JP2016535987A - 核酸配列の合成及び濃縮 - Google Patents

核酸配列の合成及び濃縮 Download PDF

Info

Publication number
JP2016535987A
JP2016535987A JP2016524530A JP2016524530A JP2016535987A JP 2016535987 A JP2016535987 A JP 2016535987A JP 2016524530 A JP2016524530 A JP 2016524530A JP 2016524530 A JP2016524530 A JP 2016524530A JP 2016535987 A JP2016535987 A JP 2016535987A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
target
temperature
blocker
melting temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2016524530A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016535987A5 (ja
Inventor
プール、ジェイソン
ハンコック、ゼーゲ
コスコ、カレナ
メルニコワ、ヴラダ
クラウチャー、ピーター
ル、ティム
エルランデル、マーク、ジー．
サミュエルズ、エリン
Original Assignee
トローバジーン インコーポレイテッド
トローバジーン インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トローバジーン インコーポレイテッド, トローバジーン インコーポレイテッド filed Critical トローバジーン インコーポレイテッド
Priority claimed from PCT/US2014/061435 external-priority patent/WO2015073163A2/en
Publication of JP2016535987A publication Critical patent/JP2016535987A/ja
Publication of JP2016535987A5 publication Critical patent/JP2016535987A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、サンプル中、対応する非ターゲット又はリファレンス核酸配列と比較して少量で存在するターゲット核酸配列の濃縮に関する。特に、当該方法は、少量の配列を数桁濃縮することにより、ターゲット配列の検出感度を実質的により高レベルにすることを可能にする。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年10月20日出願の米国仮特許出願第61/893,283号、2013年11月14日出願の米国仮特許出願第61/904,141号、及び2014年8月20日出願の米国仮特許出願第62/039,905号（これらは全て、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本開示の分野
BRAF及びKRASにおける変異は、癌細胞に対して生存及び増殖の利点を付与する遺伝子変化の例である。かかる遺伝子変化は、標的療法を選択するために使用され得る。しかし、対象において、その変化は、過剰な不変野生型配列とともに存在する。
本開示は、1以上の変化（alterations）又は変異（mutation）を含むターゲット核酸配列を合成及び濃縮することに関し；該ターゲット配列は、生物学的サンプル中に存在する高類似性の野生型配列と比較して少量（low abundance）で存在するものである。ターゲット核酸配列の優先的及び特異的な濃縮により、これまで達成されていない、実質的に高感度レベルの検出が提供される。開示する方法はまた、ターゲット配列の定量的検出も可能にする。
本開示の背景
多くの疾患及び特に癌は、単一点突然変異や小さな塩基対の挿入／欠失などの遺伝子変異と関連する。これらの稀なアレルを検出するための現行の方法は、そのほとんどすべてが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に頼る。しかし、PCRに基づく方法の主な限界は、サンプル内の正常（野生型）配列の相対存在量が多いことに起因して、低感度であり、正常（野生型）配列が優先的に増幅される点にある。多くの場合、変異アレルの検出は、変異アレルが、存在する全アレルの5〜10％超を占めるまでは不可能である。従って、バリアント配列が非バリアント（ターゲット）配列と比較して低いパーセンテージで存在する、野生型DNA配列のバックグラウンドにおいて、遺伝子変異を検出する能力は有益であり、非常に望ましい。
増幅後のシーケンシングアッセイを必要とすることなく、変異遺伝子の選択的増幅を可能にする改変されたPCR方法が記載されている。かかる方法には、以下が含まれる：Restriction endonuclease-mediated selective PCR: a novel assay for the detection of K-ras mutations in clinical samples. Am J Pathol 153:373-379), Detection of tumor mutations in the presence of excess amounts of normal DNA. Nat Biotechnol 20:186-189; “locked nucleic acid”) COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR) (Li, J., et al., 2008. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 14:579-584.), US20130149695 (Method for detecting genetic mutation by using a blocking primer), US8623603 (Full cold-PCR enrichment with reference blocking sequence); USPN 8455190 (Enrichment of a target sequence); WO2003072809 (Melting Temperature Dependent DNA Amplification)など。
COLD-PCR技術は、実施が比較的単純であるが、増幅率（amplification factor）が低く（3〜100×）、わずかな温度変化に対して感度が低い（Li, J., et al., 2008. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 14:579-584, Luthra, R., et al., 2009. COLD-PCR finds hot application in mutation analysis. Clin Chem 55:2077-2078）。他の方法、例えば、Molloy et al.（WO2003072809）に記載される方法などは、ターゲット配列を選択的に増幅するために、より低い変性温度の使用を必要とする。従って、Molloyは、野生型配列よりも低い融解温度（Tm）を有するターゲット配列に対してのみ適用可能である。
癌組織や循環細胞中の核酸、及び体液中に存在するセルフリー（cell-free）（cf）核酸は、かかる遺伝子変化と関連する癌又は他の疾患を有する個体を同定及び選択するのに役立ち得る。BRAF及びKRASにおける変異は、癌細胞に対して生存及び増殖の利点を付与する遺伝子変化の例である。かかる遺伝子変化は、標的療法を選択するために使用され得る。しかし、対象において、その変化は、過剰な不変野生型配列とともに存在する。
例えば、Spindler et al., 2012；Benesova et al., 2013；Dawson et al., 2013；Forshew et al., 2012；Shaw et al., 2012を参照。いくつかのデータは、血中の変異DNA量が、全身腫瘍組織量と相関し、耐性変異の出現を同定するために使用され得ることを示唆する（Forshew et al., 2012；Murtaza et al., 2013；Dawson et al., 2013；Diaz et al., 2012；Misale et al., 2012；Diehl et al., 2008）。
より高い感度及び／又はターゲット配列の濃縮を効率良く容易に達成できる更なる方法が必要とされている。本発明は、このニーズに対応する。
本開示の要旨
本開示は、天然の核酸、DNA又はRNA配列のバックグラウンドを有する、変化した、変異による、非野生型の核酸配列、又は生物学的サンプル中に通常存在しない他の核酸など、少量の核酸配列（ターゲット配列）を実質的に濃縮及び検出するための方法であって、少量の核酸配列の検出において数桁（orders of magnitude）高い感度を依然として可能にしつつ、より少ないステップ及び大幅に短縮された反応アッセイ時間を利用する、方法の開発に一部基づく。当該方法は、短い、フラグメント化された形態（＜50 bp）で存在する変異配列の濃縮を可能にするために開発され、ほとんどフラグメント化されていない配列（＞50 bp）の増幅にも適用可能である。本方法の適用により、非ターゲット又は野生型核酸の高いバックグラウンド内で少量の核酸配列を濃縮することが可能であり、わずか単一コピーのターゲット配列を生物学的サンプル内で検出することができる。濃縮は、その優先的な増幅を介してターゲット配列の量を相対的に増加させること、ひいては同じ生物学的サンプル内に存在する他の核酸と比較して実質的に高く（700×〜10000×倍以上）濃縮することに基づく。
第一の側面において、本開示は、増幅反応混合物においてターゲット核酸配列を濃縮するための方法を提供する。当該方法は、以下を含んでよい：
a）リファレンス（任意選択で、野生型）配列を含み、且つ1以上のターゲット（任意選択で、変異）配列であって、該リファレンス配列と少なくとも50％相同であるとともに該リファレンス配列と同じプライマー対により増幅可能でもあるターゲット配列を有すると少なくとも思われる、核酸サンプルと、そのプライマー部位間で該リファレンス配列の鎖の1つの配列の少なくとも一部と完全に相補的である過剰量のリファレンスブロッキング核酸配列と、を含む増幅反応混合物を調製すること；
b）変性リファレンス鎖及び変性ターゲット鎖を形成するために、リファレンス配列の融解温度（Tm）より高く且つ二本鎖ターゲット配列の融解温度（Tm）よりも高い第一の変性温度まで、該反応混合物の温度を上昇させること；
c）リファレンスブロッキング配列と相補的リファレンス鎖との二本鎖、及びリファレンスブロッキング配列とターゲット鎖とのヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、該反応混合物の温度を低下させること；
d）リファレンスブロッキング配列とリファレンス鎖との二本鎖の変性に優先して、リファレンスブロッキング配列とターゲット鎖との前記ヘテロ二本鎖の優先的な変性を可能にするのに十分な臨界温度（Tc）まで、該反応混合物の温度を上昇させること；
e）該反応混合物中、プライマー対が、変性ターゲット鎖及び任意の変性リファレンス鎖とアニーリングすることを可能にするために、該反応混合物の温度を低下させること；
f）該反応混合物中、変性ターゲット鎖及び変性リファレンス鎖とアニーリングしたプライマーを伸長させるために変性リファレンス鎖及び変性ターゲット鎖を形成するために、リファレンス配列の融解温度（Tm）より高く且つ二本鎖ターゲット配列の融解温度（Tm）よりも高い変性温度まで、該反応混合物の温度を上昇させること；並びに
g）c）からf）を2サイクル以上繰り返して、該反応混合物中、リファレンス配列と比較してターゲット配列を濃縮すること。
サブパラグラフf）における温度上昇は、アニーリングしたプライマーを伸長させるための別個の「ステップ」としていずれか1つの温度を維持することなく実施される。別の言い方をすれば、反応混合物の温度は、サブパラグラフe）の温度に達した後、f）における変性温度に達するまで、継続的に上昇させる。任意選択で、サブパラグラフf）の変性温度は、b）における温度と同一である。従って、いくつかの実施態様において、サブパラグラフf）及びg）における行為は、b）からe）を2サイクル以上繰り返して、該反応混合物中、リファレンス配列と比較してターゲット配列を濃縮する行為と置き換えられる。
本開示はまた、非ターゲット核酸配列の高いバックグラウンド中に含まれる少量の核酸配列（ターゲット配列）を実質的に濃縮及び検出しながら方法反応時間を短縮する、2ステップ、3ステップ又は4ステップの増幅サイクルを可能にする、アンプリコン及び／又はターゲット配列のキネティクスに基づくアレル特異的競合サイクリングアッセイ（allele specific competitive cycling assay）（ASCC）デザインも提供する。
本開示はまた、リファレンスブロッカーオリゴヌクレオチド及びプライマー結合キネティクスに基づく、短いアンプリコン（＜50 bp）のための、また大きなアンプリコン（＞50 bp)にも適した、アレル特異的競合サイクリングアッセイ（ASCC）デザインも提供する。リファレンスブロッカーは短いブロッカー配列であり、非ターゲット核酸配列の高いバックグラウンド中に含まれる少量の核酸配列（ターゲット配列）を実質的に濃縮及び検出しながら方法反応時間を短縮する、2ステップ、3ステップ又は4ステップ増幅サイクルを可能にする。
