KR20150136558A - Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법 - Google Patents

Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150136558A
KR20150136558A KR1020140063974A KR20140063974A KR20150136558A KR 20150136558 A KR20150136558 A KR 20150136558A KR 1020140063974 A KR1020140063974 A KR 1020140063974A KR 20140063974 A KR20140063974 A KR 20140063974A KR 20150136558 A KR20150136558 A KR 20150136558A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
base
abo
pna
gene
type
Prior art date
Application number
KR1020140063974A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101695477B1 (ko
Inventor
박재신
박희경
정진욱
송민식
임시근
이경명
박현철
안상현
이양한
안으리
김미정
Original Assignee
주식회사 시선바이오머티리얼스
대한민국(관리부서: 행정자치부 국립과학수사연구원장)
대한민국(관리부서: 행정자치부 국립과학수사연구원장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 시선바이오머티리얼스, 대한민국(관리부서: 행정자치부 국립과학수사연구원장), 대한민국(관리부서: 행정자치부 국립과학수사연구원장) filed Critical 주식회사 시선바이오머티리얼스
Priority to KR1020140063974A priority Critical patent/KR101695477B1/ko
Publication of KR20150136558A publication Critical patent/KR20150136558A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101695477B1 publication Critical patent/KR101695477B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 PNA 프로브 및 형광 융해곡선 분석을 이용한 혈액형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3개의 PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 ABO 유전자 간의 융해곡선 분석을 통한 ABO혈액형의 판별방법에 관한 것이다.
본 발명은 ABO 유전자에서 A와 B의 대립유전자의 변이 부분인 526번째 염기 및 803번째 염기, A와 O의 대립유전자의 변이부분인 261번째 염기에 상보적으로 결합하는 PNA프로브를 이용하므로, 염기변이에 따른 융해곡선 분석을 통해 효과적으로 ABO 혈액형을 판별할 수 있으며, PNA 프로브 각각의 융해곡선 패턴을 분석하여 혈액 중의 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형 등의 혈액형 유전형을 효과적으로 판별할 수 있다.

Description

PNA 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법{Method for the Determination of Blood Typing Using PNA Probe and fluorscence melting curve analysis}
본 발명은 PNA 프로브 및 형광 융해곡선 분석을 이용한 혈액형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3개의 PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 ABO 유전자 간의 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형의 판별방법에 관한 것이다.
혈액형 결정(Blood typing)은 ABO 시스템에 따라 A, B, AB 및 O의 4개 상이한 그룹으로, 각각 Rh 시스템 및 MN 혈액형 시스템에 따라, 인간 적혈구를 그룹화하는 전통적인 기술이다. ABO 혈액형 판별은 수혈 관련 의료분야뿐만 아니라 범죄수사 관련 법과학 분야 등 광범위하게 사용되고 있다.
일반적으로 ABO 혈액형 판별은 혈액을 이용한 혈청학적 방법을 사용한다. 혈청학정 방법은 혈액을 제외한 인체유래시료에는 적용이 불가능하며, 혈액이 변질되거나 부패한 경우 잘못된 판정이나 판정불능의 결과를 초래하는 단점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 DNA의 ABO 유전자를 이용한 ABO 혈액형 판정법인 ABO genotyping 방법이 도입되었으며, ABO genotyping은 부패하거나 변질된 혈액 및 DNA 추출이 가능한 모든 인체유래 시료에 적용이 가능하다. 이러한 이유로 ABO　genotyping법을 이용한 ABO 혈액형 판별은 진단검사의학 등의 의료계뿐만 아니라 범죄수사 해결을 위한 법과학 분야에서 유용하게 사용되고 있다. 법과학 분야에서 ABO genotyping법은 부검 혈액의 ABO 혈액형 판별 및 용의자가 지목되지 않은 주요 강력사건이나 동일범에 의한 연쇄사건 현장증거물의 ABO 혈액형 판별 등에 이용될 수 있는데, 특히 다수의 용의자들을 스크리닝함으로써 신속한 사건수사와 범인검거에 기여할 수 있다.
