WO2012020965A2 - Ｐｎａ의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｐｉｋ3ｃａ 돌연변이 검출 방법 및 키트 - Google Patents

Ｐｎａ의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｐｉｋ3ｃａ 돌연변이 검출 방법 및 키트 Download PDF

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to mutation detection of a PIK3CA (Phosphatidylinositol 3-kinase, catalytic, alpha polypeptide) gene using a peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid) probe, and more particularly, to exon 9 of a PIK3CA gene.
  • a PNA probe that specifically binds to a wild type for the detection of 20 mutations, thereby detecting only a small amount of the mutant with high sensitivity by inhibiting amplification of the wild type and a kit for use in the method.
  • PIK3CA phosphatidylinositol 3-kinase
  • Activated tyrosine kinases are involved in the carcinogenic process by activating proteins that inhibit the survival and division of cells and promote the metabolism and inhibit the function of proteins that support cell growth (Serena Di et al., Clin Cancer Res. 2009 August 15; 15 (16), 5017-5019). 75% of the PIK3CA gene mutations are found as point mutations at exon 9, which translates into the helical region of the PI3K protein, and exon 20, which translates into the kinase region; (Ligresti G et al., Cell cycle 2009 May 1; 8: 9, 1352-1358).
  • PIK3CA gene mutations are found in a wide variety of cancers, especially in colorectal cancer, gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer, breast cancer, etc.
  • PIK3CA gene mutations worsen the patient's prognosis by speeding cancer progression and increasing the frequency of metastasis. It is also known to be involved in the resistance of the targeted therapeutics of the HER family to belong to the signaling system downstream of the Human Epidermal Growth Factor (HER family) (Wee S et al., Cancer Res. 2009 May 15; 69 (10): 4286-93, Guo XN et al., Cancer Res. 2007 Jun 15; 67 (12): 5851-8, Ogino S et al., J Clin Oncol.
  • HER family Human Epidermal Growth Factor
  • Herceptin a tyrosine kinase
  • Herceptin a tyrosine kinase
  • PI3K is an important factor in the development of therapeutics that target it, and its importance is increasing. Therefore, PIK3CA mutation detection is an important predictor of the therapeutic effect in the treatment of human epidermal growth factor as a target and may play a decisive role in a good prognosis.
  • the detection method of the PIK3CA mutation is a variation detection method through sequencing after polymerase chain reaction (PCR), and the change in electrophoretic movement distance according to the three-dimensional conformation difference between wild type and mutant genes.
  • Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) method (EI-Habr EA et al., Clin Neuropathol. 2010 Jul-Aug; 29 (4) : 239-45) and the like have been used.
  • the above method is a method of detecting mutations through a process of cleavage with restriction enzymes after PCR, electrophoresis, sequencing, and thus, a reaction time is long, cumbersome and expensive.
  • the above method since clinical samples often contain very few mutations compared to wild-type, although the detection of a small amount of mutations is very important, the above method has low detection sensitivity, making it difficult to detect very small amounts of mutations.
  • PNA PNA probe that specifically binds to a wild type to inhibit amplification of a large amount of wild type.
  • Technology has been developed. PNA was first reported in 1991 as analogous DNA with nucleic acid bases linked by peptide bonds rather than phosphate bonds (Nielsen PE et al., Science 1991 Dec 6; 254 (5037): 1497-500). PNA is synthesized chemically and is not found in nature. PNAs hybridize with native nucleic acids of complementary base sequences to form double strands.
  • PNA / DNA strands are more stable than DNA / DNA strands and PNA / RNA strands are more stable than DNA / RNA strands when the number of nucleic acid bases is the same.
  • N- (2-aminoethyl) glycine is most commonly used by amide bonds.
  • the backbone of peptide nucleic acid is different from that of negatively charged natural nucleic acid. It is electrically neutral.
  • the four nucleic acid bases present in the PNA occupy a similar space as the nucleic acid bases of DNA and the distances between the nucleic acid bases are almost the same as those of natural nucleic acids.
  • PNA is not only chemically more stable than natural nucleic acid but also biologically stable because it is not degraded by nuclease or protease. Since PNA is also electrically neutral, the stability of PNA / DNA, PNA / RNA double strands is not affected by salt concentration. Because of this property, PNAs can recognize complementary nucleic acid sequences better than natural nucleic acids and are therefore used for diagnostic or other biological and medical purposes.
  • the PNA clamping technique uses the advantages of the above-described PNA, so that when the PNA probe is completely bound, the amplification reaction does not occur because the enzyme is not recognized, and in the case of a point mutation, the amplification reaction cannot be perfectly bound. As a method using the principle that occurs, it is widely used because it can quickly and accurately detect a very small amount of mutations compared to wild type.
  • US Patent Publication No. 2008/0176226 discloses PCR in the presence of a primer set that amplifies a selected site of a target nucleic acid and a PNA probe that perfectly binds to the selected site of a wild type, and performs a melt curve analysis on the obtained PCR product. Methods and kits for detecting mutations in target nucleic acids are disclosed. However, the method distinguishes the mutant types by the difference in the melting curve rather than the number of cycles of the amplification reaction. In addition to the PNA clamping probe, a donor fluorophore and an acceptor can detect fluorescence for measuring the melting curve. Requires a probe to which is attached.
  • the U.S. Patent Publication discloses a 17mer PNA (sensor probe) labeled with fluorescein at the N-terminus and a 44mer DNA (anchor probe) labeled with LC-Red 640 at the 3'-end to detect K-ras mutations. Only specific examples are disclosed, and no teaching or suggestion is made regarding the detection of mutations in the PIK3CA gene.
  • the inventors of the PIK3A gene use a relatively long (eg, 15mer or larger) PNA clamping probe to detect mutants using only amplification cycle differences with the wild type.
  • a relatively long (eg, 15mer or larger) PNA clamping probe to detect mutants using only amplification cycle differences with the wild type.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting PIK3CA mutation using PNA-based real-time PCR clamping.
  • Another object of the present invention is to provide a PIK3CA mutation detection kit using PNA-based real-time PCR clamping.
  • PIK3CA gene For the PIK3CA gene, in the presence of a set of PIK3CA gene clamping primers that amplify the exon 9 or exon 20 sites of the PIK3CA gene and a Peptide Nucleic Acid (PNA) clamping probe that fully binds to the wild type of exon 9 or exon 20 of the PIK3CA gene Performing real-time polymerase chain reaction (PCR);
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • It relates to a method for detecting mutation of the PIK3CA gene, comprising the step.
  • the Ct (cycle threshold) value of real-time PCR is measured to determine the presence or absence of mutation of the PIK3CA gene.
