KR101727598B1 - Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법 - Google Patents

Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PNA 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 미토콘드리아 DNA간의 융해곡선분석을 통한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 사용하면, 개인 식별에 소요되는 시간 및 비용을 획기적으로 줄일 수 있고, 대량의 검사 혹은 많은 사상자의 발생 시 초기 분석으로 신속한 대처가 가능하며, 신원확인 관련 정보를 코드화 할 수 있으므로 관리 및 감독이 매우 용이하다.

Description

PNA 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법{Method for Analyzing SNP of Mitochondrial DNA Using PNA Probe and Melting curve analysis}
본 발명은 PNA 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 이용하여 PNA 프로브와 미토콘드리아 DNA간의 융해곡선분석을 통한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법에 관한 것이다.
모계 혈통의 추적을 위한 계통연구에 널리 활용되는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 어머니로부터 자손에게 유전되는 특성을 가지고 있다. 이러한 미토콘드리아 DNA는 16 kb 정도로 이 중 개체 내에서 높은 변이비율을 보이는 약 1.1 kb정도의 조절 영역(control region)에 대한 중점적인 분석을 통하여 계통 연구에 활용된다. 특히 조절영역의 초가변(hypervariable; HV) 영역 1과 2는 개인별 또는 인종별로 구분할 수 있는 매우 의미 있는 영역으로서 다양한 논문 등에서 보고되어 왔다.
미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 조절영역은 법과학 영역에서 매우 중요한 신원확인 마커로 활용되고 있으며, 전 세계적으로도 법과학 영역에서 매우 중요한 과학적 근거자료로 활용되고 있다. 현재 mtDNA 분석법의 경우 골드 스탠다드인 생어 시퀀싱(sanger sequencing)을 이용하여 분석을 진행하고 있다. 이러한 생어 시퀀싱 방법의 경우 mtDNA 조절영역 안에서 정확한 염기서열의 변이정보인 SNP를 확인할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 하지만 시료의 분석에 있어서 많은 시간이 소요되며, 시료 결과의 비교분석을 위하여 실험자 및 연구자가 분석 결과를 일일이 확인하고 검토해야하는 단점이 있다. 그리고 유전자 증폭 시 비특이적인 산물이 발생할 경우 분석 결과의 저해를 초래할 수 있다. 또한 분석 장비의 경우 매우 고가에 해당하며, 시료 분석을 위한 전문 기술자가 필요하다.
PNA(peptide nucleic acid) 프로브의 경우 기존의 가수분해 방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)을 이용하여 분석하며, 특정 지역을 확인하거나 마커를 구분할 수 있는 능력이 우수하며, 상보적인 염기서열에서만 반응하는 높은 특이도를 가지고 있어 기존의 프로브가 가지고 있는 문제점을 해결할 수 있는 장점을 가지고 있다. 특히 PNA 프로브의 경우 하나의 PNA 프로브를 이용하여 염기변이를 구분할 수 있는 특징이 매우 우수하여 유전형 분석에 있어서 하나의 PNA 프로브만으로 다양한 염기의 변이 분석이 가능하며, 생어 시퀀싱 대비 저가의 일반적인 실시간 유전자 증폭장치(real-time PCR)을 활용함으로서 전문기술 육성에 비용적, 시간적 투자가 크지 않다. 따라서 초기 분석의 스크리닝 및 SNP 정보의 코드화를 통한 PNA 프로브 기반의 mtDNA 분석법은 저가의 장비를 이용하고 저비용으로 대량의 신원확인 및 개인식별에 매우 효과적으로 신속하게 분석할 수 있는 대량신속처리(high throughput) 분석법이다.
최근에는 PNA 프로브 혼성화 방법의 분석방법으로 형광 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 이용하며, FMCA는 PCR 증폭반응이 끝나고 난 후, 생성된 산물과 PNA 프로브 간의 결합력의 차이를 융해온도(Tm)로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 PNA 프로브는 디자인이 매우 간편하며, 9~15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하므로, 원하는 Tm 값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm 값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브를 변형시켜 Tm 값을 조절할 수 있다.
또한, PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm 값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능한 장점이 있다. 기존의 HRM(high resolution melting) 방법은 Tm 값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 염기서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 동시에 다수의 염기변이 분석이 가능하다.
