KR102018317B1 - 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트. - Google Patents
리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트. Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 표적 유전자의 염기 다형성을 검출하기 위한 PNA 프로브, 이를 이용한 표적 유전자의 염기 다형성 검출을 위한 융해곡선 분석방법, 이러한 융해곡선 분석방법을 포함하는 타겟 유전자의 염기 다형성 분석방법 그리고 PNA 프로브를 포함하는 표적유전자의 염기 다형성 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 음전하를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 PNA 프로브는 음전하를 가지는 분자를 포함함으로써 타겟 DNA와 높은 인식 능력 및 결합능력을 가짐과 동시에 열에 의해 빠르게 해리되어 융해곡선 그래프가 두 개가 나타나는 이형접합 시료에서도 분석이 비교적 용이하고, 또한 서로 인접한 두 개 이상의 단일염기서열변이를 동시에 분석할 수 있다.
Description
본 발명은 표적 유전자의 염기 다형성을 검출하기 위한 변형된 PNA 프로브,리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 이를 이용한 표적유전자의 염기 다형성을 분석하는 방법 그리고 PNA 프로브를 포함하는 표적유전자의 염기 다형성 검출용 키트에 관한 것이다.
단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 유전적 변이로, 병의 원인 또는 치료제에 대한 반응 등 사람마다 개인차를 가져온다. 단일염기서열변이의 검출과 확인은 맞춤의약 뿐 아니라 신약개발에도 연결되기 때문에 관심이 집중되고 있다.
단일염기서열변이의 신속한 검출을 위해서 실시간 PCR 기술을 응용한 다양한 검출 방법이 사용되고 있다. 대표적으로 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 분석하는 방법, DNA 프로브를 이용하는 방법, 또는 PNA 프로브를 이용하는 방법 등이 있다.
DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용한 단일염기서열변이 분석법은, PCR 반응 후 생성물에 대한 추가적인 조작 없이 DNA 인터컬레이팅 형광물질의 포화농도에 의해 PCR 엠플리콘(amplicon)의 염기 변화를 구별할 수 있다. 하지만 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용함에 있어 제약을 가지며, 한 번에 하나의 단일 염기서열변이 만을 분석할 수 있으며, 융해곡선을 분석하기 위한 프로그램 사용해야 한다는 단점을 가진다.[Kirk M. Ririe, et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 245, 154160, 1997; U. Hladnik et al., Clin Exp Med 2, 105108, 2002]
융해곡선 분석을 위해 사용되는 DNA프로브는 MGB 태크만(Taqman)프로브, 분자비컨(MB, Molecular Beacon), 양면(Binary)프로브가 있다. 이 방법들은 뛰어난 단일염기서열변이 구별능을 나타낸다는 장점이 있는 반면, DNA 프로브의 최소 길이가 20~40 mer 정도로 길어서 서로 인접하게 존재하는 단일염기서열변이는 하나의 반응으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다.[Hidefumi Sasaki et a., Clin Cancer Res 11, 2924-2929, 2005; Manna Zhang et al., HEPATOLOGY, 36, 3, 2002]
기존의 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석법은 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있으며, 강한 결합으로 인해 짧은 길이의 프로브를 사용할 수 있어 서로 인접하게 존재하는 단일염기서열변이의 검출이 가능하다는 장점을 가진다.
Chen, C.Y., et al., Clin. Chem. 50, 481-489, 2004
M Beau-Faller etal., British Journal of Cancer 100, 985 992, 2009
본 발명의 목적은 타겟 유전자의 염기 다형성을 검출하기 위한 PNA 프로브를 제공하는 것이다. 특히 바람직하게는 상기 PNA 프로브는 음전하가 도입된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 이용한 타겟 유전자의 염기다형성 검출을 위한 융해곡선 분석방법 및 이를 포함하는 염기다형성 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 포함하는 타겟 유전자의 염기다형성 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타겟 유전자의 염기다형성을 검출하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 제공한다.
상기 PNA 프로브는 음전하 분자를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 음전하 분자는 인산, 카르복실산, 설폰산, 질산, 붕산 계열의 모든 산의 군으로부터 적어도 하나 이상 선택될 수 있다.