  • the PNA clamping probe used in the present invention may be preferably composed of a nucleotide sequence of 15 to 30mer, more preferably 17 to 24mer in length, for example, one consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 31 Can be.
  • the PIK3CA gene clamping primer set used in the present invention is a forward primer specifically binding to the upstream portion of PIK3CA gene exon 9 wild type codon 542, 545 or 546, or exon 20 wild type codon 1047, and specifically downstream thereof It may be to include a reverse primer, for example, the forward primer is made of any one of SEQ ID NO: 36, 37, 41 and 42, the reverse primer is made of any one of SEQ ID NO: 33, 35, and 38 to 40 Can be.
  • gene amplification is analyzed using DNA intercalating fluorescent material, for example SYBR Green I, Evergreen, Ethidium Bromide (EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO -3, consisting of LC green, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 and SYTOX orange
  • DNA intercalating fluorescent material for example SYBR Green I, Evergreen, Ethidium Bromide (EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO -3, consisting of LC green, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 and SYTOX orange
  • Any fluorescent material capable of DNA intercalation can be used, and there is no particular limitation.
  • the method according to the invention can be used to determine or diagnose the treatment of colorectal cancer, gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer or breast cancer.
  • It relates to a kit for use in the mutation detection method of the PIK3CA gene according to the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the PNA-based PCR clamping principle
  • Figure 2 is a graph comparing the detection sensitivity (C t ) according to the probe to select a probe for detecting the PIK3CA exon 9 codon 542 mutation using the PNA probe of SEQ ID NO: 7 to 11 designed in the present invention
  • Figure 3 compares the detection sensitivity (C t ) according to the probe to select a probe for detecting the PIK3CA exon 9 codon 545 mutation using the PNA probe of SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16 and 17 designed in the present invention It is a graph;
  • Figure 4 is a graph comparing the detection sensitivity (C t ) according to the probe to select a probe for detecting the PIK3CA exon 20 codon 1047 mutation using the PNA probe of SEQ ID NO: 1 to 6 designed in the present invention
  • FIG. 5 is a graph comparing detection sensitivity (C t ) according to sample application amount using a PNA probe of SEQ ID NOs: 12 and 13 designed in the present invention in a cell line having a PIK3CA exon 9 codon 545 mutation;
  • FIG. 5 is a graph comparing detection sensitivity (C t ) according to sample application amount using a PNA probe of SEQ ID NOs: 12 and 13 designed in the present invention in a cell line having a PIK3CA exon 9 codon 545 mutation
  • Figure 6 is a graph comparing the detection sensitivity (C t ) according to the mutation containing concentration using a PNA probe of SEQ ID NO: 4 designed in the present invention in a cell line having a PIK3CA exon 20 codon 1047 mutation.
  • the present invention provides a method for detecting a small amount of a mutant with high sensitivity by inhibiting amplification of a wild type by a PNA probe that specifically binds to a wild type for detecting a mutation of exon 9 or 20 of the PIK3CA gene and a kit for use in the method. It is about. 1 schematically shows the principle of the method according to the invention. Specifically, the present invention is for the detection of mutations in exon 9 or 20 of the PIK3CA genes listed in Table 1 below.
  • Table 1 Exon protein amino acid Sequence Exon9 Helical Gly542lys 1624 Exon9 Helical Gly545lys 1633 Exon9 Helical Gly545gly 1634 Exon9 Helical Gly545asp 1635 Exon9 Helical Gln546Gly, Gln546Lys 1636 Exon9 Helical Gln546Pro, Gln546Arg 1637 Exon20 Kinase His1047Tyr 3139 Exon20 Kinase His1047Leu, His1047Arg 3140
  • the PNA probes of the present invention are perfectly matched to the wild-type gene sequence in which the mutations (including substitution) of PIK3CA exons 9 and 20 occur, and are preferably 15 or more, preferably 15 to 30, More preferably, it is characterized by consisting of 17 to 27, most preferably 17 to 24 base sequences.
  • the PNA probe of the present invention is preferably designed such that the wild type gene region of the region where mutations (including substitution) of PIK3CA exons 9 and 20 occur is located in the center of the probe.
  • the PNA probe of the present invention may be composed of any one of SEQ ID NOs: 1 to 31 shown in Table 2 below.
  • PNA probe sequences within the range that can be easily modified by those skilled in the art from the nucleotide sequence using conventional knowledge should be considered to be within the scope of the present invention, using the PNA-based real-time PCR clamping according to the present invention As long as the amplification cycle difference alone can effectively detect mutations of the PIK3CA gene exons 9 and 20, it is included within the scope of the present invention.
  • SEQ ID NOs: 7 to 11 are probes for completely binding with the wild type of codon 542 of PIK3CA exon 9 to inhibit wild type amplification and detect mutations. Substitution at codon 542 results in mutations in the helical structure portion of the PI3K protein by replacing guanine at nucleotide 1624 with adenine and wild type glutamic acid at codon 542 with lysine. SEQ ID NOs: 7 to 11 are designed to hybridize specifically to the 1624 th base comprising codon 542 of PIK3CA exon 9.
  • SEQ ID NOs: 9-31 are probes for completely binding with the wild type of the codon 545 portion of PIK3CA exon 9 to inhibit amplification of the wild type and to detect mutations.
  • Substitutions at codon 545 include substitution of adenine for guanine at nucleotide 1633 with substitution of lysine for wild type gutamic acid at codon 545, replacement of wild type glutamic acid at codon 545 with glycine for adenine at nucleotide 1634; Guanine of nucleotide 1635 is substituted with thymine such that the wild type glutamic acid of codon 545 is replaced with aspartic acid.
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 were designed to hybridize specifically to the 3140th base comprising codon 1047 of exon 20.
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 are probes for completely binding with wild type of codon 1047 of PIK3CA exon 20 to inhibit amplification of wild type and to detect mutations.
  • Substitution at codon 1047 results in mutations in the kinase portion of the PI3K protein by the substitution of adenine at nucleotide 3140 with guanine or thymine and substitution of arginine or leucine with wild-type histidine of codon 1047.
  • the PNA probe of the present invention may include a hydrophilic functional group at the N-terminal or C-terminal in order to increase reaction efficiency and solubility, for example, N-terminal or C-terminal It may contain one to several hydrophilic linkers, amino acids, or amine groups in Shakeel et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 2006, 81, 892-899; Gildea et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 7255-7258; Demidov et al., PNAS, 2002, 99, 5953-5958; Wang et al., Anal. Chem., 1997, 69, 5200-5202.
  • a probe in which one lysine is attached to the N-terminus or one lysine is attached to the N-terminus and the C-terminus is used.
  • the PNA oligomer used in the present invention is a PNA monomer protected with Bts (Benzothiazolesulfonyl) group, or PNA monomer protected with known Fmoc (9-flourenylmethloxycarbonyl) or t-Boc (t-butoxycarbonyl) according to the method of Korean Patent No. 464,261.
