CN108130373A - 在人pi3kca (pik3ca)基因中检测突变的方法和组合物 - Google Patents

在人pi3kca (pik3ca)基因中检测突变的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在人PI3KCA(PIK3CA)基因中检测突变的方法和组合物。本发明包括用于在人PI3KCA(PIK3CA)基因中检测癌症相关突变和基于其评估患者的试剂和方法。

Description

在人PI3KCA (PIK3CA)基因中检测突变的方法和组合物
本申请是申请日为2014年3月12日的中国专利申请201480013282.7“在人PI3KCA(PIK3CA)基因中检测突变的方法和组合物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症诊断学和用于癌症治疗的伴随诊断学。特别地，本发明涉及用于突变检测的方法和组合物，其可用于诊断和预后，以及预期癌症治疗的效力。
背景技术
磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）是胞内脂质激酶，其调节控制细胞增殖和生存、黏着和运动性的信号传递通路（Vivanco和Sawyers, (2002) The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer, Nature Rev. Cancer 2:489）。PI3KCA (PIK3CA)是PI3K基因家族的成员，其编码激酶p110α的催化亚基。该基因对瘤形成具有独特的相关性：在全部测试的PI3K基因中，只有PI3KCA被发现在多种癌症中突变。在一个研究中，在32%的结肠癌、27%的成胶质细胞瘤、25%的胃癌、8%的乳腺癌和4%的肺癌中发现了PI3KCA基因中的体细胞突变(Samuels等人(2004) High frequency of mutations in the PI3KCA gene in human cancers, Science 304:554)。随后的研究报告突变还在子宫癌（24%）、卵巢癌（10%）和宫颈癌（10%）中（Brana和Sui, (2012) Clinical development of phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors for cancer treatment, BMC Medicine2012, 10:161）。
PI3K通过特异激活Akt蛋白质将胞内Akt/mTOR通路激活。遗传方法显示通过突变体PI3KCA的该通路的组成性激活（constitutive activation）促成了对EGFR靶向治疗的抗性（Berns 等人 (2007) A functional genetic approach identifies the PI3K pathway as a major determinant of trastuzumab resistance in breast cancer,Cancer Cell 12:395）。同时，证明完整的（非突变的）PI3KCA活性可以通过特异的抑制剂进行抑制，从而克服了通路中去调节的(disregulated)上游元件的效果（例如EGFR），并且最近，已经开发了靶向PI3KCA (p110α)自身的治疗剂（在Weickhardt 等人(2010)Strategies for Overcoming Inherent and Acquired Resistance to EGFR Inhibitors by Targeting Downstream Effectors in the RAS/PI3K Pathway, Current CancerDrug Targets, 10:824；和Brana和Sui, (2012) Clinical development of phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors for cancer treatment, BMC Medicine2012, 10:161中综述）。
总之，这些研究证明了对于检测PI3KCA基因中体细胞突变以向寻求靶向癌症治疗的患者进行个人化医疗保健的方法和工具的需求。
至今，已鉴定了PI3KCA基因中超过30个体细胞突变（美国专利号8,026,053）。大多数突变聚集在外显子9和20中。然而，许多临床显著的突变已被报告也在外显子1、4和7中。诊断测定应当靶向尽可能多的这些突变。此外，精确的辨别（高特异性）是需要的，因为测定的结果将决定患者的癌症治疗过程。
发明内容
本发明包括用于检测人PIK3CA基因中每个突变H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的寡核苷酸，所述寡核苷酸与以下：SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219中的一个至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明是测定样品的人PIK3CA基因中一个或多个突变H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的存在的方法，其包括将样品与每个突变的一个等位基因特异性核苷酸寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。在该实施方案的变化中，寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
在还另一个实施方案中，本发明是用于检测在PIK3CA基因中一个或多个突变H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K突变的一组寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸的两个或多个寡核苷酸的组合。在该实施方案的变化中，寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
在还另一个实施方案中，本发明是用于检测在PIK3CA基因中一个或多个突变H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的反应混合物，其包含对每个突变的一个等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。在该实施方案的变化中，反应混合物包含以下中的一个或多个：SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
在还另一个实施方案中，本发明是在患者中评估癌症的方法，其通过使用对每个突变的一个等位基因特异性寡核苷酸在患者样品中检测PIK3CA基因中的一个或多个突变H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K，所述寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。在该实施方案的变化中，一个或多个寡核苷酸选自：SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
发明详述
定义
为促进该公开的理解，提供了在本文中使用的术语的如下定义。
术语“X[n]Y”指的是错义突变，其导致在氨基酸序列内的第[n]位上氨基酸X至氨基酸Y的取代。例如，术语“H1047R”指的是在第1047位的组氨酸被精氨酸取代的突变。
术语“等位基因特异性引物”或“AS 引物”指的是杂交至靶序列的多于一种变体，但是能够在靶序列的变体之间辨别的引物，因为所述引物只对变体中的一种在合适条件下通过核酸聚合酶有效地延伸。对靶序列的其它变体，延伸是效率较低的或无效率的。
术语“通用引物”指的是包含等位基因特异性引物的引物对的第二引物。通用引物不是等位基因特异性的，即，其不在等位基因特异性引物辨别的靶序列的变体之间进行辨别。
关于癌症的术语“评估”指的是推断癌症的状态或状况以及确定对诊断程序或治疗的需要，评价治疗的潜在效力，监控主体的癌症，或涉及癌症的治疗或诊断的任何其它步骤或方法。
术语“互补的”或“互补性”是根据有关Watson-Crick碱基配对原则的多核苷酸的反向平行链使用的。术语“完全互补的”或“100%互补的”指的是在反向平行链之间具有全部碱基的Watson-Crick配对的互补序列，即，在多核苷酸双链体中的任何两个碱基之间没有错配。然而，甚至在不存在完全互补性下双链体在反向平行链之间形成。术语“部分互补的”或“不完全互补的”指的是反向平行多核苷酸链之间碱基的小于完全100%的任何比对（例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未匹配碱基）。部分互补链之间的双链体通常比完全互补链之间的双链体更不稳定。
术语“样品”指的是含有或推测含有核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和肿瘤，并且还指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋的组织（FFPET）和从其分离的核酸。为检测体细胞突变，样品通常包括实体肿瘤（原发性或转移性）的部分(fragment)或在身体其它部位例如在循环血液中发现的肿瘤来源细胞。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交换地使用。“寡核苷酸”是有时用于描述较短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可以包含对应于指定的核苷酸序列的区域的至少6个核苷酸，例如至少约10-12个核苷酸，或至少约15-30个核苷酸。
术语“一级序列(primary sequence)”指的是在多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰诸如含氮碱基修饰、糖修饰或其它主链修饰不是一级序列的部分。标记，诸如缀合至寡核苷酸的发色团也不是一级序列的部分。因此，两条寡核苷酸可以具有同样的一级序列但是修饰和标记不同。