또한 상기 음전하 분자는 PNA 프로브의 N 말단, C 말단 또는 PNA골격의 알파, 베타, 감마 위치에 결합될 수 있으며, 최소 하나 이상의 음전하 분자가 연속적, 간헐적으로 프로브의 염기에 결합할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용하는 융해곡선 분석 방법을 제공한다.
상기 융해곡선 분석방법에 이용되는 PNA 프로브는 음전하 분자를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 음전하가 포함된 PNA 프로브를 이용함에 따라 융해곡선 해상도가 증가하여 이형 접합 시료 분석에 용이하다.
본 발명에 따른 음전하 분자를 포함하는 PNA 프로브는 인산, 카르복실산, 설폰산, 질산, 붕산 계열의 모든 산의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 음전하 분자를 포함할 수 있다. 음전하 분자는 PNA 프로브의 N 말단, C 말단 또는 PNA골격의 알파, 베타, 감마 위치에 결합될 수 있으며, 최소 하나 이상의 음전하 분자가 연속적, 간헐적으로 프로브의 염기에 결합할 수 있다.
또한 상기 PNA 프로브는 형광물질을 포함할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 음전하 분자를 포함하는 PNA 프로브를 이용한 타겟 유전자의 염기 다형성 분석방법을 제공한다.
상기 타겟 유전자의 염기 다형성 분석 방법은 융해곡선 분석하는 것을 이용할 수 있다.
PNA는 DNA보다 열 및 생물학적 안정성과 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합능력이 뛰어나서 단일염기서열변이를 검출하는 실시간 PCR 기술의 프로브로 사용할 수 있다. 그러나 실시간 PCR 방법은 시료 내 타겟 DNA를 검출함에 있어 형광물질을 사용하기 때문에, 한 위치의 단일염기변이를 검출하기 위해서는 두 개의 서로 다른 파장의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있다. 이는 다중 검출(multiplex detection)을 함에 있어 커다란 제한사항으로 작용하며, 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 형광 프로브의 융해곡선 분석을 통하여 해결할 수 있다. 하지만 변형되지 않은 PNA 프로브를 사용하여 융해곡선 분석을 할 경우에 융해곡선을 그래프의 피크 반진폭너비(half width at half maximum)가 넓어서 이형접합 시료의 경우 결과 분석이 명확하지 않다는 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 PNA 프로브의 기본 골격에 음전하를 가진 아미노산을 결합하여 온도가 높아짐에 따라 PNA 프로브와 타겟 DNA가 빠르게 해리되어 융해곡선의 분석을 명확하게 할 수 있었다. 이에 대한 간략한 모식도를 도 1에 나타내었다.
본 발명에 따른 PNA 프로브는 융해곡선 그래프의 피크 반진폭너비(half width at half maximum)가 좁은 특징으로 인하여 하기의 예와 같은 다양한 분자 진단 기술에 적용할 수 있다. 예를 들면 짧은 염기서열 내에서 여러 위치의 코돈에서 염기다형성이 발생할 경우에 융해곡선의 해상도가 높기 때문에 한 위치에서 염기다형성이 일어났는지, 둘 또는 여러 위치에서 염기다형성이 발생하였는지 하나의 PNA 프로브를 이용하여 검출 할 수 있다. 또한, 융해곡선의 해상도가 높기 때문에 염기다양성이 일어난 위치의 염기에 따라 융해곡선이 서로 구분되며, 이로 인하여 변이가 일어난 염기서열을 시퀀싱 분석과 같은 별도의 분석이 없어도 간편하게 염기서열을 알아낼 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하는 염기다형성 검출을 위한 융해곡선 분석방법은 융해곡선 해상도가 증가함에 따라 염기다형성의 다중검출이 가능하고 또한 단일염기서열변이가 서로 인접해서 존재하는 경우에도 다중검출이 가능할 수 있게 한다.