  • PIK3CA gene clamping primer refers to amplification of a mutant gene that inhibits amplification of a wild-type gene that is perfectly bound to a PNA probe and that is not completely bound to the PNA probe (ie, a mismatched sequence exists). Point to PCR primers.
  • the clamping primer of the present invention is not particularly limited, but in order to detect mutations with higher sensitivity and specificity, a part of the clamping primer overlaps with the PNA probe in one direction based on the PNA clamping probe, Including the site, it is preferable to devise in consideration of the size of the PCR amplification product.
  • the length is between 17mer and 30mer, it is preferable to design lower than the T m of the PNA probe.
  • the clamping primers were designed to overlap the PNA probes of SEQ ID NOs: 1 to 31 and 5 to 12 base sequences.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 36 exemplified herein is designed to specifically recognize the upstream partial base of codon 542 of the PIK3CA gene exon 9 of SEQ ID NOs: 7-11.
  • the reverse primer of SEQ ID NO: 33 in combination with the forward primer of SEQ ID NO: 36 exemplified herein was designed to specifically recognize the 61-80th base of the 9 region of the PIK3CA gene intron.
  • the reverse primers of SEQ ID NOs: 39 and 40 were designed to specifically recognize the downstream bases of codons 545 and 546 of the PIK3CA gene exon 9 of SEQ ID NOs: 9-31.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 37 in combination with the reverse primers of SEQ ID NOs: 39 and 40 exemplified herein is designed to specifically recognize the 32-59th base of the PIK3CA gene exon 9.
  • the forward primers of SEQ ID NOs: 41 and 42 were designed to specifically recognize the upstream partial base of codon 1047 of the PIK3CA gene exon 20 of SEQ ID NOs: 1-6.
  • the reverse primer of SEQ ID NO: 35 in combination with the forward primers of SEQ ID NOs: 41 and 42 exemplified in the present invention was designed to specifically recognize the 9th to 29th bases of the 21 region of the PIK3CA gene intron.
  • the length of the primer was designed to be between 20mer and 28mer so that the size of the amplification product of the primer combination was 50bp to 500bp, respectively.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 32 provided in the present invention for gene identification through sequencing of exon 9 of the PIK3CA gene was designed to specifically recognize the -63 ⁇ -44th base of the PIK3CA gene intron 8 site
  • the reverse primer in combination with the primer was designed to specifically recognize the 61-80th base of the PIK3CA gene intron 9 site by SEQ ID NO: 33.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 34 provided in the present invention is designed to specifically recognize the 69th to 88th bases of the PIK3CA gene exon 20 region, and the primers The reverse primer in combination with was designed to specifically recognize the 9th to 29th bases of the 21 region of the PIK3CA gene intron with SEQ ID NO.
  • These primers were designed to be combined so that the size of the amplification product was 202 bp.
  • Table 3 The properties of each primer are summarized in Table 3 below.
  • the PIK3CA gene used in step (a) is prepared by extracting from the subject sample.
  • nucleic acid extraction there is no particular limitation on nucleic acid extraction, and any nucleic acid extraction method generally used may be used, and DNA may be prepared by extracting DNA from blood or tumor samples of a patient using commercially available nucleic acid extraction kits.
  • step (a) mutations in the PIK3CA gene are detected using a real time PCR method.
  • Real-time PCR method provides more accurate quantitative analysis because the amount of initial sample with exponential amplification is expressed as the number of cycles (Cycle threshold, hereinafter referred to as 'C t ') where the exponential increase in fluorescence is detected.
  • the reaction can be analyzed in real time. This method eliminates the step of measuring the intensity with an electrophoresis image analyzer and can quickly and easily diagnose by automating and quantifying the amplification degree of the amplification product.
  • the PNA clamping probe in the reaction product of real-time PCR clamping has a final concentration of 1 to 1000 nM.
  • fluorescence is detected by using an intercalating method.
  • a fluorescent label is intercalated on the amplified double-stranded DNA to emit fluorescence.
  • the amount of product produced is measured. This can be applied to any PCR device and can detect mutations in the PIK3CA gene with high sensitivity and specificity even without the preparation of a primer.
  • a DNA-binding fluorophore used in a real-time gene detection method is used as a fluorescent material for identifying gene amplification products, and there is no particular limitation on the type thereof.
  • a DNA-binding fluorophore used in a real-time gene detection method is used as a fluorescent material for identifying gene amplification products, and there is no particular limitation on the type thereof.
  • SYBR Green I Evergreen, Ethidium Bromide (EtBr)
  • BEBO YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC Green, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX orange and the like
  • SYBR Green I Evergreen, Ethidium Bromide (EtBr)
  • BEBO YO-PRO-1, TO-PRO-3
  • LC Green SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16
  • step (b) the amplification of the PIK3CA gene is determined by analyzing the gene amplification by real-time PCR in step (a).
  • the amplification of the PIK3CA gene may be confirmed by comparing the amplified C t values.
  • a PNA probe designed to hybridize with a wild-type gene hybridizes to the PIK3CA mutant codon gene region and inhibits amplification, the amplification is inhibited, resulting in high C t value.
  • the hybridization cannot be hybridized with the PNA probe, resulting in a low C t value.
  • PIK3CA mutation detection method using PNA-based real-time PCR clamping of the present invention can be used to examine tumors such as colon cancer, gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer, breast cancer, etc.
  • tumors such as colon cancer, gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer, breast cancer, etc.
  • tumor research it can be very useful for studying the mechanisms involved in the PIK3CA signaling system. It can also be effectively applied to studies that require large sample analysis, such as population-based studies.
  • PNA probes that fully bind to the wild type of exon 9 codons 542, 545 and exon 20 codon 1047 of the PIK3CA gene were constructed as shown in Table 2 above. Probes that perfectly bind to the wild type of each codon are designed so that the mutant sequence is located in the middle of the probe for effective isolation from the mutation. PNA probes were synthesized according to the method described in Korean Patent No. 464,261 (Lee H et al., Org Lett. 2007 Aug 16; 9 (17): 3291-3.).
  • Primers were prepared by analyzing exon 9 and 20 sites of PIK3CA gene for amplification and clamping PCR of target nucleic acids of PIK3CA exon 9 and 20.
  • the primers of SEQ ID NO: 36 were synthesized using a primer set consisting of SEQ ID NOs: 32 and 33 and a clamping primer of PIK3CA exon 9 codon 542 to identify wild type and mutant genes of PIK3CA exon 9.
  • the reverse primer used for clamping exon 9 codon 542 the reverse primer of SEQ ID NO: 33 designed to identify the gene of PIK3CA exon 9 was used identically.