本開示はまた、短いアンプリコンについて、可変配列を有する位置でのミスマッチに起因して、リファレンスブロッカー - リファレンス配列Tmとリファレンスブロッカー - ターゲット配列Tmとの間に融解温度の有意な差を得ることができるという発見に一部基づく。従って、本開示はまた、約80 bp以下又は約60 bp以下又は40 bp以下、又は約12 bp〜35bpの間の長さの短いリファレンスブロッカーを利用する、少量の核酸配列（ターゲット配列）を濃縮及び検出するための方法も提供する。さらに、本開示は、多量（greater abundance）の非ターゲット配列、例えば、天然、野生型、又はリファレンス配列などを有するサンプル中に存在する少量の核酸配列（ターゲット）を実質的に濃縮及び検出するための定量的方法を提供する。
実質的に濃縮されたターゲット核酸配列は、患者において変異核酸配列（例えば、ターゲット配列）の存在を検出又は定量化することによる、患者における癌のモニタリング又は検出に対して高い検出感度を提供するために使用されてよい。ターゲット配列には、例えば、BRAF、EGFR、c-MET、HER-2、HER-3、NRAS、KRAS、PIK3CA、AKT-1、MAP2PK、ER、AR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、PDGFR1、PDFGR2、PDGFR3、TP53、SMAD1などの癌関連変異型が含まれる。
また、低侵襲性患者サンプリング方法を用いて得られたサンプル中、低レベルのターゲット配列を実質的に濃縮する、セルフリー（cell-free）DNA(cfDNA)を使用する方法も含まれる。
一側面において、1以上の少量ターゲット配列を含むと思われる核酸サンプルにおいて、ターゲット核酸配列を濃縮するための方法であって、
a．以下を含む反応混合物を調製すること：リファレンス配列、該混合物においてリファレンス配列の量と比較して過剰なブロッキング配列、及び含むと思われる1以上のターゲット配列
（ここで、
該ターゲット配列は、リファレンス配列に対して少なくとも50％相同であり；
該ブロッキング配列は、リファレンス配列の領域と完全に相補的であり、該リファレンス配列の領域は、ターゲット配列の間にあるか又はオーバーラップするものである）；
b．該反応混合物を、以下の2サイクル以上に供すること：
i．リファレンス配列とアニーリングしたブロッカー配列の変性を可能とするが必須ではない、予め選択した変性温度（Tsd）（ここで、Tsdは、リファレンス配列 - ブロッカー配列二本鎖の計算上の融解温度より高い）まで、該反応混合物の温度を加熱すること、及び
ii．濃縮されたターゲット配列を形成するために、プライマーアニーリング及びその相補的ターゲット配列からの1以上のプライマーの伸長を可能にする伸長温度まで、該反応混合物の温度を低下させること；
を含む、方法を提供する。
別の側面において、1以上の少量ターゲット配列を有すると思われるサンプルにおいて、ターゲット核酸配列を濃縮するための方法であって、
a）リファレンス配列、該リファレンス配列と完全に相補的な過剰なブロッキング配列、及び該ターゲット配列の領域と完全に相補的なプライマー対（ここで、該ターゲット配列は、リファレンス配列と少なくとも50％の相補性を有する）、を含む反応混合物を調製すること、並びに該反応混合物を以下の2サイクル以上に供すること：
i）ターゲット配列ホモ二本鎖の変性を可能にするために、ターゲット配列の融解温度より高く、且つリファレンス配列ホモ二本鎖又はブロッカー - リファレンス配列二本鎖の融解温度よりも低い選択的温度（Tsd）；並びに
ii）プライマー：ターゲット配列の伸長、及び該反応混合物中、リファレンス配列と比較したターゲット配列の濃縮を可能にするために、ブロッカー - ターゲット二本鎖の融解温度より高い温度まで、該反応混合物の温度を低下させること；
を含む、方法を提供する。
別の側面において、1以上の少量ターゲット配列を有すると思われるサンプルにおいて、ターゲット核酸配列を濃縮するための方法であって、
a）リファレンス配列、該リファレンス配列と完全に相補的な過剰なブロッキング配列、及び該リファレンス配列の間にあるか又はオーバーラップする該ターゲット配列の領域と完全に相補的なプライマー対（ここで、該ターゲット配列は、リファレンス配列と少なくとも50％の相補性を有する）、を含む反応混合物を調製すること、並びに該反応混合物を、以下の2サイクル以上に供すること：
i）ホモ二本鎖リファレンス及びターゲット配列の変性を可能にするのに十分な第一の温度まで、該反応混合物を加熱すること；
ii）ターゲット - ブロッカー二本鎖配列と比較してリファレンス - ブロッカー二本鎖配列の優先的な形成を可能にする温度まで、該反応混合物を冷却すること；
iii）ブロッカー - ターゲット二本鎖配列の変性を可能にするために、選択的変性温度（Tsd）まで、該反応混合物を加熱すること；並びに
iv）ターゲット配列とアニーリングしたプライマー配列の伸長、及び該反応混合物中、リファレンス配列と比較したターゲット配列の実質的濃縮を可能にするために、ブロッカー - リファレンス配列；プライマー対；及びブロッカー - 変異配列、の融解温度より低い温度まで、該反応混合物を冷却すること；
を含む、方法を提供する。
任意選択で、ブロッカー：変異配列は、上記ステップivの反応温度よりも低い融解温度を有してよい。
別の側面において、少量のターゲット配列の優先的増幅及び実質的に高い濃縮を可能にする、プライマー配列のデザインを最適化するための方法を提供する。また、リファレンス、天然又は野生型核酸の大多数のバックグラウンドを有するサンプル中に存在する少量のターゲット配列を増幅するための一本鎖オリゴヌクレオチドDNAプライマーも提供する。
一実施態様において、選択的変性のために選択される温度（Tsd）は、ターゲット配列の融解温度であるか又は該融解温度より高くてよい。
別の実施態様において、選択的変性のために選択される温度（Tsd）は、ターゲット配列の融解温度よりも実質的に高くてよい。
別の実施態様において、選択的変性のために選択される温度（Tsd）は、ターゲット配列の融解温度より低くてよい。
リファレンスブロッキング配列又は短いブロッキング配列は、変性ターゲット鎖の一部と相補的であってよく、それはそれ自体も、使用されるプライマーの一方又は両方の3’末端の少なくとも一部と相補的である。
リファレンスブロッキングオリゴヌクレオチドは、伸長を阻害するためにブロックされる3’末端を含んでよい。任意選択で、同じオリゴヌクレオチドの5’末端もブロックされてよい。非限定的な例として、リファレンスブロッキングオリゴヌクレオチド鎖（複数可）は、Taq DNAポリメラーゼによる5’から3’へのエキソヌクレオリシス（exonucleolysis）を妨げるヌクレオチドを含む5’末端を含んでよい。なお更なる実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、一本鎖核酸リファレンスブロッキング配列であってよく；b）において、反応混合物を第一の変性温度まで加熱した際に、一本鎖リファレンスブロッキング配列を形成するよう変性する、二本鎖核酸リファレンスブロッキング配列であってよく；一本鎖のDNA、RNA、ペプチド核酸又はロックド核酸であってよく；或いは、一本鎖のDNA、RNA、ペプチド核酸又はロックド核酸又は別の修飾ヌクレオチド間のキメラであってよい。
いくつかの場合、リファレンスブロッキングオリゴヌクレオチドは、3'-endoのコンフォメーションで「ロック」されるリボース糖部分を有する1つ以上のロックド核酸（locked nucleic acid）（LNA）ヌクレオチドを有するDNA残基を含有してよい。かかるLNAリファレンスブロッキングオリゴヌクレオチドの使用は、本開示のリファレンス配列及びターゲット配列の両方について該オリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させるために使用されてよい。
いくつかの側面において、リファレンスブロッキングオリゴヌクレオチドは、より短い塩基対配列を含んでよく、ここで、該ブロッキングオリゴヌクレオチド配列は、野生型（非ターゲット）DNA配列又はアレルに対して相補的又は特異的である。かかる短い配列のオリゴヌクレオチド（「短いブロッカー」）は、フォワード鎖又はリバース鎖のいずれかと相補的であってよい。任意選択で、短いブロッカーは、その野生型のオリゴヌクレオチド配列の融解温度とほぼ同じ又はそれより高い融解温度を有する。任意選択で、ブロッカー配列と、同じ鎖のプライマー配列とのいくつかの又は部分的なオーバーラップが存在してよい。任意選択で、短い配列のブロッキングオリゴヌクレオチドは、所望のとおり、LNA（複数可）を含有してよい。短い配列は、好ましくは、約80 bp長以下、又は約60 bp長以下、又は約40 bp長以下、又は約12 bpから約60 bp長の間である。
ペプチド核酸又はLNAのいくつかの場合において、キメラブロッキングオリゴヌクレオチド上のペプチド核酸又はロックドヌクレオチドの位置（複数可）は、変異が存在すると思われる又は存在することが知られている位置（複数可）とマッチするように選択され、それにより、リファレンスブロッキング配列とターゲット鎖とのヘテロ二本鎖を変性させるのに必要とされる温度と、リファレンスブロッキング配列と相補的リファレンス鎖とのヘテロ二本鎖を変性させるのに必要とされる温度との間の差が増加する。
他の実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、そのプライマー結合部位間で、又はプライマー結合部位といずれかの末端でオーバーラップして、リファレンス配列の鎖の1つと完全に相補的である。更なる実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、リファレンス配列に等しいか又は該配列よりも短い。なお更なる実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、プライマー対のプライマーと比較してモル過剰で反応混合物中に存在する。他のバージョンにおいて、二本鎖ターゲット配列の融解温度は、二本鎖リファレンス配列の融解温度よりも高いか、又は該温度に等しい。更なるバージョンにおいて、Tsdは、1秒間から60秒間維持される。
別の側面において、当該方法は、リファレンス配列を有し、且つ1以上のターゲット配列であって、該リファレンス配列と少なくとも50％相同であるとともに該リファレンス配列と同じプライマー対により増幅可能でもあるターゲット配列を有すると思われる、核酸サンプルと、過剰量のブロッキング核酸配列と、を含む反応混合物の使用を含む。別の側面において、プライマー配列は、リファレンス配列と相補的であり、その後の変異検出方法（次世代シーケンシングを含むが、これに限定されない）での組込みのためのタグ配列も含有する。
反応混合物をPCRに供することによりリファレンス及びターゲット配列を最初に増幅し、次いで、該反応混合物の少なくとも一部を上記濃縮方法に供する方法が本開示に含まれる。いくつかの場合、PCRによる最初の増幅は、10サイクル以下、8サイクル以下、又は6サイクル以下であってよい。他の場合において、PCRによる最初の増幅は、10サイクル以上であってよい。
別の実施態様において、ターゲット配列は、ヒト患者などの対象において、ホモ接合変異のものであってよい。いくつかの場合、リファレンス及びターゲット配列は、KRAS配列であり、任意選択でヒトKRAS配列である。他の実施態様において、ターゲット配列は、BRAF配列における変異を含んでよい。いくつかの場合、変異は、ヒトBRAF配列におけるものである。任意選択で、変異は、BRAFアミノ酸配列の600位のバリン変異として当業者に知られる、V600E、V600K、V600D又はV600Rの変異であってよい。
一実施態様において、ターゲット配列は、BRAF、EGFR、c-MET、HER-2、HER-3、NRAS、PIK3CA、KRAS、AKT-1、MAP2PK、ER、AR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、PDGFR1、PDFGR2、PDGFR3、TP53、SMAD1又は他の遺伝子の癌関連変異配列であってよい。
他の側面において、リファレンス及びターゲット配列は、尿、血液、血清又は血漿などの体液から任意選択で得られてよい、セルフリーDNA(cfDNA)である。
いくつかの実施態様において、開示するプライマー対は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれが、その3’末端にて、二本鎖ターゲット配列の1つの鎖と相補的である配列を含むものである。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーの一方又は両方は、その5’末端にて、ターゲット配列中には見られない異種配列を含む。異種配列は、人工的（artificial）、合成的、人為的（manmade）、又はターゲット配列に対して外因性のソース由来であってよい。かかるプライマーの使用により、ターゲット配列は、人工的であり且つ開示する核酸分子合成を実施した結果である、キメラ分子へと変換される。
いくつかの実施態様において、開示する濃縮方法は、リファレンス配列を含むサンプル中のターゲット配列の量を決定するための方法の一部として使用され、これが提供される。決定するための方法は、開示する濃縮方法と、それに続く評価又は検出方法、例えば、非限定的な例としてシーケンシング又は大量並列シーケンス（massively parallel sequences）などであって、ターゲット配列の量を測定するために、対象由来のサンプルと、既知量のターゲット配列を有する1つ以上のコントロールサンプルとを使用し；次いで、サンプル中のターゲット配列の1つ以上の既知サンプルの測定値（複数可）との比較により、1つ以上のコントロールサンプルに対するターゲット配列の量を計算する、方法の実施を含んでよい。いくつかの場合、サンプルは尿であり、ターゲット配列はcfDNAである。