术语“引物”指的是这样的寡核苷酸，其与靶核酸中的序列杂交，并且能够作为在适合于这样的合成的条件下的沿着核酸互补链合成的起始点。如在本文中使用的，术语“探针”指的是与靶核酸中的序列杂交并且通常被可检测地标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，诸如3'-端修饰（其使得探针通过核酸聚合酶是不可延伸的），和一个或多个发色团。具有相同序列的寡核苷酸可以作为在一个测定中的引物和在不同测定中的探针。
术语“经修饰的核苷酸”指的是核酸聚合物中的单元，其含有经修饰的碱基、糖或磷酸基团，或在其结构中掺入非天然部分。非天然核苷酸的实例，包括具有经修饰的含氮碱基的核苷酸，例如烷基化的或另外具有在涉及Watson-Crick配对的常规含氮碱基中不存在的基团的替代物。通过说明和非限制性的方式，经修饰的核苷酸包括具有被甲基、乙基、苄基或丁基-苄基取代的碱基的核苷酸。
如在本文中使用的，术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶”指的是被扩增、检测或两者均进行的核酸序列的部分。
术语“杂交的”和“杂交”指的是两条核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体的形成。不需要两条核酸在它们的全长上具有100%的互补性以实现杂交。
本发明包括用于快速并准确确定患者样品中PI3KCA基因中一个或多个突变的存在的方法和组合物。本发明能够检测选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的突变以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个。
对多重处理（multiplexing）灵敏并且可经受检验的(amenable)一种技术是在例如美国专利号6,627,402中描述的等位基因特异性PCR (AS-PCR)。该技术在序列的野生型变体的存在下检测核酸序列中的突变或多态性。在成功的等位基因特异性PCR中，扩增靶核酸期望的变体，而没有扩增其它变体，至少没有达到可检测的水平。
等位基因特异性PCR的辨别的一种量度是在涉及两个等位基因的扩增反应中Ct值之间的差异(ΔCt)。每个扩增反应通过在核酸扩增测定的背景下“生长曲线”或“扩增曲线”是函数的图表进行表征，其中自变量是扩增循环的数目并且因变量是在扩增的每个循环测量的扩增依赖性的可测量参数，诸如通过荧光团发出的荧光。通常，扩增依赖性的可测量参数是杂交后或通过核酸聚合酶的核酸酶活性水解探针后由探针发出的荧光的量，参见Holland 等人, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280 和美国专利号5,210,015。生长曲线通过“阈值”（或Ct值）进行表征，所述“阈值”（或Ct值）是其中实现可测量参数的预定量级的循环数。较低的Ct值代表更迅速的扩增，而较高的Ct值代表更慢的扩增。在等位基因特异性反应的背景下，两个模板的Ct值之间的差异代表了反应中的等位基因的辨别。
在等位基因特异性PCR中，至少一条引物是等位基因特异的，使得引物延伸只有（或优先）在当序列的特定变体存在时发生，并且在当另一个变体存在时不发生（或以较低效率发生，即具有实质上的ΔCt）。成功的等位基因特异性引物设计是不可预测的技术。尽管设计用于已知序列的引物是常规的，但不存在用于设计可以在非常相似的序列之间进行辨别的引物的法则。当一个或多个等位基因特异性引物靶向在相同反应混合物中存在的一个或多个多态性位点时，所述辨别是特别具有挑战的。
通常，在引物中辨别的核苷酸，即仅与靶序列的一种变体匹配的核苷酸，是3'-端核苷酸。然而，引物的3'端只是特异性的多个决定因素中的一个。例如，另外的错配也可以影响辨别（参见美国专利申请公开号US20100099110）。另一个方法是包含非天然或经修饰的核苷酸，其改变引物和靶序列之间的碱基配对（美国专利号6,001,611）。降低的延伸动力学和因此引物的特异性由多种因素影响，其包括错配的整体序列背景和在反应中存在的其它核酸。这些外部因素对每个另外错配的影响以及单独的或组合的每个另外的非天然核苷酸的影响是不可被预测的。本发明申请人测试了引物的多个变体并且发现，令人惊讶地，某些变体对于它们在紧密相关的靶序列之间辨别的能力有显著差异。
为了引物的成功延伸，在引物3'-端的互补性比在引物5'-端的互补性更关键（Innis 等人编辑. PCR Protocols, (1990) Academic Press, 第1章，第9-11页）。因此本发明包括在表1-13中公开的引物以及其具有5'-端变化的等同物。
在一个实施方案中，本发明包括用于检测选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的PI3KCA突变以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个的寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明包括选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219（表1-13）的寡核苷酸以及与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体(variations)，其用于特异地检测人PI3KCA基因中的突变。如在表1-13中说明的，具有与给定的寡核苷酸90%同一性的寡核苷酸包括具有与该寡核苷酸的1个、2个或3个错配的那些。如在表1-13中进一步说明的，具有与给定的寡核苷酸90%同一性的寡核苷酸还包括具有一个或多个非天然核苷酸的那些。如在表1-13中进一步说明的，错配和非天然核苷酸通常在寡核苷酸3'-端部分出现，特别是在倒数第二的5个核苷酸内(within 5 penultimatenucleotides)。然而，一些具有与给定的寡核苷酸90%同一性的寡核苷酸还包括在寡核苷酸中其它位置（例如在寡核苷酸的5'-部分中）具有1个、2个或3个错配的那些。如在下文的实施例中证明的，本发明的寡核苷酸通过使用公式ΔCt = Ct(野生型) – Ct(突变体)确定的基本上正的(substantial positive)ΔCt进行表征，表明野生型模板的扩增比突变体模板的扩增可检测地更慢。
表格说明
下划线的核苷酸与野生型和突变体序列两者均错配。以下缩写用于碱基经修饰的核苷酸： A*和C*分别为N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤和N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶，C^是N4-乙基-脱氧胞嘧啶；和C#是N4-甲基-脱氧胞嘧啶。
表1：用于检测突变H1047L的寡核苷酸
表2：用于检测突变H1047R的寡核苷酸
表3：用于检测突变H1047Y的寡核苷酸
表4：用于检测突变N345K的寡核苷酸
表5：用于检测突变E542K的寡核苷酸
表6：用于检测突变E545A的寡核苷酸
L-G夹。
表7：用于检测突变E545G的寡核苷酸
表8：用于检测突变E545K的寡核苷酸
表9：用于检测突变Q546K的寡核苷酸
表10：用于检测突变Q546E的寡核苷酸
表11：用于检测突变Q546L的寡核苷酸
表12：用于检测突变G1049R的寡核苷酸
表13：用于检测突变M1043I的寡核苷酸
本发明的实施方案是用于检测PIK3CA基因中密码子1042和1050之间的一个或多个核苷酸位置的突变的寡核苷酸，所述寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、39、208和219的一个或多个序列至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸。寡核苷酸可以包含与所述序列之一的3个或更少错配，排除3'-端核苷酸和/或在3'-端倒数第二的5个核苷酸中的至少一个错配。寡核苷酸可以进一步包含在3'-端的末端5个核苷酸中至少一个经修饰的核苷酸。寡核苷酸特别适合用于检测突变M1043I、H1047L、H1047R、H1047Y和/或H1049R中的一个或多个。
本发明的另一个实施方案是用于检测PIK3CA基因中突变N345K的寡核苷酸，所述寡核苷酸与SEQ ID NO: 61至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸。寡核苷酸可以包含与SEQID NO: 61的3个或更少错配，排除3'-端核苷酸和/或在3'-端倒数第二的5个核苷酸中至少一个错配。寡核苷酸可以进一步包含在3'-端的末端5个核苷酸中至少一个经修饰的核苷酸。
本发明的另一个实施方案是用于检测PIK3CA基因中密码子541和547之间一个或多个核苷酸位置的突变的寡核苷酸，所述寡核苷酸与选自 SEQ ID NO: 84、99、126、148、168、185和197的一个或多个序列至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸。寡核苷酸可以包含与所述序列之一的3个或更少的错配，排除3'-端核苷酸和/或在3'-端倒数第二的5个核苷酸中至少一个错配。寡核苷酸可以进一步包含在3'-端的末端5个核苷酸中至少一个经修饰的核苷酸。寡核苷酸特别适合用于检测突变E542K、E545A、E545G、E545K、Q546K、Q546L 和/或Q546E中的一个或多个。