또한 본 발명에 따른 음전하를 가진 아미노산을 결합한 PNA 프로브뿐만 아니라 타겟 DNA의 단일염기서열 변이 위치 외의 다른 곳에 불완전 상보 결합(mis-match)을 이루는 염기를 도입한 경우에도 유사한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위하여, 본 발명은 검체 시료로부터 타겟 DNA를 분리하는 단계;
리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 타겟 DNA를 혼성화하는 단계;
온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 타겟 DNA의 염기다형성 분석 방법을 제공한다.
상기 타겟 유전자의 염기다형성 분석방법 및 융해곡선 분석방법에서 이용되는 PNA 프로브는 음전하는 포함하는 것이 바람직하다. 음전하를 포함하는 PNA 프로브는 인산, 카르복실산, 설폰산, 질산, 붕산 계열의 모든 산의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 음전하 분자를 포함할 수 있다. 음전하 분자는 PNA 프로브의 N 말단, C 말단 또는 PNA골격의 알파, 베타, 감마 위치에 결합될 수 있으며, 최소 하나 이상의 음전하 분자가 연속적, 간헐적으로 PNA 프로브의 각 염기에 결합할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 염기다형성 분석방법 및 융해곡선 분석방법에서 이용되는 PNA 프로브는 형광물질을 포함할 수 있다. 상기 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3 로 구성되는 군에서 선택되는 하나이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine).BHQ1, BHQ2 또는 Dabysyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 및 이의 유도체, 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 타겟 유전자의 염기 다형성 분석 방법에서 이용되는 음전하 분자가 결합된 PNA 프로브는 리포터 및 소광자(quencher)를 포함 할 수 있다. 상기 음전하 분자와 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 타겟 DNA와 혼성화 된 후 형광 신호가 발생되며, 온도가 올라감에 따라 음전하 효과에 의해 프로브의 적정 융해 온도에서 타겟 DNA와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 상기 음전하가 포함된 PNA 프로브는 음전하가 없는 PNA 프로브와 비교하여 타켓 DNA와의 해리가 빨라 융해곡선의 해상도를 증가시킨다. 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 타켓 DNA의 염기다형성을 분석할 수 있다.
또한 타겟 유전자의 염기 다형성 분석 방법에서 이용되는 음전하 분자가 결합된 PNA 프로브는 인터컬레이팅 형광물질을 포함할 수 있다. 음전하 분자와 인터컬레이팅 형광물질이 결합된 프로브는 타겟 DNA와 혼성화 된 후 형광 신호가 발생 되며, 음전하 효과에 의해 프로브의 적정 융해 온도에서 타겟 DNA와 빠르게 융해되어 신호가 소광되며, 상기 형광 신호의 온도에 따라 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 타켓 DNA의 염기다형성을 분석할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 타겟 유전자의 염기다형성 분석방법은 인터컬레이팅 형광 물질이 프로브에 직접적인 결합 없이 형광 신호 검출을 이용하여 얻어진 융해곡선을 분석하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위하여, 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브의 융해곡선 분석법을 이용한 타겟 유전자의 염기 다형성 분석용 키트를 제공한다. 상기 키트는 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 포함하는 것이 바람직하며, 또한 상기 PNA 프로브는 음전하를 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 염기 다형성 분석용 키트는 다중 타겟 DNA 또는 단일 타겟 DNA의 염기 다형성을 분석하는데 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 프로브는 기본 골격에 음전하를 가진 아미노산을 결합함으로써 타겟 DNA와 높은 인식 능력 및 결합능력을 가짐과 동시에 열에 의해 빠르게 해리될 수 있다. 따라서 본 발명의 음전하를 포함하는 PNA 프로브를 이용하는 염기다형성 분석방법은 융해곡선 그래프가 두 개가 나타나는 이형접합 시료에서도 분석이 비교적 용이하고, 또한 서로 인접한 두 개 이상의 단일염기서열변이를 동시에 분석할 수 있는 장점을 가진다. 여기에서 융해곡선 분석의 용이함은 이형 접합 시료에서만 한정되는 것은 아니며, 동형 접합(Homozygous) 시료에서도 모두 적용할 수 있다.
도 1은 PNA 프로브가 타겟 DNA와 결합한 모식도 및 융해곡선 그래프이다.
(a) 음전하를 가진 아미노산을 결합한 PNA 프로브를 사용한 경우.