図1は、本方法の一実施態様を説明する。 図2は、本方法の一実施態様を説明する。 図3は、本方法の一実施態様を説明する。 図4は、融解温度プロファイルを説明する。 図5は、異なるブロッカーの例示的なキネティクスプロファイルを説明する。 図6は、単一コピーアッセイ感度を検証するために利用されるポアソン分布を説明する。 図7は、KRASアッセイの単一コピー感度の実証を説明する。 図8は、少量のターゲット配列の実質的濃縮を説明する。 図9は、本方法の一実施態様の概略図を提供する。 図10は、本方法の一実施態様の概略図を提供する。 図11は、本方法の一実施態様を説明する。 図12は、本方法の一実施態様の臨床的応用を説明する。 図13は、本方法の一実施態様の臨床的応用を説明する。
本発明の詳細な説明
本発明は、セルフリーサンプルから少量のターゲット核酸配列を高濃縮するための方法、組成物、ソフトウェア及びキットを対象とする。当該方法は、以前の方法よりも効率的で、ステップが少なく、且つより短い反応時間を必要とする、核酸配列増幅プロトコルに一部基づく。開示する方法は、ターゲット特異性を維持しながら、数桁（700×〜1000×＋）高い検出感度を可能にする。従来の方法とは異なって、最適化されたブロッカー配列及びプライマーのデザインを使用し、はるかに少ないサイクルステップを必要とする方法を本明細書に開示する。提供する方法はまた、より広範なターゲット配列の検出を可能とし、リファレンス配列の融解温度よりも低い融解温度を有する少量のターゲット配列の同定のみに限定されない。
本発明は、複数のサンプルタイプ、例えば、cfDNA（尿、血清、血漿）、CTCs、体液（唾液、喀痰、膵液、精液、脳脊髄液、涙、粘液）又は組織バイオプシー（FNA、FFPE、TMA）などに対して実施でき；少量の組織又はDNAを必要とし；定量化可能であり；増幅領域において、全ての変異の優先的濃縮を多重化（multiplex）する能力を有し、全ての変異を検出する。本発明は、アレル特異的な変異の検出に限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「ターゲット配列を濃縮する（enriching）」又は少量のターゲット核酸の「濃縮（enrichment）」とは、サンプルにおいて、ターゲット配列の量を増加させること、及び対応するリファレンス配列に対してターゲット配列の比率を増加させることをいう。例えば、サンプル中、ターゲット配列とリファレンス配列との比率が当初5％対95％である場合、99.99999％及び0.00001％リファレンス配列の最終的な比率を生じるように、増幅反応においてターゲット配列を優先的に増幅してよく、或いはサンプル内のその存在を数桁増加させるように、増幅反応においてターゲット配列を優先的に増幅してよい。例えば、増幅反応混合物の元のサンプル内にターゲット配列が少なくとも1鎖存在し得る場合、増幅後の増幅反応混合物中に存在するターゲット配列の鎖は100鎖から11000鎖又はそれ以上となり、従って、元のサンプル中のリファレンス配列の量と比較して、ターゲット配列が100×から少なくとも11000×又はそれ以上濃縮されるだろう。
本明細書で使用する場合、用語「ターゲット配列」とは、核酸サンプルにおいて、対応するリファレンス配列よりも少量であるか又はあまり見られない核酸をいう。ターゲット配列は、サンプルにおいて、リファレンス配列＋ターゲット配列の総量の50％未満を構成するだろう。ターゲット配列は、異常又は変異アレルであってよい。例えば、サンプル（例えば、組織、血液、血漿、尿又は他の体液）は、多数の正常細胞とわずかな又は単一の癌細胞を含有してよい。正常細胞は、非変異型又は野生型のアレルを含有する一方、癌細胞は、体細胞変異、及び／又はそのカウンターパートである非変異型若しくは野生型のアレルと比較して配列における差異を含有する。このような場合、変異体がターゲット配列であり、他方、野生型配列がリファレンス配列である。本明細書で使用する場合、「ターゲット鎖」とは、二本鎖ターゲット配列の単一の核酸鎖をいう。
ターゲット配列は、対応するリファレンス配列と少なくとも50％相同でなければならないが、リファレンス配列と少なくとも1ヌクレオチドは異ならなければならない。ターゲット配列は、リファレンス配列に使用されるプライマーと同じプライマー対によりPCRを介して増幅可能であるが、そのように制限される必要はない。ターゲット配列はまた、プライマーが、ターゲット配列を含有する配列領域で増幅するよう選択される限り、リファレンス配列に使用されないプライマー対によりPCRを介して増幅可能であってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「アンプリコン」とは、増幅産物である核酸をいう。従って、アンプリコンは、リファレンス配列、ターゲット配列、又は増幅に供されている核酸の任意の配列と相同であってよい。通常、反応サンプル内において、アンプリコン配列の濃度は、元の（テンプレート）核酸配列の濃度よりも有意に高くなるだろう。
本明細書で使用する場合、用語「リファレンス配列」とは、核酸サンプルにおいて、対応するターゲット配列よりも多く見られる核酸をいう。リファレンス配列は、サンプルにおいて、全リファレンス配列＋ターゲット配列の50％超を構成する。好ましくは、リファレンス配列は、ターゲット配列よりも10×、15×、20×、25×、30×、35×、40×、45×、50×、60×、70×、80×、90× 100×、150×、200×又はそれ以上のDNA及び／又はRNAレベルで発現される。本明細書で使用する場合、「リファレンス鎖」とは、二本鎖リファレンス配列の単一の核酸鎖をいう。
本明細書で使用する場合、用語「野生型」とは、集団において、特定の遺伝子について最も一般的なポリヌクレオチド配列又はアレルをいう。一般に、野生型アレルは、正常細胞から得られるだろう。特定の目的又は実施者の希望に応じて、リファレンス配列は、通常、野生型配列である。
本明細書で使用する場合、用語「変異（mutant）」とは、核酸配列におけるヌクレオチド変化（すなわち、単一又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入）をいう。変異を有する（bears）核酸は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列のものとは配列において異なる核酸配列（変異アレル）を有する。本発明は、体細胞変異及び多型と広く関連する。本発明の方法は、約1から10の間のヌクレオチド配列変化を含有する変異アレルを選択的に濃縮するのに特に有用であるが、とはいえ、より多数の配列変化を有する場合であっても有用である。変異アレルは、典型的には、病変組織又は細胞から得られ、疾患状態と関連する。
本明細書で使用する場合、用語「融解温度」又は「Tm」とは、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度をいう。一般に、Tmは、二本鎖核酸分子中のワトソン・クリック塩基対の半分が切断（broken）又は解離される（すなわち、「融解」される）一方で、ワトソン・クリック塩基対のもう半分が二本鎖コンフォメーションにて元の状態のままである温度として定義されてよい。言い換えれば、Tmは、2つの相補的配列のヌクレオチドの50％がアニーリングされ（二本鎖）、該ヌクレオチドの50％が変性される（一本鎖）温度として定義される。従って、Tmは、二本鎖核酸分子から一本鎖核酸分子への移行における（又は、逆に、一本鎖核酸分子から二本鎖核酸分子への移行における）中間点を定義する。
「選択される変性温度」又は「Tsd」は、本明細書に開示するような一実施態様の一側面に従って、パラメーター及び計算上のTmを含む予め選択されたデザインを利用して決定される温度である。通常、本明細書で提供する方法において、選択される温度は、ブロッカー：リファレンス配列の融解温度より低いか、又はブロッカー：リファレンス配列の融解温度より高いか、又はブロッカー：リファレンス配列の融解温度とほぼ同じである、予め選択される温度であろう。
Tmは、多数の方法により、例えば、Wetmur 1991（Wetmur, J. G. 1991. DNA probes：applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 26：227-259）のように最近傍計算（nearest-neighbor calculation）により、及びインターネットで利用可能なOligoTMプライマーデザイン及びプログラムを含む市販のプログラムにより、推定することができる。或いは、Tmは、実際の実験を介して決定することができる。例えば、二本鎖DNA結合又は挿入（intercalating）色素、例えば、臭化エチジウム又はSYBR-green（Molecular Probes）などは、核酸の実際のTmを決定するために、融解曲線アッセイで使用され得る。核酸のTmを決定するための更なる方法は、当分野で周知である。これらの方法のいくつかは、「Enrichment of a Target Sequence」と題される本発明者の先行特許出願、国際出願第PCT/US2008/009248号（現在は、U.S. Ser. No. 12/671,295号）（参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される。
本明細書で使用する場合、「リファレンスブロッキング配列」は、操作された（engineered）一本鎖又は二本鎖の核酸配列、例えばオリゴヌクレオチドなどであって、好ましくは、ターゲット配列の増幅セクションよりも短い長さを有する。一実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、リファレンス配列の増幅セクションよりも、該配列のそれぞれの側にて、いくつかの塩基分短く、その結果、プライマーは、リファレンス配列と目立つ程度に（appreciably）結合しない。別の実施態様において、リファレンスブロッキング配列は、プライマー結合部位とオーバーラップしてよい。任意選択で、リファレンスブロッキング配列の3’ OH末端は、DNAポリメラーゼ伸長に対してブロックされる。任意選択で、5’末端は、Taq DNAポリメラーゼによる5’から3’へのエキソヌクレオリシスを妨げるために修飾される。リファレンスブロッキング配列はまた、反応混合物を臨界温度「Tc」に供する際にリファレンス配列とアニーリングされたままとなる他の形態、例えば、一本鎖のDNA、RNA、ペプチド核酸（PNA）又はロックド核酸（LNA）又は別の修飾ヌクレオチド間のキメラなどもとり得る。
一実施態様において、PNA又はLNAは、ターゲット配列におけるものとは異なるリファレンス配列中のヌクレオチドと隣接する及び／又はこれを含む位置にて、リファレンスブロッキング配列中で使用される。かかる構造は、リファレンスブロッキング配列 - リファレンス配列と、リファレンスブロッキング配列 - ターゲット配列ヘテロ二本鎖との融解温度の差を増加させ、Tsdでのリファレンスブロッキング配列 - ターゲット配列ヘテロ二本鎖の変性、及びターゲット配列の濃縮にさらに有利に働く。さらに、PNA又はLNA修飾は、リファレンスブロッキング配列のリファレンス配列及びターゲット配列との融解温度を上昇及び調整するために、リファレンスブロッキング配列での他の位置に追加されてよい。
1つ以上の修飾ヌクレオチド、LNA又はPNAが、リファレンスブロッキング配列中に存在する場合、修飾ヌクレオチド、LNA又はPNAの位置は、変異（すなわち、ターゲット配列とリファレンス配列との間の配列における差）が存在すると思われる少なくとも1つの位置とマッチするように選択されてよい。リファレンスブロッキング配列において修飾ヌクレオチドを組み込むためにこの位置を選択することにより、リファレンスブロッキング配列と相補的リファレンス鎖との二本鎖を変性させるために必要とされる温度と、リファレンスブロッキング配列と一部相補的なターゲット配列とのヘテロ二本鎖を変性させるために必要とされる温度との差が最大化される。
「リファレンスブロッキング」配列又は「短いブロッキング」配列又は「ブロッカー」配列は、リファレンス配列の1つの鎖と完全に相補的であってよい（プライマー結合部位間で、又はプライマー結合部位と部分的にオーバーラップして）。リファレンスブロッキング配列及び短いブロッキング配列は、リファレンス配列よりも短い。ブロッカー配列は、プライマーの長さを超えてよい。例えば、（ターゲット配列の長さに応じて）ブロッカー配列が、シーケンシングされる領域を含めて、フォワード又はリバースプライマーの長さに沿って完全に伸び、リバースブロッカーとのオーバーラップを含む場合。例えば：13塩基対のフォワードプライマーを有するKRASブロッカーは、フォワードプライマー由来の13ヌクレオチド塩基＋シーケンシング領域における5塩基＋リバースプライマーと相補的な最大3 bpであってよい。この例では、ブロッカーは、全長に伸びる、より長いプライマー及びより長いシーケンシング領域との約21塩基対の長さを含み得る。
本明細書で使用する場合、「短いブロッキング配列」又は「短いブロッカー」は、80 bp長以下、又は60 bp長以下、又は10 bpと63 bpの間の長さを有するリファレンスブロッキング配列である。短いブロッカー配列は、「ホットブロッカー配列（hot blocker sequences）」、又はリファレンス配列若しくはWT-WT二本鎖ヌクレオチド鎖の融解温度より高い融解温度を有する配列、を含む。好ましくは、短いブロッキング配列は、リファレンス配列と二本鎖化される場合、反応混合物中に含まれる対の少なくとも1つのプライマーの融解温度よりも高いブロッカー：リファレンス配列融解温度を有するだろう。