在另一个实施方案中，本发明是检测选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的人PI3KCA (PIK3CA)基因中突变以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、 5、6 、7、8、9、10、11、12 或13个的诊断方法，其使用选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、 84、 99、126、148、168、185、197、208、219的寡核苷酸或与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体(variations)。在该实施方案的变化中，方法包括使用选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228的一个或多个寡核苷酸。方法包括在对应的下游引物和检测探针的存在下将含有核酸的测试样品与一个或多个寡核苷酸接触。有利地，位置相近的突变的检测可以在单一反应中执行。在一些实施方案中，单一反应含有两个或多个等位基因特异性寡核苷酸，例如，SEQ ID NO: 8、21和46可以连同单一下游引物和单一检测探针在一个反应混合物中组合。相似地，单一反应物(a single reaction)可以含有SEQ ID NO: 93、113、141、 166、170和199中的两个或多个，可以连同单一下游引物和单一检测探针在一个反应混合物中组合。方法包括在对应的下游引物（即能够杂交至靶核酸的相反链(opposite strand)从而能够进行指数扩增的引物）、核苷三磷酸和核酸聚合酶的存在下将含有核酸的测试样品与一个或多个寡核苷酸接触，使得只有当PI3KCA突变在样品中存在时一个或多个等位基因特异性引物才有效地延伸；和通过直接或间接检测引物延伸的存在或不存在来检测PI3KCA突变的存在或不存在。
在特别的实施方案中，使用探针检测引物延伸的存在。可以使用放射性的、或发色团（荧光团）标记，例如掺入FAM、JA270、CY5家族染料或HEX染料的标记将探针标记。作为使用荧光标记的探针检测的一个实例，突变可以通过实时聚合酶链式反应（rt-PCR）进行检测，其中探针的杂交导致探针的酶消化和产生荧光的检测（TaqMan™ probe method,Holland 等人 (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280）。可选地，延伸产物和扩增产物的存在可以如例如在Sambrook, J. 和 Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning, 第3版.CSHL Press, 第5和9章中描述的，通过凝胶电泳随后染色或印迹并杂交进行检测。
在另一个实施方案中，本发明是治疗患者的方法，所述患者具有可能含有具有突变体PI3KCA基因的细胞的肿瘤。方法包括将来自患者的样品与选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100 (99)、127 (126)、148、170 (168)、185、197、208、219的一个或多个寡核苷酸或与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体接触，在一个或多个对应的第二引物的存在下执行等位基因特异性扩增，并且通过检测引物延伸的存在或不存在来检测PI3KCA突变的存在或不存在，并且如果发现或未发现至少一个突变，对患者实施合适的治疗方案。在一些实施方案中，治疗包括施用由PI3KCA基因编码的蛋白质（p110-α蛋白）的抑制剂。在其它实施方案中，如果没有发现PI3KCA突变，治疗包括施用通路上游蛋白质的抑制剂，例如EGFR蛋白，并且如果发现突变，则施用可选的治疗。在该实施方案的变化中，方法包括将来自患者的样品与选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228的一个或多个寡核苷酸接触。
在还另一个实施方案中，本发明是含有试剂的试剂盒，所述试剂用于检测PI3KCA基因中的突变，特别是选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的突变，以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个。试剂包括选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100 (99)、127(126)、148、170 (168)、185、197、208、219的一个或多个寡核苷酸，或与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体，一个或多个对应的第二引物，和任选地，一个或多个探针。在该实施方案的变化中，试剂包括选自SEQ ID NO: 11、32、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217 和228的一个或多个寡核苷酸。试剂盒可以进一步包含扩增和检测测定的执行所需的试剂，诸如核苷三磷酸、核酸聚合酶和聚合酶功能所需的缓冲液。在一些实施方案中，探针是可检测地标记的。在这样的实施方案中，试剂盒可以包含用于标记和检测标记的试剂。
在还另一个实施方案中，本发明是反应混合物，其用于检测PI3KCA基因中的突变，特别是选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的突变，以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个。混合物包含选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的一个或多个寡核苷酸或与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体，一个或多个对应的第二引物，和任选地，一个或多个探针。在该实施方案的变化中，反应混合物包含选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228的一个或多个寡核苷酸。反应混合物可以进一步包含试剂，诸如核苷三磷酸、核酸聚合酶和对聚合酶功能所需的缓冲液。
在还另一个实施方案中，本发明是在患者中评估癌症的方法，其通过在患者样品中检测PI3KCA基因中的突变，特别是选自H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的突变以及同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、 5、6、 7、 8、 9、10、11、12或13个，对于每个突变，使用选自SEQ ID NO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸或与所述寡核苷酸至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸的变体。在该实施方案的变化中，寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
具体实施方式
实施例
示例性的反应条件
在下文的全部实施例中，使用了以下反应条件。每个反应包含突变体或野生型DNA模板的104个拷贝，选择性引物和通用引物各自0.1µM，检测探针，尿嘧啶-N-糖基化酶，DNA聚合酶和合适的DNA聚合酶缓冲液。反应物在LIGHTCYCLER® 480设备（Roche MolecularDiagnostics, Indianapolis, Ind.）上经历了以下热循环概况：50oC 5分钟，随后是95oC(10秒) 至 62oC (30秒)的2个循环，和93oC (10秒)至62oC (30秒)的65个循环。在每个62oC步骤的起始收集荧光数据。使用来自每个反应的Ct值计算ΔCt。对每个实施例显示了平均Ct和标准偏差。
实施例1
用于检测人PI3KCA基因中突变H1047L的引物的性能
实施例2
用于检测人PI3KCA基因中突变H1047R 的引物的性能
实施例3
用于检测人PI3KCA基因中突变H1047Y 的引物的性能
实施例4
用于检测人PI3KCA基因中突变N345K 的引物的性能
实施例5
用于检测人PI3KCA基因中突变E542K 的引物的性能
实施例6
用于检测人PI3KCA基因中突变E545A 的引物的性能
实施例7
用于检测人PI3KCA基因中突变E545G 的引物的性能
实施例8
用于检测人PI3KCA基因中突变E545K 的引物的性能
实施例9
用于检测人PI3KCA基因中突变Q546K 的引物的性能
实施例10
用于检测人PI3KCA基因中突变Q546E 的引物的性能
实施例11
用于检测人PI3KCA基因中突变Q546L 的引物的性能
实施例12
用于检测人PI3KCA基因中突变G1049R 的引物的性能
实施例13
用于检测人PI3KCA基因中突变M1043I 的引物的性能
虽然本发明已参考具体的实施例进行了详细描述，但是可以在本发明范围内进行多种修饰将对本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明的范围不应当由在本文中描述的实施例限定，而是由下文呈现的权利要求限定。
序列表
<110> ROCHE DIAGNOSTICS GMBH
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> 在人PI3KCA (PIK3CA)基因中检测突变的方法和组合物
<130> 31384 WO-KOE
<150> 61/780,017
<151> 2013-03-13
<160> 230
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注释="人工序列描述:合成引物"
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<212> DNA
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<221> 修饰的碱基
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<221> 修饰的碱基
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<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 15
ccgtttttgt tgtccagcca ccatgaa 27
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<213> 人工序列
