製
［186］体細胞突然変異の同時多重検出及び敏感度の向上のために、表１２のプローブを配列番号３５または３６クランピングＰＮＡプローブ４μＭ、配列番号３２〜３４、３７〜３８ＰＮＡプローブ１０μＭの濃度になるようにそれぞれ稀釈してＰＮＡプローブ混合液を製造した。次に、配列番号３９及び４０の正方向プライマー３μＭ、配列番号４１及び４２の逆方向プライマー１０μＭ濃度になるように稀釈後、各プライマーによる結果を確認した。

［187］表１５で準備した標的核酸を用いて体細胞突然変異の検出有無及び検出敏感度を確認した（図１３、１４、１５）。

［188］８−２：リアルタイムＰＣＲ反応及び融解曲線分析を通じた検出敏感度の確認
［189］８−１で製造したＰＮＡプローブＰＣＲプライマー混合液１０μｌ、ＰＣＲ増幅溶液（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）１０μｌを混合した後、準備したターゲットＤＮＡ試料をそれぞれ５μｌずつ添加してリアルタイムＰＣＲ反応を行った（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ、ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド、米国）。ＰＣＲサイクルは大きく、クランピング反応、検出反応及び融解反応の３つのステップに分けて進行し、９５℃で１５分間反応後、９５℃３０秒、７０℃２０秒、６３℃３０秒、７２℃３０秒の反応過程を蛍光測定なしに１５ｃｙｃｌｅ繰り返した後、９５℃で１０秒、５３℃２０秒、７２℃２０秒の反応過程を４０ｃｙｃｌｅ行い、蛍光は５３℃で測定した。その後、９５℃で１５分間維持後、３５℃まで下げた後に５分間混成化させた後、３５℃から７５℃まで０．５℃ずつ上昇させつつ蛍光を測定して融解曲線分析を行った。

［190］その結果、配列番号３３の検出プローブの場合、ターゲットＤＮＡ試料のうちＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ及びＧ１２Ｖのそれぞれに対する融解温度が互いに異なり（図１３（Ａ））、配列番号３４の検出プローブの場合も、ターゲットＤＮＡ試料のうちＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ及びＧ１２Ｖのそれぞれに対する融解温度が互いに異なり（図１３（Ｂ））、一つの検出プローブのみで多数の突然変異遺伝子を検出することができることを確認した。

［191］すなわち、検出プローブとクランピングプローブを同一のストランドでデザインしてターゲットと競争的な反応をするシステムもまた一つのチューブ内で各突然変異検出プローブを融解温度の差を用いて２個の蛍光（リポーター）のみで、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃを同時多重的に検出することができることを確認した。

［192］また、各突然変異遺伝子ｃｌｏｎｅ １０４コピーを１００％と定め、確保された野生型遺伝子（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ）ＤＮＡ ２５ｎｇに順次的に稀釈し、野生型遺伝子に各突然変異遺伝子（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ）を１％、０．１％、０．０１％、０％含有されるようにサンプルを作製して上記のような方法でＰＣＲ反応を行った結果、野生型遺伝子の場合、本発明のＰＮＡクランピングプローブにより増幅が抑制され、０．０１％で含まれた突然変異の検出も可能であることを確認した（図１４）。

［193］以上に本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。

Claims (24)