(b) 변형되지 않은 PNA 프로브를 사용한 경우.
도 2는 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 이형접합(Heterozygous) 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타낸다.
(a) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 11의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(b) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 11의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(c) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 12의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(d) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 12의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(e) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 13의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(f) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 13의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
도 3은 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 이형접합 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타낸다.
(a) 감마 글루탐산을 결합하지 않은 PNA 프로브의 경우.
(b) 두 개의 감마 글루탐산이 두 개의 염기를 사이에 두고 결합한 PNA 프로브의 경우.
(c) 두 개의 감마 글루탐산이 염기를 사이에 두지 않고 연속으로 결합한 PNA 프로브의 경우.
(d) 두 개의 감마 글루탐산이 한 개의 염기를 사이에 두고 결합한 PNA 프로브의 경우.
도 4는 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브가 다중 검출을 함을 나타낸다. 검은색 선은 서열번호 2번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 파란색 선은 서열번호 7번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 빨간색 선은 서열번호 8번 PNA 프로브에 의한 융해곡선.
(a) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 상보결합을 하는 타겟 DNA 올리고머로 구성된 동형 접합 시료와 실험한 경우.
(b) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 단일염기서열변이가 있어 불완전 상보결합을 하는 타겟 DNA 올리고머로 구성된 동형 접합 시료와 실험한 경우.
(c) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 상기의 (a), (b)에서 사용된 타겟 DNA 올리고머를 1:1 비율로 혼합한 이형접합 시료와 실험한 경우.
도 5은 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 서로 인접하여 위치한 경우에 다중 검출을 함을 나타내는 도면. 검은색 선은 서열번호 2번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 파란색 선은 서열번호 7번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 빨간색 선은 서열번호 8번 PNA 프로브에 의한 융해곡선.
(a) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 19번 DNA 올리고머를 사용한 경우.
(b) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 20번 DNA 올리고머를 사용한 경우.
(c) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 19, 20번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합하여 사용한 경우.
도 6은 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 여러 가지 이형접합 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타내는 도면.
(a) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 22번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(b) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 26번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(c) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 23번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(d) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 27번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(e) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 24번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(f) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 28번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(a) 음전하를 가진 아미노산을 결합한 PNA 프로브를 사용한 경우.
(b) 변형되지 않은 PNA 프로브를 사용한 경우.
도 2는 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 이형접합(Heterozygous) 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타낸다.
(a) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 11의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(b) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 11의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(c) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 12의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(d) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 12의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(e) 변형되지 않은 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 13의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
(f) 감마 글루탐산을 결합한 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 10, 13의 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우.
도 3은 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 이형접합 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타낸다.
(a) 감마 글루탐산을 결합하지 않은 PNA 프로브의 경우.
(b) 두 개의 감마 글루탐산이 두 개의 염기를 사이에 두고 결합한 PNA 프로브의 경우.
(c) 두 개의 감마 글루탐산이 염기를 사이에 두지 않고 연속으로 결합한 PNA 프로브의 경우.
(d) 두 개의 감마 글루탐산이 한 개의 염기를 사이에 두고 결합한 PNA 프로브의 경우.
도 4는 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브가 다중 검출을 함을 나타낸다. 검은색 선은 서열번호 2번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 파란색 선은 서열번호 7번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 빨간색 선은 서열번호 8번 PNA 프로브에 의한 융해곡선.
(a) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 상보결합을 하는 타겟 DNA 올리고머로 구성된 동형 접합 시료와 실험한 경우.
(b) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 단일염기서열변이가 있어 불완전 상보결합을 하는 타겟 DNA 올리고머로 구성된 동형 접합 시료와 실험한 경우.
(c) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 각각의 프로브와 상기의 (a), (b)에서 사용된 타겟 DNA 올리고머를 1:1 비율로 혼합한 이형접합 시료와 실험한 경우.
도 5은 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 서로 인접하여 위치한 경우에 다중 검출을 함을 나타내는 도면. 검은색 선은 서열번호 2번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 파란색 선은 서열번호 7번 PNA 프로브에 의한 융해곡선, 빨간색 선은 서열번호 8번 PNA 프로브에 의한 융해곡선.