이에, 본 발명자들은 간편하고 효과적으로 mtDNA를 이용한 신원확인 방법을 개발하고자 노력한 결과, PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브 및 미토콘드리아 DNA간의 형광 융해곡선분석의 코드화를 통해 개인을 보다 효과적으로 판별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 미토콘드리아 DNA에 상보적으로 혼성화하는 PNA 프로브 및 융해곡선분석을 통한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 미토콘드리아 DNA에 상보적으로 혼성화하는 PNA 프로브를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트의 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 미토콘드리아 DNA와 PNA 프로브간의 융해온도를 코드화하여 개인 식별을 위한 정보의 제공방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 다음 단계를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석방법을 제공한다.
(a) 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 복수개의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
(c) 상기 융해곡선의 분석을 통하여 염기서열 변이를 확인하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 또는 2 영역에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 초가변(HV) 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 또는 2 영역에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 HV 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 다음 단계를 포함하는 개인 식별을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
(a) 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 복수개의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계;
(b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 미토콘드리아 DNA와 상기 PNA 프로브들 간의 융해온도를 PNA 프로브별로 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득된 PNA 프로브별 융해온도를 각각 구간화하여 프로브별로 코드를 부여하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 또는 2 영역에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브는 HV 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용한 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법을 사용하면, 개인 식별에 소요되는 시간 및 비용을 획기적으로 줄일 수 있고, 대량의 검사 혹은 많은 사상자의 발생 시 초기 분석으로 신속한 대처가 가능하며, 개인 식별정보를 코드화 할 수 있으므로 관리 및 감독이 매우 용이하다.
도 1은 mtDNA 유전형 분석을 위한 PNA 프로브 커버 영역을 나타낸 것이다.
도 2는 양성 대조군의 융해곡선 분석 결과(도 2a) 및 73개의 인간 시료에 대한 융해곡선 결과(도 2b)를 나타낸 것이다.
도 3은 73개의 시료에 대한 mtDNA 염기서열 분석의 세트별 및 프로브별 융해곡선 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 73개의 시료에 대한 프로브별 코드화를 나타낸 것이다.
도 5는 mtDNA 염기서열 정보의 참조 Tm(융해온도) 코드를 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 간편하고 효과적인 신원확인 방법을 개발하고자 노력한 결과, PNA 프로브를 이용하여 PNA 프로브 및 미토콘드리아 DNA간의 형광 융해곡선분석의 코드화를 통해 개인을 보다 효과적으로 판별할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 복수개의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 융해곡선의 분석을 통하여 염기서열 변이를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
또한, 상기 복수개의 PNA 프로브에 대해 복수개의 융해곡선을 수득할 수 있으며, 복수개의 혼성화된 산물을 융해시켜 수득한 복수개의 융해곡선에 대해 각각 분석하여 염기서열 변이를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 일실시예에 있어서, 상기 복수개의 PNA 프로브를 하나의 시험용기에서 미토콘드리아 DNA을 포함하는 시료와 혼성화시키는 것일 수 있으며, 이 경우 상기 PNA 프로브는 프로브별로 결합된 리포터가 서로 상이하게 제작되는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 PNA 프로브는 SNP에도 융해온도 차이가 발생하기 때문에, 미토콘드리아 DNA의 염기변이를 이용하여 PNA 프로브의 융해곡선 분석을 수행하였으며, 본 발명의 일실시예에서는 mtDNA의 초가변영역(HV) 1 또는 2의 염기서열에 상보적으로 결합하는 16개의 PNA 프로브를 제작하였다(표 1). 상기 16개의 PNA 프로브는 HV 1 영역 및 HV 2 영역을 기준으로, 완전한 혼성화를 이루도록 제작하였다. 즉, mtDNA의 HV 1 및 HV 2 영역의 SNP 또는 염기 결실로 인한 불완전한 혼성화가 이루어지기 때문에 융해온도 차이가 발생한다.
또한, 본 발명의 PNA 프로브는 HV 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '염기변이'는 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, SNP 뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 PNA 프로브는 각각 미토콘드리아 DNA와 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 미토콘드리아 DNA와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광된다. 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여 미토콘드리아 DNA의 SNP을 식별할 수 있다.
본 발명에서는 PNA 프로브를 이용한 융해곡선분석을 위해 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질을 결합하였다.