  • SEQ ID NOs: 39 and 40 were synthesized with a clamping primer of PIK3CA exon 9 codon 545, and the primer of SEQ ID NO: 37 was used as a forward primer used for clamping exon 9 codon 545.
  • the primers of SEQ ID NOs: 41 and 42 were synthesized using a primer set consisting of SEQ ID NOs: 34 and 35 to identify wild type and mutant genes of PIK3CA exon 20 and a clamping primer of exon 20 codon 1047.
  • the reverse primer used for clamping exon 20 codon 1047 the reverse primer of SEQ ID 35 was designed to identify the gene of PIK3CA exon 20.
  • the sequence of the used primer is as shown in Table 3 above. Primers were synthesized by Bioneer (Korea).
  • Genes of PIK3CA exons 9 and 20 were amplified using primer sets of SEQ ID NOs: 32 and 33 and primer sets of SEQ ID NOs: 34 and 35 using human whole DNA.
  • the amplified nucleic acid was ligated into pGEM-T easy vector (Promega, USA) and transformed into E. coli JM 109 cells to obtain a large amount of DNA.
  • a primer for mutation was prepared using a normal clone prepared by the above-described method, and a clone with a mutant gene was obtained using a site-specific mutagenesis kit (Stratagene, USA). The obtained clone was confirmed by its sequencing analysis.
  • HT29 genomic DNA human colon cancer cell line [KCLB30038, Korea Cell Line Bank (KCLB), Seoul, Korea] was distributed as a wild type cell line. Mutant cell lines shown in Table 4 below were also sold from Korea Cell Line Bank.
  • Cell lines received were 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA) and 1X penicillin-streptomycin (WelGENE, Korea) in RPMI1640 (Hyclone, Thermo scientific, USA) or MEM (WelGENE, Korea). ) was incubated in an incubator with 37, 5% carbon dioxide (CO 2 ).
  • the cultured cell line was extracted with DNA using a High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, USA) according to the manual provided in the kit to obtain a target nucleic acid.
  • the obtained nucleic acid was quantified using a nanodrop spectrophotometer (ND 2000C, Thermo Scientific, USA) and stored at -20 to use.
  • the amplified PCR product was purified using Labopass PCR purification kit (Cosmojintech, Korea) and then sequencing to confirm genotype. Genotype-identified wild-type and mutant cell lines were used as samples for real-time PCR using the PNA probe of the present invention .
  • One clamping probe (100 nM) 1, 2X IQ Sybr Green Supermix (Bio-Rad, USA) 10, distilled water 6 was added and a real-time PCR machine (CFX96TM Real-Time PCR System, Bio) -RAD Co., Ltd.) for 3 minutes at 95 and then added to the reaction of 95 30 seconds and 70 to 20 seconds PNA can hybridize, and repeat the reaction of 63 30 seconds, 72 30 seconds 40 times. Fluorescence was measured at 72 polymerization stages.
  • SEQ ID NOS: 9 to 31 SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 16, and 17 were applied to confirm the effects of inhibiting amplification of codon 545 wild type of exon 9 and detecting mutations. As shown in FIG. 3. All the probes applied showed excellent effects, in particular the probes of SEQ ID NOs: 12 and 13 were found to have a better effect in detecting various mutations.
  • FIG. 4 The results of confirming the effect of inhibiting the amplification of codon 1047 wild type of exon 20 and detecting the mutation by applying the probe of SEQ ID NOS: 1 to 6 are shown in FIG. As shown in FIG. 4, the probes of SEQ ID NOs: 1, 2, and 4 exhibited excellent effects, and in particular, the probes of SEQ ID NO: 4 were found to exhibit better effects.
  • the mutant genes were included in the wild-type genes to include 10 ng, 5 ng, 2.5 ng, 1 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, and 0.01 ng, respectively.
  • the correlation between the t values was analyzed to confirm the detection limit of the mutant.
  • C t shows the results of comparing the detection sensitivity (C t ) according to the sample application amount using the PNA probes of SEQ ID NOs: 12 and 13 in the cell line having the PIK3CA exon 9 codon 545 mutation.
  • the C t value representing the number of reactions in which the fluorescence reaches the threshold value decreases constantly (ie, the C t value increases), thereby increasing the amount of the mutant gene and the C t value. Correlated with.
  • FIG. 6 shows the results of comparing the detection sensitivity (C t ) according to the mutation-containing concentration using a PNA probe of SEQ ID NO: 4 in a cell line having a PIK3CA exon 20 codon 1047 mutation.
  • the C t value is constantly decreased (ie, the C t value is increased), indicating that there is a correlation between the relative concentration of the mutant gene and the C t value.
  • mutations in the PIK3CA gene which are expected to be involved in cancer development, prognosis, and drug resistance, can be detected within a short time even a mutation contained in a very small amount with excellent sensitivity and specificity.
  • the PNA itself which is used as a probe, is very stable to biological enzymes and physical elements, and the detection method is very simple and it is expected to be very easy for mass analysis and clinical use because the detection is performed in a short time.

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Abstract

본 발명은 PIK3CA 유전자 엑손 9 또는 20의 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

ＰＮＡ의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＰＩＫ3ＣＡ 돌연변이 검출 방법 및 키트
본 발명은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 프로브를 이용한 PIK3CA(Phosphatidylinositol 3-kinase, catalytic, alpha polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 20의 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이에 따라, 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하는 많은 돌연변이가 발견되고 있다. 이 중 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 단백질의 활성화를 가져오고 PI3K는 타이로신 키나제 수용체의 신호전달 체계를 활성화한다. 활성화된 타이로신 키나제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사촉진을 방해하며 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시킴으로써 발암과정에 관여한다(Serena Di et al., Clin Cancer Res. 2009 August 15;15(16), 5017-5019). PIK3CA 유전자변이의 75%가 PI3K 단백질의 헬리컬(helical) 부위로 번역되는 엑손 9번과 키나제 부위로 번역되는 엑손 20번 위치에서 점 돌연변이(point mutation)로 발견되며, 그 외 매우 다양한 위치에서 산발적으로 나타난다(Ligresti G et al., Cell cycle 2009 May 1;8:9, 1352-1358). 이러한 PIK3CA 유전자 변이는 매우 다양한 암에서 발견되며, 특히 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암, 유방암 등에서 25 내지 40% 비율로 나타난다고 보고되어 있다(Ligresti G et al., Cell cycle 2009 May 1;8:9, 1352-1358, Barbi S et al., J Exp Clin Cancer Res. 2010 Apr 16;29, 32, Kalinsky K et al., Clin Cancer Res. 2009 August 15;15(16), 5049-5059, Gallia GL et al., Mol Cancer Res. 2006 Oct;4(10):709-14, Ogino S et al., J Clin Oncol. 2009 Mar 20;27(9):1477-84, Oda K et al. Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10669-73). PIK3CA 유전자 돌연변이는 암 진행 속도를 빠르게 하고 전이 빈도를 증가시켜 환자의 예후를 악화시킨다. 또한 인간 표피성장인자류(Human Epidermal Growth Factor, HER family)의 하류부분(downstream)의 신호전달 체계에 속하여 HER 패밀리의 표적 치료제들의 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Wee S et al., Cancer Res. 2009 May 15;69(10):4286-93, Guo XN et al., Cancer Res. 2007 Jun 15;67(12):5851-8, Ogino S et al., J Clin Oncol. 2009 Mar 20;27(9):1477-84). 최근 보고된 논문에 의하면, HER2 유전자가 증폭된 유방암에 티로신 키나제 일종인 허셉틴(Herceptin)이라는 약제의 처방이 치료예후를 좋게 하는 것으로 알려져 있지만, HER2 유전자의 증폭과 더불어 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 가질 경우 허셉틴에 대한 내성을 가진다고 보고되어 있다(O'Brien NA et al., Mol Cancer Ther. 2010 Jun;9(6):1489-502). PI3K는 이를 표적으로 하는 치료제의 개발에 중요한 요소로 그 중요성이 증가되고 있다. 따라서 PIK3CA 돌연변이 검출은 인간 표피성장인자를 표적으로 치료하는 방법에 있어 치료효과를 예측할 수 있는 중요한 지표이며 좋은 예후에 결정적인 역할을 할 수 있다.