リファレンスブロッキング配列又は短いブロッキング配列はまた、任意のサイズ長のフラグメント（アンプリコン）の増幅を可能にするように設計されてもよい。かかるブロッキング配列は、好ましくは、短いフラグメント化核酸、例えば、セルフリーDNAサンプル中に存在するそれらのフラグメント化DNA配列などを増幅するのに十分な長さを有するように設計される。リファレンスブロッキング配列は、好ましくは、反応混合物中、ブロッキング配列 - リファレンス配列の融解温度、及びブロッキング配列 - ターゲット配列の融解温度、及びプライマーの融解温度の間の差異を可能にするように設計される。当然のことながら、当業者に理解されるように、リファレンスブロッキング配列の長さは、当該方法のキネティクスが、プライマー - ブロッカー結合温度及びターゲット核酸の天然 - 変性コンフォメーション間の関係性に一部基づくため、最大又は上限を有さない。高い融解温度を有し、反応混合物中にて過剰量で存在するブロッカーは、リファレンス核酸又は野生型核酸配列との優先的な結合又はアニーリングの達成を可能にする。更に、ターゲット：ブロッカー融解温度が、核酸配列ミスマッチに起因して、低い又は実質的に低い場合、不利なキネティクス又は結合率がもたらされ、ターゲット配列とのブロッカー結合／アニーリングの比率又はキネティクスに対して或いはそれらと比較して、フォワード又はリバースプライマーがターゲット核酸配列と優先的にアニーリングすることが可能となる。
「臨界温度（critical temperature）」又は「Tc」とは、リファレンス配列の融解温度「Tm」より低い温度をいう。いくつかの実施態様において、Tcは、リファレンス配列及びターゲット配列の両方のTmよりも低い（Tc＜Tref又はTtgt）。臨界温度は、Tmより低い温度において、二本鎖ターゲット配列、及び二本鎖DNAを形成するようにクロスハイブリダイズされたターゲット - リファレンス配列（bl：ref）が、リファレンス／リファレンスホモ二本鎖よりもこれらのヘテロ二本鎖を優先的に変性させるように、二本鎖化することを利用する。ターゲット配列及びリファレンス配列がクロスハイブリダイズする場合、短い（例えば、＜200 bp）二本鎖DNA配列に沿って任意の場所で生じる1つ以上の単一ヌクレオチドミスマッチのわずかな配列の差異により、その配列について融解温度（Tm）の予測可能な変化が生じるだろう（Lipsky, R. H., et al.（2001）Clin Chem, 47, 635-644；Liew, M., et al.（2004）Clin Chem, 50, 1156-1164）。正確な配列的背景（sequence context）及びミスマッチの位置に応じて、0.1〜20℃の融解温度の変化が予期される。
「プライマー配列」は、9〜30 bp、又は10〜25 bp、又は11〜22 bp、又は13〜16 bp長の核酸配列を含む。プライマー配列は、PCR反応の間に増幅産物を形成するように、ターゲット及びリファレンス配列の逆鎖とアニーリングする、合成的に操作された核酸配列である。ターゲット及びリファレンス配列は、プライマー結合を促進するために、少なくとも25塩基でなければならない。プライマー配列は、タグ又はアダプター配列を含んでよい。アダプターは、操作された核酸であり、15〜30 bp、又は20〜25 bp、又は18〜23 bp長であってよい。プライマー対は、反応のTsdよりも低いTmを有するように設計されてよい。本明細書で使用する場合、「プライマー対」とは、相補的核酸鎖とアニーリングし、そこから伸長するように設計された2つのプライマー配列をいい、最大45 bpであってよい。
本明細書で使用する場合、「相同性（homology）」とは、2つのポリマー分子間、例えば、2つのポリヌクレオチド間又は2つのポリペプチド間のサブユニット配列類似性をいう。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25：3389-3402（1977）及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-410（1990）に記載される。
本開示は、対象のサンプル由来のセルフリー核酸における遺伝子変化のルーティンな臨床検出のための高感度で、容易且つ安価な試験を提供する。いくつかの実施態様において、当該試験は、KRAS変異検出に基づく。他の実施態様において、当該試験は、BRAF変異、例えば、BRAF V600E変異、又はEGFR変異、c-met、MET、HER-2、HER-3、NRAS、PIK3CA 1047、KRAS 161Hなどのためであってよい。他の実施態様において、遺伝子変化は、ターゲット配列と、対応するリファレンス配列との間の差異をもたらす、置換、挿入、欠失又は転座であってよい。
本明細書に記載の特定の変異に加えて、本開示は、野生型配列の存在下、疾患又は障害と関連する任意の細胞又はミトコンドリア変異について、開示する方法を使用することを提供する。多くの実施態様において、開示する方法は、癌（原発性癌又は転移している癌を含む）の場合に実施されてよい。他の場合において、当該方法は、悪性又は非悪性の腫瘍の場合に使用されてよい。
癌の非限定的な例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳又は神経系の癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌（recta; cancer）、結腸直腸癌（colorectal cancer）、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド癌、消化管間質癌、ホジキン病、腸癌、カポジ肉腫、腎癌、大腸癌、喉頭癌、下咽頭癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、非HCLリンパ系悪性腫瘍（ヘアリー細胞バリアント（hairy cell variant）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、脾びまん性赤脾髄小型B細胞リンパ腫（splenic diffuse red pulp small B-cell lymphoma）（SDRPSBCL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、全身性肥満細胞症、又は脾性リンパ腫／白血病分類不能（splenic lymphoma/leukemia unclassifiable）（SLLU））、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、成人軟部組織肉腫、皮膚癌、皮膚の基底細胞癌（basal cell skin cancer）、皮膚の扁平上皮細胞癌（squamous cell skin cancer）、皮膚の基底細胞及び扁平上皮細胞癌、メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、胃癌、小腸癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍。
非HCLリンパ系悪性腫瘍の非限定的な例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヘアリー細胞バリアント（HCL-v）、脾辺縁帯リンパ腫（SMZL）、脾びまん性赤脾髄小型B細胞リンパ腫（SDRPSBCL）、脾性白血病／リンパ腫分類不能（SLLU）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病、低悪性度リンパ腫、全身性肥満細胞症、及び脾性リンパ腫／白血病分類不能（splenic lymphoma/leukemia unclassifiable）（SLLU）。
本明細書で使用する場合、「患者」は哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ又はブタなどであり得る。多くの場合、哺乳動物はヒトである。
更なる実施態様において、開示する方法は、ヒト対象、例えば、本明細書に記載するような遺伝子変化と関連する疾患又は障害のための療法又は治療を受けている対象、或いは残存疾患又は再発について調査される対象などで使用される。対象は、任意の年齢、性別又は人種の任意の個体であってよい。
多くの場合、対象由来でターゲット配列を含むサンプルは体液である。体液の非限定的な例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：末梢血、血清、血漿、尿、喀痰、唾液、膵液、脳脊髄液、涙、粘液、精液、リンパ液、羊水、及び髄液。本開示は、ターゲット配列の実質的（100×〜11000×倍）な濃縮がそれにより達成でき、非ターゲット核酸のバックグラウンドを含む生物学的サンプル内で単一コピーの変異配列（例えば、EGFR欠失、EGFR T790M、KRAS単一塩基置換）まで検出し得ることを可能にすることを実証する。本開示はまた、大量並列シーケンシングが、尿cfDNAにおいて、KRAS遺伝子の変異状態をモニタリングするための有効なツールであり得ることを実証する。アッセイは、KRASコドン12及び13内の7つ全てのKRAS変異に対して選択的且つ高特異的である。結果から、腫瘍組織がKRAS変異を含有する9人の患者のうち、8人の尿中で変異型KRASが検出され得たことが示される。8つの検出可能な腫瘍サンプルのうち4つにおいて、コールされる（called）ヌクレオチドが一致しないこと（discrepancy）は、これらのサンプルの患者腫瘍不均一性における不一致を強調し得る。セルフリー尿DNAから変異を検出するために大量並列DNAシーケンシングを用いることにより、分子標的療法の応答、不応答及び耐性機構の出現について、転移性患者が非侵襲的にモニタリングされる。
本明細書で使用する場合、用語「サンプル」とは、アナライトアッセイが望まれるアナライトを含有し得るいずれをもいう。多くの場合、アナライトは、セルフリー（cf）核酸分子、例えば、BRAFの全て又は一部をコードするDNA又はcDNA分子などである。用語「サンプル」には、核酸（ゲノムDNA、cDNA、RNA、mRNA）のサンプルが含まれる。サンプルは、生物学的サンプル、例えば、生物学的液体又は生物学的組織などであってよい。生物学的液体の例として、尿、血液、血漿、血清、唾液、膵液、精液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、ヒト、動物、植物、細菌、真菌又はウイルスの構造の構造材料の1つを形成する、通常、その細胞間物質と一緒になった特定の種類の細胞の凝集体であり、これには結合組織、上皮組織、筋組織及び神経組織が含まれる。生物学的組織の例としては、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈及び個々の細胞（複数可）も挙げられる。「サンプル」にはまた、in vitroの細胞培養成分のサンプル、自然分離物（isolates）（例えば、飲料水、海水、固形物質など）、微生物試料（specimens）、又は核酸トレーサー分子で「スパイク（spiked）」されている試料も含まれる。
本発明の核酸配列はゲノムDNAから増幅され得る。ゲノムDNAは、以下の方法又は代替の方法に従って、組織又は細胞から単離され得る。かかる方法は当分野で周知である。或いは、本発明の核酸配列は、当分野で周知の方法により、血液又は別の液体から単離され得る。
いくつかの実施態様において、開示する濃縮方法は、リファレンス配列を含むサンプル中のターゲット配列の量を決定するための方法の一部として使用される。濃縮方法はまた、濃縮後に1つ以上の変異を評価するための検出方法と組み合わされてよい。当該方法は、開示する濃縮方法と、それに続く更なる評価又は検出方法、例えば、非限定的な例としてシーケンシング又は大量並列シーケンス（massively parallel sequences）などであって、ターゲット配列の量を測定するために、対象由来のサンプルと、既知量のターゲット配列を有する1つ以上のコントロールサンプルとを使用し；次いで、サンプル中のターゲット配列の1つ以上の既知サンプルの測定値（複数可）との比較により、ターゲット配列及び1つ以上のコントロールサンプルの量を計算する、方法の実施を含んでよい。開示する方法は、MALDI-TOF、HR融解曲線解析（HR-melting）、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング（single-molecule sequencing）、パイロシーケンシング、第二世代ハイスループットシーケンシング（second generation high-throughput sequencing）、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCR及び定量PCRから選択される1つ以上の方法を用いて、濃縮ターゲット配列を有する反応混合物を分析することをさらに含んでよい。これらの分析技術は、本明細書に記載するように、合成された核酸内で特異的ターゲット（変異）配列を検出するために使用されてよい。いくつかの場合、サンプルは尿であり、ターゲット配列はcfDNAである。
当業者ならば、本明細書に記載の方法のいずれかのために、任意の変異配列をPCR増幅するために有用なプライマーを決定できる。いくつかの実施態様において、PCRは、例えば、米国特許出願公開公報第US/2010/0068711号などに記載されるように、約50ヌクレオチド未満の配列を増幅する。他の実施態様において、PCRは、例えば、米国特許第8,623,603号又は米国仮特許出願第62/039,905号などに記載されるように、野生型バージョンの遺伝子の増幅を抑制するブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて実施される。いくつかの実施態様において、1つ以上のプライマーは、当分野で知られるように、外因性又は異種配列（例えば、アダプター又は「タグ」配列など）を含み、その結果、得られた増幅分子は、天然に存在しない配列を有する。