ABO 유전자는 9번 염색체 장완(9p34)에 위치하며 모두 7개의 엑손(exon)을 가지고 있다. ABO 유전자는 1065개의 염기로 구성되어 있고, 상기 염기는 345개 아미노산을 코딩(coding) 하고 있는 것으로 알려져 있다. A 와 B의 대립유전자(allele)는 7군데의 염기에서 차이를 보이며 이 중 아미노산의 변이를 보이는 곳은 nt526, nt796, nt803의 3 군데이고, O형은 A 대립유전자의 nt261번째의 G염기 결실로 발생한 틀 이동 돌연변이(frame-shift mutation)로서 해당 전이효소가 합성되지 못하는 표현형이다.
ABO 유전자에 의해 발현되는 아미노산은 UDP-N-acetyl galactose transferase라는 골지체 막효소로, A 유전자는 N-acetylgalactosaminyl transferase라는 효소를 만들어 glucose-galactose-N-acetyl glucosamime-galactose-fucose의 구조를 가지는 H 사슬(chain) 끝에 N-acetylgalactosamine을 붙여주어 A형 항원을, B 유전자는 H 사슬(chain) 끝에 D-galactose를 붙여주는 galactosyl transferase라는 효소를 만들어 B형 항원이 생성되며, O 유전자는 이런 당전이 효소(glycosyl transferase)를 만들 수 없으므로 H chain만을 표현하는 것으로 알려져 있다.
ABO genotyping은 이런 ABO 유전자의 특징을 이용하는 것으로, A 및 B 대립유전자의 nt803위치에 각각 특이하게 결합하는 A-R 프라이머(primer)와 B-R 프라이머(primer)를 이용하여 2개 종의 대립유전자를 분리 증폭하고, 따로 O 대립유전자용 프라이머 세트(primer set)로 ABO 유전자를 증폭시킨 다음, nt261, nt526, nt 703, nt796위치의 염기서열을 인식하는 제한효소를 처리하여 대립유전자 형을 확인하는 PCR-RFLP(polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism)법이 있으며, ABO 유전자 각각에 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트에 형광염료를 라벨하여, 증폭되는 형광분석을 통한 혈액형 판별법을 사용하고 있다.
한편, PNA는 peptide nucleic acids의 약자로 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 polyamide로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)가 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 restriction enzyme으로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
또한, DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 염기변이(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 융해온도가 차이가 나며, 이러한 결합력의 차이를 이용하여 단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism) 및 삽입/결실에 의한 염기변화를 검출할 수 있게 된다. PNA 프로브와 타겟 DNA의 융해온도(Tm) 값은 PNA 프로브 염기서열과 이에 상보적으로 혼성화하는 타겟 DNA의 염기서열의 차이에 따라 변하므로, 이를 이용한 어플리케이션(application)의 개발이 용이하다.
PNA 프로브는 택맨 프로브(TaqMan probe)의 가수분해 방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법 (hybridization method)을 이용하여 분석하며, 이와 비슷한 역할을 하는 프로브로는 비콘 프로브(molecular beacon probe) 또는 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
최근에는 PNA 프로브 혼성화 방법의 분석방법으로 형광 융해곡선 분석(FMCA; Fluorescence Melting Curve Analysis)을 이용하며, FMCA는 PCR 증폭반응이 끝나고 난 후, 생성된 산물과 PNA 프로브 간의 결합력의 차이를 융해온도(Tm)로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 PNA 프로브는 디자인이 매우 간편하며, 9~15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하므로, 원하는 Tm 값을 가지는 프로브를 디지인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm 값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브를 변형시켜 Tm 값을 조절할 수 있다.
또한, PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm 값이 높기 때문에 DNA보다 ?은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능한 장점이 있다. 기존의 HRM(High resolution melting)방법은 Tm 값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 염기서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 다수의 염기변이 분석이 가능하다.
이에, 본 발명자들은 좀더 간편하고 효과적으로 ABO 혈액형을 판별하기 위해 예의 노력한 결과, PNA 프로브 및 형광 융해곡선 분석을 이용하여 혈액형을 판별하면, 혈액 중의 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형등의 혈액형을 효과적으로 판별할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ABO 유전자에 상보적으로 혼성화하는 PNA 프로브 및 형광 융해곡선 분석을 이용한 혈액형 판별 방법 및 판별 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 ABO 유전자 간의 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 포함하는 ABO 혈액형 판별키트를 제공한다.