PIK3CA 돌연변이의 검출 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 야생형과 돌연변이 유전자의 3차원적인 구조(conformation) 차이에 따른 전기영동상 이동 거리의 변화를 통해 검출하는 방법인 중합효소연쇄반응-단일쇄 형태구조 다형성(Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism; PCR-SSCP) 방법(EI-Habr EA et al., Clin Neuropathol. 2010 Jul-Aug;29(4):239-45) 등이 사용되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다. 또한 임상 시료는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많기 때문에, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이의 검출이 어렵다.
민감도를 증가시키기 위해 야생형과 돌연변이간의 용융온도 차이를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 고감도 용융온도분석(high-resolution melting curve analysis, HRMA) 방법, 스코피언(scorpion) 프로브를 이용하여 돌연변이를 선택적으로 검출하는 스코피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR)(DxS' scorpions and ARMS ) 방법 등이 사용되고 있다(Simi L et al., Am J Clin Pathol. 2008 Aug;130(2):247-53, Board RE et al., Clin Chem. 2008 Apr;54(4):757-60). 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다(Bernard et al., Clin Chem. 2002 Aug;48(8):1178-85). 그러나 상기한 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야 하기 때문에 하나의 돌연변이를 검출하기 위하여 여러 반응이 요구되는 번거로움이 있다(Simi L et al., Am J Clin Pathol. 2008 Aug;130(2):247-53, Board RE et al., Clin Chem. 2008 Apr;54(4):757-60).
최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다(Nielsen PE et al., Science 1991 Dec 6;254(5037):1497-500). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.
미국공개특허 제2008/0176226호는 표적핵산의 선택된 부위를 증폭하는 프라이머 세트와 야생형의 상기 선택된 부위와 완벽하게 결합하는 PNA 프로브 존재 하에 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물에 대해 용융곡선 분석을 수행하여 표적핵산의 돌연변이를 검출하는 방법 및 키트를 개시하고 있다. 그러나 상기 방법은 증폭반응의 사이클 수가 아닌 용융곡선의 차이로 돌연변이형을 구별하게 되는데, PNA 클램핑 프로브 이외에 용융곡선을 측정하기 위한 형광을 검출할 수 있는 공여체 형광물질(donor fluorophore)과 수용체(acceptor)가 부착되어 있는 프로브를 필요로 한다. 이와 같이 형광이 표지된 프로브를 다량 포함하여 검출을 하게 되므로 분석을 위한 비용이 높아지는 문제점이 발생한다. 또한, 상기 미국공개특허는 K-ras 돌연변이를 검출하기 위하여 N-말단에 플루오레세인으로 표지된 17mer PNA(센서 프로브)와 3'-말단에 LC-Red 640으로 표지된 44mer DNA(앵커 프로브)를 이용한 예만을 구체적으로 개시하고 있을 뿐, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출에 대해서는 어떠한 교시나 암시도 하지 않았다.
본 발명자들은 PIK3A 유전자에 대하여, 비교적 길이가 긴(예: 15mer 이상) PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써 용융곡선의 차이를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형의 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 PIK3CA 돌연변이 검출 기술을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 PIK3CA 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 PIK3CA 돌연변이 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 면은
PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 엑손 20 부위를 증폭시키는 PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머 세트와, PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 엑손 20의 야생형과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, PIK3CA 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
단계를 포함하는, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정한다.
본 발명에 사용되는 PNA 클램핑 프로브는 바람직하게는 15 내지 30mer, 보다 바람직하게는 17 내지 24mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 31의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 사용되는 PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머 세트는 PIK3CA 유전자 엑손 9 야생형 코돈 542, 545 또는 546, 또는 엑손 20 야생형 코돈 1047의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머와, 그의 하류부분에 특이적으로 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 정방향 프라이머는 서열번호 36, 37, 41 및 42 중 어느 하나로 이루어지는 것이고, 역방향 프라이머는 서열번호 33, 35, 및 38 내지 40 중 어느 하나로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서는, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는바, 예를 들어 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. DNA 인터컬레이션(intercalation)이 가능한 형광물질은 어느 것이라도 사용가능하며 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따른 방법은 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암 또는 유방암의 치료를 결정하거나 진단하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 면은
서열번호 1 내지 31 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
를 포함하는, 본 발명에 따른 PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
도 1은 PNA 기반의 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고;
도 2는 본 발명에서 고안된 서열번호 7 내지 11의 PNA 프로브를 이용하여 PIK3CA 엑손 9 코돈 542 돌연변이를 검출하는 프로브를 선별하기 위하여 프로브에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 그래프이며;
도 3은 본 발명에서 고안된 서열번호 12, 13, 14, 16 및 17의 PNA 프로브를 이용하여 PIK3CA 엑손 9 코돈 545 돌연변이를 검출하는 프로브를 선별하기 위하여 프로브에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 그래프이고;
도 4는 본 발명에서 고안된 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브를 이용하여 PIK3CA 엑손 20 코돈 1047 돌연변이를 검출하는 프로브를 선별하기 위하여 프로브에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 그래프이며;
도 5는 PIK3CA 엑손 9 코돈 545 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 본 발명에서 고안된 서열번호 12 및 13의 PNA 프로브를 이용하여 샘플적용 양에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 그래프이고;
도 6은 PIK3CA 엑손 20 코돈 1047 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 본 발명에서 고안된 서열번호 4의 PNA 프로브를 이용하여 돌연변이 포함 농도에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 그래프이다.