(a) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 19번 DNA 올리고머를 사용한 경우.
(b) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 20번 DNA 올리고머를 사용한 경우.
(c) 감마 글루탐산이 결합된 세 개의 PNA 프로브와 표 2의 서열번호 19, 20번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합하여 사용한 경우.
도 6은 PNA 프로브가 단일염기서열변이가 있는 여러 가지 이형접합 시료와의 결합에 의한 융해곡선 그래프를 나타내는 도면.
(a) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 22번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(b) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 26번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(c) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 23번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(d) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 27번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(e) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 21, 24번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
(f) 표 1의 서열번호 9번 PNA 프로브와 표 2의 서열 번호 25, 28번 DNA 올리고머를 1:1로 혼합한 시료를 사용한 경우
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 아래의 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 실시 예에 한정되는 것이 아님은 명확한 것이다.
[
실시예
1] 융해곡선 분석 실험에 사용된
PNA
프로브
및
타겟
DNA
올리고머
합성 및 융해곡선 분석 방법
본 발명의 융해곡선 분석을 위해 표 1과 같은 PNA 프로브를 합성하여 사용하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열 ( N' -> C' ) | 서열길이 |
| 1 | 861-F71 | Dabcyl-CAAACAGCTGGG-OK-ROX | 12 |
| 2 | 861-glu2-71-65 | Dabcyl-CAAAC A GC T GGG-OK-ROX | 12 |
| 3 | 858-F-78 | Dabcyl-TTGGGCGGGCC-OK-ROX | 11 |
| 4 | 858-glu2-70 | Dabcyl-TTGGGCG G GC C -OK-ROX | 11 |
| 5 | 858-glu270 | Dabcyl-TTGGGCGG GC C-OK-ROX | 11 |
| 6 | 858-glu-270 | Dabcyl-TTGGGCG G G C C-OK-ROX | 11 |
| 7 | 18-2-3 | Dabcyl-TAGTTG G GA T GTAC-OK-FAM | 14 |
| 8 | K13_melt | Dabcyl-ACGCCACC A GC T CC-OK-HEX | 14 |
| 9 | K | Dabcyl-GAGCTTGGTGGCG-OK-FAM | 13 |
상기 표 1에서 O는 링커, 굵은 글씨체 및 밑줄로 표시된 문자는 γ-글루탐산(glutamic acid)-PNA 모노머(monomer), K는 라이신(lysine)을 의미한다.
PNA 프로브는 한국등록특허 제 464,261호에 기재된 방법에 따라 PNA 올리고머를 벤조티아졸설포닐(Bts : Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다[Lee et al., Org. Lett., 2007, 9, 3291-3293]. 이 방법 이외에도 알려진 9-플루오레닐메톨시카르보닐(Fmoc : 9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl) 합성법을 사용하여 PNA를 합성할 수도 있다[Kim L. et al., J. Org. Chem. 59, 5767-5773, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51, 6179-6194, 1995]. 리포터 물질 및 소광 물질은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 PNA 프로브에 표지하였다.