1. 標的核酸をリアルタイムで検出するための一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及び野生型遺伝子または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を含み、
   増幅曲線及び融解曲線を同時分析し、０．０１％突然変異までリアルタイム及び同時多重的に検出するためのプローブ混合体であって、
   前記検出プローブまたはクランピングプローブは、構造的変形のためにアミノ酸またはアミノ酸の側鎖が結合されており、前記アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−リシン及びＤ−リシンからなる群より選択されるものである、プローブ混合体。
2. 前記検出プローブまたはクランピングプローブは核酸類似体であって、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする請求項１に記載のプローブ混合体。
3. 前記アミノ酸はプローブのＮ末端またはＣ末端位置に結合されることを特徴とする請求項１に記載のプローブ混合体。
4. 前記アミノ酸の側鎖は、プローブ骨格のアルファ、ベータまたはガンマ位置に結合されることを特徴とする請求項１に記載のプローブ混合体。
5. 前記検出プローブは、リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたことを特徴とする請求項１に記載のプローブ混合体。
6. 前記リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインクロロトリアジニル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ロダミングリーン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）、ロダミンレッド（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ）、テトラメチルロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ）、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ＴＥＴ、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系列染料及びチアジカルボシアニン（ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）染料で構成された群より選択された一つ以上の蛍光物質であることを特徴とする請求項５に記載のプローブ混合体。
7. 前記消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＴＡＭＲＡ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＤＱ、ＱＳＹ、ブラックベリークエンチャ（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ブラックホールクエンチャ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｑｘｌ、アイオワブラック（Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ）ＦＱ、アイオワブラックＲＱ及びＩＲＤｙｅ ＱＣ−１群より選択された一つ以上であることを特徴とする請求項５に記載のプローブ混合体。
8. 標的核酸をリアルタイムで検出するための一つ以上の検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）及び野生型遺伝子または望まない遺伝子の増幅を抑制するクランピングプローブ（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を含むプローブ混合体を用いた同時多重的標的核酸の検出方法であって、
   増幅曲線及び融解曲線を同時分析し、０．０１％突然変異までリアルタイム及び同時多重的に検出することができ、
   前記検出プローブまたはクランピングプローブは、構造的変形のためにアミノ酸またはアミノ酸の側鎖が結合されており、前記アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−リシン及びＤ−リシンからなる群より選択されるものである、同時多重的標的核酸の検出方法。
9. 前記検出プローブまたはクランピングプローブは核酸類似体であって、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
10. 前記アミノ酸はプローブのＮ末端またはＣ末端位置に結合されることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
11. 前記アミノ酸の側鎖は、プローブ骨格のアルファまたはベータ、ガンマ位置に結合されることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
12. 前記検出プローブは、リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及び消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたことを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
13. 前記リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインクロロトリアジニル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ロダミングリーン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）、ロダミンレッド（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ）、テトラメチルロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ）、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ＴＥＴ、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系列染料及びチアジカルボシアニン（ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）染料で構成された群より選択された一つ以上の蛍光物質であることを特徴とする請求項１２に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
14. 前記消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＴＡＭＲＡ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＤＱ、ＱＳＹ、ブラックベリークエンチャ（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ブラックホールクエンチャ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｑｘｌ、アイオワブラック（Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ）ＦＱ、アイオワブラックＲＱ及びＩＲＤｙｅ ＱＣ−１群より選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１２に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
15. 野生型遺伝子と相補的に結合して重合酵素の伸長反応を抑制するクランピングプローブを用いて標的核酸遺伝子を選択的に増幅させ、標的核酸を検出するための一つ以上の検出プローブを用いて同時多重的に標的核酸有無または濃度を検出することを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
16. 前記検出プローブ及びクランピングプローブは、標的とする核酸鎖の同一ストランドに結合して野生型遺伝子の抑制及び標的核酸遺伝子の検出が同時になされることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
17. 前記検出プローブ及びクランピングプローブは、標的とする核酸鎖の互いに異なるストランドに結合して野生型遺伝子の抑制及び標的核酸遺伝子の検出が同時になされることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
18. プローブ混合体を用いた標的核酸の検出は、リアルタイム増幅曲線及び融解曲線の同時分析が可能であることを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
19. （ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させてリアルタイム増幅曲線を得るステップ；（ｂ）前記増幅過程の後、温度を変化させつつ増幅産物と検出プローブとの間の融解曲線を得るステップ；及び（ｃ）前記得られるリアルタイム増幅曲線及び融解曲線を別途に分析するか、あるいは順次的または同時に分析するステップ；を含むことを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
20. 前記増幅は、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて行うことを特徴とする請求項１９に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
21. 前記（ｂ）ステップの融解曲線を得るステップの前に、リアルタイム増幅曲線を得るステップとは別途に５乃至２０のＰＣＲサイクルを追加することを特徴とする請求項１９に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
22. （ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させてリアルタイム増幅曲線を得るステップ；（ｂ）前記得られるリアルタイム増幅曲線を分析するステップ；を含むことを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
23. （ａ）標的核酸が含まれている検体試料にクランピングプローブ及び検出プローブで構成されたプローブ混合体及びプライマーを混合して混成化させるステップ；（ｂ）温度を変化させつつ、前記混成化された産物を融解させて融解曲線を得るステップ；及び（ｃ）前記得られる融解曲線を分析するステップ；を含むことを特徴とする請求項８に記載の同時多重的標的核酸の検出方法。
24. 請求項１〜７の何れか一項に記載のプローブ混合体を含む標的核酸同時多重検出用キット。