본 발명은 PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 20의 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 도 1에 본 발명에 따른 방법의 원리를 모식적으로 나타내었다. 구체적으로, 본 발명은 아래 표 1에 열거된 PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 20의 돌연변이 검출을 위한 것이다.
표 1
엑손 단백질 아미노산 염기서열
Exon9 Helical Gly542Lys 1624
Exon9 Helical Gly545Lys 1633
Exon9 Helical Gly545Gly 1634
Exon9 Helical Gly545Asp 1635
Exon9 Helical Gln546Gly, Gln546Lys 1636
Exon9 Helical Gln546Pro, Gln546Arg 1637
Exon20 Kinase His1047Tyr 3139
Exon20 Kinase His1047Leu, His1047Arg 3140
1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
본 발명의 PNA 프로브는 PIK3CA 엑손 9 및 20의 돌연변이(치환 포함)가 발생하는 부분의 야생형 유전자 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서, 15개 이상, 바람직하게는 15~30개, 보다 바람직하게는 17~27개, 가장 바람직하게는 17~24개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 PNA 프로브는 PIK3CA 엑손 9 및 20의 돌연변이(치환 포함)가 발생하는 부분의 야생형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 아래 표 2에 기재한 서열번호 1 내지 31 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인바, 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 PIK3CA 유전자 엑손 9 및 20의 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
구체적으로는, 서열번호 7 내지 11은 PIK3CA 엑손 9의 코돈 542의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 코돈 542에서의 치환은, 뉴클레오티드 1624의 구아닌이 아데닌으로 치환되어 코돈 542의 야생형 글루탐산이 라이신으로 치환되어 PI3K 단백질의 헬리컬(helical) 구조 부분에 변이를 준다. 서열번호 7 내지 11은 PIK3CA 엑손 9의 코돈 542를 포함하는 1624번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 9 내지 31은 PIK3CA 엑손 9의 코돈 545 부분의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 코돈 545에서의 치환은, 뉴클레오티드 1633의 구아닌이 아데닌으로 치환되어 코돈 545의 야생형 글구탐산이 라이신으로 치환되는 것, 뉴클레오티드 1634의 아데닌이 구아닌으로 치환되어 코돈 545의 야생형 글루탐산이 글리신 으로 치환되는 것, 뉴클레오티드 1635의 구아닌이 티민으로 치환되어 코돈 545의 야생형 글루탐산이 아스파라긴산으로 치환되는 것을 포함한다. 서열번호 1 내지 6은 엑손 20의 코돈 1047를 포함하는 3140번째 염기에 특이적으로 혼성화 되도록 고안되었다. 서열번호 1 내지 6은 PIK3CA 엑손 20의 코돈 1047의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 코돈 1047에서의 치환은, 뉴클레오티드 3140의 아데닌이 구아닌 또는 티민으로 치환되어 코돈 1047의 야생형 히스티딘이 아르기닌 또는 류신으로 치환되어 PI3K 단백질의 키나제 부분에 변이를 준다.
표 2
서열번호 이름 서열( 5'→ 3' ) 길이
1 H1047-1 AATTATGCACATCATGGTGGC 21
2 H1047-2 AATTATGCACATCATGGTGGCT 22
3 H1047-3 GATTCACATCATGGTGGC 18
4 H1047-4 ATTATGCACATCATGGTGGC 20
5 H1047-5 TTATGCACATCATGGTG 17
6 H1047-6 ATTCACATCATGGTGGC 17
7 E542-1 ATCCTCTCTCTGAAATCACTGA 22
8 E542-2 TCTCTGAAATCACTGAGCAG 20
9 E542_E545-1 CCTCTCTCTGAAATCACT 18
10 E542_E545-2 GATCCTCTCTCTGAAATCACT 21
11 E542_E545-3 ATCCTCTCTCTGAAATCACTG 21
12 E545·546-1-as TCTTTCTCCTGCTCAGTSATTT 22
13 E545·546-2-as TCTTTCTCCTGCTCAGTSATTTAG 24
14 E545·546-3-as TTTCTCCTGCTCAGTSATTT 20
15 E545·546-4-s CTTAAATCACTGAGCAGGA 19
16 E545·546-5-s AATCACTGAGCASSAGA 17
17 E545·546-6-s TCTTAAATCACTGAGCAGG 19
18 E545·546-7-s AAATCACTGAGCAGGAGAAA 20
19 E545·546-8-s AAATCATTGAGCAGGAGAAA 20
20 E545·546-9-s AAATCACTGASCAGGAGAAA 20
21 E545·546-10-s AAATCACTGASCAGSAGAAA 20
22 E545·546-11-as TTCTCCTGCTCAGTGATTT 19
23 E545·546-12-as TTTCTCCTGCTCAGTGATTTTAG 23
24 E545·546-13-as CTTTCTCCTGCTCAGTGATTT 21
25 E545·546-14-as TCTTTCTCCTGCTCATTGATTT 22
26 E545·546-15-as AATCTTTCTCCTGCTCATTGATTT 24
27 E545·546-16-as TCTTTCTCCTGCTCAGTGATTT 22
28 E545·546-17-s AAATCACTGAGCAGGAGAAAGA 22
29 E545-1-as TTCTCCTGCGCAGTGATTT 19
30 E545-2-as TTTCTCCTGCGCAGTGATTTTAG 23
31 E545-3-as CTTTCTCCTGCGCAGTGATTT 21
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal)에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다[Shakeel et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 2006, 81, 892-899; Gildea et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 7255-7258; Demidov et al., PNAS, 2002, 99, 5953-5958; Wang et al., Anal. Chem., 1997, 69, 5200-5202]. 구체적으로, 본 발명에서는 N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착되거나, N-말단과 C-말단에 라이신(lysine)이 1개씩 부착된 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Dueholm et al., J Org chem. 59(19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1(3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51(22): 6179-6194, 1995).
2. PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 불일치 서열이 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다. 본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1 내지 31의 PNA 프로브와 5 내지 12개의 염기서열이 중첩되도록 클램핑 프라이머를 설계하였다. 본 발명에서 예시된 서열번호 36의 정방향 프라이머는 서열번호 7 내지 11의 PIK3CA 유전자 엑손 9의 코돈 542의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 36의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 33의 역방향 프라이머는 PIK3CA 유전자 인트론 9 부위의 61~80번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 39 및 40의 역방향 프라이머는 서열번호 9 내지 31의 PIK3CA 유전자 엑손 9의 코돈 545 및 546의 하류부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 39 및 40의 역방향 프라이머와 조합되는 서열번호 37의 정방향 프라이머는 PIK3CA 유전자 엑손 9의 32~59번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 41 및 42의 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 PIK3CA 유전자 엑손 20의 코돈 1047의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 41 및 42의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 35의 역방향 프라이머는 PIK3CA 유전자 인트론 21 부위의 9~29번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 프라이머의 길이는 20mer에서 28mer 사이로 각각 프라이머 조합의 증폭산물의 크기가 50bp 내지 500bp가 되도록 고안되었다.
한편, PIK3CA 유전자의 엑손 9의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여 본 발명에서 제공되는 서열번호 32의 정방향 프라이머는 PIK3CA 유전자 인트론 8 부위의 -63~-44 번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 33으로 PIK3CA 유전자 인트론 9 부위의 61~80번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 269 bp가 되도록 고안되었다. PIK3CA 유전자의 엑손 20의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여, 본 발명에서 제공되는 서열번호 34의 정방향 프라이머는 PIK3CA 유전자 엑손 20 부위의 69~88 번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 35로 PIK3CA 유전자 인트론 21 부위의 9~29번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 202 bp가 되도록 고안되었다. 각각의 프라이머의 특성은 아래 표 3에 정리되어 있다.
표 3
서열 번호 부위 위치 이름 방향 서열(5'→ 3') 길이
32 인트론 8 -63 ~ -44 E542·545-F 정방향 CTGTGAATCCAGAGGGGAAA 20
33 인트론 9 61 ~ 80 E542·545-R 역방향 ACATGCTGAGATCAGCCAAA 20
34 엑손 20 69 ~ 88 H1047-F 정방향 CTCAATGATGCTTGGCTCTG 20
35 인트론 21 9 ~ 29 H1047-R 역방향 TCAGTTCAATGCATGCTGTTT 21
36 엑손 9 59 ~ 73 E542K clamp-F 정방향 CAATTTCTACACGAGATCCTCTCTC 25
37 엑손 9 32 ~ 59 E545F2 정방향 GGGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGC 28
38 엑손 9 86 ~ 109 E542 clamp-R2 역방향 AATCTTTCTCCTGCTCAGTGATTT 24
39 엑손 9 97 ~ 120 E545 clamp-R3 역방향 ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTG 24
40 엑손 9 99 ~ 122 E546 clamp-R4 역방향 TGACTCCATAGAAAATCTTTCTCC 24
41 엑손 20 240 ~ 262 H1047RL clamp-F 정방향 CATGAAACAAATGAATGATGCAC 23
42 엑손 20 240 ~ 261 H1047YRL clamp-F 정방향 CATGAAACAAATGAATGATGCA 22
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 PIK3CA 돌연변이 검출
본 발명에 따른 PIK3CA 유전자 돌연변이 검출방법은
(a) PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머 세트와 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, PIK3CA 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 단계:
를 포함한다.
단계 (a)에서 사용되는 PIK3CA 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비된다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액 또는 종양 표본으로부터 DNA를 추출하여 준비된다.
단계 (a)에서는, 실시간 PCR 방법을 이용하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 검출한다. 실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 인터컬레이팅(intercalating)법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 인터컬레이션(intercalation)되어 형광을 발하게 되는데 이 때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다. 이로써 어느 PCR 기기에나 적용할 수 있고 프라이머를 따로 제작하지 않아도 높은 민감도 및 특이도로 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, SYBR 그린 I 외에 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX 오렌지 등을 사용할 수 있다(Gudnason et al., Nucleic Acids Res. 2007;35(19):e127, Bengtsson et al., Nucleic Acids Res. 2003;31(8):e45; Wittwer et al., Clinical Chemistry 49(6):853-860).
단계 (b)에서는, 단계 (a)의 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는바, 증폭된 Ct값을 비교하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 PIK3CA 돌연변이 코돈 유전자 부위에 혼성화되어 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 Ct값이 높게 나타난다. 반면 PIK3CA 돌연변이 코돈 부위에 돌연변이가 발생한 경우 PNA 프로브와 혼성화되지 못하고 증폭되어 Ct값이 낮게 나타나게 된다. 양성 대조 시료로부터 얻어진 Ct값에서 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값을 빼어 얻어진 Ct의 값을 확인하여 각 코돈의 돌연변이 유무를 확인한다(하기 수학식 1 참조).
[수학식 1]
Ct = 양성대조 시료로부터 얻어진 Ct값 - 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값
[양성대조 시료: 야생형 유전자 시료]
돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 Ct값이 낮게 나타나게 되므로 Ct 차이가 클수록 돌연변이가 다량 포함되어 있음을 판단할 수 있다.
본 발명의 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 PIK3CA 돌연변이 검출 방법은 대장암을 비롯하여 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암, 유방암 등의 종양을 검사하는데 이용할 수 있으며, 종양 연구뿐만 아니라 PIK3CA 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: PIK3CA 엑손 9 및 20에 존재하는 코돈 542, 545 및 1047 야생형의 증폭을 억제하기 위한 PNA 프로브 합성
PIK3CA 유전자의 엑손 9 코돈 542, 545 및 엑손 20 코돈 1047의 야생형과 완벽하게 결합하는 28개의 PNA 프로브를 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464,261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다(Lee H et al., Org Lett. 2007 Aug 16;9(17):3291-3.).
실시예 2: PIK3CA 엑손 9 및 20의 표적핵산 증폭 및 클램핑 PCR을 위한 프라이머 합성
PIK3CA 엑손 9 및 20의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 PIK3CA 유전자의 엑손 9 및 20 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. PIK3CA 엑손 9의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 32 및 33으로 이루어진 프라이머 세트와 PIK3CA 엑손 9 코돈 542의 클램핑 프라이머로 서열번호 36의 프라이머를 합성하였다. 엑손 9 코돈 542의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 PIK3CA 엑손 9의 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 33의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다. PIK3CA 엑손 9 코돈 545의 클램핑 프라이머로 서열번호 39 및 40을 합성하였으며, 엑손 9 코돈 545의 클램핑에 사용된 정방향 프라이머로는 서열번호 37의 프라이머를 사용하였다. PIK3CA 엑손 20의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 34 및 35로 이루어진 프라이머 세트와 엑손 20 코돈 1047의 클램핑 프라이머로 서열번호 41 및 42의 프라이머를 합성하였다. 엑손 20 코돈 1047의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 PIK3CA 엑손 20의 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 35의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 3에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 3: PIK3CA 엑손 9 및 20의 표적핵산을 제조하기 위한 돌연변이유발 및 클론제조
인간의 전체 DNA를 이용하여 서열번호 32 및 33의 프라이머 세트와 서열번호 34 및 35의 프라이머 세트를 사용하여 PIK3CA 엑손 9 및 20 부분의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 핵산을 pGEM-T 이지 벡터(Promega, USA)에 결찰하고 E. coli JM 109 세포에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하였다. 변이 유전자를 가진 클론을 확보하기 위해 상기한 방법으로 제조된 정상 클론을 이용하여 돌연변이용 프라이머를 제작하고 부위특이적 돌연변이유발 키트 (Stratagene, USA)를 사용하여 변이 유전자를 가진 클론을 확보하였다. 확보된 클론은 염기서열 분석으로 그 변이 여부를 확인하였다.