본 발명은 ABO 유전자에서 A와 B의 대립유전자의 변이 부분인 526번째 염기 및 803번째 염기, A와 O의 대립유전자의 변이부분인 261번째 염기에 상보적으로 결합하는 PNA프로브를 이용하므로, 염기변이에 따른 융해곡선 분석을 통해 효과적으로 ABO 혈액형을 판별할 수 있으며, PNA 프로브 각각의 융해곡선 패턴을 분석하여 혈액 중의 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형 등의 혈액형 유전형을 효과적으로 판별할 수 있다.
도 1은 ABO 유전자 내의 PNA 프로브의 상보적 결합위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 혈액형 유전형 판별을 위한 ABO 유전자 증폭 및 PNA 프로브를 이용한 형광융해곡선분석(FMCA)의 PCR 조건을 나타낸 모식도이다.
도 3은 혈액형 유전형에 따른 PNA 프로브의 융해곡선을 나타낸 그래프이다. 3 종류의 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석은 하나의 튜브에서 실시하였으며, 융해곡선 3개는 좌측으로부터 ABOF(FAM), ABOH(HEX), ABOT(Texas Red)의 순서이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 ABO 유전자 간의 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법에 관한 것이다.
ABO 유전자는 1065개의 염기로 구성되어 있고, 모두 7개의 엑손(exon)으로 이루어져 있으며, 상기 염기는 345개 아미노산을 코딩(coding) 하는 것으로 알려져 있다. A 와 B의 대립유전자(allele)는 7군데의 염기에서 차이를 보이며 이 중 아미노산의 변이를 보이는 곳은 nt526, nt796, nt803의 3 군데이고, O형은 A 대립유전자의 nt261번째의 G염기 결실로 발생한 틀 이동 돌연변이(frame-shift mutation)로서 해당 전이효소가 합성되지 못하는 표현형이다.
본 발명에서는 PNA 프로브는 단일염기변이에도 융해온도가 차이가 발생하기 때문에, 이러한 ABO 유전자의 염기변이를 이용하여 PNA 프로브의 융해온도 분석을 수행하였으며, 본 발명의 일 실시예에서는 ABO 유전자의 엑손 6 내에 존재하는 261번째 염기, 엑손 7 내에 존재하는 526번째 염기 및 803번째 염기에 상보적으로 결합하는 3개의 PNA 프로브를 제작하였다 (도 1). 상기 3개의 PNA 프로브는 각 염기의 번호는 ABO 유전자 좌위(locus)의 대립유전자를 기준으로 작성하였으며, PNA 프로브가 완전한 혼성화를 이루도록 제작하였다. 즉, A, B 및 O 대립유전자간의 단일염기변이 또는 염기 결실로 인한 불완전한 혼성화가 이루어지기 때문에 융해온도 차이가 발생한다.
따라서, 본 발명의 3 종류의 PNA 프로브는 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 6의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 3 종류의 리포터 및 소광자가 포함된 ABO 혈액형 판별용 PNA 프로브는 각각 ABO 유전자와 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 ABO 유전자와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광된다. 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여 ABO 혈액형 유전형을 판별할 수 있다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 '염기변이'는 DNA의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에서는 A 대립유전자를 기준으로 B 대립유전자는 단일염기변이가, O 대립유전자는 염기 결실에 의한 변이가 이루어진 것으로 나타내었다.
본 발명에서는 PNA 프로브를 이용한 형광융해곡선분석을 위해 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질을 결합하였다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법은 구체적으로, (a) (ⅰ) ABO 유전자를 포함하는 시료, (ⅱ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브 및 (ⅲ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트를 혼합시켜 ABO 유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 PNA 프로브 간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 단계를 포함하는 방법을 이용하거나,
(a) (ⅰ) ABO 유전자를 포함하는 시료, (ⅱ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 혼합하여 PNA 프로브와 ABO 유전자를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 "ABO 유전자를 포함하는 시료"는 인간 유래의 ABO 유전자를 포함하는 DNA를 함유하는 다양한 시료를 사용할 수 있으며, 혈액뿐만 아니라 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
ABO 유전자를 포함하는 시료는 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.