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 미토콘드리아 핵산을 포함하는 시료는 그로부터 mtDNA 및 mtRNA가 획득될 수 있는 세포를 함유하는 조직 또는 체액에 관한 것이다. 예를 들면, 생물학적 시료는 피부, 폐, 유방, 전립선, 신경, 근육, 심장, 위, 결장, 직장 조직 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 혈액, 타액, 뇌 척수액, 가래, 소변, 점액, 관절낭액, 복막액, 양수 등으로부터 유도될 수 있다.
미토콘드리아 핵산을 포함하는 시료는 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일가닥으로, 또는 부분적인 단일가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예: 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.
본 발명의 일실시예에서는 mtDNA를 주형으로 하여 SNP 분석을 수행하기 위해, 실시예 1에서 합성한 16개의 PNA 프로브 및 시료(사용한 시료)를 증폭하여 생성된 mtDNA 증폭산물과 PNA 프로브의 융해곡선 분석을 수행하였다. 그 결과, mtDNA 염기서열의 염기변이 또는 염기 결실로 인한 PNA 프로브와의 불완전 혼성화로 인해 서로 다른 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인하였다(도 2b 및 도 3).
본 발명은 다른 관점에서, 리포터및 소광자가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 PNA 프로브를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트에 관한 것이다.
상기 PNA 프로브는 HV 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 미토콘드리아 DNA의 증폭을 위한 프라이머 세트, 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 리포터 및 소광자가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 염기서열에 혼성화하는 복수개의 PNA 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 미토콘드리아 DNA와 상기 PNA 프로브들 간의 융해온도를 PNA 프로브별로 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 PNA 프로브별 융해온도를 각각 구간화하여 프로브별로 코드를 부여하는 단계를 포함하는 신원확인을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
본 발명은 미토콘드리아 DNA의 염기서열을 분석하기 위하여 미토콘드리아 DNA와 PNA 프로브간의 융해온도를 코드화한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미토콘드리아 DNA와 상기 PNA 프로브 간의 융해온도는 그 융해온도 구간이 서로 상이하도록 구간화하여 별개의 코드를 부여하는 것일 수 있다.
본 발명의 미토콘드리아 DNA의 염기서열 코드법을 이용하여 검체 시료의 미토콘드리아 DNA의 융해곡선을 분석해본 결과, 하나의 PNA 프로브와 혼성화하는 시료의 염기서열 변이 여부에 따라 융해온도는 서로 동일하거나 상이하게 나타났으나, 둘 이상의 PNA 프로브를 사용하여 동시에 분석을 진행하는 경우 검체의 시료에 따라 융해온도의 조합은 서로 상이함을 확인할 수 있었다. 이러한 특징을 이용하는 경우 프로브를 활용한 참조 코드(reference code)를 제작할 수 있는데, 그 결과는 도 5와 같이 코드의 부여가 가능하다.
이처럼 PNA 프로브는 시료의 염기서열과 완전히 혼성화되지 않으면 융해온도가 달라지기 때문에 염기서열 변화를 확인할 수 있으며, 각각의 염기서열 변화에 따른 복수개의 융해온도에 일련의 코드를 부여할 경우, 많은 양의 시료를 분석할 수 있고, 시료의 추적관리가 가능한 장점이 있다. 더불어 미리 코드를 부여해놓은 시료의 코드법에 따라 새로운 시료의 융해온도를 분류하면 친자확인, 용의자 DNA 대조 또는 사상자 식별 등 미토콘드리아 DNA 코드 정보를 통해 신원확인을 용이하게 할 수 있다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 코드법을 이용하면 미토콘드리아 DNA의 염기서열 변이가 빈번히 발생하는 염기서열, 예컨대 초가변(HV) 1 또는 2 영역에 상보적으로 결합하는 최소한의 PNA 프로브를 제작하고, 융해곡선을 코드화함으로써 신원확인을 위하여 별도의 분석 프로그램이 필요 없는 장점이 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 16개의 프로브로 73개 검체의 식별이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 개인 식별을 위한 코드화의 경우 염기서열 변화 여부에 따라 하나의 PNA 프로브가 다양한 융해 온도를 나타내어 이들을 적절히 조합하여 숫자로 표기할 경우 각각의 시료의 정보를 확인할 수 있고, 융해온도의 범위를 세분화하여 구간화 할수록 적은 숫자의 PNA 프로브로 많은 시료의 정보를 코드화할 수 있다. 융해온도의 구간화는 융해곡선 측정이 가능한 온도인 40~95℃, 장비에 따라서는 5~95℃의 온도 범위에서 구분이 가능할 수 있다. 그러나 염기서열의 변이 위치가 다름에도 불구하고 융해온도가 동일하게 나타나는 경우가 있을 수 있으며, 이 경우에는 추가적인 PNA 프로브를 제작하여 구분이 가능하도록 할 수 있다.