실시예 4: PIK3CA 엑손 9 및 20의 야생형 및 돌연변이 세포주(cell line)로부터의 핵산 추출
PIK3CA 엑손 9 및 20의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 한국세포주은행으로부터 세포주를 분양받았다. 야생형 세포주로 HT29(genomic DNA) 인간 대장암 세포주[KCLB30038, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았다. 하기 표 4에 나타낸 돌연변이 세포주들도 한국세포주은행으로부터 분양 받았다.
표 4
KCLB No. 돌연변이 엑손 세포주명 기원
30038 야생형 HT29 대장암
000601 E542K 엑손 9 SNU601 위궤양성 종양
30022 E545K 엑손 9 MCF7 유방암
10247 H1047R 엑손 20 HCT116 대장암
분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA) 또는 MEM(WelGENE, 한국)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1X 페니실린-스트렙토마이신(WelGENE, 한국)이 첨가된 배지를 사용하여 37, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 고순도 PCR 주형 제조 키트(High Pure PCR Template Preparation Kit)(Roche, USA)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20에 보관하여 사용하였다. 인간 세포주로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 3에 기재되어 있는 서열번호 32 및 33의 프라이머 세트와 서열번호 34 및 35의 프라이머 세트를 적용하여 PIK3CA 엑손 9 및 20 부분의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 Labopass PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 염기서열분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 및 변이형 세포주는 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법의 검체로 사용하였다.
실시예 5: PIK3CA 엑손 9 코돈 542에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
실시예 3에서의 클론으로부터 추출된 플라스미드 DNA와 실시예 4에서의 세포주로부터 추출된 DNA를 이용하여 하기 조건으로 RT-PCR 클램핑을 수행하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 검색하는 PNA 프로브들을 만들어 차이점을 비교해 보고 분석함으로써 최적의 PNA 프로브를 찾고자 하였다. 클론에서 추출된 플라스미드 DNA 용액 1 또는 세포주에서 추출된 주형 DNA 용액(50 ng/) 1 , 표 3에 나타난 1개의 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/) 1 , 안티센스 프라이머(10 pmole/) 1 , 표 2에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 , 2X IQ Sybr 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 , 증류수 6 를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95에서 3분 동안 반응시킨 후 95 30초 그리고 PNA가 혼성화될 수 있는 70에서 20초 반응을 추가하고, 63 30초, 72 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72 중합반응 단계에서 측정하였다.
상기 프로브들 중 서열번호 7 내지 11의 프로브를 적용하여 엑손 9의 코돈 542 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 두 세트의 프라이머(서열번호 33과 36, 및 서열번호 37와 38)로 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 33과 서열번호 36을 이용한 정방향 클램핑에서는 서열번호 7이 모두 매우 우수한 효과를 나타냈으며, 서열번호 37와 38를 이용한 역방향 클램핑에서는 서열번호 8 내지 10의 프로브가 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
서열번호 9 내지 31의 프로브 중 대표적으로 서열번호 12, 13, 14, 16 및 17을 적용하여 엑손 9의 코돈 545 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이. 적용한 모든 프로브가 우수한 효과를 나타내며, 특히 서열번호 12 및 13의 프로브가 다양한 돌연변이를 검출하는데 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
서열번호 1 내지 6의 프로브를 적용하여 엑손 20의 코돈 1047 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 서열번호 1, 2 및 4의 프로브가 우수한 효과를 나타내며, 특히 서열번호 4의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6: PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법을 통한 PIK3CA 유전자의 돌연변이 검색
실시예 5에서 확립된 실시간 PCR을 이용한 방법을 사용하여 야생형 유전자에 돌연변이 유전자를 각각 10ng, 5ng, 2.5ng, 1ng, 0.1ng, 0.05ng, 0.01ng이 포함하도록 제작하여 돌연변이 유전자의 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하였다.
도 5에 PIK3CA 엑손 9 코돈 545 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 서열번호 12 및 13의 PNA 프로브를 이용하여 샘플적용 양에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 결과를 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 돌연변이 유전자의 양이 증가할수록 형광이 역치값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소(즉 Ct값이 증가)하여, 돌연변이 유전자의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
도 6에 PIK3CA 엑손 20 코돈 1047 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 서열번호 4의 PNA 프로브를 이용하여 돌연변이 포함 농도에 따른 검출 민감도(Ct)를 비교한 결과를 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 돌연변이 유전자의 상대적 농도가 증가할수록 Ct값이 일정하게 감소(즉 Ct값이 증가)하여, 돌연변이 유전자의 상대적 농도와 Ct값 사이에 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 방법 사용 시 0.1%로 존재하는 돌연변이의 유무도 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 암 발생, 예후 및 약제내성에 관여하는 것으로 예상되는 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 극소량 포함되어 있는 돌연변이까지 검출할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 검출이 이루어지므로 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
서열목록 전자파일 첨부(C:\KipoNet\KOPATENTIN\panagene-PIK3CA.app)

Claims (11)

  1. PIK3CA(Phosphatidylinositol 3-kinase, catalytic, alpha polypeptide) 유전자의 엑손 9 또는 엑손 20 부위를 증폭시키는 PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머 세트와, PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 엑손 20의 야생형과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, PIK3CA 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
    단계를 포함하는, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 PIK3CA 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PNA 클램핑 프로브는 15 내지 30mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, PNA 클램핑 프로브는 17 내지 24mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, PNA 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 31의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, PIK3CA 유전자 클램핑 프라이머 세트는 PIK3CA 유전자 엑손 9 야생형 코돈 542, 545 또는 546, 또는 엑손 20 야생형 코돈 1047의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머와, 그의 하류부분에 특이적으로 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 정방향 프라이머는 서열번호 36, 37, 41 및 42 중 어느 하나로 이루어지는 것이고, 역방향 프라이머는 서열번호 33, 35, 및 38 내지 40 중 어느 하나로 이루어지는 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질은 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암 또는 유방암의 치료를 결정하거나 진단하는데 사용하기 위한, PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  11. 서열번호 1 내지 31 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
    를 포함하는, 제5항에 따른 PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.
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