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<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (30)..(30)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 16
aatccattgt tgttgtccag ccaccatgaa 30
<210> 17
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<400> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 19
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<211> 22
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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引物"
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<212> DNA
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<221> 来源
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引物"
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<212> DNA
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<212> DNA
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引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
<400> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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引物"
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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引物"
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<211> 23
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<213> 人工序列
<220>
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引物"
<400> 39
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 40
tttgttgtcc agccaccatg aca 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 41
tttgttgtcc agccaccatg aga 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 42
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<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 43
tttgttgtcc agccaccatg gta 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 44
tttgttgtcc agccaccatg tta 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 45
tttgttgtcc agccaccatc ata 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 46
tttgttgtcc agccaccatt ata 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 47
tttgttgtcc agccaccata ata 23
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 48
gttttgttgt ccagccacca tgata 25
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 49
ttgtgttgtc cagccaccat gata 24
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 50
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgcgt 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 51
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgctt 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 52
agtatttcat gaaacaaatg aatgatggat 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 53
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgtat 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 54
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgaat 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 55
agtgtttcat gaaacaaatg aatgatgcat 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 56
agtgtttcat gaaacaaatg aatgatgcat 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 57
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgcgt 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 58
agtatttcat gaaacaaatg aatgattcat 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 59
agtatttcat gaaacaaatg aatgatgctt 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 60
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaat 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 61
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaaa 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 62
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaca 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 63
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaga 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 64
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgata 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 65
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgcaa 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 66
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtggaa 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 67
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgtaa 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 68
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtcaaa 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 69
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgttaaa 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 70
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtaaaa 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 71