본 발명의 개인 식별 코드법을 이용하여 미토콘드리아 DNA의 융해곡선을 분석해본 결과, 융해온도를 구간화하여 각 프로브별로 도 4와 같이 코드의 부여가 가능하다. 각각의 염기서열 변화에 따른 융해온도에 일련의 코드를 부여할 경우, 코드 자체가 염기서열 정보를 포함하는 신원확인에 사용할 수 있으며, 코드를 통한 정보의 간소화로 관리 및 추적이 매우 용이한 장점이 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 융해곡선온도를 프로브별로 분류한 후 각각의 숫자를 부여하고 각 시료에 대하여 코드화를 수행하였고(도 4), 이를 생어 시퀀싱 결과와 비교하여 mtDNA 염기서열에 따른 참조서열을 제작하였다(도 5).
상기 각 시료에 대한 코드화 정보 및 참조서열의 대조결과, 프로브의 특정 온도에서 생어 시퀀싱 결과와 일치하는 고유의 mtDNA 염기서열 정보를 확인할 수 있었다(실시예 3). 즉, 미토콘드리아 DNA을 포함하는 시료와 PNA 프로브의 융해곡선 분석결과를 각 시료의 코드화 및 참조 코드와의 비교에 의하여 분석을 수행할 경우, 신속하고 효과적으로 신원확인을 할 수 있는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 미토콘드리아 DNA의 신원확인용 PNA 프로브 제조
PNA 프로브는 염기서열 분석을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적 SNP와의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 더불어 형광이 표기된 인공합성 올리고의 구조적 특징으로 PNA 프로브 제작 시 형광 리포터와 소광자의 위치를 교차하여 제작하였다.
또한, 염기의 변이 부분의 융해온도(Tm)는 제작한 PNA 프로브를 기준으로 인공합성 올리고의 상보적인 결합에 의하여 차이가 발생할 수 있도록 제작하였다(표 1).
Figure 112016089034768-pat00001
(상기 표 1에서, TxR는 Texas red를 나타낸다. 또한, Dabcyl은 소광자, FAM, Texas red, HEX, Alexa 680 및 Cy5는 리포터를 의미한다.)
표 1에 나타난 바와 같이, mtDNA SNP 분석을 위해 제작한 PNA 프로브의 경우 HV 1 영역 9개, HV 2 영역 7개를 제작하였으며, 총 16개 프로브를 이용하여 mtDNA SNP 62개(HV 1: 42, HV 2: 20)를 구분하여 신원확인을 확인할 수 있도록 제작하였다(도 1).
[ 실시예 2] mtDNA SNP 융해곡선 분석
mtDNA 염기서열 분석을 위한 시료는 국립과학수사연구원에서 보관중인 73개의 시료를 이용하여 실험에 사용하였으며, 양성 대조군(positive control)의 경우 NCBI DB를 이용하여 HV 1 및 HV 2 영역의 참조 서열(reference sequence)를 제작하였다. 상기 73개의 시료는 생어 시퀀싱을 통하여 mtDNA의 유전자 분석을 완료한 시료를 사용하였다.
시료를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 얻은 mtDNA 증폭산물과 실시예 1에서 합성한 프로브 세트를 혼합한 다음, CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 융해곡선분석을 실시하였으며, PNA 프로브를 이용한 mtDNA 염기서열 분석 실험의 조성은 다음과 같다.
우선, HV 1 mtDNA 유전형 분석의 경우 유전자 증폭 후 얻어진 HV 1 유전자 산물 3㎕, 프라이머 HV 1-R 1㎕/50pmol, PNA 프로브 A 세트 0.5㎕/10pmol(HV 1-P16129, HV 1-P16311-9, HV 1-P16172, HV 1-P16278 및 HV 1-P16217-23) 및 증류수 5.5㎕를 첨가하여 mtDNA HV 1 A 세트를 제조하였으며, HV 1 B 세트의 경우 A 세트 제조 시 사용한 유전자 산물 및 프라이머는 동일하게 첨가하되 PNA 프로브의 경우 B 세트 0.5㎕/10pmol(HV 1-P16261, HV 1-P16297-8, HV 1-P16182-3-9 및 HV 1-P16362)를 첨가하여 제조하였다.