본 발명의 실시예에서는 사람의 혈액, 조직, 체액 등의 인체시료 및 법의학 현장시료로부터 추출한 다양한 혈액형 유전자형을 가진 시료(DNA)를 주형으로 하여 PCR을 수행하기 위해, 실시예 1에서 합성한 3쌍의 프라이머 세트 및 3 종류의 PNA 프로브와 시료(사용한 시료)를 혼합한 다음, 도 2의 방법으로 ABO 유전자를 증폭한다음, 증폭산물과 3종의 PNA 프로브의 융해곡선 분석을 수행하였으며, 사람의 ABO 유전자에서 B 및 O 대립유전자의 단일염기변이 또는 염기 결실로 인한 PNA 프로브와의 불완전 혼성화로 인해 서로 다른 혈액형별 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 융해온도 차이 패턴을 분석하여 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형 등의 혈액형 유전자형을 판별할 수 있는 것을 확인하였다 (도 3).
도 3에 나타난 바와 같이, AA 형은 ABOF PNA 프로브 및 ABOH PNA 프로브와 완전한 혼성화를 이루며, ABOR PNA 프로브와는 불완전한 혼성화를 이루는 것을 확인하였으며, AO 형에서 ABOF PNA 프로브는 A 대립유전자와 완전한 혼성화를 이루며, O 대립유전자와 불완전한 혼성화를 이루므로 융해곡선 피크가 두개로 나타나는 것을 확인하였다. 이외 다른 혈액형 유전자형 역시 3종의 PNA 프로브에 의해 각기 다른 패턴의 융해곡선을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 혈액형 유전자형에 따른 PNA 융해곡선 패턴을 분석하기 위해, 표 2와 PNA FMCA를 통해 얻어진 융해온도(Melting Temperature = Tm) 및 융해곡선 패턴을 표기화(Calling)하였다.
본 발명에서는 ABO 혈액형 유전자형에 따른 PNA 프로브의 융해온도 범위 및 표기법을 설정하기 위해, 실시예 2에서 PNA 프로브를 이용한 형광융해곡선분석(FMCA)을 수행하여 도출된, 융해온도(Tm)값을 융해온도에 맞추어 표기법화 하였으며(표 3), ABO 유전자를 PNA FMCA를 통해 얻어진 융해온도를 ABOF, ABOH, ABOT PNA 프로브 순서에 따라서 고유의 표기법 변환하여 표 4에 나타내었다.
즉, ABO 유전자를 포함하는 시료와 3종류의 PNA 프로브의 융해곡선 분석결과를 상기 표 3 및 표 4의 표기법에 맞추어서 분석을 하면, 간편하고 효과적으로 혈액형 유전형을 판별할 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 포함하는 ABO 혈액형 판별키트에 관한 것이다.
상기 3 종류의 PNA 프로브는 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 6의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하며, ABO 혈액형 판별키트는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 키트는 ABO 혈액형 유전자형인 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형을 판별할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, ABO 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
혈액형 판별용 PNA 프로브 제조
혈액형 중에서 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형 등을 포함하는 사람의 혈액, 조직, 체액 등의 인체시료 및 법과학 현장시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하기 위해 ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트와 상기의 염기와 혼성화를 이루는 PNA 프로브를 제작하였다 ((주) 파나진, 한국).
먼저, PNA 프로브는 혈액형 판별을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
A, B 및 O 대립유전자와는 단일염기변이 또는 염기 결실로 인한 불완전한 혼성화가 이루어지기 때문에 융해온도 차이가 발생하게 되며, 염기의 변이 부분은 보통 표적핵산과 5℃이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합 부위 가운데에 위치하도록 디자인하지만, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적핵산과 PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 중앙 부분에 ABO 유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다 (표 1).