開示するプライマー対は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれが、その3’末端にて、二本鎖ターゲット配列の1つの鎖と相補的である配列を含むものである。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーの一方又は両方は、その5’末端にて、ターゲット配列中には見られない異種配列を含む。異種配列は、人工的（artificial）、合成的、人為的（manmade）、又はターゲット配列に対して外因性のソース由来であってよい。かかるプライマーの使用により、ターゲット配列は、人工的であり且つ開示する核酸分子合成を実施した結果である、キメラ分子へと変換される。プライマーは、最大45 bp長であってよく、或いは約9〜30 bp、10〜25 bp、11〜22 bp又は13〜16 bp長であってよい。プライマーは、アダプター配列を含んでよい。アダプター配列は、約15〜30 bp、20〜25 bp又は18〜23 bp長であってよい。
一実施態様において、記載する方法はまた、検出されるターゲット（変異）配列の定量化を可能にする定量的アッセイとして実施されてもよい。定量化は、評価からのアウトプットシグナル（任意選択でパーセンテージとして）に基づき、濃縮前のターゲット配列の計算上のインプットパーセンテージを決定するための手段を提供する。これは、図12で説明するような近似曲線を参照することにより実施されてよい。試験サンプルの評価からの実際のアウトプットは、既知量のターゲット配列DNAを含む1つ以上のコントロール反応物と組み合わせて決定される。試験サンプル及びコントロール（複数可）からのアウトプットを近似曲線と比較して、試験サンプルについて計算上のインプットを内挿又は外挿する。これにより、濃縮後の検出に基づいて、濃縮前のサンプル中のターゲット配列の量を定量的に決定することが可能となる。
cf核酸における遺伝子変化（変異）の存在に対する検出限界は、1つ以上のネガティブコントロール（例えば、健常なコントロール対象由来又は検証された細胞株由来）及び複数の患者サンプルからのデータを評価することにより決定されてよい。任意選択で、限界は、偽陰性のパーセンテージを最小化することに一部基づき決定されてよく、偽陰性のパーセンテージを最小化することは偽陽性を最小化するよりも重要だからである。BRAF V600Eについての非限定的な閾値の1セットは、いずれの変異体も存在しない又は野生型のみとの決定のために、cf核酸のサンプル中、変異が約0.05％未満；「ボーダーライン」として約0.05％から約0.107％の範囲、及び検出される変異として約0.107％超として定義される。他の実施態様において、変異について非検出を指定する閾値は、対応する野生型配列と比較して、変異の検出が約0.1％未満、約0.15％未満、約0.2％未満、約0.3％未満、約0.4％未満、約0.5％未満、約0.6％未満、約0.7％未満、約0.8％未満、約0.9％未満、又は約1％未満と設定される。KRAS Exon 2変異アッセイについての非限定的な閾値の1セットは、変異の定量的決定のために、1コピー未満の変異と定義される。
先行の濃縮PCR方法
少量のターゲット配列のための先行のPCRに基づく濃縮方法（例えば、full又はfast COLD-PCR）は、標準的な増幅プロトコルを使用しており、二本鎖リファレンス配列と二本鎖ターゲット配列との間の融解温度の理論的差異にのみ基づく。例えば、Molloyらの国際出願公開公報第WO/03/072809号「Melting Temperature Dependent DNA Amplification」において、核酸の選択的増幅は、変性温度を変化させることにより達成され得ることが発見された。当該方法は、リファレンス配列よりも低い変性温度を有する配列（典型的には変異配列）を、ターゲット温度の融解温度であるか又はそれより高いがリファレンス温度よりも低い変性温度をサイクリングすることにより、優先的に増幅する。別の例において、例えば、Makrigiorgosらによる国際出願第PCT/US2008/009248号（現在は、U.S. Ser. No. 12/671,295号）のFull COLD-PCRにおいて、リファレンス及びターゲット配列についてのTmよりも「十分高く（well above）」なるよう選択される第一の変性後、反応混合物を8分間の期間にわたって冷却し、次いで、「二本鎖リファレンス配列についての融解温度より低く、且つリファレンス - ターゲットヘテロ二本鎖のより低い融解温度よりも高くなるよう選択される」臨界変性温度（Tc）でインキュベートする（Description of Inventionを参照）。Fast COLD-PCRでは、反応混合物を、リファレンス配列Tmより高い温度（例えば、94℃）での第一の変性に供さず、その代わりに、（a）二本鎖リファレンス配列についての融解温度より低く、且つ二本鎖ターゲット配列のより低い融解温度よりも高くなるよう選択されるか、或いは；（b）リファレンス配列とターゲット配列との変性程度間に依然として差異を生じさせるものの、リファレンス配列及びターゲット配列の両方のTmよりも低くなるよう選択されるか、のいずれかである臨界変性温度（例えば、Tc＝83.5℃）でインキュベートする（Description of the Inventionを参照）。Full COLD-PCRは、Makrigiorgosらにより、「非効率的」及び「時間がかかる」と記載されており、Fast COLD-PCRは、野生型配列のTmと「同じ又はそれより高いTmを有する変異配列」を検出することができない（US20140106362号のBackground of the Inventionを参照）。米国特許第8623603号及びMakrigiorgosらによるUS20140106362号（「Full cold-PCR enrichment with reference blocking sequence」）の両方において、Full及びFast COLD-PCRの問題に対処するための試みは、効率を改善し且つサイクル時間を減らすために、反応混合物において「過剰量のリファレンスブロッキング配列」を使用することを含む。先行のすべての濃縮方法では、ターゲット配列融解温度（Tm）は、リファレンス配列融解温度（Tm）よりも低くなければならないので、該方法は、野生型Tmよりも低いTmを有するそれら変異配列の検出のみを可能にする。従って、かかる先行の方法は、二本鎖ターゲット配列のTmが、二本鎖リファレンス配列のTmよりも低い条件に限定される。これは、WT：WTホモ二本鎖分子のTmよりも低いTmを有するであろう二本鎖分子を作り出すようにヘテロ二本鎖が特異的に形成されるFull cold PCRでも当てはまる。本発明の方法では、ブロッカー：リファレンス配列が、3つのカテゴリーのいずれか（該Tmより高いか、低いか又はそれと同じ）であり得ることから、本発明者らの方法は、PCR産物の融解温度に依存せず、効率的である。濃縮は、ブロッカー及びリファレンス間、又はブロッカー及びターゲット鎖間の短いアンプリコンの結合キネティクスの有利な側面；先行する方法とは独立した側面を利用し、融解温度に依存しないものとなる。
本開示は、より広範なターゲット配列の検出を可能とし、且つリファレンス配列融解温度より低い融解温度を有するそれらターゲット配列のみの同定に限定されない、方法を提供する。
本方法は、サンプル内、特にフラグメント化DNAを含む及び／又は大多数の野生型若しくは非ターゲット配列を含むサンプル内において、少量の核酸配列の実質的に高い（700×〜1000×）濃縮を可能にする。例えば、高いバックグラウンド（例えば、10,000又はそれ以上）の野生型分子における単一コピーの変異。当該方法を実施後、リファレンスに対するターゲット分子の比率は、実質的に増加される。
速い／異なる（Fast/Differential）キネティックのブロッカー
本明細書で提供する方法は、特異的に設計されたリファレンスブロッカー配列及びプライマー配列を利用する増幅サイクルセットを使用する。ブロッカー配列は、選択した元の又は野生型ヌクレオチド配列と相補性を有する短いヌクレオチド配列である。任意選択で、短いブロッカーは、実施者により予め決定される又は所望されるようにLNAsを含む。短いブロッカー配列は、フォワード又はリバース鎖のいずれかに対して相補的であってよく、好ましくは、それらは、本明細書及び以下で提供するデザイン方法に基づき予め選択される。所望の場合、ブロッカー配列の、同じ鎖のプライマーとのオーバーラップが存在してよい。
本明細書に記載の方法は、2以上の増幅サイクルセットを含む。増幅サイクルセットは、2以上の増幅サイクル、3以上の増幅サイクル、適切には5以上の増幅サイクル、適切には7以上の増幅サイクル、適切には10以上の増幅サイクルを含んでよい。増幅サイクルセットは、2〜30サイクル、4〜25サイクル、5〜20サイクル、又は40サイクル若しくはそれ以上を含んでよい。
本明細書に記載の速い又は異なるキネティックのブロッカー方法では、核酸サンプル中のターゲット及びリファレンス配列は、当該方法に含める前に、PCRなどの事前増幅方法により増幅されてよいが、必要ではない。PCRは、リファレンス配列の融解温度より高い第一の変性温度を用いることにより完了されてよく、その結果、リファレンス配列とターゲット配列の両方が増幅される。過剰なブロッカーを含む反応混合物を用いてもよい。過剰なブロッカーは、鎖の結合を妨げるのに役立ち、選択的増幅プロセスをさらに推し進める。
PCRはまた、濃縮手順後のサンプル中の核酸をさらに増幅するために、本明細書に記載の方法を実施後に使用されてもよい。本明細書に記載の方法に続いて、変異検出方法を用いて増幅反応混合物を分析してもよい。当業者ならば、特定の（すなわち、ターゲット）核酸についてサンプルを分析するために多くの方法が使用され得ることを理解するだろう。かかる方法には、MALDI-TOF、HR融解曲線解析、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、パイロシーケンシング、第二世代ハイスループットシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCR及び定量PCRが含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、1以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は変化を含むリファレンス配列の変異アレルを示すターゲット配列を検出するために有用であり得る。
本明細書に記載の方法は、定量又はリアルタイムPCR装置で実施されてよい。反応混合物は、核酸検出剤、例えば、核酸検出色素（例えば、SYBR Green）又は標識プローブ（例えば、TaqManプローブ、又は蛍光マーカーで標識された他のオリゴヌクレオチド）などを含んでよい。本明細書に記載の方法はまた、2つ以上の異なるターゲット配列を濃縮するために使用されてよく、該ターゲット配列は、同じプライマー対又は異なるプライマー対で増幅可能であってよい。かかる方法は、2以上の核酸検出剤を含んでよい。
本明細書で説明する又は提供する方法のいずれかは、個別のプロトコル、条件及び実施者の目的のために最適化でき、最適化すべきであることが当業者に理解されるだろう。
本開示はまた、開示する方法を実施するためのキットを一部提供する。キットに含まれるべき様々な化学試薬の例は以下である：適切な容器に包装される - ターゲット核酸を増幅するための1つ以上のターゲット配列プライマーオリゴヌクレオチド、1つ以上のブロッカーオリゴヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、核酸増幅反応のためのバッファー溶液、及びコントロール試薬（例えば、標準的な濃度の、ポジティブ及び／又はネガティブコントロールのターゲット核酸、並びにポジティブ及び／又はネガティブコントロールの野生型又はリファレンス核酸）、並びに／又は1つ以上の少量ターゲット核酸を検出するため及び任意選択で定量化するためにキットを使用するための説明書。キットはまた、様々な化学試薬又は器具（appliances）、並びに色素、タグ、蛍光標識又は他のこのようなマーカーと反応性（reactable）の溶液及び／又は物質；核酸と結合する色素を含む溶液、を含む検出のためのユニット、を含んでもよい。
本発明の方法及び試薬は、キットの形態で慣習的に包装され得る。かかるキットは、本明細書に記載するように、様々な研究及び診断的適用に使用され得る。
当業者は、本明細書で述べる既知の技術又は等価な技術の詳細の説明のために一般的な参照テキストを参照し得る。これらのテキストには以下が含まれる：Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.（2005）；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（3rd edition）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York（2000）；Coligan et al., Current Protocols in Immunology , John Wiley & Sons, N.Y.；Enna et al., Current Protocols in Pharmacology , John Wiley & Sons, N.Y.；Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics（1975）, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition（1990）。これらのテキストは、当然のことながら、本開示の側面を構成又は使用する際にも参照され得る。