상기의 PNA 프로브와 결합을 이루는 타겟 DNA 올리고머는 표 2와 같이 ㈜바이오니아(한국)에서 합성 의뢰하여 사용하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5' -> 3') | 서열길이 |
| 10 | 58T-61T | CGCACCCAGCTGTTTGGCCTGCCCAAAATC | 30 |
| 11 | 58T-61A | CGCACCCAGCAGTTTGGCCTGCCCAAAATC | 30 |
| 12 | 58T-61G | CGCACCCAGCGGTTTGGCCTGCCCAAAATC | 30 |
| 13 | 58C-61C | CGCACCCAGCCGTTTGGCCTGCCCAAAATC | 30 |
| 14 | 58A-61C | CGCACCCAGCCGTTTGGCCAGCCCAAAATC | 30 |
| 15 | Tm-13-04 | CATGTACGTCCCAACTACATG | 21 |
| 16 | Tm-13-01 | CATGTACGTCACAACTACATG | 21 |
| 17 | 2120758-G(W) | AAGGTTGGAGATGGTGGCGTAGGCTA | 26 |
| 18 | 2120758-C | AAGGTTGGAGATGCTGGCGTAGGCTA | 26 |
| 19 | 3Target_W | CACCCAGCTGTTTGGAAGCATGGTACGCCACTAAGCTCCAAGGAATCGGTTGGAGATGGTGGCGTAGGCTA | 71 |
| 20 | 3Target_M | CACCCAGCAGTTTGGAAGCATGGTACGCCAGTAAGCTCCAAGGAATCGGTTGGAGATGCTGGCGTAGGCTA | 71 |
| 21 | K(D) | CATGCGCCACCAAGCTCCATG | 21 |
| 22 | K(D)-0A | CATGCGCCACTAAGCTCCATG | 21 |
| 23 | K(D)-0C | CATGCGCCACGAAGCTCCATG | 21 |
| 24 | K(D)-0T | CATGCGCCACAAAGCTCCATG | 21 |
| 25 | K(D)-0A | CATGCGCCACTAAGCTCCATG | 21 |
| 26 | K(D)-1A | CATGCGCCAATAAGCTCCATG | 21 |
| 27 | K(D)-2A | CATGCGCCAGTAAGCTCCATG | 21 |
| 28 | K(D)-3A | CATGCGCCATTAAGCTCCATG | 21 |
상기의 표 1에 나열한 PNA 프로브 1.25 uM, 표 2에 나열한 DNA 올리고머 0.25 uM와 PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)을 넣고 혼합한 뒤 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 95℃ 에서 5분 동안 반응 후, 40℃까지 초당 0.1℃의 속도로 낮춘 뒤에 5분 동안 유지시킨 다음, 40℃부터 95℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다.
[
실시예
2] 감마 글루탐산이
결합된
PNA
프로브를
이용한
단일염기서열변이가
있는 이형접합 시료의 융해곡선 분석
감마 글루탐산이 결합된 PNA 프로브와 변형되지 않은 PNA 프로브 간의 융해곡선의 차이를 비교하기 위하여 표 1의 서열번호 1, 2의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 10과 서열번호 11 내지 12 내지 13 중 하나와 1:1 비율로 혼합한 올리고머와 각각 상기의 실시 예 1의 방법을 이용하여 실험하여 융해곡선을 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 감마 글루탐산이 결합된 PNA 프로브를 사용한 경우에 음전하 효과로 온도 상승에 따른 타겟 DNA와의 해리가 빠르게 진행되어 단일염기서열변이가 있는 이형접합 시료에서 융해곡선의 해상도가 월등하게 증가함을 확인할 수 있었다.
[
실시예
3]
PNA
프로브에
결합된
감마 글루탐산의 위치에 따른
단일염기서열변이가
있는 이형접합 시료의 융해곡선 분석
PNA 프로브에 결합된 감마 글루탐산의 위치에 따른 융해곡선의 차이를 비교하기 위하여 표 1의 서열번호 3, 4, 5, 6번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 13, 14번 DNA 올리고머를 1:1 비율로 혼합한 시료와 각각 상기의 실시예 1의 방법을 이용하여 융해곡선을 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
감마 글루탐산이 두 개가 두 개의 염기를 사이에 두고 결합된 PNA 프로브를 사용한 경우에 단일염기서열변이가 있는 이형접합 시료에서 두 개의 융해곡선이 가장 명확하게 분리되었다.
[
실시예
4] 감마 글루탐산이
결합된
서로 다른 세 개의
PNA
프로브를
이용하여
PNA
프로브와 세 개의 서로 다른 동형접합 시료 또는
단일염기서열변이를
포함하는 이형접합 시료에서의 융해곡선 분석
상기의 실시 예 2를 다중 검출에 적용할 수 있는지를 확인하였다. 표 1의 서열번호 2번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 10 내지 11 또는 둘을 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머와의 조합, 표 1의 서열번호 7번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 15 내지 16 또는 둘을 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머와의 조합, 그리고 표 1의 서열번호 8번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 17 내지 18 또는 둘을 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머와의 조합을 상기의 실시 예 1의 방법을 이용하여 실험하여 융해곡선을 분석하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 감마 글루탐산이 결합된 PNA 프로브를 이용하여 다중 검출도 가능함을 확인하였다.