한편, HV 2의 경우 HV 2 mtDNA 유전형 분석을 위한 유전자 증폭산물 3㎕, 프라이머 HV 2-R 1㎕/50pmol, PNA 프로브 A 세트 0.5㎕/10pmol(HV 2-P146-50-52, HV 2-P263 및 HV 2-P204-7) 및 증류수 5.5㎕를 첨가하여 mtDNA HV 2 A 세트를 제조하였으며, HV 2 B 세트의 경우 HV 2 A 세트 제조 시 사용한 유전자 산물 및 프라이머는 동일하게 첨가하되 PNA 프로브의 경우 B 세트 0.5㎕/10pmol(HV 2-P235, HV 2-P249 및 HV 2-P195-9), HV 2 C 세트의 경우 HV 2 A 세트 제조 시 사용한 유전자 산물 및 프라이머는 동일하게 첨가하되 PNA 프로브의 경우 C 세트 0.5㎕/10pmol(HV 2-P73)를 첨가하여 제조하였다.
HV 1 및 HV 2 양성 대조군 시료와 73개의 인간 시료에서 mtDNA 염기서열 분석을 진행하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 75℃, 55℃ 및 45℃ 순으로 각 1분간 혼성화 시킨 후, 30℃에서 85℃까지 1.0℃/5sec씩 상승시키며 형광을 측정하는 융해곡선 분석을 수행하였다(도 2a 및 2b).
양성 대조군을 이용한 융해곡선 분석 결과 합성한 염기서열 분석을 위하여 제작한 PNA 프로브가 고유의 융해곡선 온도를 나타냄으로서 정확하게 구분하는 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 또한, 상기 양성 대조군을 기준으로 73개의 시료에 대한 mtDNA 염기서열 분석을 위한 융해곡선 분석을 세트별 및 프로브별로 그 결과를 정리하였다(도 4).
[ 실시예 3] PNA 프로브를 이용한 mtDNA 염기서열 정보의 코드화(N-Code)
실시예 2의 융해곡선분석 결과를 바탕으로, 융해곡선 온도를 프로브별로 그룹화 후 각각 숫자를 부여하고, 73개의 시료에 대하여 코드화(number-coding) 하였다(표 4). 또한, 생어 시퀀싱 결과와 비교하여 mtDNA 염기서열에 따른 참조 코드를 제작하였다(도 5).
도 5의 경우, 73개 시료의 생어 시퀀싱 결과와 도 4의 프로브별 융해온도의 그룹화를 통하여 정리 후 프로브의 특정 온도에서 생어 시퀀싱 결과와 일치하는 고유의 mtDNA 염기서열 정보를 확인할 수 있었다. 도 5의 참조 코드를 기초로 73개 시료에 대한 mtDNA 염기서열 정보의 위치를 순차적으로 정리하여 전체 HV 1 및 HV 2 영역의 mtDNA 염기서열 정보를 코드화 하였다.
신원확인에 활용할 수 있는 mtDNA 염기서열 정보를 PNA 프로브를 이용한 융해곡선을 분석한 결과 생어 시퀀싱 결과와 100% 일치함을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석방법:
    (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 융해곡선의 분석을 통하여 염기서열 변이를 확인하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석방법.
  6. 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브를 포함하는 미토콘드리아 DNA의 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석용 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트.
  10. 제6항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 DNA의 SNP 분석용 키트.
  11. 다음 단계를 포함하는 신원확인을 위한 정보 제공방법:
    (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합되어 있고, 미토콘드리아 DNA의 초가변(HV) 1 영역에 혼성화하는 서열번호 1 내지 9의 PNA(peptide nucleic acid) 프로브 또는 HV 2 영역에 혼성화하는 서열번호 10 내지 16의 PNA 프로브 및 검체 시료의 미토콘드리아 DNA를 혼성화하는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 미토콘드리아 DNA와 상기 PNA 프로브들 간의 융해온도를 PNA 프로브별로 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득된 PNA 프로브별 융해온도를 각각 구간화하여 프로브별로 코드를 부여하는 단계.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신원확인을 위한 정보 제공방법.
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