atagaaattc tttgtgcaac ctacgtgaaa 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (30)..(30)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 72
atgaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaaa 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 73
atgaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaaa 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 74
atgaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaaa 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 75
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaca 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 76
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgcaa 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<400> 77
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtgaca 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (30)..(30)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 78
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgggaaa 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 79
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtcaaa 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 80
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgggaaa 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<400> 81
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtcaaa 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (30)..(30)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 82
ataaaaattc tttgtgcaac ctacgtcaaa 30
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 83
caatttctac acgagatcct ctctctg 27
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 84
caatttctac acgagatcct ctctcta 27
<210> 85
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 85
caatttctac acgagatcct ctctcaa 27
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 86
caatttctac acgagatcct ctctcca 27
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 87
caatttctac acgagatcct ctctcga 27
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 88
caatttctac acgagatcct ctctgta 27
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 89
caatttctac acgagatcct ctcttta 27
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 90
caatttctac acgagatcct ctctata 27
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 91
caatttctac acgagatcct ctcacta 27
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 92
caatttctac acgagatcct ctcccta 27
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 93
caatttctac acgagatcct ctcgcta 27
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 94
cagtttctac acgagatcct ctctcta 27
<210> 95
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (31)..(31)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 95
gaagcaattt ctacacgaga tcctctctct a 31
<210> 96
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (29)..(29)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 96
gaagcaattt ctacacgaga tcctctctct a 31
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 97
cagtttctac acgagatcct ctctcta 27
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 98
gagatcctct ctctgaaatc actga 25
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 99
gagatcctct ctctgaaatc actgc 25
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 100
gagatcctct ctctgaaatc actcc 25
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 101
gagatcctct ctctgaaatc acttc 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 102
gagatcctct ctctgaaatc actac 25
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 103
gagatcctct ctctgaaatc acagc 25
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 104
gagatcctct ctctgaaatc accgc 25
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 105
gagatcctct ctctgaaatc acggc 25
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 106
gagatcctct ctctgaaatc agtgc 25
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 107
gagatcctct ctctgaaatc attgc 25
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 108
gagatcctct ctctgaaatc aatgc 25
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 109
gggatcctct ctctgaaatc actgc 25
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 110
gggatcctct ctctgaaatc actgc 25
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 111
gggatcctct ctctgaaatc actgc 25
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 112
gagatcctct ctctgaaatc gctgc 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 113