好ましい実施態様を以下の実施例に記載する。本明細書において請求する範囲内の他の実施態様は、本明細書で開示するような本発明の仕様及び実施の考慮から、当業者に明らかとなるだろう。本開示の他の特性及び利点も異なる実施例から明らかである。提供する実施例は、本開示を実施するのに有用な異なる構成要素及び方法論を説明する。実施例とともにその仕様は、例示のみとして考慮されることが意図される。本発明の技術範囲は、これらの実施例に限定されない。
実施例1
2ステップPCR濃縮アッセイの例（EGFR Exon 19欠失）を図1に提供する。このアッセイでは、選択的変性ステップが、アニーリングステップに先行する。反応が62.4℃のアニーリング温度まで移行（ramps）する際に、先のPCRサイクルで生成された任意の相補的野生型鎖は、プライマーがアニーリングする前に、ブロッカーと結合する。次いで、プライマーは相補的変異鎖とアニーリングし、配列オーバーラップに起因して、任意のブロッカーがその変異鎖と結合する可能性を妨げる（大部分の欠失のために、任意のブロッカーが変異体と結合する可能性は、実際にはほんの少しの共通配列しか存在しないことから、非常に低い）。この例示的アッセイでは、予め選択されたアニーリングステップ（62.4℃）において、ブロッカー：ターゲット及びリファレンス（wt）：ターゲットヘテロ二本鎖の形成は、わずかなパーセンテージしか相補的でないことから、非常に低い（検出可能又は計算可能なレベル未満）可能性が高い。
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987
実施例2
4ステップPCR濃縮アッセイの略図の例（EGFR Exon 20 T790M）を図2に提供する。このアッセイでは、98℃の変性ステップにより、全ての二本鎖の変性が確保される。第二の（任意選択）ステップ（70℃）の間に、ブロッカー - 野生型二本鎖が形成されるが、ブロッカー - 変異体二本鎖は殆ど形成されない（70℃は、ブロッカー - 変異体Tmより高いため）。ステップ3の選択的変性では、ブロッカー - 野生型の多くが変性するだろう（存在し得る任意のブロッカー - 変異体二本鎖とともに）。2ステップPCR（実施例1）と全く同様に、反応が64.0℃のアニーリング温度まで移行して戻る（ramps back）際に、相補的野生型鎖は、プライマーがアニーリングする前に、過剰なブロッカーにより結合される。次いで、プライマーは相補的変異鎖とアニーリングし、ブロッカーがその変異鎖と結合する可能性を妨げる。短いアンプリコン長により、追加の伸長ステップを必要とすることなく、伸長が可能となる。
EGFR T790M_Tについての濃縮レベルを下表6に提供する。
Figure 2016535987
実施例3
図3は、KRAS Exon 2単一塩基置換について、4ステップPCR濃縮アッセイの例を提供する。このアッセイは、選択的変性ステップが野生型 - ブロッカーTmより低く選択されることを除いて、実施例2と同様の様式で進められる。ブロッカー - 野生型Tm、プライマー - テンプレートTm、及びブロッカー - 変異体Tm間の温度差は、実施例2におけるものよりもはるかに大きく、より効率的な濃縮が導かれる。
上記実施例は、リファレンス核酸のバックグラウンドにおいて少量のターゲット配列を実質的に濃縮するための、キネティクスに基づくプライマー及びブロッカー配列のデザイン（様々な反応構成要素間の関係性に基づく）の適用を実証する。
実施例4
キネティックに基づくブロッカー及びプライマー配列のデザイン
図4は、ブロッカー - 野生型テンプレート（Tm＝80℃）、ブロッカー - 変異体テンプレート（Tm＝64℃）、及びプライマー - テンプレート二本鎖（Tm＝69℃）について、単純化された融解温度プロファイルを図示及び説明する略図を提供する。KRASアッセイを用いて所与の曲線を説明するが、原理は一般的である。各オリゴヌクレオチドは、50％の分子が平均して一本鎖であり、50％が二本鎖形成物としてそれらテンプレートと結合する温度であるオリゴヌクレオチドのTm（アッセイ条件下）とともに、ほぼシグモイド（ロジスティック）の融解温度プロファイルを有する。当該プロセスは、個々の分子が、この温度で、連続的に融解し、再アニーリングするという点で動的である。選択的変性温度では、プライマー及びブロッカー - 変異体テンプレート二本鎖のほぼ100％が解離する一方、ブロッカー - 野生型二本鎖のおよそ18％が元の状態のままであり得ることが見られる。逆に、温度が69℃のプライマーTmまで移行して下がる（ramps down）までには、ほぼ全ての野生型分子がブロッカーと結合している一方で、ほぼ全ての変異体分子は一本鎖のままとなるだろう。ブロッカーと、該ブロッカーと同じセンスと結合するプライマーとの間には配列におけるオーバーラップが存在することから、プライマーは、野生型と結合することがほとんどできないだろう。同様に、温度が64℃のブロッカー - 変異体テンプレートTmまで移行して下がるまでには、ほぼ全ての変異配列がプライマーと結合しており、従って、60℃の「アニーリング」温度が、ブロッカー - 変異体テンプレートTmより低いにもかかわらず、比較的少ないブロッカーしか変異体と結合することができない。これらの曲線は、それらが各温度での「平衡」状態を表すことから、単純化されている（simplistic）。融解及びアニーリングのキネティクスは、平衡に達するのに短い期間（数秒間まで）を要し得、従って、温度プロファイルは、現実には、いくらかのラグを示すだろう。
キネティックの考察を適用して、予め選択されるプライマーの好ましい融解温度は、以下を含むように設計される：
a）ブロッカー - wt産物の融解温度より低い；
b）ブロッカー - 変異体産物の融解温度より高い；
c）ブロッカーが、1つのプライマー又は2つのプライマーとオーバーラップし得る；
d）ブロッカーは必ずしもプライマーとのオーバーラップを有さなくてよい；且つ／或いは
d）経験的（empirically）に導かれる選択的変性（Tsd）は、ブロッカー - wt産物の融解温度よりも高い(例えば、EGFRdel及びEGFR T790)又は低い（例えば、KRAS）ものであり得るが、通常、プライマーの、完全相補的な配列とのアニーリングを可能にする温度よりも高いだろう。
図5は、ターゲット配列と結合されるブロッカー（例えば、76℃のTmを有する野生型ブロッカー）のパーセンテージが、反応温度が78.9℃の選択的変性温度に達する場合に、時間とともにどのように変化するかを説明する図を提供する。
実施例3
単一コピーアッセイ感度の検証
図6は、正規分布ヒストグラム及びポアソン確率表を提供する。右側の表は、ポアソン確率分布表である。表のカラムは、離散区間（interval）において、観測されるイベント数である。行（rows）は、区間あたりの平均イベント数である（区間あたり0.13イベント、区間あたり0.25イベントなど）。表中の各セルは、単一区間で、期待される平均イベント数（行）が生じる、所与のイベント数（カラム）を観察する確率である。例えば、癌変異検出試験に関して、1ミリリットル（区間）あたり2つの変異体DNA鎖を検出すると期待する場合、単一ミリリットルが、変異体DNA鎖を全く含有しない可能性は14％となるだろう。
図7 曲線適合（curve fit）及び癌患者の計算上のインプット変異レベルが、KRAS G12D変異を含む患者由来の生物学的液体サンプルで検出された。濃縮されたリファレンスデータの生データをプロットすることにより、双曲線（飽和結合又は用量反応曲線としても知られる）への最良適合が示され、低レベル変異種の強い非線形濃縮が実証される。全DNAの0.2％、0.05％、0.01％及び0.0％の変異体DNAインプットが、それぞれ、全配列読み取りのパーセンテージとして、18.25％、4.45％、1.84％及び0.54％の観察検出レベルから回帰（returned）された。
実施例4
KRASアッセイの単一コピー感度
図7は、ターゲットKRAS G12Aの単一コピー感度を検証するアッセイの理論上及び実験上の分布結果の例を実証する。左側にて、分布を表す14のサブプロットに分割する。分布の上列（top row）は、各分布の上にラベルされた平均コピー急増（spiked-in）インプットを生じる、20の測定についての理論的予想を表す。下列は、実際の実験結果を表す。各サブプロットのx軸は、アッセイにより検出される変異配列読み取り数（ログスケール）である。各サブプロットのy軸は、x軸に沿ったデータポイントの密度測定値であり、ポイントが近づくほど、密度が高くなる。密度曲線の下の領域は一つである。密度曲線により表されるポイントの2峰性分布は、検出されるサンプル（MT）と検出されないサンプル（WT）間の直感的なカットポイント（青線）を提供する。各サブプロット中の数字は、検出されたサンプル数（カットポイントの右側）及び検出されなかったサンプル数（カットポイントの左側）（20のうち）を示す。
実施例5
野生型DNA配列の高いバックグラウンドにおけるKRAS変異の検出
図8は、反応のために使用されるサンプル中、60 ng及び360 ngの全核酸で開始するバックグラウンドレベルにおいて変異が検出されたアッセイの結果を提供する。60 ng（17,400コピー）の野生型ゲノムDNA、又は360 ng（104,400コピー）の野生型ゲノムDNAのいずれかのバックグラウンドにおける7つの変異コピーの検出。図を7つのサブプロットに分割し、それぞれ、アッセイにより検出される7つのKRAS変異（G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D）の1つについての結果を表す。各サブプロットのx軸は、試験した3つのサンプルタイプを列挙する：17,400の野生型バックグラウンドにおける7つの変異コピー、104,400の野生型DNAバックグラウンドにおける7つの変異コピー、及び野生型のみ（17,400コピー）。各サブプロットのy軸は、アッセイにより検出される変異配列読み取り数（ログスケール）である。
実施例6
濃縮PCRとドロップレットデジタル（droplet digital）PCRによる変異検出との統合
図9は、ドロップレットデジタルPCR（RainDance, Billerica, MA）と統合するためのBRAF V600E変異検出アッセイデザインを示す。最初のステップは、BRAF V600E座位と隣接する2つのプライマーを用いた事前増幅を伴い、ここで、両方のプライマーは、第二ラウンドのプライマーとハイブリダイズする非相補的5’タグを含む。相補的ブロッキングオリゴヌクレオチドは、wt BRAF増幅を抑制し、事前増幅ステップ内で変異BRAF V600E配列の濃縮を達成した。第二のステップは、変異体対野生型の定量を区別可能にするために、それぞれ、FAM（V600E BRAF）及びVIC（wt BRAF）TaqManプローブを用いた、二本鎖ddPCR反応を伴った。RainDrop ddPCR装置（RainDance；Billerica, MA）を、PCRドロップレット分離、蛍光読み取り、及び変異配列、wt配列又は未反応プローブを含むドロップレットの計数、のために使用した。
実施例7
次世代シーケンシングとの統合
次世代シーケンシング方法による更なるターゲット配列検出と併用する方法の使用を図10に提供する。
図10 - コドン12及び13におけるKRAS遺伝子変異を検出するためのウルトラショート（ultra-short）アッセイのデザイン。アッセイは、31 bpのフットプリントを利用し、変異DNAフラグメントを特異的に濃縮する事前増幅ステップを含み、Exon 2領域における少なくとも7つの異なるKRAS変異を検出する。野生型配列ブロッカー及び変異特異的増幅は、変異座位の特異性の増加及び高濃縮を提供する。
実施例8
図11 - MADスコアを用いた検出カットオフの確立。ドット付き縦線は、2シグマのzスコアカットオフを表す。結腸癌患者（h.）からの変異検出結果、フォワード読み取り（金色ポイント）及びリバース読み取り（青色ポイント）とともに、健常コントロールで観察されたKRAS G12Vターゲット／非ターゲット比率のzスコア密度分布（灰色）。
図12は、インプットコピー数の定量化を可能とする方法のアッセイ結果を提供する：5から500までの様々なインプット変異コピーのレベルで、各変異について検量線を作成した。未知サンプル及び標準サンプルの両方を同じ方法で濃縮した。シーケンシング後、カットオフ値を超える変異読み取りカウントを、それぞれの検量線上にプロットして、インプットコピー数を計算した。未知サンプルのコピー数インプットは、対象の変異についての検量線へとプロットすることに基づき計算した。左から右の図は、左においては3000変異まで、右においては30変異までスケールアップした同じデータを示しており、より低レベルのインプットでの優れた線形性が実証される。変異コピーが低下すると、曲線は線形化し且つタイトになり（tightens）、低い変異荷重で良好な定量化を提供する。
実施例9
癌患者におけるKRAS G12Sの検出
図13は、エルドハイム・チェスター患者の癌患者由来の液体サンプル中、KRAS G12S変異DNAの検出を表す。単一のエルドハイム・チェスター患者から尿及び血液を複数の時点で採取した：2013年11月13日（尿及び血液）、2014年4月22日（尿）、及び2014年4月30日（血液）。20の野生型標準コントロール（STD_WT）及び3のテンプレートなし（no-template）コントロール（STD_NTC）とともに、同じランで、全てのサンプルから抽出されたDNAに対してKRASアッセイを実施した。y軸は、アッセイにより検出される変異配列読み取り数（ログスケール）である。
実施例11
予め選択された融解温度を有するブロッカー及びプライマー配列を設計するための方法の適用を、以下の表5に示す例示的ターゲット特異的プライマー、表6に示す例示的ブロッカー配列、表7に示すEGFR 858ターゲット配列に対するターゲット特異的プライマー、及び表8に示すEGFR T790Mに対するプライマー配列とともに以下に提供する。
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987
Figure 2016535987