혈액형 판별을 위한 PNA 프로브 및 프라이머 서열
마커 타입 명명 서열 서열번호
ABO261 In/Del ABOF-F CTGCCAGCTCCATGACCGCACGCC 서열번호 1
ABOF-R ACACAGTTAACCCAATGGTGGTGTTCTGGAGCC 서열번호 2
ABOF(프로브) Dabcyl-GTGGTGACCCCTT (FAM) 서열번호 3
ABO526 SNP ABOH-F GACGCTGGGGACCGGTCGGCAGCTG 서열번호 4
ABOH-R CATGGACACGTCCTGCTAGCGCTTG 서열번호 5
ABOH(프로브) Dabcyl-CGCGCACCTCC (HEX) 서열번호 6
ABO803 SNP ABOR-F CTTCTACGGAAGCAGCCGGGAGGCCTTCAC 서열번호 7
ABOR-R TGGTGGCAGGCCCTGGTGAGCCGCTG 서열번호 8
ABOR(프로브) Dabcyl-GAACGCCCCCA (Texas Red) 서열번호 9
(상기 표 1에서 Dabcyl은 소광자, FAM, HEK 및 Texas Red는 리포터를 의미한다.)
표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, ABOF PNA 프로브는 ABO 유전자의 261번째 염기를 포함하는 부분에, ABOH PNA 프로브는 ABO 유전자의 526번째 염기를 포함하는 부분에, ABOR PNA 프로브는 ABO 유전자의 803번째 염기를 포함하는 부분에 상보적으로 결합할 수 있도록 제작하였으며, 각 염기의 번호는 ABO 유전자 좌위(locus)의 대립유전자를 기준으로 작성하였으며, PNA 프로브가 완전한 혼성화를 이루도록 제작하였다.
즉, ABOF PNA 프로브는 A 및 B 대립유전자와 완전한 혼성화를, O 대립 유전자와 불완전한 혼성화를 이루도록 설계하였으며, ABOH PNA 프로브는 A 대립유전자와 완전한 혼성화를, B 및 O 대립유전자와 불완전한 혼성화를 이루도록 설계하였고, ABOR PNA 프로브는 B 대립유전자와 완전한 혼성화를, A 및 O 대립유전자와 불완전한 혼성화를 이루도록 설계하였다.
ABO 유전자 염기변이에 따른 용해곡선 분석
사람의 혈액, 조직, 체액 등의 인체시료 및 법의학 현장시료로부터 추출한 다양한 혈액형 유전자형을 가진 시료(DNA)를 주형으로 하여 PCR을 수행하기 위해, 실시예 1에서 합성한 3쌍의 프라이머 세트 및 3 종류의 PNA 프로브와 시료(사용한 시료)를 혼합한 다음, CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR 증폭과정 및 융해곡선 분석을 실시하였으며, PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 10X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, 3쌍의 forward primer 및 reverse primer 0.5㎕, PNA 프로브 3종 및 3㎕ human DNA(시료)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시하였다.
하나의 혈액형 샘플 분석을 위해, 3 종류의 PNA 프로브를 조합하여 하나의 튜브 내에서 DNA 증폭 및 융해곡선 분석을 수행하였다. 리얼타임 PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 73℃에서 25초 동안 반응시켰으며, 이를 36 cycle 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 35℃에서 5분간 혼성화 시킨 후, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 0.5초간 정지 상태를 유지하였다 (도 2).
사람의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 다음, 융해곡선을 분석한 결과, 사람의 ABO 유전자에서 B 및 O 대립유전자의 단일염기변이 또는 염기 결실로 인한 PNA 프로브와의 불완전 혼성화로 인해 서로 다른 혈액형별 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 융해온도 차이 패턴을 분석하여 AA형, AO형, BB형, BO형, AB형, O01,02형 등의 혈액형 유전자형을 판별할 수 있는 것을 확인하였다 (도 3).
혈액형 유전자형에 따른 PNA 융해곡선 패턴을 분석하기 위해, 표 2와 PNA FMCA를 통해 얻어진 융해온도(Melting Temperature = Tm) 및 융해곡선 패턴을 표기화(Calling)하였다.