gagatcctct ctctgaaatc attgc 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 114
gagatcctct ctctgaaatc actcc 25
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> G夹
<400> 115
gagatcctct ctctgaaatc actcc 25
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 116
gagatcctct ctctgaaatc accgc 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 117
gagatcctct ctctgaaatc actac 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 118
gagatcctct ctctgaaatc gccgc 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 119
gagatcctct ctctgaaatc accgc 25
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 120
gagatcctct ctctgaaatc acggc 25
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 121
gagatcctct ctctgaaatc actcc 25
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 122
gagatcctct ctctgaaatc acggc 25
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 123
gagatcctct ctctgaaatc accgc 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 124
gagatcctct ctctgaaatc acagc 25
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 125
gagatcctct ctctgaaatc actga 25
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 126
gagatcctct ctctgaaatc actgg 25
<210> 127
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 127
gagatcctct ctctgaaatc actcg 25
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 128
gagatcctct ctctgaaatc actag 25
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 129
gagatcctct ctctgaaatc acttg 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 130
gagatcctct ctctgaaatc acagg 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 131
gagatcctct ctctgaaatc accgg 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 132
gagatcctct ctctgaaatc acggg 25
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 133
gagatcctct ctctgaaatc agtgg 25
<210> 134
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 134
gagatcctct ctctgaaatc aatgg 25
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 135
gagatcctct ctctgaaatc attgg 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 136
gggatcctct ctctgaaatc actgg 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 137
gggatcctct ctctgaaatc actgg 25
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 138
gagatcctct ctctgaaatc actcg 25
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 139
gagatcctct ctctgaaatc actcg 25
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 140
gagatcctct ctctgaaatc acttg 25
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 141
gagatcctct ctctgaaatc actag 25
<210> 142
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 142
gagatcctct ctctgaaatc actcg 25
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 143
gagatcctct ctctgaaatc aatgg 25
<210> 144
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (28)..(28)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 144
ctatacgaga tcctctctct naaatcactg g 31
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 145
agatcctctc tctgaaatca ctag 24
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 146
agatcctctc tctgaaatca cggg 24
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 147
acgagatcct ctctctgaaa tcactg 26
<210> 148
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 148
acgagatcct ctctctgaaa tcacta 26
<210> 149
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 149
acgagatcct ctctctgaaa tcacaa 26
<210> 150
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 150
acgagatcct ctctctgaaa tcacca 26
<210> 151
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 151
acgagatcct ctctctgaaa tcacga 26
<210> 152
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 152
acgagatcct ctctctgaaa tcagta 26
<210> 153
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 153
acgagatcct ctctctgaaa tcaata 26
<210> 154
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 154
acgagatcct ctctctgaaa tcatta 26
<210> 155
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 155
acgagatcct ctctctgaaa tcccta 26
<210> 156
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 156
acgagatcct ctctctgaaa tcgcta 26
<210> 157
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 157
acgagatcct ctctctgaaa tctcta 26
<210> 158
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<400> 158
aggagatcct ctctctgaaa tcacta 26
<210> 159
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 159
aggagatcct ctctctgaaa tcacta 26
<210> 160
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-乙基-脱氧胞嘧啶
<400> 160
aggagatcct ctctctgaaa tcacta 26
<210> 161
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 161