Claims (19)

1以上の少量ターゲット配列を含むと思われる核酸サンプルにおいて、ターゲット核酸配列を濃縮するための方法であって、
a．以下を含む反応混合物を調製すること：リファレンス配列、該混合物においてリファレンス配列の量と比較して過剰なブロッキング配列、及び含むと思われる1以上のターゲット配列
（ここで、
該ターゲット配列は、リファレンス配列に対して少なくとも50％相同であり；
該ブロッキング配列は、リファレンス配列の領域と完全に相補的であり、該リファレンス配列の領域は、ターゲット配列の間にあるか又はオーバーラップするものである）；
b．該反応混合物を、以下の2サイクル以上に供すること：
i．リファレンス配列とアニーリングしたブロッカー配列の変性を可能とするが必須ではない、予め選択した変性温度（Tsd）（ここで、Tsdは、リファレンス配列 - ブロッカー配列二本鎖の計算上の融解温度より高い）まで、該反応混合物の温度を加熱すること、及び
ii．濃縮されたターゲット配列を形成するために、プライマーアニーリング及びその相補的ターゲット配列からの1以上のプライマーの伸長を可能にする伸長温度まで、該反応混合物の温度を低下させること；
を含む、方法。
1以上の少量ターゲット配列を有すると思われるサンプルにおいて、ターゲット核酸配列を濃縮するための方法であって、
a）リファレンス配列、該リファレンス配列と完全に相補的な過剰なブロッキング配列、及び該ターゲット配列の領域と完全に相補的なプライマー対（ここで、該ターゲット配列は、リファレンス配列と少なくとも50％の相補性を有する）、を含む反応混合物を調製すること、並びに該反応混合物を以下の2サイクル以上に供すること：
i）ホモ二本鎖リファレンス及びターゲット配列の変性を可能にするのに十分な第一の温度まで、該反応混合物を加熱すること；
ii）リファレンス - ブロッカー二本鎖配列の優先的な形成を可能にする温度まで、該反応混合物を冷却すること；
iii）ブロッカー - ターゲット二本鎖配列の変性を可能にするために、選択的変性温度（Ts）まで、該反応混合物を加熱すること；並びに
iv）ターゲット配列とアニーリングしたプライマー配列の伸長、及び該反応混合物中、リファレンス配列と比較したターゲット配列の実質的濃縮を可能にするために、ブロッカー - リファレンス配列；プライマー対；及びブロッカー - 変異配列、の融解温度より低い温度まで、該反応混合物を冷却すること；
を含む、方法。
リファレンスブロッキング配列における3’末端が、伸長を妨げるためにブロックされる、請求項1又は2に記載の方法。
リファレンスブロッキング配列における5’末端が、Taq DNAポリメラーゼによる5’から3’へのエキソヌクレオリシスを妨げるヌクレオチドを含む、請求項1又は2に記載の方法。
リファレンスブロッキング配列が、そのプライマー結合部位間で、又はプライマー結合部位のいずれかでオーバーラップして、リファレンス配列の鎖の1つと完全に相補的である、請求項1又は2に記載の方法。
リファレンスブロッキング配列が、40塩基対以下の長さからなる短いブロッカーである、請求項1又は2に記載の方法。
プライマー配列が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度よりも低いアニーリング温度を有する、請求項1又は2に記載の方法。
選択的温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約5℃以上高い、請求項1又は2に記載の方法。
ターゲット配列がEGFR Exon 19欠失であり、選択的変性温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約5℃以上高い、請求項1に記載の方法。
選択的変性温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約5.5℃高く、且つプライマー配列のTmよりも約15.5℃高い、請求項9に記載の方法。
選択的変性温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも低く、且つプライマー配列のTmよりも約15.5℃高い、請求項9に記載の方法。
選択的変性温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約5.5℃高く、且つプライマー配列のTmよりも高い、請求項9に記載の方法。
伸長温度が、約62.4℃であるか、又は約61℃と約64℃の間である、請求項10に記載の方法。
リファレンス：ブロッカー配列とブロッカー：ターゲット配列との間の融解温度の差が、約5から14セルシウス度の間である、請求項1又は2に記載の方法。
リファレンス配列がKRASであり、リファレンス：ブロッカー配列とブロッカー：ターゲットとの間の融解温度の差が-1.1℃である、請求項1又は2に記載の方法。
ターゲット配列がEGFR Exon 20 T790Mであり、選択的変性温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約14.3℃以上高い、請求項2に記載の方法。
選択的アニーリング温度が、リファレンス配列 - ブロッカー配列融解温度の融解温度よりも約2℃低い、請求項12に記載の方法。
伸長温度が、約62.4℃であるか、又は約61℃と約64℃の間である、請求項12に記載の方法。
変異アレルが、
BRAF；
KRAS；
EGFR；
NRAS；
C-MET；
HER-2；
HER-3；
PIK3CA；AKT-1；MAP2PK；ER；AR；FGFR1；FGFR2；FGFR3；KIT；PDGFR1；PDFGR2；PDGFR3；TP53；及びSMAD1
からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
サイクリング後、反応混合物のサンプルを、MALDI-TOF、HR融解曲線解析、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、パイロシーケンシング、第二世代ハイスループットシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCR及び定量PCRからなる群から選択される方法の1つ以上を用いて分析する、請求項1又は2に記載の方法。
JP2016524530A 2013-10-20 2014-10-20 核酸配列の合成及び濃縮 Withdrawn JP2016535987A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361893283P 2013-10-20 2013-10-20
US201361904141P 2013-11-14 2013-11-14
US61/904,141 2013-11-14
US201462039905P 2014-08-20 2014-08-20
US62/039,905 2014-08-20
US61/893,283 2014-10-20
PCT/US2014/061435 WO2015073163A2 (en) 2013-11-14 2014-10-20 Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016535987A true JP2016535987A (ja) 2016-11-24
JP2016535987A5 JP2016535987A5 (ja) 2017-11-30