Figure pat00001
상기 표 2에서, P는 완전한 혼성화(Perfect match), M은 불완전한 혼성화(miss match)를 의미하며 H의 경우 완전한 혼성화(Perfect match)와 불완전한 혼성화(Miss match)가 동시에 존재함을 의미한다. 상기 결과를 살펴보면, 각 혈액혈별로 PNA 프로브와의 융해온도가 서로 다른 것을 확인할 수 있었으며, 패턴 표기에 있어서도 각각의 혈액형 유전자형에 따라 다른 결과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
ABO 혈액형 유전자형에 따른 PNA 프로브의 융해온도 범위 및 표기법 설정
ABO 혈영형 유전자형에 따른 PNA 프로브의 융해온도 범위 및 표기법을 설정하기 위해, 실시예 2에서 PNA 프로브를 이용한 형광융해곡선분석(FMCA)을 수행하여 도출된, 융해온도(Tm)값을 융해온도에 맞추어 표기법화 하였다 (표 3). 즉, 완전한 혼성화(P), 불완전한 혼성화(M) 및 완전한 혼성화와 불완전한 혼성화가 동시 존재시(H), 융해온도의 ±3℃ 범위를 만들고 이 범위 안에 들면 각각의 문자로 표기하여 고유의 표기법을 가지도록 하였다.
Figure pat00002
또한, 혈액형에 대하여 ABO 유전자를 PNA FMCA를 통해 얻어진 융해온도를 ABOF, ABOH, ABOT PNA 프로브 순서에 따라서 고유의 표기법 변환하면 표 4와 같이 나타낼 수 있다.
Figure pat00003
즉, ABO 유전자를 포함하는 시료와 3종류의 PNA 프로브의 융해곡선 분석결과를 상기 표 3 및 표 4의 표기법에 맞추어서 분석을 하면, 간편하고 효과적으로 혈액형 유전형을 판별할 수 있는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seasun Biomaterials Republic of Korea <120> Method for the Determination of Blood Typing Using PNA Probe and fluorscence melting curve analysis <130> P14-B114 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOF-F <400> 1 ctgccagctc catgaccgca cgcc 24 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOF-R <400> 2 acacagttaa cccaatggtg gtgttctgga gcc 33 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOF-probe <400> 3 gtggtgaccc ctt 13 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOH-F <400> 4 acgctgggga ccggtcggca gctg 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOH-R <400> 5 catggacacg tcctgctagc gcttg 25 <210> 6 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOH-Probe <400> 6 cgcgcacctc c 11 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOR-F <400> 7 cttctacgga agcagccggg aggccttcac 30 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOR-R <400> 8 tggtggcagg ccctggtgag ccgctg 26 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABOR-Probe <400> 9 gaacgccccc a 11

Claims (9)

  1. 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 ABO 유전자 간의 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3 종류의 PNA 프로브는 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 6의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소광자(quenching)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법.
  5. 제1항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법:
    (a) (ⅰ) ABO 유전자를 포함하는 시료, (ⅱ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브 및 (ⅲ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트를 혼합시켜 ABO 유전자를 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 PNA 프로브 간의 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 단계.
  6. 제1항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석을 통한 ABO 혈액형 판별방법:
    (a) (ⅰ) ABO 유전자를 포함하는 시료, (ⅱ) ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 혼합하여 PNA 프로브와 ABO 유전자를 혼성화시키는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 단계.
  7. 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, ABO 유전자의 261번째 염기, 526번째 염기 및 803번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 3 종류의 PNA 프로브를 포함하는 ABO 혈액형 판별키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 3 종류의 PNA 프로브는 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 6의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 ABO 혈액형 판별키트.
  9. 제7항에 있어서, 상기 판별키트는 융해곡선 분석을 통해 ABO 혈액형을 판별하는 것을 특징으로 하는 ABO 혈액형 판별키트.