[
실시예
5] 감마 글루탐산이
결합된
서로 다른 세 개의
PNA
프로브를
이용하여 세 개의 서로 다른
단일염기서열변이가
서로 인접해서 존재하는 이형접합 시료에서의 융해곡선 분석
상기의 실시 예 4에서 확인한 다중 검출 능력이 단일염기서열변이가 서로 인접해서 존재하는 경우에도 가능한 것인지 확인하였다. 표 1의 서열번호 2, 7, 8번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 19 내지 20 또는 둘을 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머와 상기의 실시 예 1의 방법을 이용하여 실험하여 융해곡선을 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 감마 글루탐산이 결합된 PNA 프로브를 이용하여 단일염기서열변이가 서로 인접해서 존재하는 경우에도 다중 검출도 가능함을 확인하였다.
[실시 예 6]
타겟
DNA
의 단일염기서열 변이 위치 외의 다른 곳에 불완전 상보 결합을 이루는 염기를 도입한
PNA
프로브를
이용한
단일염기서열변이가
있는 이형접합 시료에서의 융해곡선 분석
타겟 DNA의 단일염기서열 변이 위치 외의 다른 곳에 불완전 상보 결합을 이루는 염기를 도입한 PNA 프로브의 효과를 확인하기 위하여 표 1의 서열번호 9 번의 PNA 프로브를 표 2의 서열번호 21과 서열번호 22 내지 23 내지 24 중 하나와 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머, 그리고 서열번호 25과 서열번호 26 내지 27 내지 28중 하나와 1:1 비율로 혼합한 타겟 올리고머와 각각 상기의 실시 예 1의 방법을 이용하여 실험하여 융해곡선을 분석하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 타겟 DNA의 단일염기서열 변이 위치 외의 다른 곳에 불완전 상보 결합을 이루는 염기를 도입한 PNA 프로브도 단일염기서열변이가 있는 이형접합 시료에서 두 개의 융해곡선이 명확하게 분리되는 것을 확인했다.
본 발명에서 개발된 PNA 형광 프로브는 실시 예에서 명확히 한 융해곡선 분석 방법 뿐 만 아니라 형광 프로브를 사용하여 타겟 DNA를 분석할 수 있는 모든 방법, 예를 들어 실시간 PCR 방법에 이용될 수 있지만, 이는 한 예일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 가능한 모든 방법으로 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
<110> Panagene Inc.
<120> Melting curve analysis using PNA probe comprising reporter and
quencher, Method and Kit for analyzing Nucleotide Polymorphism
using melting curve analysis
<130> P1209113125
<160> 28
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(861-F71)
<400> 1
caaacagctg gg 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(861-glu2-71-65)
<400> 2
caaacagctg gg 12
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(858-F-78)
<400> 3
ttgggcgggc c 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(858-glu2-70)
<400> 4
ttgggcgggc c 11
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(858-glu270)
<400> 5
ttgggcgggc c 11
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(858-glu-270)
<400> 6
ttgggcgggc c 11
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(18-2-3)
<400> 7
tagttgggat gtac 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(K13_melt)
<400> 8
acgccaccag ctcc 14
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pna probe(K)
<400> 9
gagcttggtg gcg 13
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(58T-61T)
<400> 10
cgcacccagc tgtttggcct gcccaaaatc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(58T-61A)
<400> 11
cgcacccagc agtttggcct gcccaaaatc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(58T-61G)
<400> 12
cgcacccagc ggtttggcct gcccaaaatc 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(58C-61C)
<400> 13
cgcacccagc cgtttggcct gcccaaaatc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(58A-61C)
<400> 14
cgcacccagc cgtttggcca gcccaaaatc 30
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(Tm-13-04)
<400> 15
catgtacgtc ccaactacat g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(Tm-13-01)
<400> 16
catgtacgtc acaactacat g 21
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(2120758-G(W))
<400> 17
aaggttggag atggtggcgt aggcta 26
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(2120758-C)
<400> 18
aaggttggag atgctggcgt aggcta 26
<210> 19
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(3Target_W)
<400> 19
cacccagctg tttggaagca tggtacgcca ctaagctcca aggaatcggt tggagatggt 60
ggcgtaggct a 71
<210> 20
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(3Target_M)
<400> 20
cacccagcag tttggaagca tggtacgcca gtaagctcca aggaatcggt tggagatgct 60
ggcgtaggct a 71
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D))
<400> 21