aggagatcct ctctctgaaa tcacta 26
<210> 162
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 162
acgagatcct ctctctgaaa tcaata 26
<210> 163
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 163
acgagatcct ctctctgaaa tcacaa 26
<210> 164
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-甲基-脱氧胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 164
acgagatcct ctctctgaaa tcaata 26
<210> 165
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 165
acgagatcct ctctctgaaa tcacca 26
<210> 166
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N4-叔丁基-苄基-脱氧胞嘧啶
<400> 166
acgagatcct ctctctgaaa tcccta 26
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 167
agatcctctc tctgaaatca ctgagc 26
<210> 168
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 168
agatcctctc tctgaaatca ctgaga 26
<210> 169
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 169
agatcctctc tctgaaatca ctgaca 26
<210> 170
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 170
agatcctctc tctgaaatca ctgaaa 26
<210> 171
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 171
agatcctctc tctgaaatca ctgata 26
<210> 172
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 172
agatcctctc tctgaaatca ctgcga 26
<210> 173
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 173
agatcctctc tctgaaatca ctgtga 26
<210> 174
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 174
agatcctctc tctgaaatca ctggga 26
<210> 175
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 175
agatcctctc tctgaaatca ctcaga 26
<210> 176
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 176
agatcctctc tctgaaatca ctaaga 26
<210> 177
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 177
agatcctctc tctgaaatca cttaga 26
<210> 178
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 178
aggtcctctc tctgaaatca ctgaga 26
<210> 179
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (27)..(27)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 179
gaggtcctct ctctgaaatc actgaga 27
<210> 180
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 180
gaggtcctct ctctgaaatc actgaga 27
<210> 181
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 181
gagatcctct ctctgaaatc actgaaa 27
<210> 182
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 182
gagatcctct ctctgaaatc actggga 27
<210> 183
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 183
gagatcctct ctctgaaatc actaaga 27
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 184
atcctctctc tgaaatcact gagc 24
<210> 185
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 185
atcctctctc tgaaatcact gagg 24
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 186
atcctctctc tgaaatcact gaag 24
<210> 187
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 187
atcctctctc tgaaatcact gacg 24
<210> 188
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 188
atcctctctc tgaaatcact gatg 24
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 189
atcctctctc tgaaatcact gcgg 24
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 190
atcctctctc tgaaatcact gggg 24
<210> 191
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 191
atcctctctc tgaaatcact gtgg 24
<210> 192
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 192
atcctctctc tgaaatcact aagg 24
<210> 193
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 193
atcctctctc tgaaatcact cagg 24
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 194
atcctctctc tgaaatcact tagg 24
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 195
tcctctctct gaaatcactg agca 24
<210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 196
tcctctctct gaaatcactg agca 24
<210> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 197
tcctctctct gaaatcactg agct 24
<210> 198
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 198
tcctctctct gaaatcactg agat 24
<210> 199
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 199
tcctctctct gaaatcactg aggt 24
<210> 200
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 200
tcctctctct gaaatcactg agtt 24
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 201
tcctctctct gaaatcactg aact 24
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 202
tcctctctct gaaatcactg acct 24
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 203
tcctctctct gaaatcactg atct 24
<210> 204
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 204
tcctctctct gaaatcactg cgct 24
<210> 205
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 205
tcctctctct gaaatcactg ggct 24
<210> 206