KR1020140063974A 2014-05-27 2014-05-27 Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법 KR101695477B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140063974A KR101695477B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140063974A KR101695477B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150136558A true KR20150136558A (ko) 2015-12-07
KR101695477B1 KR101695477B1 (ko) 2017-01-12

Family

ID=54872420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140063974A KR101695477B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101695477B1 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101684832B1 (ko) * 2016-06-22 2016-12-08 (주)한국유전자정보센터 실시간 중합효소 연쇄반응법을 이용한 고양이 혈액형 검출용 조성물 및 이들을 이용한 검출방법
KR20170125490A (ko) * 2016-05-04 2017-11-15 주식회사 시선바이오머티리얼스 프로브 및 융해패턴 분석을 이용한 염기서열 동일성 판별방법
WO2018048021A1 (ko) * 2016-09-12 2018-03-15 대한민국(관리부서:행정자치부 국립과학수사연구원장) Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법
CN110982895A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 河南兴龙生物技术有限公司 一种检测人类红细胞abo血型基因分型的引物组、试剂盒及应用
US10627416B2 (en) 2016-11-22 2020-04-21 Republic Of Korea(National Forensic Service Director Ministry Of The Interior And Safety) Aptasensor for detecting female-specific trace of blood and detection apparatus using the same
CN113789374A (zh) * 2021-09-24 2021-12-14 广西医科大学第一附属医院 用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Forensic Sci., Vol. 56, Suppl 1, S179-182 (2010.10.19.)* *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170125490A (ko) * 2016-05-04 2017-11-15 주식회사 시선바이오머티리얼스 프로브 및 융해패턴 분석을 이용한 염기서열 동일성 판별방법
KR101684832B1 (ko) * 2016-06-22 2016-12-08 (주)한국유전자정보센터 실시간 중합효소 연쇄반응법을 이용한 고양이 혈액형 검출용 조성물 및 이들을 이용한 검출방법
WO2018048021A1 (ko) * 2016-09-12 2018-03-15 대한민국(관리부서:행정자치부 국립과학수사연구원장) Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법
US10337055B2 (en) 2016-09-12 2019-07-02 Republic Of Korea (National Forensic Service Director, Ministry Of Public Administration & Security) Method for analyzing SNPs of mitochondrial DNA using PNA probes and melting curve analysis
US10627416B2 (en) 2016-11-22 2020-04-21 Republic Of Korea(National Forensic Service Director Ministry Of The Interior And Safety) Aptasensor for detecting female-specific trace of blood and detection apparatus using the same
CN110982895A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 河南兴龙生物技术有限公司 一种检测人类红细胞abo血型基因分型的引物组、试剂盒及应用
CN110982895B (zh) * 2019-12-31 2023-02-14 河南兰德施坦纳基因科技有限公司 一种检测人类红细胞abo血型基因分型的引物组、试剂盒及应用
CN113789374A (zh) * 2021-09-24 2021-12-14 广西医科大学第一附属医院 用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101695477B1 (ko) 2017-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11041189B2 (en) Genetic markers for discrimination and detection of a virus causing red sea bream iridovirus disease which is an infectious aquatic organism disease, and method of discriminating and detecting the virus using the same
KR101695477B1 (ko) Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법
KR101830700B1 (ko) 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출방법
KR101969971B1 (ko) 양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트
KR101642783B1 (ko) 참돔 이리도바이러스병 원인바이러스의 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
KR101644773B1 (ko) 어류 에드와드 감염증과 연쇄구균 감염증 원인세균의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101782489B1 (ko) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도
KR101986193B1 (ko) 유전성 난청 검출용 ｐｎａ 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법
KR101737314B1 (ko) 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
KR101727598B1 (ko) Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법
KR101655071B1 (ko) 참돔 이리도 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
KR101655069B1 (ko) 잉어 허피스 바이러스 그레이 에스피에이치 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
KR101655068B1 (ko) 잉어 허피스 바이러스 베르코이버 티케이 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
WO2018092998A1 (ko) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 유전자 변이 검출방법
KR101737318B1 (ko) 노랑머리병 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
KR20200129600A (ko) 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전형 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 헬리코박터 파일로리 유전형 판별방법
KR101644776B1 (ko) 참돔 이리도바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
KR101911220B1 (ko) 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법
KR102575618B1 (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물
KR102543156B1 (ko) 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물
KR101737316B1 (ko) 엑스트라 스몰 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
KR101737313B1 (ko) 전염성 근괴사증 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
CN110621784B (zh) 使用双功能pna探针诊断微卫星不稳定性的方法和诊断微卫星不稳定性的试剂盒
KR20160036906A (ko) 프로브 혼합체의 반응성을 높일 수 있는 프라이머 및 그의 용도
KR20170009445A (ko) Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191121

Year of fee payment: 4