Family

ID=55151140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016524530A Withdrawn JP2016535987A (ja) 2013-10-20 2014-10-20 核酸配列の合成及び濃縮

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20160273022A1 (ja)
JP (1) JP2016535987A (ja)
CN (1) CN105283555A (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9128861B2 (en) 2013-01-17 2015-09-08 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
EP3212808B1 (en) 2014-10-30 2022-03-02 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
AU2016263457B2 (en) * 2015-05-18 2020-08-27 Saga Diagnostics Ab Detection of target nucleic acid and variants
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
CN107012221A (zh) * 2016-10-14 2017-08-04 苏州艾达康医疗科技有限公司 基于阻断物的富集系统及其应用
CN106755451A (zh) * 2017-01-05 2017-05-31 苏州艾达康医疗科技有限公司 核酸制备及分析
KR102662580B1 (ko) * 2017-07-26 2024-05-03 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 변이 유전자 검출 방법
CN108179191A (zh) * 2018-02-05 2018-06-19 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测人类ctDNA基因突变的试剂盒
CN108410982A (zh) * 2018-02-05 2018-08-17 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种基于maldi-tof-ms检测肺癌34个突变位点的试剂盒
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
CN109632938B (zh) * 2019-01-11 2021-03-16 中国科学院化学研究所 聚多巴胺修饰的银纳米颗粒在质谱分析检测中的应用
CN109762901B (zh) * 2019-01-30 2022-11-29 杭州瑞普基因科技有限公司 用于富集低频dna突变的dna探针应用于多种突变的同时检测
CN111004839A (zh) * 2019-12-18 2020-04-14 杭州瑞普基因科技有限公司 基于锁核酸修饰的阻滞物进行阻滞取代扩增富集检测目标突变的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5849497A (en) * 1997-04-03 1998-12-15 The Research Foundation Of State University Of New York Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
US6391592B1 (en) * 2000-12-14 2002-05-21 Affymetrix, Inc. Blocker-aided target amplification of nucleic acids
AUPS076902A0 (en) 2002-02-26 2002-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel selective polymerase chain reaction
ES2546848T3 (es) * 2006-03-10 2015-09-29 Epigenomics Ag Un método para identificar una muestra biológica para el análisis de la metilación
PT2183379E (pt) * 2007-08-01 2015-09-25 Dana Farber Cancer Inst Inc Enriquecimento de uma sequência alvo
ES2595489T3 (es) 2008-07-18 2016-12-30 Trovagene, Inc. Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR
US20130178383A1 (en) * 2008-11-12 2013-07-11 David Spetzler Vesicle isolation methods
US8206929B2 (en) 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
ES2665500T3 (es) 2010-03-08 2018-04-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia
KR101312241B1 (ko) 2010-04-27 2013-09-27 사회복지법인 삼성생명공익재단 증폭억제시발체를 이용하는 유전자 돌연변이 검출 방법
CN103459612A (zh) 2010-12-03 2013-12-18 布兰代斯大学 用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒
GB201100150D0 (en) 2011-01-06 2011-02-23 Epistem Ltd Mutational analysis
US20140147846A1 (en) 2011-05-26 2014-05-29 Brandeis University Detection of sequence variants in the human epidermal growth factor receptor (egfr) gene
US9133490B2 (en) 2012-05-16 2015-09-15 Transgenomic, Inc. Step-up method for COLD-PCR enrichment

Also Published As

Publication number Publication date
US20160273022A1 (en) 2016-09-22
CN105283555A (zh) 2016-01-27
US9725755B2 (en) 2017-08-08
US20170009276A1 (en) 2017-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9725755B2 (en) Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences
CN107419018B (zh) 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
US11015213B2 (en) Method of preparing cell free nucleic acid molecules by in situ amplification
JP5531367B2 (ja) 標的配列の濃縮
US10329605B2 (en) Method to increase sensitivity of detection of low-occurrence mutations
US10023917B2 (en) High resolution melting analysis as a prescreening tool
US20130149695A1 (en) Method for detecting genetic mutation by using a blocking primer
US11834707B2 (en) Nucleic acid amplification blocker for detecting low-abundance mutation sequence and application thereof
KR20140010093A (ko) 혼합 집단 중 표적 dna의 서열분석을 위한 키트 및 방법
US10351903B2 (en) Allele amplification bias
US20160194691A1 (en) Dna mutation detection employing enrichment of mutant polynucleotide sequences and minimally invasive sampling
WO2015073163A2 (en) Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences
Niya et al. Sensitive high-resolution melting analysis for screening of KRAS and BRAF mutations in Iranian human metastatic colorectal cancers
US20140295431A1 (en) Method of allele-specific amplification
US11952632B2 (en) Kits and methods for detecting cancer-related mutations
WO2016093333A1 (ja) 塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのｐｃｒ増幅を抑制する方法
CN108004317A (zh) Pik3ca基因突变检测体系及其试剂盒
Su et al. Sensitive and selective detections of codon 12 and 13 KRAS mutations in a single tube using modified wild-type blocker
WO2016103727A1 (ja) 特異的核酸配列の増幅促進方法
EP2951321A2 (en) Synthesis and enrichment of nucleic acid sequences

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20160420

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20160420

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171019

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20171019

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20180517