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 206
tcctctctct gaaatcactg tgct 24
<210> 207
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 207
catgaaacaa atgaatgatg cacatcatg 29
<210> 208
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 208
catgaaacaa atgaatgatg cacatcatc 29
<210> 209
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 209
catgaaacaa atgaatgatg cacatcaac 29
<210> 210
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 210
catgaaacaa atgaatgatg cacatcacc 29
<210> 211
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 211
catgaaacaa atgaatgatg cacatcagc 29
<210> 212
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 212
catgaaacaa atgaatgatg cacatcctc 29
<210> 213
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 213
catgaaacaa atgaatgatg cacatcgtc 29
<210> 214
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 214
catgaaacaa atgaatgatg cacatcttc 29
<210> 215
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 215
catgaaacaa atgaatgatg cacataatc 29
<210> 216
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 216
catgaaacaa atgaatgatg cacatgatc 29
<210> 217
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 217
catgaaacaa atgaatgatg cacattatc 29
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 218
agccaccatg atgtgcatca ttc 23
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 219
agccaccatg atgtgcatca tta 23
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 220
agccaccatg atgtgcatca taa 23
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 221
agccaccatg atgtgcatca tga 23
<210> 222
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 222
agccaccatg atgtgcatca ata 23
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 223
agccaccatg atgtgcatca cta 23
<210> 224
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 224
agccaccatg atgtgcatca gta 23
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 225
agccaccatg atgtgcatcc tta 23
<210> 226
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 226
agccaccatg atgtgcatcg tta 23
<210> 227
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 227
agccaccatg atgtgcatct tta 23
<210> 228
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<400> 228
aggcaccatg atgtgcatca tta 23
<210> 229
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 229
aggcaccatg atgtgcatca tta 23
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成
引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> N6-叔丁基-苄基-脱氧腺嘌呤
<400> 230
aggcaccatg atgtgcatca tta 23

Claims (13)

1.用于检测在PIK3CA基因中的突变H1047Y的寡核苷酸，所述寡核苷酸与SEQ ID NO:39至少90%相同并且具有其3'-端核苷酸，所述寡核苷酸包含3个或更少的错配，排除所述3'-端核苷酸，其中至少一个错配或至少一个经修饰的核苷酸在3'-端倒数第二的5个核苷酸中。
2.测定样品的人PIK3CA基因中的突变H1047Y的存在的方法，其包括将样品与一个等位基因特异性核苷酸寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与包含SEQ ID NO: 39的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸，所述寡核苷酸包含3个或更少的错配，排除所述3'-端核苷酸，其中至少一个错配或至少一个经修饰的核苷酸在3'-端倒数第二的5个核苷酸中。
3.权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为SEQ ID NO: 46。
4.权利要求2或3所述的方法，其进一步包括除H1047Y之外的每个突变的至少一个等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219的寡核苷酸具有至少90%的同一性并且具有与其相同的3'-端核苷酸。
5.权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
6.用于检测PIK3CA基因中的突变H1047Y和一个或多个突变H1047L、H1047R、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的一组寡核苷酸，其包含两个或多个寡核苷酸的组合，其中一个寡核苷酸与权利要求1的寡核苷酸相同并且除H1047Y之外的每个突变的至少一个等位基因特异性寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。
7.权利要求6所述的组，其中所述寡核苷酸为SEQ ID NO: 46和/或所述等位基因特异性寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
8.权利要求6所述的组，其包含SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
9.用于检测PIK3CA基因中的突变H1047Y和一个或多个突变H1047L、H1047R、N345K、E542K、E545A、E545G、E454K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K的反应混合物，其包含与权利要求1的寡核苷酸相同的一个寡核苷酸以及除H1047Y之外的每个突变的至少一个等位基因特异性寡核苷酸，所述等位基因特异性寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。
10.权利要求9所述的反应混合物，其中所述寡核苷酸为SEQ ID NO: 46和/或所述等位基因特异性寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
11.权利要求9所述的反应混合物，其包含SEQ ID NO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
12.通过在患者样品中检测PIK3CA基因中的突变H1047Y和一个或多个突变H1047L、H1047R、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L和Q546K来评估患者中的癌症的方法，其包括将样品与权利要求1的寡核苷酸相同的一个寡核苷酸以及除H1047Y之外的每个突变的一个等位基因特异性核苷酸寡核苷酸接触，所述等位基因特异性核苷酸寡核苷酸与选自SEQ ID NO: 2、18、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核苷酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核苷酸。
13.权利要求12所述的方法，其中所述寡核苷酸为SEQ ID NO: 46和/或所述等位基因特异性寡核苷酸选自SEQ ID NO: 8、21、78、93、113、141、166、170、194、199、217和228。
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