catgcgccac caagctccat g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-0A)
<400> 22
catgcgccac taagctccat g 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-0C)
<400> 23
catgcgccac gaagctccat g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-0T)
<400> 24
catgcgccac aaagctccat g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-0A)
<400> 25
catgcgccac taagctccat g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-1A)
<400> 26
catgcgccaa taagctccat g 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-2A)
<400> 27
catgcgccag taagctccat g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA oligomer(K(D)-3A)
<400> 28
catgcgccat taagctccat g 21
Claims (11)
- 리포터 및 소광자가 결합되고, 음전하 분자를 포함하는 PNA 프로브를 이용하는 타겟 유전자의 염기 다형성 검출을 위한 융해곡선 분석방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 인터컬레이팅 형광 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
- 제 1항에 있어서, 프로브에 직접적으로 결합하지 않는 인터컬레이팅 형광 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 음전하 분자는 인산, 카르복실산, 설폰산, 질산, 붕산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 음전하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 음전하 분자는 N 말단, C 말단 또는 PNA골격의 알파, 베타, 감마 위치에 결합되며, 적어도 하나 이상의 음전하 분자가 연속적 또는 간헐적으로 결합 되는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
- 검체 시료로부터 타겟 DNA를 분리하는 단계;
리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 타겟 DNA를 혼성화하는 단계;
온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하고,
상기 PNA 프로브는 음전하 분자를 포함하는 것인 타겟 DNA의 염기다형성 분석방법. - 삭제
- 리포터 및 소광자가 결합되고, 음전하 분자를 포함하는 PNA 프로브의 융해곡선 분석법을 이용한 타겟 유전자의 염기 다형성 분석용 키트.
- 제 9항에 있어서, 상기 키트는 다중 타겟 DNA 또는 단일 타겟 DNA의 염기다형성 분석용인 것을 특징으로 하는 키트.
- 삭제
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020120112365A KR102018317B1 (ko) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120112365A KR102018317B1 (ko) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140046688A KR20140046688A (ko) | 2014-04-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120112365A KR102018317B1 (ko) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트. |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102018317B1 (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101695477B1 (ko) * | 2014-05-27 | 2017-01-12 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | Pna 프로브 및 형광융해곡선분석을 이용한 혈액형 판별방법 |
| KR101951172B1 (ko) * | 2014-11-07 | 2019-02-22 | 주식회사 파나진 | 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브, 키트 및 방법 |
| KR102266987B1 (ko) * | 2014-12-24 | 2021-06-21 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | Pna 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법 |
| WO2016122198A1 (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | PNA 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 임계 사이클(Ct)에 따른 핵산 검출의 문제를 해결하는 방법 |
| KR102214804B1 (ko) * | 2015-07-17 | 2021-02-15 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법 |
| KR101986193B1 (ko) * | 2015-11-26 | 2019-06-07 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 유전성 난청 검출용 ｐｎａ 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법 |
| KR101898258B1 (ko) * | 2016-05-04 | 2018-09-13 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 프로브 및 융해패턴 분석을 이용한 염기서열 동일성 판별방법 |
| KR101727598B1 (ko) * | 2016-09-12 | 2017-04-17 | 대한민국 | Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법 |
| KR20180072480A (ko) * | 2016-12-21 | 2018-06-29 | 한국생명공학연구원 | 자가 형광 신호 증폭이 가능한 마이크로 rna 검출용 바이오 프로브 세트 및 이의 용도 |
| WO2018174318A1 (ko) * | 2017-03-24 | 2018-09-27 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트 |
| KR101919896B1 (ko) * | 2018-05-03 | 2018-11-19 | 주식회사 유디피아 | 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법 |
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